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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Esse protocolo integra conjuntos de dados públicos de transcrição e validação de células epiteliais do cólon para identificar o S100P como um biomarcador compartilhado associado à doença inflamatória intestinal, câncer colorretal e adenocarcinoma pancreático.
A doença inflamatória intestinal (DII) está associada a um risco aumentado de câncer colorretal (CCR) e adenocarcinoma pancreático (PAAD), mas as características moleculares compartilhadas entre essas doenças permanecem incompletamente compreendidas. Este estudo teve como objetivo identificar genes comuns e vias biológicas associadas à DII, CCR e PAAD por meio de análise transcriptômica integrada e validação experimental. Conjuntos de dados de expressão gênica para IBD, CRC e PAAD foram obtidos a partir dos bancos de dados The Cancer Genome Atlas e Gene Expression Omnibus. Foram realizadas análises de redes de coexpressão gênica ponderadas e análises diferenciais de expressão para identificar genes associados e compartilhados à doença. Gene Ontology e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (análises foram usadas para explorar funções e vias biológicas enriquecidas. A infiltração de células imunes foi avaliada usando Identificação de Tipo Celular por Estimativa de Subconjuntos Relativos de Transcritos de RNA. Foi realizada a análise das características operacionais do receptor para avaliar o desempenho diagnóstico dos genes comuns. A análise de sequenciamento de RNA de célula única foi realizada para examinar a distribuição celular do S100P. Além disso, os efeitos da regulação negativa do S100P foram avaliados em células epiteliais do cólon estimuladas por lipopolissacarídeos (LPS). Foram identificados um total de 162 genes associados à doença e quatro genes comuns. Análises de enriquecimento funcional indicaram um enriquecimento significativo de vias relacionadas ao sistema imunológico e inflamatório, incluindo a via de sinalização da interleucina-17. A análise de infiltração imune revelou tendências semelhantes em várias populações de células imunes entre DII, CRC e PAAD. A análise de célula única mostrou expressão elevada de S100P em células epiteliais das três doenças. A regulação para baixo do S100P restaurou a capacidade proliferativa das células epiteliais do cólon estimuladas por LPS e reduziu a expressão de citocinas inflamatórias. A análise transcriptômica integrada identificou o S100P como biomarcador associado à DII, CRC e PAAD, destacando características imunológicas compartilhadas entre essas doenças.
A doença inflamatória intestinal (DII) representa um espectro de distúrbios imunológicos que afetam o trato gastrointestinal, incluindo colite ulcerativa e doença deCrohn 1. A etiologia da DII é altamente complexa, envolvendo anormalidades imunes mucosas, disbiose e suscetibilidadegenética 2. A DII é uma preocupação global de saúde, com taxas crescentes de incidência e cargas econômicas substanciais, e sua prevalência crescente tem atraído considerávelatenção 1. Importante destacar que pacientes com DII têm um risco significativamente aumentado de desenvolver câncer colorretal (CRC)3 e adenocarcinoma pancreático (PAAD)4. Embora essa associação tenha sido bem documentada, a intercomunicação genética entre DII, CRC e PAAD permanece incompletamente compreendida.
Estudos anteriores sugerem fortemente que DII, CRC e PAAD compartilham processos patogênicos comuns; no entanto, biomarcadores diagnósticos específicos e sensíveis ainda faltam, e os mecanismos patogênicos compartilhados não foram totalmente elucidados. Felizmente, com o rápido avanço e a ampla disponibilidade de tecnologias de sequenciamento de alta produtividade, inúmeros conjuntos de dados transcriptômicos de pacientes com DII, CRC e PAAD tornaram-se publicamente disponíveis, permitindo uma investigação sistemática das interconexões moleculares entre essasdoenças 2,5,6.
Este estudo utilizou dados de sequenciamento de alto rendimento de pacientes com DII, CRC e PAAD para identificar genes associados à doença e compartilhados usando análise ponderada de redes de coexpressão gênica (WGCNA) e análise diferencial de expressão. Esses genes foram investigados posteriormente para identificar possíveis vias de sinalização compartilhada entre DII, CRC e PAAD. Além disso, avaliamos o valor diagnóstico desses genes comuns. A análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) demonstrou que o gene-chave S100P foi predominantemente expresso em células epiteliais. Por fim, investigamos o papel biológico do S100P na DII.
Em conclusão, este estudo teve como objetivo identificar biomarcadores diagnósticos comuns e vias biológicas associadas à DII, CCR e PAAD, fornecendo assim valiosos insights clínicos sobre a prevenção e o tratamento compartilhados dessas doenças.
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Este estudo utilizou conjuntos de dados públicos e desidentificados do The Cancer Genome Atlas (TCGA) e do Gene Expression Omnibus (GEO), além de linhas celulares comerciais estabelecidas. Nenhum participante humano recém-recrutado, informações identificáveis do paciente ou amostras derivadas do paciente foram envolvidas. Todas as análises foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais relevantes e os termos de uso dos bancos de dados públicos. Portanto, não foram necessárias aprovações éticas institucionais adicionais nem consentimento informado para este estudo.
Fonte de Dados
Os dados RNA-seq para as coortes IBD (GSE179285; plataforma: GPL6480 e GSE24287; plataforma: GPL6480), coortes CRC (TCGA-CRC; plataforma: Illumina HiSeq 2000 e GSE87211; plataforma: GPL13497) e coortes PAAD (GSE128735; plataforma: GPL20301 e GSE62452; plataforma: GPL6244) foram baixados da TCGA e da GEO. Todos os conjuntos de dados foram acessados em 5 de dezembro de 2025.
Para cada conjunto de dados, as amostras foram estritamente divididas em dois subgrupos, com os tecidos da lesão/tumor da doença servindo como grupo de casos e os tecidos normais não lesionais correspondentes como grupo controle. Especificamente, a coorte de DII continha 297 amostras de mucosa intestinal de pacientes com DII e 56 amostras de mucosa intestinal normal de indivíduos saudáveis; a coorte CRC incluiu 841 tecidos tumorais colorretais primários e 211 tecidos epiteliais colorretais normais adjacentes correspondentes; e a coorte de PAAD consistia em 114 tecidos tumorais de PAAD e 106 tecidos parênquimatos pancreáticos normais.
Todos os conjuntos de dados dentro da mesma categoria de doença foram integrados de forma uniforme. A função normalizeBetweenArrays do pacote limma foi aplicada para realizar normalização de quantis entre amostras, eliminando efetivamente efeitos de lote entre plataformas e padronizando valores de expressão gênica em diferentes conjuntos de dados para análises diferenciais subsequentes.
Triagem de genes relacionados à DII, CRC e PAAD e genes comuns
Primeiro, genes diferencialmente expressos (DEGs) foram triados das coortes IBD, CRC e PAAD usando o pacote limma, e os valores P originais foram corrigidos usando o método da taxa de falsa descoberta (FDR) de Benjamini-Hochberg. Nas coortes IBD, CRC e PAAD, os critérios de triagem foram definidos em |logFC| > 0,4 e P < 0,05. Além disso, WGCNA foi realizada em todos os genes, com um limiar mínimo de módulo de 100 (potência soft-threshold = 0,90; tipo de rede = assinado). Consequentemente, DEGs comuns e genes módulos foram identificados entre as três coortes. Genes consistentemente identificados por ambos os métodos foram definidos como genes comuns, enquanto os genes restantes foram categorizados como genes relacionados.
IBP e Análise de Enriquecimento Funcional
Essas análises foram realizadas nos genes associados à doença. A análise de interação proteína-proteína (IBP) foi realizada usando o banco de dados STRING (escoragem de interação > 0,40). A análise de enriquecimento funcional incluiu análises da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), que foram realizadas usando o clusterProfiler, enrichplot e org. Hs.eg.db pacotes (P < 0,05 e valor q ajustado FDR [método Benjamini–Hochberg] < 0,05).
Perfilamento do Microambiente Imunológico
O CIBERSORT é um algoritmo confiável para estimar os níveis de infiltração de células imunes a partir de dados de expressão gênica usando a matriz padrão de assinaturaLM22 7. Neste estudo, o algoritmo CIBERSORT foi usado para estimar a extensão da infiltração de células imunes em amostras das coortes de DII, CRC e PAAD, a fim de explorar as características compartilhadas do microambiente imune entre as três doenças. A análise foi realizada com 1.000 permutações para calcular valores P para cada amostra, e a normalização de quantil (QN = TRUE) foi aplicada ao arquivo de expressão da mistura. Apenas amostras com valor CIBERSORT P < 0,05 foram mantidas para análises subsequentes, garantindo a confiabilidade dos resultados da deconvolução.
Avaliação do Valor Diagnóstico dos Genes Comuns
O valor diagnóstico dos genes comuns nas coortes IBD, CRC e PAAD foi avaliado usando análise de características operacionais do receptor (ROC) com o pacote pROC em R. A troca ótima entre sensibilidade e especificidade foi visualizada usando curvas ROC.
qRT-PCR, Transfecção Celular e Ensaio de Formação de Colônias
qRT-PCR e transfecção celular foram realizadas de acordo comestudos anteriores 8,9,10. A transfecção transitória foi realizada usando o reagente de transfecção jetPRIME (Polyplus, China) conforme as instruções do fabricante. As células eram incubadas com a mistura de transfecção por 6 horas, após as quais o meio era substituído por DMEM completo. Experimentos subsequentes foram realizados 48 horas após a transfecção.
Resumidamente, o RNA celular total foi extraído usando reagente TRIzol. O RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando o PrimeScript RT Master Mix. A PCR quantitativa foi realizada usando qPCR TB Green. β-actina foi usada como gene de referência interno para a normalização da expressão. Experimentos biológicos foram realizados em triplicado. As sequências de primer e a sequência siS100P podem ser encontradas em um estudo anterior 11.
As células NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 e BXPC2 foram obtidas conforme listado na Tabela de Materiais. Todas as linhagens celulares passaram por identificação celular e testes de micoplasma.
Durante os experimentos, todas as células foram liberadas por 3 a 5 gerações. Todas as células foram cultivadas em DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina–estreptomicina.
O ensaio de formação da colônia foi realizado conforme descrito em um estudoanterior 12. Brevemente, 1.000 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços e cultivadas por 10 dias antes do fim do experimento. As células foram fixadas com 4% de paraformaldeído, coradas com 0,1% de violeta cristalino, e as colônias foram contadas usando ImageJ.
Análise de Genes Comuns Com Base em Dados de SCRNA-seq
Os dados de scRNA-seq dos conjuntos de dados IBD (GSE214695), CRC (GSE166555) e PAAD (GSE154778) foram pré-processados conforme descrito em estudosanteriores 8,13. Matrizes de contagem bruta foram colapsadas pela expressão média para símbolos duplicados de genes usando limma:avereps. A filtragem inicial reteve genes detectados em pelo menos três células e células contendo pelo menos 50 transcritos únicos. Células com fração de transcrito mitocondrial >5% ou menos de 50 genes detectados foram removidas. A normalização logarítmica foi realizada com um fator de escala de 10.000, seguida por transformação estabilizadora de variância para identificar os 1.500 genes mais variáveis que foram padronizados com escore Z antes da análise de componentes principais (PCA). Genes marcadores definidores de clusters foram filtrados usandologaritarítmic 2 (variação de duplicação) > 0,5, fração de detecção ≥0,25 em clusters-alvo e um valor P ajustado <0,05.
Brevemente, o pré-processamento de dados foi realizado usando o pacote Seurat, e a anotação de tipo de célula foi realizada usando o pacote SingleR (versão 2.6.0). O clustering de células foi realizado em Seurat usando construção de grafos k-vizinhos mais próximos e embedding t-SNE baseado nas dimensões PCA 1–20. A distribuição e os níveis de expressão dos genes comuns entre diferentes tipos celulares foram então examinados.
Construção do Modelo IBD
De acordo com estudos anteriores, 14 lipopolissacarídeos (LPS) foram usados para induzir inflamação em células epiteliais do cólon humano normais (FHC e NCM460), gerando assim um modelo de DII que imita inflamação. Experimentos biológicos foram realizados em triplicado. As células eram rotineiramente cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2. Quando a confluência celular atingiu aproximadamente 50%–70%, o meio de cultivo foi substituído por meio fresco e completo, e as células foram tratadas com 10 ng/mL LPS por 12 horas. Um volume igual de soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) foi usado como controle do veículo. O volume de cultura era de 2 mL por poço em placas de 6 poços. Após o tratamento, o meio era removido, as células eram lavadas duas vezes com PBS estéril pré-resfriado e as células eram coletadas para análises subsequentes.
Análise estatística
Todas as análises de bioinformática foram realizadas usando o software R (versão 4.1.2). Comparações entre dois grupos foram realizadas usando o teste t de Student, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram realizadas usando análise unidirecional da variância (ANOVA). A análise de correlação foi realizada usando o método Spearman. Todos os experimentos celulares foram repetidos pelo menos três vezes, e os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). Um valor P ou FDR < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. NS, não significativo; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**) e P < 0,001 (***).
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DEGs em IBD, CRC e PAAD
Primeiro, as coortes de DII (GSE179285 e GSE24287), coortes de CRC (TCGA-CRC e GSE87211) e coortes PAAD (GSE128735 e GSE62452) foram integradas, e a integração foi avaliada usando PCA e gráficos de densidade de expressão gênica. Os resultados mostraram que os efeitos em lote entre os diferentes conjuntos de dados foram efetivamente eliminados após a integração (Figura 1A–F).
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Estudos anteriores destacaram a associação da DII, um distúrbio gastrointestinal imunológico, com várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas17, esclerosemúltipla 18, esclerose lateralamiotrófica 19, endometriose20, artrite reumatoide2, linfomade Hodgkin 21, CRC22 e PAA23. A DII geralmente ...
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Conflito de Interesses:
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Os autores reconhecem o apoio financeiro do Plano Nacional de P&D da China (Subsídio nº 2023YFB3210400).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
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