Esse protocolo integra conjuntos de dados públicos de transcrição e validação de células epiteliais do cólon para identificar o S100P como um biomarcador compartilhado associado à doença inflamatória intestinal, câncer colorretal e adenocarcinoma pancreático.
Artigo de investigação
S100P como Biomarcador Compartilhado em Doença Inflamatória Intestinal, Câncer Colorretal e Adenocarcinoma Pancreático: Uma Análise Transcriptômica Integrada
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença inflamatória intestinal (DII) está associada a um risco aumentado de câncer colorretal (CCR) e adenocarcinoma pancreático (PAAD), mas as características moleculares compartilhadas entre essas doenças permanecem incompletamente compreendidas. Este estudo teve como objetivo identificar genes comuns e vias biológicas associadas à DII, CCR e PAAD por meio de análise transcriptômica integrada e validação experimental. Conjuntos de dados de expressão gênica para IBD, CRC e PAAD foram obtidos a partir dos bancos de dados The Cancer Genome Atlas e Gene Expression Omnibus. Foram realizadas análises de redes de coexpressão gênica ponderadas e análises diferenciais de expressão para identificar genes associados e compartilhados à doença. Gene Ontology e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (análises foram usadas para explorar funções e vias biológicas enriquecidas. A infiltração de células imunes foi avaliada usando Identificação de Tipo Celular por Estimativa de Subconjuntos Relativos de Transcritos de RNA. Foi realizada a análise das características operacionais do receptor para avaliar o desempenho diagnóstico dos genes comuns. A análise de sequenciamento de RNA de célula única foi realizada para examinar a distribuição celular do S100P. Além disso, os efeitos da regulação negativa do S100P foram avaliados em células epiteliais do cólon estimuladas por lipopolissacarídeos (LPS). Foram identificados um total de 162 genes associados à doença e quatro genes comuns. Análises de enriquecimento funcional indicaram um enriquecimento significativo de vias relacionadas ao sistema imunológico e inflamatório, incluindo a via de sinalização da interleucina-17. A análise de infiltração imune revelou tendências semelhantes em várias populações de células imunes entre DII, CRC e PAAD. A análise de célula única mostrou expressão elevada de S100P em células epiteliais das três doenças. A regulação para baixo do S100P restaurou a capacidade proliferativa das células epiteliais do cólon estimuladas por LPS e reduziu a expressão de citocinas inflamatórias. A análise transcriptômica integrada identificou o S100P como biomarcador associado à DII, CRC e PAAD, destacando características imunológicas compartilhadas entre essas doenças.
Introdução
A doença inflamatória intestinal (DII) representa um espectro de distúrbios imunológicos que afetam o trato gastrointestinal, incluindo colite ulcerativa e doença deCrohn 1. A etiologia da DII é altamente complexa, envolvendo anormalidades imunes mucosas, disbiose e suscetibilidadegenética 2. A DII é uma preocupação global de saúde, com taxas crescentes de incidência e cargas econômicas substanciais, e sua prevalência crescente tem atraído considerávelatenção 1. Importante destacar que pacientes com DII têm um risco significativamente aumentado de desenvolver câncer colorretal (CRC)3 e adenocarcinoma pancreático (PAAD)4. Embora essa associação tenha sido bem documentada, a intercomunicação genética entre DII, CRC e PAAD permanece incompletamente compreendida.
Estudos anteriores sugerem fortemente que DII, CRC e PAAD compartilham processos patogênicos comuns; no entanto, biomarcadores diagnósticos específicos e sensíveis ainda faltam, e os mecanismos patogênicos compartilhados não foram totalmente elucidados. Felizmente, com o rápido avanço e a ampla disponibilidade de tecnologias de sequenciamento de alta produtividade, inúmeros conjuntos de dados transcriptômicos de pacientes com DII, CRC e PAAD tornaram-se publicamente disponíveis, permitindo uma investigação sistemática das interconexões moleculares entre essasdoenças 2,5,6.
Este estudo utilizou dados de sequenciamento de alto rendimento de pacientes com DII, CRC e PAAD para identificar genes associados à doença e compartilhados usando análise ponderada de redes de coexpressão gênica (WGCNA) e análise diferencial de expressão. Esses genes foram investigados posteriormente para identificar possíveis vias de sinalização compartilhada entre DII, CRC e PAAD. Além disso, avaliamos o valor diagnóstico desses genes comuns. A análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) demonstrou que o gene-chave S100P foi predominantemente expresso em células epiteliais. Por fim, investigamos o papel biológico do S100P na DII.
Em conclusão, este estudo teve como objetivo identificar biomarcadores diagnósticos comuns e vias biológicas associadas à DII, CCR e PAAD, fornecendo assim valiosos insights clínicos sobre a prevenção e o tratamento compartilhados dessas doenças.
Protocolo
Este estudo utilizou conjuntos de dados públicos e desidentificados do The Cancer Genome Atlas (TCGA) e do Gene Expression Omnibus (GEO), além de linhas celulares comerciais estabelecidas. Nenhum participante humano recém-recrutado, informações identificáveis do paciente ou amostras derivadas do paciente foram envolvidas. Todas as análises foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais relevantes e os termos de uso dos bancos de dados públicos. Portanto, não foram necessárias aprovações éticas institucionais adicionais nem consentimento informado para este estudo.
Fonte de Dados
Os dados RNA-seq para as coortes IBD (GSE179285; plataforma: GPL6480 e GSE24287; plataforma: GPL6480), coortes CRC (TCGA-CRC; plataforma: Illumina HiSeq 2000 e GSE87211; plataforma: GPL13497) e coortes PAAD (GSE128735; plataforma: GPL20301 e GSE62452; plataforma: GPL6244) foram baixados da TCGA e da GEO. Todos os conjuntos de dados foram acessados em 5 de dezembro de 2025.
Para cada conjunto de dados, as amostras foram estritamente divididas em dois subgrupos, com os tecidos da lesão/tumor da doença servindo como grupo de casos e os tecidos normais não lesionais correspondentes como grupo controle. Especificamente, a coorte de DII continha 297 amostras de mucosa intestinal de pacientes com DII e 56 amostras de mucosa intestinal normal de indivíduos saudáveis; a coorte CRC incluiu 841 tecidos tumorais colorretais primários e 211 tecidos epiteliais colorretais normais adjacentes correspondentes; e a coorte de PAAD consistia em 114 tecidos tumorais de PAAD e 106 tecidos parênquimatos pancreáticos normais.
Todos os conjuntos de dados dentro da mesma categoria de doença foram integrados de forma uniforme. A função normalizeBetweenArrays do pacote limma foi aplicada para realizar normalização de quantis entre amostras, eliminando efetivamente efeitos de lote entre plataformas e padronizando valores de expressão gênica em diferentes conjuntos de dados para análises diferenciais subsequentes.
Triagem de genes relacionados à DII, CRC e PAAD e genes comuns
Primeiro, genes diferencialmente expressos (DEGs) foram triados das coortes IBD, CRC e PAAD usando o pacote limma, e os valores P originais foram corrigidos usando o método da taxa de falsa descoberta (FDR) de Benjamini-Hochberg. Nas coortes IBD, CRC e PAAD, os critérios de triagem foram definidos em |logFC| > 0,4 e P < 0,05. Além disso, WGCNA foi realizada em todos os genes, com um limiar mínimo de módulo de 100 (potência soft-threshold = 0,90; tipo de rede = assinado). Consequentemente, DEGs comuns e genes módulos foram identificados entre as três coortes. Genes consistentemente identificados por ambos os métodos foram definidos como genes comuns, enquanto os genes restantes foram categorizados como genes relacionados.
IBP e Análise de Enriquecimento Funcional
Essas análises foram realizadas nos genes associados à doença. A análise de interação proteína-proteína (IBP) foi realizada usando o banco de dados STRING (escoragem de interação > 0,40). A análise de enriquecimento funcional incluiu análises da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), que foram realizadas usando o clusterProfiler, enrichplot e org. Hs.eg.db pacotes (P < 0,05 e valor q ajustado FDR [método Benjamini–Hochberg] < 0,05).
Perfilamento do Microambiente Imunológico
O CIBERSORT é um algoritmo confiável para estimar os níveis de infiltração de células imunes a partir de dados de expressão gênica usando a matriz padrão de assinaturaLM22 7. Neste estudo, o algoritmo CIBERSORT foi usado para estimar a extensão da infiltração de células imunes em amostras das coortes de DII, CRC e PAAD, a fim de explorar as características compartilhadas do microambiente imune entre as três doenças. A análise foi realizada com 1.000 permutações para calcular valores P para cada amostra, e a normalização de quantil (QN = TRUE) foi aplicada ao arquivo de expressão da mistura. Apenas amostras com valor CIBERSORT P < 0,05 foram mantidas para análises subsequentes, garantindo a confiabilidade dos resultados da deconvolução.
Avaliação do Valor Diagnóstico dos Genes Comuns
O valor diagnóstico dos genes comuns nas coortes IBD, CRC e PAAD foi avaliado usando análise de características operacionais do receptor (ROC) com o pacote pROC em R. A troca ótima entre sensibilidade e especificidade foi visualizada usando curvas ROC.
qRT-PCR, Transfecção Celular e Ensaio de Formação de Colônias
qRT-PCR e transfecção celular foram realizadas de acordo comestudos anteriores 8,9,10. A transfecção transitória foi realizada usando o reagente de transfecção jetPRIME (Polyplus, China) conforme as instruções do fabricante. As células eram incubadas com a mistura de transfecção por 6 horas, após as quais o meio era substituído por DMEM completo. Experimentos subsequentes foram realizados 48 horas após a transfecção.
Resumidamente, o RNA celular total foi extraído usando reagente TRIzol. O RNA foi transcrito reversamente em cDNA usando o PrimeScript RT Master Mix. A PCR quantitativa foi realizada usando qPCR TB Green. β-actina foi usada como gene de referência interno para a normalização da expressão. Experimentos biológicos foram realizados em triplicado. As sequências de primer e a sequência siS100P podem ser encontradas em um estudo anterior 11.
As células NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 e BXPC2 foram obtidas conforme listado na Tabela de Materiais. Todas as linhagens celulares passaram por identificação celular e testes de micoplasma.
Durante os experimentos, todas as células foram liberadas por 3 a 5 gerações. Todas as células foram cultivadas em DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina–estreptomicina.
O ensaio de formação da colônia foi realizado conforme descrito em um estudoanterior 12. Brevemente, 1.000 células foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços e cultivadas por 10 dias antes do fim do experimento. As células foram fixadas com 4% de paraformaldeído, coradas com 0,1% de violeta cristalino, e as colônias foram contadas usando ImageJ.
Análise de Genes Comuns Com Base em Dados de SCRNA-seq
Os dados de scRNA-seq dos conjuntos de dados IBD (GSE214695), CRC (GSE166555) e PAAD (GSE154778) foram pré-processados conforme descrito em estudosanteriores 8,13. Matrizes de contagem bruta foram colapsadas pela expressão média para símbolos duplicados de genes usando limma:avereps. A filtragem inicial reteve genes detectados em pelo menos três células e células contendo pelo menos 50 transcritos únicos. Células com fração de transcrito mitocondrial >5% ou menos de 50 genes detectados foram removidas. A normalização logarítmica foi realizada com um fator de escala de 10.000, seguida por transformação estabilizadora de variância para identificar os 1.500 genes mais variáveis que foram padronizados com escore Z antes da análise de componentes principais (PCA). Genes marcadores definidores de clusters foram filtrados usandologaritarítmic 2 (variação de duplicação) > 0,5, fração de detecção ≥0,25 em clusters-alvo e um valor P ajustado <0,05.
Brevemente, o pré-processamento de dados foi realizado usando o pacote Seurat, e a anotação de tipo de célula foi realizada usando o pacote SingleR (versão 2.6.0). O clustering de células foi realizado em Seurat usando construção de grafos k-vizinhos mais próximos e embedding t-SNE baseado nas dimensões PCA 1–20. A distribuição e os níveis de expressão dos genes comuns entre diferentes tipos celulares foram então examinados.
Construção do Modelo IBD
De acordo com estudos anteriores, 14 lipopolissacarídeos (LPS) foram usados para induzir inflamação em células epiteliais do cólon humano normais (FHC e NCM460), gerando assim um modelo de DII que imita inflamação. Experimentos biológicos foram realizados em triplicado. As células eram rotineiramente cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2. Quando a confluência celular atingiu aproximadamente 50%–70%, o meio de cultivo foi substituído por meio fresco e completo, e as células foram tratadas com 10 ng/mL LPS por 12 horas. Um volume igual de soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) foi usado como controle do veículo. O volume de cultura era de 2 mL por poço em placas de 6 poços. Após o tratamento, o meio era removido, as células eram lavadas duas vezes com PBS estéril pré-resfriado e as células eram coletadas para análises subsequentes.
Análise estatística
Todas as análises de bioinformática foram realizadas usando o software R (versão 4.1.2). Comparações entre dois grupos foram realizadas usando o teste t de Student, enquanto comparações entre múltiplos grupos foram realizadas usando análise unidirecional da variância (ANOVA). A análise de correlação foi realizada usando o método Spearman. Todos os experimentos celulares foram repetidos pelo menos três vezes, e os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (DS). Um valor P ou FDR < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. NS, não significativo; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**) e P < 0,001 (***).
Resultados
DEGs em IBD, CRC e PAAD
Primeiro, as coortes de DII (GSE179285 e GSE24287), coortes de CRC (TCGA-CRC e GSE87211) e coortes PAAD (GSE128735 e GSE62452) foram integradas, e a integração foi avaliada usando PCA e gráficos de densidade de expressão gênica. Os resultados mostraram que os efeitos em lote entre os diferentes conjuntos de dados foram efetivamente eliminados após a integração (Figura 1A–F).
Figura 1. Normalização das coortes de doença inflamatória intestinal (DII), câncer colorretal (CCR) e adenocarcinoma pancreático (PAAD). (A) A análise de componentes principais (PCA) traça gráficos antes e depois da normalização das coortes de DII (GSE179285 e GSE24287). (B) Gráficos de distribuição de expressão gênica antes e depois da normalização das coortes de DII. (C) Gráficos PCA antes e depois da normalização das coortes de CRC (TCGA-CRC e GSE87211). (D) Gráficos de distribuição de expressão gênica antes e depois da normalização das coortes de CRC. (E) Gráficos PCA antes e depois da normalização das coortes PAAD (GSE62452 e GSE128735). (F) Gráficos de distribuição de expressão gênica antes e depois da normalização das coortes PAAD. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Após a integração do conjunto de dados e a correção do efeito em lote, foi realizada análise diferencial de expressão nas coortes IBD, CRC e PAAD. Dentro de cada coorte, lesão da doença ou tecidos tumorais foram comparados com tecidos normais pareados para identificar DEGs. Na coorte de DII, foram identificados 183 DEGs, incluindo 64 genes de regulação negativa e 119 genes de aumento (Figura 2A). Na coorte de CRC, foram identificados 5.064 DEGs, incluindo 2.477 genes com regulação negativa e 2.587 genes com regulação para cima (Figura 2B). Na coorte da PAAD, foram identificados 2.293 DEGs, incluindo 901 genes com regulação negativa e 1.392 genes com regulação positiva (Figura 2C). No total, 40 DEGs sobrepostos foram identificados entre as coortes de DII, CRC e PAAD (Figura 2D).
Figura 2. Análise diferencial de expressão de coortes de DII, CCR e PAAD. (A) Mapa de calor e gráfico vulcânico dos genes diferencialmente expressos (DEGs) na coorte da DII. (B) Mapa de calor e gráfico de vulcões dos DEGs na coorte do CRC. (C) Mapa de calor e gráfico vulcânico dos DEGs na coorte PAAD. (D) Diagrama de Venn mostrando DEGs sobrepostos entre as coortes IBD, CRC e PAAD. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
WGCNA em IBD, CRC e PAAD
A WGCNA foi realizada nas coortes IBD, CRC e PAAD. Na coorte de DII, três módulos foram identificados como estando intimamente associados a características clínicas, sendo que os módulos MEbrown e MEturquesa apresentaram as correlações mais fortes (Figura 3A). De forma semelhante, na coorte de CRC, oito módulos foram identificados como estando intimamente associados a características clínicas, sendo que os módulos MEbrown e MEturquoise apresentaram as correlações mais fortes (Figura 3B). Na coorte da PAAD, um módulo foi identificado como estando intimamente associado a características clínicas, com os módulos MEblack e MEbrown apresentando as correlações mais fortes (Figura 3C).
Figura 3. Análise ponderada da rede de coexpressão gênica (WGCNA) das coortes de DII, CRC e PAAD. (A) Mapa de calor mostrando correlações entre módulos de coexpressão gênica e características clínicas na coorte da DII. (B) Mapa de calor mostrando correlações entre módulos de coexpressão gênica e características clínicas na coorte CRC. (C) Mapa de calor mostrando correlações entre módulos de co-expressão gênica e características clínicas na coorte PAAD. (D) Diagrama de Venn mostrando genes sobrepostos identificados a partir de módulos-chave de coexpressão nas coortes IBD, CRC e PAAD. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Com base em genes de módulos significativamente correlacionados com características clínicas, foram identificados 434 genes associados a módulos potencialmente envolvidos em DII, CCR e PAAD (Figura 3D).
Análise de Enriquecimento Funcional de Genes Comuns em DII, CRC e PAAD
Combinando os resultados da análise de expressão diferencial e o WGCNA, foram identificados 40 DEGs comuns e 122 genes associados a módulos comuns. Para investigar as características moleculares compartilhadas da DII, CRC e PAAD, esses genes foram integrados para análises posteriores, resultando em 158 genes associados à doença.
Primeiro, os 158 genes foram analisados usando o banco de dados STRING para construir uma rede PPI (Figura 4A). Posteriormente, foram realizadas análises de enriquecimento GO e KEGG. A análise GO revelou enriquecimento significativo em processos biológicos, incluindo o metabolismo hormonal (Figuras 4B,C), enquanto a análise KEGG mostrou enriquecimento em vias como a via de sinalização da interleucina-17 (IL-17) e a via de sinalização do receptor ativado pelo proliferador de peroxissomos (PPAR) (Figura 4D,E).
Figura 4. Análise de enriquecimento funcional de genes associados à doença identificados em DII, CCR e PAAD. (A) Rede de interação proteína-proteína (PPI) de genes associados a doenças. (B) Análise de enriquecimento por Ontologia Gênica (GO) apresentada como um gráfico de pontos de processos biológicos enriquecidos, componentes celulares e termos de função molecular. (C) Rede gene–conceito GO mostrando as relações entre termos GO enriquecidos e genes associados. (D) Análise de enriquecimento de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) apresentada como um gráfico de pontos. (E) Rede gene–via KEGG mostrando as relações entre vias enriquecidas e genes associados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Análise de Correlação de Genes Comuns com Infiltração de Células Imunes em DII, CRC e PAAD
O CIBERSORT foi usado para estimar os níveis de infiltração de células imunológicas nas coortes de DII, CRC e PAAD. Na coorte de DII, foram observadas diferenças nos níveis de infiltração de células imunes entre amostras normais e de DII (Figura 5A), e foram avaliadas correlações entre genes comuns e populações de células imunes (Figura 5B). De forma semelhante, foram observadas diferenças nos níveis de infiltração de células imunes entre amostras normais e de CRC na coorte de CRC (Figura 5C), e foram avaliadas correlações entre genes comuns e populações de células imunes (Figura 5D). Na coorte de PAAD, também foram observadas diferenças nos níveis de infiltração de células imunes entre amostras normais e de PAAD (Figura 5E), e foram avaliadas correlações entre genes comuns e populações de células imunes (Figura 5F).
Figura 5. Análise de infiltração de células imunes em coortes de DII, CRC e PAAD. (A) Gráficos de violino mostrando as proporções estimadas de populações de células imunes na coorte da DII. (B) Análise de correlação entre genes comuns e populações de células imunes na coorte de DII, incluindo o mapa de calor de correlação das células imunes e a rede de associação gene–célula imune. (C) Gráficos de violino mostrando as proporções estimadas de populações de células imunes na coorte de CRC. (D) Análise de correlação entre genes comuns e populações de células imunes na coorte de CRC, incluindo o mapa de calor de correlação das células imunes e a rede de associação gene–célula imune. (E) Gráficos de violino mostrando as proporções estimadas das populações de células imunes na coorte do PAAD. (F) Análise de correlação entre genes comuns e populações de células imunes na coorte PAAD, incluindo o mapa de calor de correlação celular imune e a rede de associação gene–célula imune. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Avaliação do Valor Potencial de Genes Comuns em DII, CRC e PAAD
Os padrões de expressão dos genes comuns foram avaliados posteriormente nas coortes de DII, CRC e PAAD. O S100P foi consistentemente superexpresso em todas as três coortes (Figuras 6A, D, G). Além disso, o desempenho diagnóstico dos genes comuns foi avaliado por meio da análise ROC.
Figura 6. Desempenho diagnóstico de genes comuns em coortes de DII, CCR e PAAD. (A) Níveis de expressão de FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 na coorte de DII. (B) Curvas de características operacionais do receptor (ROC) que mostram o desempenho diagnóstico de genes comuns individuais na coorte da DII. (C) Curva ROC mostrando o desempenho diagnóstico do modelo diagnóstico combinado na coorte da DII. (D) Níveis de expressão de FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 na coorte CRC. (E) Curvas ROC que mostram o desempenho diagnóstico de genes comuns individuais na coorte CRC. (F) Curva ROC mostrando o desempenho diagnóstico do modelo diagnóstico combinado na coorte de CRC. (G) Níveis de expressão de FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 na coorte PAAD. (H) Curvas ROC que mostram o desempenho diagnóstico de genes comuns individuais na coorte PAAD. (I) Curva ROC mostrando o desempenho diagnóstico do modelo diagnóstico combinado na coorte PAAD. Os valores da área sob a curva (AUC) e os intervalos de confiança correspondentes de 95% são mostrados quando aplicável. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Na coorte de DII, os valores da área sob a curva (AUC) foram 0,626 para FXYD3, 0,597 para S100P, 0,670 para PLA2G2A e 0,697 para MUC1, enquanto o modelo diagnóstico combinado apresentou um AUC de 0,815 (Figura 6B,C). De forma semelhante, na coorte CRC, os valores de AUC foram 0,839 para FXYD3, 0,738 para S100P, 0,716 para PLA2G2A e 0,672 para MUC1, enquanto o modelo diagnóstico combinado apresentou um AUC de 0,925 (Figura 6E,F). Na coorte PAAD, os valores de AUC foram 0,852 para FXYD3, 0,896 para S100P, 0,637 para PLA2G2A e 0,733 para MUC1, enquanto o modelo diagnóstico combinado apresentou um AUC de 0,901 (Figura 6H,I).
Análise de scRNA-seq baseada em genes comuns
Após o pré-processamento dos dados scRNA-seq do conjunto de dados de IBD, foram identificados 17 clusters celulares e 8 tipos celulares. A distribuição dos genes comuns entre diferentes populações celulares foi então avaliada, e os genes comuns foram predominantemente expressos em células epiteliais (Figura 7A). De forma semelhante, o pré-processamento do conjunto de dados CRC identificou 20 clusters celulares e 8 tipos celulares, com os genes comuns também predominantemente expressos em células epiteliais (Figura 7B). Por fim, o pré-processamento do conjunto de dados PAAD identificou 19 clusters celulares e 7 tipos celulares, e os genes comuns também foram predominantemente expressos em células epiteliais (Figura 7C).
Figura 7. Análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) de genes comuns em tecidos de DII, CCR e PAAD. (A) Visualização de aproximação e projeção de variedades uniformes (UMAP) de agrupamentos celulares no conjunto de dados IBD (GSE214695), anotações correspondentes de tipos celulares e gráficos de características mostrando a expressão de FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 entre populações celulares. (B) visualização UMAP de clusters celulares no conjunto de dados CRC (GSE166555), anotações correspondentes de tipos celulares e gráficos de características mostrando a expressão de FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 entre populações celulares. (C) Visualização UMAP de clusters celulares no conjunto de dados PAAD (GSE154778), anotações correspondentes de tipos celulares e gráficos de características mostrando a expressão de FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 entre populações celulares. Escalas de cor indicam níveis relativos de expressão gênica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Função biológica do S100P na DII
Dada a superexpressão consistente de S100P nas coortes de DII, CRC e PAAD, juntamente com relatórios anteriores que descrevem seu papel na CRC ePAAD 15,16, este estudo investigou ainda mais a função biológica de S100P na DII.
Primeiro, a expressão de S100P foi significativamente aumentada no modelo de DII induzida por LPS, e a eficiência de knockdown de siS100P foi confirmada (Figura 8A,B). Além disso, o tratamento com LPS reduziu a proliferação celular, enquanto a inibição da expressão de S100P restaurou parcialmente a proliferação celular (Figura 8C). Além disso, o knockdown do S100P reduziu significativamente a expressão de IL-1β, IL-6 e TNF-α nas linhas celulares modelo de DII FHC e NCM460 (Figuras 8D,E). Por fim, a regulação negativa de S100P reduziu a expressão de IL17RA em células epiteliais do cólon, células CRC e células PAAD (Figura 8F).
Figura 8. A regulação negativa do S100P atenua as respostas inflamatórias induzidas por lipopolissacarídeos (LPS) em células epiteliais do cólon. (A) Expressão relativa de mRNA S100P em células FHC após estimulação LPS e knockdown de S100P. (B) Expressão relativa de mRNA S100P em células NCM460 após estimulação LPS e knockdown de S100P. (C) Imagens representativas de formação de colônias e quantificação da proliferação celular em células FHC e NCM460 após estimulação LPS e knockdown de S100P. (D) Medição ELISA dos níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α em células FHC após estimulação LPS e knockdown de S100P. (E) Medição ELISA dos níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α em células NCM460 após estimulação LPS e knockdown de S100P. (F) Expressão relativa de IL-17RA após a redução de S100P em células FHC, NCM460, HCT116, SW1116, PANC-1 e BxPC-3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Disponibilidade de Dados
Os conjuntos de dados analisados durante o estudo atual estão publicamente disponíveis na TCGA e no repositório GEO sob os números de acesso TCGA-CRC, GSE179285, GSE24287, GSE87211, GSE128735, GSE62452, GSE214695, GSE166555 e GSE154778. Nenhum novo conjunto de dados de sequenciamento foi gerado durante este estudo.
Discussão
Estudos anteriores destacaram a associação da DII, um distúrbio gastrointestinal imunológico, com várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas17, esclerosemúltipla 18, esclerose lateralamiotrófica 19, endometriose20, artrite reumatoide2, linfomade Hodgkin 21, CRC22 e PAA23. A DII geralmente é considerada como aumentando o risco de desenvolver tanto CRC24 quantoPAAD 23. Embora associações epidemiológicas entre essas doenças tenham sido relatadas, suas características moleculares compartilhadas permanecem incompletamente compreendidas. Neste estudo, integramos conjuntos de dados transcriptômicos em massa, dados de scRNA-seq e experimentos funcionais celulares para investigar características moleculares compartilhadas entre DII, CRC e PAAD. Nossas descobertas fornecem insights adicionais sobre possíveis características moleculares e imunológicas compartilhadas entre esses contextos de doença.
Neste estudo, identificamos 158 genes associados à doença por meio de análise de expressão diferencial e WGCNA, compreendendo 40 DEGs comuns e 122 genes associados a módulos comuns. A análise de enriquecimento funcional demonstrou enriquecimento significativo de vias, incluindo a via de sinalização IL-17. Estudos anteriores relataram papéis importantes para a sinalização da IL-17 na progressão da DII, CRC ePAAD 25,26,27. Essas observações sugerem que processos relacionados à IL-17 podem representar uma característica biológica comum entre essas doenças. No entanto, o presente estudo não investigou diretamente a relação mecanicista entre a sinalização S100P e IL-17, e estudos funcionais adicionais são necessários para esclarecer essa associação. Quatro genes comuns (FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1) foram identificados nos conjuntos de dados analisados. Estudos anteriores demonstraram que FXYD3 regula o crescimento das célulasPAAD 28, S100P foi implicado na progressão de CRC ePAAD 15,16, e MUC1 participa da progressão de DII, CRC ePAAD 29,30,31. Em contraste, PLA2G2A tem sido menos extensivamente investigada em todas as três doenças. A análise ROC demonstrou que cada um dos quatro genes apresentou desempenho diagnóstico mensurável, enquanto o modelo diagnóstico combinado alcançou desempenho diagnóstico maior do que os genes individuais. Nossas descobertas, portanto, estendem observações anteriores ao identificar esses genes como características moleculares compartilhadas em DII, CRC e PAAD.
A análise de infiltração de células imunes demonstrou padrões de infiltração semelhantes para células B naïves, células natural killer (NK) em repouso e macrófagos M0 nas coortes IBD, CRC e PAAD. Além disso, a análise scRNA-seq mostrou que FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 foram predominantemente expressos em células epiteliais. Essas descobertas fornecem informações adicionais sobre a distribuição celular dos genes identificados e sua possível associação com características relacionadas ao sistema imunológico. No entanto, as análises atuais não estabelecem interações diretas entre células epiteliais e o microambiente imunológico, sendo necessários estudos mecanicistas adicionais.
Por fim, investigamos o papel biológico do S100P em um modelo de DII que imita inflamação induzida por LPS. A expressão de S100P aumentou significativamente após a estimulação do LPS, e o knockdown mediado por siRNA reduziu efetivamente sua expressão. Nas condições experimentais examinadas, o knockdown do S100P restaurou parcialmente a proliferação celular e reduziu a expressão das citocinas inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α. Além disso, a regulação para baixo do S100P estava associada à redução da expressão de IL17RA. Esses achados apoiam investigações adicionais do S100P em respostas celulares relacionadas à inflamação.
Este estudo apresenta várias limitações. Primeiro, apenas experimentos de perda de função foram realizados, e experimentos de superexpressão ou resgate não foram realizados; portanto, não pode ser estabelecido um papel causal direto do S100P. Segundo, a expressão de S100P foi avaliada principalmente no nível de mRNA, e a validação em nível proteico não foi realizada. Terceiro, os experimentos funcionais foram limitados a um modelo celular que imita inflamação, enquanto os modelos de CRC e PAAD não foram investigados experimentalmente. Por fim, embora análises multiômicas tenham fortalecido a identificação de características moleculares compartilhadas, estudos mecanicistas adicionais e validação in vivo são necessários para esclarecer ainda mais os papéis biológicos do S100P e dos outros genes compartilhados.
Em conclusão, este estudo identificou características moleculares compartilhadas, vias biológicas e características imunológicas relacionadas entre DII, CCR e PAAD. Quatro genes comuns (FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1) demonstraram potencial diagnóstico em todos os conjuntos de dados analisados, e o S100P foi investigado mais profundamente em um modelo de DII que imita inflamação. Essas descobertas fornecem uma base para estudos futuros que investiguem os mecanismos moleculares compartilhados que ligam a DII, a CCR e a PAAD.
Divulgações
Conflito de Interesses:
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio financeiro do Plano Nacional de P&D da China (Subsídio nº 2023YFB3210400).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
Referências
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