Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo murino de asma alérgica (AA) induzida por ovoalbumina (OVA) para avaliar os mecanismos terapêuticos da Terapia de Aplicação de Medicamento no Ponto de Acupuntura Kechuanting (KAST) sobre a inflamação das vias aéreas do tipo 2, por meio da modulação das células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) pulmonares pela via do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP)/proteína 1 modificadora da atividade do receptor (RAMP1).
Artigo de investigação
A Terapia de Adesão ao Ponto de Acupuntura Kechuanting Alivia a Inflamação das Vias Aéreas do Tipo 2 em Camundongos com Asma Alérgica ao Modular o Número de ILC2s
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A Terapia de Aplicação no Ponto de Acupuntura Kechuanting (KAST) demonstrou melhorar efetivamente a inflamação das vias aéreas em pacientes com asma alérgica (AA); no entanto, seus mecanismos subjacentes permanecem pouco claros. Este estudo teve como objetivo investigar os mecanismos terapêuticos da KAST em um modelo murino de AA sob uma perspectiva neuroimunológica. Um modelo murino de asma alérgica induzida por ovoalbumina (OVA) foi estabelecido, e os camundongos foram tratados com KAST. Os efeitos da KAST sobre as células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) pulmonares e a inflamação tipo 2 das vias aéreas foram avaliados por citometria de fluxo, coloração com hematoxilina-eosina (HE) e imuno-histoquímica. O nível proteico do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) nos tecidos pulmonares foi avaliado por meio de western blotting (WB) e ELISA. A administração intranasal de CGRP ou do inibidor do receptor de CGRP BIBN-4096 foi realizada em camundongos com asma alérgica para investigar o papel regulador da via CGRP/proteína modificadora da atividade do receptor 1 (RAMP1) sobre as ILC2s e a inflamação tipo 2 das vias aéreas. A KAST reduziu o número de ILC2s e aliviou a inflamação tipo 2 das vias aéreas, acompanhada pela diminuição da expressão de CGRP nos tecidos pulmonares. A administração intranasal de CGRP aumentou as ILC2s RAMP1+ e o total de ILC2s nos pulmões e agravou a inflamação tipo 2 das vias aéreas. Por outro lado, a administração intranasal de BIBN-4096 reduziu as ILC2s pulmonares e atenuou a inflamação tipo 2 das vias aéreas. A KAST reduz a inflamação das vias aéreas na asma alérgica, o que está fortemente associado à downregulação da via CGRP/RAMP1 e à subsequente supressão das ILC2s pulmonares, conforme comprovado por inibição farmacológica.
Introdução
A asma alérgica (AA) é o fenótipo de asma mais comum, correspondendo a 60–80% de todos os casos de asma na China1. Caracteriza-se por alta prevalência e controle subótimo da doença, o que prejudica gravemente a qualidade de vida dos pacientes e impõe significativa carga econômica2,3,4,5. Embora os corticosteroides inalatórios (ICS) permaneçam o pilar do tratamento clínico6, alguns pacientes apresentam resposta limitada, e o uso prolongado está frequentemente associado a efeitos adversos e à incapacidade de interromper a progressão da doença7. Assim, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas novas, seguras e eficazes continua sendo uma prioridade tanto nos contextos clínicos quanto de pesquisa. A Terapia de Aplicação em Ponto de Acupuntura Kechuanting (KAST), uma aplicação externa da medicina tradicional chinesa, libera compostos ativos por via transdérmica, o que potencialmente evita o efeito de primeira passagem hepático e minimiza reações adversas sistêmicas8,9. Estudos clínicos demonstraram que a KAST pode aliviar os sintomas da asma, restaurar parcialmente a função pulmonar e melhorar a qualidade de vida dos pacientes10,11,12. Paralelamente, estudos de metabolômica sérica, farmacologia de rede e modelos animais de asma sugerem que a KAST atenua a inflamação das vias aéreas por meio da redução dos níveis séricos e do lavado broncoalveolar (BALF) de mediadores inflamatórios, incluindo a downregulação da expressão de IgE, IL-4 e IL-139,13,14. Em conjunto, esses achados fornecem evidências de apoio à eficácia terapêutica da KAST na asma. No entanto, seus mecanismos de ação precisos permanecem obscuros.
Um mecanismo patológico central que impulsiona a recorrência da AA é a inflamação das vias aéreas do tipo 2, na qual as células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s) desempenham um papel fundamental15. Após estimulação por alérgenos, as ILC2s secretam citocinas como IL-5 e IL-13, promovendo assim a inflamação das vias aéreas16,17. Estudos demonstraram que a eliminação das ILC2s alivia significativamente a inflamação das vias aéreas em camundongos asmáticos, destacando seu papel central na progressão da doença18. Notavelmente, a ativação e a função das ILC2s são rigorosamente reguladas por múltiplos mecanismos, sendo as interações neuroimunes um foco crescente de atenção nos últimos anos. Evidências recentes indicam que o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) pode se ligar à proteína modificadora da atividade do receptor 1 (RAMP1) na superfície das ILC2s, induzindo sua ativação e subsequente liberação de citocinas do tipo 2, o que agrava a inflamação das vias aéreas na AA19,20,21. No presente estudo, nossa triagem de RNA-sequenciamento em alto rendimento (RNA-seq) identificou o CGRP como um neuropeptídio criticamente responsivo, fortemente modulado pela intervenção com KAST. Portanto, focando na via CGRP/RAMP1, utilizamos o KAST como intervenção em camundongos com AA para investigar seus possíveis mecanismos na modulação da atividade das ILC2s e no alívio da inflamação das vias aéreas do tipo 2.
Protocolo
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelas Academias Nacionais de Ciências. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (número de aprovação: 2023DW-059-01). Uma lista abrangente de todos os materiais, reagentes, ferramentas e softwares utilizados neste estudo está detalhada na Tabela de Materiais.
Animais experimentais e agrupamento
Camundongos fêmeas saudáveis da linhagem BALB/c (grau SPF, com 8–10 semanas de idade) foram obtidos do Centro de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (licença nº SYXK (Su) 2018-0049). Os animais foram mantidos em condições padrão, com ciclo claro/escuro de 12 h, à temperatura de 24–26 °C. Ração e água esterilizadas foram fornecidas ad libitum, a cama foi substituída regularmente e as gaiolas foram limpas rotineiramente. Após 7 dias de adaptação, os camundongos foram aleatoriamente divididos em seis grupos (n = 7/grupo): grupo Normal, grupo modelo, grupo CGRP, grupo BIBN-4096, grupo KAST e grupo KAST + CGRP. Os animais foram alocados aleatoriamente aos grupos utilizando uma tabela de números aleatórios gerada por computador. A alocação dos grupos foi mantida em sigilo em relação aos pesquisadores até que as intervenções fossem atribuídas. Para otimizar o uso dos tecidos, amostras pulmonares da coorte randomizada (n = 7 por grupo) foram sistematicamente alocadas a diferentes rotas de processamento, com os tamanhos exatos das amostras analisadas (n = 5, 4 ou 3) para ensaios histológicos e moleculares específicos indicados explicitamente nas respectivas legendas das figuras. Nenhum dado foi excluído da análise.
Preparação da formulação KAST
A formulação foi preparada pelo Departamento de Farmácia do Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing22. Foram utilizadas nove ervas medicinais chinesas tradicionais: Semen Brassicae (2 partes), Rhizoma Corydalis (2 partes), Radix Kansui processada com vinagre (1 parte), Asarum (1 parte), Ephedra (1 parte), Semen Lepidii (1 parte), Cravo (1 parte), Casca de canela (1 parte) e Gleditsia sinensis (1 parte). Cada erva foi moída em pó fino e peneirada em uma peneira de 80 malhas. Para cada 100 g de pó misturado, foram adicionados 70 mL de suco fresco de gengibre e 30 mL de parafina líquida, misturados completamente e processados em aplicações de 0,3 g ± 5%, com diâmetro de 0,5 cm. Especificamente, todos os ingredientes herbais e o gengibre fresco foram autenticados pelo Farmacêutico-Chefe Lin-gang Zhao e armazenados a 4 °C em ambiente escuro e seco antes do uso9. Para garantir a reprodutibilidade da intervenção e a estabilidade entre diferentes lotes, foi implementado um rigoroso padrão de controle de qualidade com base nos métodos UPLC-Q-TOF-MS e HPLC estabelecidos por nossa equipe, confirmando a presença constante de marcadores ativos principais, como a tiorcianato de sinapina23. Na prática, as aplicações de 0,5 cm foram fixadas com fita adesiva médica respirável hipoalergênica de 2,5 cm × 5,5 cm para assegurar uma entrega transdérmica ideal.
Estabelecimento do modelo murino de AA
O modelo de AA foi induzido de acordo com um protocolo estabelecido na literatura, utilizando sensibilização com OVA e desafio intranasal24. Exceto o grupo Normal, todos os camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de 200 µL de solução salina contendo 100 µg de OVA e 2 mg de hidróxido de alumínio nos dias 0 e 12. Dos dias 18 a 23, os camundongos foram desafiados intranasalmente uma vez ao dia com 50 µg de OVA em 50 µL de solução salina. Dos dias 24 a 53, o OVA foi administrado intranasalmente a cada dois dias. No dia 54, após pesar os camundongos, a eutanásia foi realizada por dislocação cervical e os tecidos foram coletados. Posteriormente, o coeficiente pulmonar foi determinado dividindo-se o peso total dos pulmões pelo peso corporal.
Intervenções
Dos dias 40 a 53, os camundongos do grupo KAST e do grupo KAST + CGRP tiveram a região dorsal (3 cm × 6 cm) raspada. Patches foram aplicados sobre os pontos acupunturais bilaterais Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) e Shenshu (BL23), fixados com fita adesiva durante 1,5 h, uma vez ao dia, por 14 dias consecutivos. Os camundongos dos grupos CGRP e KAST + CGRP receberam administração intranasal de 10 µL de solução de Calcitonina/CALCA (1 pg/µL) em dias alternados, do dia 40 ao 53. Os camundongos do grupo BIBN-4096 receberam administração intranasal de 10 µL de solução de BIBN-4096 (0,3 mg/mL, antagonista do receptor de CGRP) em dias alternados. Os grupos normal e modelo receberam alimentação padrão sem intervenção. O KAST foi administrado do dia 40 ao dia 53, após o estabelecimento da inflamação das vias aéreas alérgica (iniciado no dia 40, ou seja, 22 dias após o primeiro desafio com OVA no dia 18). Assim, o KAST neste estudo atuou como uma intervenção terapêutica e não profilática.
Para a preparação da pele, a remoção de pelos na região dorsal designada foi realizada com uma tesoura elétrica. A localização dos pontos de acupuntura seguiu rigorosamente a nomenclatura e localização padrão dos pontos de acupuntura para animais de laboratório – Parte 3: Camundongos (T/CAAM 0002-2020), publicada pela Sociedade Chinesa de Acupuntura e Moxabustão. Os quatro pares de pontos dorsais bilaterais foram marcados com precisão e definidos da seguinte forma: Feishu (B13: entre as costelas abaixo do processo espinhoso da 3ª vértebra torácica, 3 mm lateral à linha média posterior), Geshu (B17: abaixo do processo espinhoso da 7ª vértebra torácica, 3 mm lateral à linha média), Pishu (B20: abaixo do processo espinhoso da 12ª vértebra torácica, 3 mm lateral à linha média) e Shenshu (B23: abaixo do processo espinhoso da 2ª vértebra lombar, 3 mm lateral à linha média). A fita 3M foi firmemente enrolada para garantir uma adesão estável, evitando qualquer deslocamento do curativo ou erosão cutânea secundária durante o período de retenção de 1,5 h.
As doses de CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL por camundongo) e BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL por camundongo) foram selecionadas com base em estudos publicados25. Especificamente, para a intervenção com CGRP, uma solução de BSA a 0,1% foi preparada dissolvendo-se 1 mg de BSA em 1 mL de ddH2O, seguido de vortex para obter uma concentração final de 1 mg/mL. Antes da reconstituição, o pó liofilizado da proteína Calcitonin/CALCA foi centrifugado a 12.000 × g durante 30 s a 4 °C. Em seguida, adicionaram-se 20 µL da solução de BSA a 0,1% preparada para obter uma solução estoque de 1 µg/µL. O frasco foi invertido suavemente várias vezes (sem vortex), centrifugado por alguns segundos e deixado em temperatura ambiente por vários minutos para garantir a completa reconstituição da proteína. Para preparar a solução de trabalho de 1 pg/µL sem gerar um volume de diluição única inviável, foi realizada uma diluição seriada padrão em dois passos: 1 µL da solução estoque de 1 µg/µL foi primeiramente diluído em 999 µL de solução salina estéril para formular uma solução intermediária de 1 ng/µL, e então 1 µL dessa solução intermediária foi misturado com mais 999 µL de solução salina estéril para obter a solução de trabalho final de 1 pg/µL. A solução de trabalho foi mantida a 4 °C, enquanto as alíquotas restantes foram armazenadas a -20 °C por até 2–3 meses. Para o grupo BIBN-4096, 1 mg do pó de BIBN-4096 foi dissolvido em 333 µL de ddH2O para obter uma solução estoque de 3 mg/mL, a qual foi fracionada em alíquotas de 50 µL por frasco e armazenada a -80 °C. Para preparar a solução de trabalho de 0,3 mg/mL, cada alíquota de 50 µL da solução estoque foi completamente misturada com 450 µL de solução salina estéril. Dos dias 40 a 53, um volume de 10 µL da solução de CGRP a 1 pg/µL ou da solução de BIBN-4096 a 0,3 mg/mL foi administrado intranasalmente a cada camundongo a cada dois dias, sob contenção suave e sem anestesia.
Medidas de desfecho e métodos de detecção
Teste comportamental
No dia 53, após o desafio intranasal final, as frequências de episódios de coceira nasal e espirros foram monitoradas e registradas usando um sistema de vídeo digital durante um período de 10 min. As frequências de comportamento nos vídeos foram contadas independentemente por dois pesquisadores de maneira duplo-cega. Em casos de discrepância significativa entre as contagens, um terceiro pesquisador reavaliou o vídeo, e os dados com maior consistência foram finalmente selecionados para análise estatística.
Teste de provocação brônquica
Dentro de 24 h após o desafio final, a resposta das vias aéreas foi avaliada usando acetilcolina (ACh) nebulizada nas concentrações de 0, 5, 10, 20 e 40 mg/mL (300 µL por concentração, nebulizado por 1 min). Os valores de pausa aprimorada (Penh), um índice adimensional utilizado para indicar empiricamente a constrição das vias aéreas e avaliar a hiperreatividade das vias aéreas (AHR), foram registrados durante 5 min após cada nebulização por meio de plestimografia de corpo inteiro não invasiva. Os camundongos foram aclimatados à câmara por 10 min antes do registro. O Penh foi calculado automaticamente usando o software do sistema integrado de armazenamento/transmissão em tempo real, de acordo com a fórmula empírica que equilibra o tempo expiratório/inspiratório e os fluxos máximos.
Histopatologia (coloração HE)
Tecidos pulmonares fixados em paraformaldeído 4% foram desidratados por meio de uma série de álcool em gradiente, clarificados em xilol e emblocados em parafina usando um processador automatizado. Os blocos foram cortados com espessura de 4 µm, flutuados em banho-maria a 42 °C e montados em lâminas de vidro. As lâminas foram incubadas a 80 °C por 2 h e secas durante a noite antes de serem resfriadas à temperatura ambiente. Para coloração, as seções foram desparafinizadas em xilol (I e II, 20 min cada), reidratadas por meio de uma série de etanol em gradiente (100% I/II e 75%, 5 min cada) e lavadas com água da torneira. As lâminas foram coradas com hematoxilina por 3–5 min, diferenciadas com álcool ácido 1% e realçadas em solução azuladora. Após a lavagem, as seções foram desidratadas com etanol 85% e 95% (5 min cada) e contracoradas com eosina por 5 min. Por fim, as lâminas foram desidratadas em etanol absoluto (I, II e III, 5 min cada), clarificadas em xilol (I e II, 5 min cada), montadas com bálsamo neutro e secas ao ar. As imagens foram capturadas de campos aleatórios em aumento de 200× utilizando microscópio óptico e o sistema CaseViewer. A inflamação pulmonar e o espessamento epitelial foram classificados cegamente em uma escala de 0 a 4: 0, ausência de inflamação; 1, células inflamatórias ocasionais; 2, poucos focos inflamatórios (<3); 3, múltiplos focos inflamatórios (≥3); 4, infiltração difusa por todo o pulmão. O espessamento epitelial foi pontuado como: 0, normal; 1, espessamento visível; 2, espessamento parcial das vias aéreas; 3, obstrução quase completa; 4, ausência de estrutura normal. Para cada grupo experimental, um total de 20 campos microscópicos aleatórios foram analisados e avaliados para obtenção das pontuações histopatológicas brutas. Os dados de cada quatro campos foram médias para gerar um único ponto de dado independente, resultando em um tamanho final de amostra de n = 5 réplicas por grupo para análise estatística. A pontuação foi realizada de maneira cega.
Sequenciamento de RNA
O RNA total foi extraído de tecidos pulmonares de camundongos utilizando o reagente TRIzol, conforme o protocolo do fabricante. A pureza, concentração e integridade do RNA foram avaliadas utilizando um espectrofotômetro e uma plataforma baseada em microfluídica. As bibliotecas do transcriptoma foram construídas utilizando um kit comercial de preparação de bibliotecas e sequenciadas em uma plataforma de sequenciamento de alto rendimento para gerar leituras pareadas de 150 pb. Os dados brutos foram submetidos a controle de qualidade utilizando software apropriado de filtragem para obter leituras limpas, as quais foram mapeadas para o genoma de referência utilizando uma ferramenta de alinhamento sensível a splicing. Os níveis de expressão gênica foram calculados como FPKM, e as contagens de leituras foram compiladas por meio de uma ferramenta de contagem de leituras. A análise de expressão diferencial foi realizada utilizando um pacote estatístico especializado, com limiares definidos em |log2 Razão de Expressão| ≥ 1 e p ajustado < 0,05.
ELISA
Tecidos pulmonares frescos de camundongo foram pesados com precisão e homogeneizados em tampão PBS numa proporção rigorosa de 20 mg de tecido para 200 µL de tampão. Os homogeneizados foram centrifugados a aproximadamente 13.400 × g durante 10 min a 4 °C para obter os sobrenadantes proteicos. Para normalização, o teor bruto de proteína dos sobrenadantes foi calibrado utilizando o método de BCA. O procedimento de ELISA foi realizado em triplicata técnica utilizando kits comerciais, conforme o protocolo do fabricante. Resumidamente, 50 µL de diluições padrão ou 50 µL de amostras pré-diluídas (10 µL de amostra proteica misturados com 40 µL de diluente da amostra, obtendo uma diluição final de 5 vezes) foram adicionados às placas de 96 poços revestidas com anticorpo. As placas foram seladas e incubadas a 37 °C por 30 min. Após cinco lavagens com tampão de lavagem diluído 1:30, 50 µL do reagente conjugado ligado à enzima foram adicionados a cada poço (exceto aos poços em branco), e a mistura foi incubada a 37 °C por 30 min. Após mais cinco lavagens, 50 µL da solução cromogênica A e 50 µL da solução cromogênica B foram adicionados a cada poço, e a placa foi incubada ao abrigo da luz a 37 °C por 10 min. A reação foi interrompida pela adição de 50 µL da solução de parada, que alterou a cor de azul para amarelo. A absorbância (valor de OD) de cada poço foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas dentro de 15 min. Curvas padrão foram traçadas utilizando um modelo de regressão logística de quatro parâmetros ou regressão linear (garantindo R2 > 0,99), a partir das quais as concentrações das proteínas-alvo nos homogeneizados de tecido pulmonar foram calculadas.
Citometria de fluxo
Os tecidos pulmonares foram ressecados, picados e digeridos em 5 mL de RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 50 µL de Liberase TM e 5 µL de DNase I a 37 °C por 45 min com agitação a 80 rpm. A suspensão digerida foi filtrada através de uma peneira celular de 400 malhas e centrifugada a 300 × g por 10 min a 4 °C. O pellet foi ressuspenso em 2 mL de tampão de lise de eritrócitos por 10 min à temperatura ambiente, no escuro. Após a lavagem, as células foram ressuspensas e coradas com Ghost Dye Red 780 (1,25 µL por amostra) por 20 min a 4 °C no escuro para exclusão de células mortas. Após nova lavagem, as células foram bloqueadas com 10 µL de Reagente Bloqueador de FcR por 10 min a 4 °C. Em seguida, as células foram coradas na superfície com os seguintes anticorpos conjugados a fluorocromos por 30 min a 4 °C: FITC anti-murino CD45 (0,5 µL), PE anti-murino/humano KLRG1 (1,25 µL), BB700 rato anti-murino CD90.2 (0,5 µL) e uma mistura de linhagem biotinilada contendo anti-murino CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (todos 0,5 µL cada) e anti-murino CD19 (2 µL). Após a lavagem, as células foram incubadas com Streptavidina Brilliant Violet 605 (2 µL) por 30 min a 4 °C. Os dados foram adquiridos em uma plataforma de citometria de fluxo BD e analisados usando o software FlowJo. As matrizes de compensação de derramamento de fluorescência foram monitoradas e ajustadas automaticamente pelo software calibrado do instrumento. A estratégia hierárquica de seleção para identificação de ILC2s pulmonares foi implementada sequencialmente da seguinte forma: primeiramente, os linfócitos totais foram isolados com base na morfologia de dispersão dianteira/lateral (FSC-A/SSC-A), seguido pela discriminação de dupletos por meio do gate de células singulares (FSC-H/FSC-A). Células viáveis foram subsequentemente identificadas pela exclusão de células mortas (Ghost Dye-) e, então, gates padrão foram progressivamente aplicados para selecionar as populações CD45+ e Lineage-. Dentro da janela de seleção viável CD45+ Lineage-, os ILC2s pulmonares foram explicitamente definidos e quantificados com base nos clusters positivos subsequentes em cascata sequencial de CD90.2+ e KLRG1+.
Imunofluorescência (IF)
Cortes congelados de pulmão foram descongelados à temperatura ambiente por 15–30 min e lavados três vezes com PBST (PBS contendo 0,05% de Tween-20) durante 6 min cada para remover o composto OCT. Após a remoção do líquido em excesso, uma barreira hidrofóbica foi desenhada ao redor do tecido usando uma caneta para imunohistoquímica. Os cortes foram incubados em um tampão de bloqueio e permeabilização contendo 0,3% de Triton X-100 e 5% de soro de cabra a 37 °C por 100 min, seguido de incubação prolongada (16–20 h) a 4 °C com o anticorpo primário. No dia seguinte, os cortes foram equilibrados à temperatura ambiente por 30 min, lavados três vezes com PBST e incubados com um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo, compatível com a espécie, a 37 °C no escuro por 60–90 min. Após mais três lavagens com PBST, os núcleos foram contra-coloridos com DAPI (diluído 1:1 ou 2:1 em PBS) por 8 min à temperatura ambiente no escuro. Após uma última rodada de lavagens com PBST (3 × 6 min), os cortes foram montados com um meio de montagem antidesvanecimento, selados para evitar a formação de bolhas e armazenados no escuro. As imagens foram capturadas usando um microscópio confocal com aumento de 400×. O número de células positivas por campo foi contado manualmente utilizando o software Leica LAS X. Para cada grupo experimental, um total de 15 campos microscópicos aleatórios foram analisados para obter as contagens brutas de células. Os dados de cada três campos foram médios para gerar um único ponto de dado independente, resultando em um tamanho final de amostra de n = 5 réplicas por grupo para análise estatística. A contagem foi realizada de maneira cega.
Imunohistoquímica (IHC)
As seções de parafina foram desparafinizadas em três mudanças de xilol (15 min cada), reidratadas em uma série gradiente de etanol (100% duas vezes, 85% e 75%; 5 min cada) e lavadas com água destilada. A recuperação de antígenos foi realizada em tampão citrato (pH 6,0) utilizando uma panela de pressão (3 min em alta pressão após fervura), seguida de resfriamento e três lavagens de 5 min em PBS (pH 7,4). A peroxidase endógena foi bloqueada com H2O2 a 3% por 15 min à temperatura ambiente, no escuro. Após a lavagem, as seções foram circundadas com uma caneta hidrofóbica e bloqueadas com soro de cabra a 3% por 30 min. Em seguida, as seções foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários diluídos em PBS: anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) ou anti-IL-13 (1:150). No dia seguinte, as seções foram lavadas e incubadas com anticorpos secundários conjugados à HRP (anti-murino para IL-4; anti-coelho para IL-5 e IL-13) por 50 min à temperatura ambiente. Os sinais foram visualizados usando uma solução de DAB recém-preparada sob controle microscópico e interrompidos com água da torneira. Por fim, as seções foram contracoradas com hematoxilina, diferenciadas, azuladas, desidratadas em álcoois e xilol em concentrações crescentes e montadas com bálsamo neutro para exame microscópico. A densidade óptica média (IOD/Área) foi quantificada utilizando uma plataforma de software de análise de imagem em aumento de 200×. Para cada grupo experimental, um total de 15 campos microscópicos aleatórios foram registrados para obtenção dos valores brutos. Os dados de cada três campos foram médios para gerar um único ponto de dado independente, resultando em um tamanho final de amostra de n = 5 réplicas por grupo para análise estatística. A pontuação foi realizada por dois observadores cegos.
Western blot (WB)
Para o preparo da amostra, tecidos pulmonares de camundongos (aproximadamente 30 mg) foram finamente picados e homogeneizados em 300 µL de tampão de lise RIPA pré-resfriado, suplementado com 1% de coquetel de inibidores de protease/fosfatase. A homogeneização foi realizada usando um homogeneizador de tecidos a 60 Hz por quatro ciclos (60 s por ciclo). Os lisados foram então centrifugados a aproximadamente 13.400 × g por 15 min a 4 °C para coletar o sobrenadante. As concentrações totais de proteína foram determinadas por meio de um kit padrão de ensaio de proteína BCA. As amostras foram então normalizadas, misturadas com tampão de carregamento 5x na proporção volumétrica de 4:1 e desnaturadas a 95 °C por 7 min. Para eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), amostras de proteína (20 µg por poço) foram carregadas ao lado de um marcador de peso molecular de proteína pré-estainado, separadas a uma voltagem constante de 80 V por 20 min e, em seguida, ajustadas para 120 V por 70 min. As proteínas foram então transferidas por eletrotransferência úmida para membranas de PVDF de 0,22 µm sob corrente constante de 300 mA por 120 min em banho de gelo. As membranas foram bloqueadas com BSA a 5% em TBST por 1 h à temperatura ambiente e incubadas durante a noite (até 18 h) a 4 °C com anticorpos primários contra CGRP (1:500) e GAPDH (1:2000). Após três lavagens com TBST (10 min cada), as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rábano silvestre (1:10000) por 1–2 h à temperatura ambiente. Após mais três lavagens, as bandas proteicas foram visualizadas utilizando um substrato quimioluminescente aprimorado (ECL) em um sistema de imagem VILBER Fusion FX. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o ImageJ 1.8, e a expressão da proteína-alvo foi normalizada em relação ao controle interno GAPDH.
Análise estatística
Todos os dados experimentais são expressos como média ± desvio padrão (DP). A análise dos dados e a elaboração de gráficos estatísticos foram realizadas utilizando uma plataforma estatística especializada. Antes das comparações entre grupos, os conjuntos de dados foram sistematicamente submetidos a testes de normalidade. Para dados com distribuição normal e variâncias homogêneas, foi aplicada a análise de variância (ANOVA) unidirecional ou bidirecional ordinária, seguida dos testes post hoc de Tukey, Šídák, Holm-Šídák ou LSD de Fisher para comparações múltiplas aos pares. Ao comparar múltiplos grupos com um único grupo controle, foi utilizado o teste de Dunnett. Para conjuntos de dados com variâncias heterogêneas, foi empregada a ANOVA de Brown-Forsythe, seguida do teste post hoc de Dunnett T3. Para conjuntos de dados que não seguiram a normalidade, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, seguido do teste post hoc de Dunn para comparações múltiplas. Um valor de P < 0,05 foi considerado indicativo de diferenças estatisticamente significativas. Os diferentes níveis de significância são indicados dinamicamente como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001. Todas as avaliações dos resultados experimentais, incluindo pontuação histológica, análise de citometria de fluxo e quantificação de imagens, foram realizadas de maneira rigorosamente cega.
Resultados
KAST reduz ILC2s pulmonares e atenua a inflamação das vias aéreas do tipo 2
Para investigar os efeitos terapêuticos do KAST, foi estabelecido um modelo de camundongo com asma alérgica induzida por OVA e tratado com adesivos aplicados nos pontos de acupuntura Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) e Shenshu (BL23) (Figura 1A). Após a indução do modelo, os camundongos com asma alérgica apresentaram redução do peso corporal, enquanto os camundongos tratados com KAST exibiram aumento significativo do peso corporal em comparação com o grupo modelo (Figura 1B). O coeficiente pulmonar, um indicador de inflamação pulmonar, estava elevado nos camundongos com asma alérgica, mas foi acentuadamente reduzido após o tratamento com KAST (Figura 1C). Avaliações comportamentais revelaram aumento de coceira nasal e espirros nos camundongos com asma alérgica, os quais foram significativamente aliviados pelo KAST (Figura 1D–E). A pletismografia de corpo inteiro demonstrou que os valores de Penh, indicativos de hiperreatividade das vias aéreas, estavam elevados nos camundongos com asma alérgica, mas diminuíram após o tratamento, sugerindo melhora da função pulmonar (Figura 1F). A análise histopatológica com coloração HE revelou infiltração de células inflamatórias peribronquiais e perialveolares no grupo modelo em comparação com os controles normais. Em contraste, a infiltração inflamatória foi reduzida no grupo tratado com KAST (Figura 2A–B). A imuno-histoquímica mostrou que IL-4, IL-5 e IL-13 estavam principalmente localizadas no citoplasma das células inflamatórias infiltradas e em algumas células epiteliais, com possível acúmulo nos espaços intersticiais. Em comparação com os controles normais, o grupo modelo exibiu sinais positivos e valores de densidade óptica média acentuadamente aumentados, os quais foram significativamente reduzidos no grupo KAST (Figura 2C–H). A citometria de fluxo demonstrou ainda que o número de ILC2 estava significativamente aumentado nos pulmões dos camundongos com asma alérgica em comparação com os controles normais, enquanto o KAST reduziu acentuadamente as contagens de ILC2 (Figura 2I–J).
KAST atenua a inflamação de via aérea do tipo 2 por meio da supressão do eixo CGRP/RAMP1
A hiperativação das ILC2 é regulada por múltiplos fatores. A análise de RNA-seq revelou que a expressão de CGRP foi significativamente aumentada em camundongos com AA, e o KAST reduziu acentuadamente os níveis pulmonares de CGRP (Figura 3A). O Western blot e o ELISA confirmaram níveis elevados de proteína CGRP no grupo modelo em comparação com os controles, os quais foram reduzidos pelo KAST (Figura 3B–D). Esses resultados sugerem que o KAST atenua a expressão de CGRP nos pulmões de camundongos com AA, modulando assim as respostas imunes das ILC2. Em conjunto, essas variações na sequenciação de alto rendimento e na triagem proteica sugerem uma forte associação entre a intervenção terapêutica com KAST e a redução dos níveis pulmonares de CGRP em camundongos com AA.
Para explorar mais a fundo o papel do CGRP, camundongos AA foram tratados com CGRP exógeno, com o antagonista do receptor de CGRP BIBN-4096 ou com KAST combinado com CGRP. Os resultados de ELISA mostraram níveis significativamente reduzidos de proteína de CGRP nos grupos KAST e BIBN-4096, níveis elevados no grupo CGRP e níveis mais altos no grupo KAST + CGRP em comparação com KAST isolado (Figura 4A). A citometria de fluxo revelou que o número de ILC2 foi reduzido nos grupos KAST e BIBN-4096, mas aumentado nos grupos CGRP e KAST + CGRP em relação ao grupo modelo (Figura 4B–C). A coloração com HE mostrou infiltração reduzida de células inflamatórias ao redor das vias aéreas e alvéolos nos grupos KAST e BIBN-4096, enquanto a infiltração foi agravada nos grupos CGRP e KAST + CGRP (Figura 4D–E). O ELISA confirmou ainda níveis diminuídos de IL-4, IL-5 e IL-13 nos grupos KAST e BIBN-4096, mas níveis aumentados nos grupos CGRP e KAST + CGRP (Figura 4F–H).
O número de ILC2s pulmonares RAMP1+ILC2s entre diferentes grupos foi avaliado por meio de coloração de imunofluorescência multicolorida. Os resultados demonstraram que, em comparação com o grupo controle normal, o número de ILC2s RAMP1+ totais nos tecidos pulmonares do grupo modelo foi significativamente aumentado. Em comparação com o grupo modelo, o número de ILC2s pulmonares RAMP1+ aumentou ainda mais significativamente no grupo CGRP, enquanto foi acentuadamente reduzido nos grupos BIBN-4096 e KAST. Notavelmente, em comparação com o grupo KAST, o grupo KAST + CGRP exibiu um aumento significativo nas contagens de ILC2s pulmonares RAMP1+, indicando que a reposição exógena de CGRP revertiu com sucesso os efeitos inibitórios do KAST sobre as populações de ILC2s RAMP1+ totais (Figura 5A–B).
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os conjuntos completos de dados brutos gerados e analisados durante o presente estudo foram depositados em um repositório de acesso público. Especificamente, esses materiais abrangentes incluem todas as imagens completas e originais de membranas para ensaios de Western blot (WB), todas as imagens microscópicas completas, brutas e de alta resolução para histologia (HE e IHC) e ensaios de imunofluorescência (IF), bem como conjuntos de dados individuais de replicação e planilhas de quantificação em Excel. Todos os dados brutos estão disponíveis publicamente no seguinte DOI persistente: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. A ordem de seleção de eventos para citometria de fluxo está apresentada na Figura Suplementar 1. Duas imagens completas de blot foram enviadas como Figuras Suplementares 2–3, e os dados quantitativos foram enviados na Tabela Suplementar 1.
Figura 1: Efeitos do KAST sobre os sintomas e a função pulmonar em camundongos AA. (A) Protocolo para indução de asma alérgica utilizando OVA. (B) Estatísticas do peso corporal dos camundongos em cada grupo, n = 5. (C) Coeficiente pulmonar dos camundongos em cada grupo, n = 5. (D) Número de coçadas no nariz nos 10 minutos após o último desafio, n = 5. (E) Frequência de espirros nos 10 minutos após o último desafio, n = 5. (F) Valores de Penh dos camundongos em cada grupo após estimulação com diferentes concentrações de acetilcolina, n = 5. Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA unidirecional ou bidirecional, seguidas por teste post hoc de comparações múltiplas quando aplicável. n = réplicas biológicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Regulação do número de ILC2 e da inflamação tipo 2 das vias aéreas pelo KAST em camundongos AA. (A) Alterações morfológicas dos pulmões examinadas por coloração com HE. Barra de escala = 50 µm. Aumento: 200×. A pontuação de inflamação foi avaliada de forma cega. (B) Análise estatística das pontuações de inflamação entre diferentes grupos, n = 5. (C–H) Imagens representativas de IHC e valores médios de densidade óptica da expressão proteica de IL-4 (C, D), IL-5 (E, F) e IL-13 (G, H) nos tecidos pulmonares de diferentes grupos, n = 5. Barra de escala = 50 µm. Aumento: 200×. (I) Gráficos representativos de citometria de fluxo mostrando o último passo do gateamento de ILC2s pulmonares nos grupos Normal, Modelo e KAST. Células únicas viáveis foram selecionadas sequencialmente como CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), seguidas por CD90.2+, e os ILC2s pulmonares foram finalmente identificados pela expressão positiva de KLRG1+. Os dados foram adquiridos em uma plataforma de citometria de fluxo de alto desempenho e analisados utilizando um pacote especializado de software para análise de citometria de fluxo. (J) Análise de ILC2s indicada pela porcentagem de células CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ entre as células vivas, n = 5. Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA unidirecional seguida de testes apropriados de comparação múltipla pós-hoc. n = réplicas biológicas. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: O KAST inibe a expressão de CGRP nos tecidos pulmonares de camundongos AA. (A) Mapa térmico da expressão gênica entre diferentes grupos, n = 4. (B) Imagens representativas de WB de CGRP (10 kDa) e GAPDH (37 kDa) nos tecidos pulmonares de cada grupo. (C) Análise por WB da expressão proteica de CGRP nos tecidos pulmonares, apresentada como expressão relativa de CGRP (razão CGRP/GAPDH), n = 3. (D) Análise por ELISA da expressão proteica de CGRP nos tecidos pulmonares, n = 4. Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA unidirecional seguida por teste post hoc de comparações múltiplas. n = réplicas biológicas. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 4: Efeitos do KAST sobre os números de ILC2 e a inflamação aérea do tipo 2 por meio do CGRP em camundongos AA. (A) Análise por ELISA da expressão proteica de CGRP em tecidos pulmonares de diferentes grupos, n = 4. (B) Gráficos representativos de citometria de fluxo de ILC2s (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) em cada grupo. (C) Análise de ILC2s indicada pelo percentual de células CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ entre as células viáveis, n = 5. (D) Alterações morfológicas dos pulmões examinadas por coloração com HE. Barra de escala = 50 µm. Aumento: 200×. (E) Análise estatística dos escores de inflamação entre diferentes grupos, n = 5. (F–H) Análise por ELISA da expressão proteica de IL-4 (F), IL-5 (G) e IL-13 (H) em tecidos pulmonares de diferentes grupos, n = 4. Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA unidirecional seguida de testes apropriados de comparação múltipla post hoc. n = réplicas biológicas. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 5: Efeitos do KAST sobre os números de ILC2 nos tecidos pulmonares por meio da via CGRP/RAMP1. (A) Contagem de células de ILC2 RAMP1⁺ (definidas como células triplo-positivas KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) por campo de 400× nos tecidos pulmonares, n = 5. (B) Coloração fluorescente representativa dos tecidos pulmonares. Os núcleos foram corados com DAPI (azul) e a imuno-histoquímica foi realizada para KLRG1 (roxo), GATA3 (vermelho) e RAMP1 (verde). Barra de escala = 50 µm. Quantificação: contagem manual de ILC2 RAMP1⁺ (células KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) de forma cega utilizando uma plataforma especializada de análise de imagens. Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA unidirecional seguida por teste post hoc de comparações múltiplas. n = réplicas biológicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 1: Gráficos representativos de citometria de fluxo mostrando a estratégia sequencial de seleção para o isolamento de ILC2s pulmonares. Primeiro, os eventos totais foram selecionados usando dispersão para a frente (FSC-A) e dispersão lateral (SSC-A). Duplicatas foram excluídas por meio de FSC-A versus FSC-H para obter células singulares. Células vivas foram identificadas como Ghost Dye Red 780⁻ para eliminar populações de células mortas. Os leucócitos foram então selecionados com base em CD45⁺, seguido pela seleção de células negativas para marcadores de linhagem (Lin⁻). Dentro do subconjunto CD45⁺ Lin⁻, as células foram ainda selecionadas com base em CD90.2⁺, e os ILC2s pulmonares foram finalmente definidos pela expressão positiva de KLRG1 (KLRG1⁺).Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Imagem representativa de Western blot do referencial interno GAPDH (37 kDa) a partir de amostras de tecido pulmonar de camundongo. A densidade óptica integrada da banda foi quantificada pelo software ImageJ para posterior normalização.Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Imagem representativa de Western blot da proteína-alvo CGRP (10 kDa) de amostras de tecido pulmonar de camundongo. A expressão relativa de CGRP foi calculada dividindo a densidade óptica integrada das bandas de CGRP pelos valores correspondentes de densidade óptica integrada de GAPDH.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: Valores dos dados brutos. Valores dos dados brutos utilizados para gerar os gráficos.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O tratamento da AA enfrenta várias limitações, incluindo efeitos colaterais associados ao uso prolongado de medicamentos, controle incompleto dos sintomas e recorrências frequentes. Embora a farmacoterapia convencional seja eficaz, geralmente é acompanhada por desfechos adversos, como dependência de corticosteroides26,27. Em contraste, o KAST oferece uma alternativa segura, econômica e conveniente para o manejo da AA. Evidências clínicas demonstraram que o KAST pode aliviar efetivamente os sintomas da asma por meio da modulação da função imunológica pulmonar28. Neste estudo, demonstramos ainda que o KAST atenua a inflamação das vias aéreas do tipo 2 em camundongos com AA por meio da supressão da via CGRP/RAMP1 e da redução do número de ILC2s.
A imunidade inata, particularmente as ILC2s, desempenha um papel indispensável na iniciação, amplificação e manutenção da inflamação tipo 2 nas vias aéreas na AA29. Após a exposição ao alérgeno, as ILC2s respondem rapidamente aos alarminas derivados do epitélio, secretando grandes quantidades de IL-5 e IL-13 em poucas horas, desencadeando assim respostas inflamatórias tipo 230,31. Além disso, as ILC2s promovem a diferenciação de Th2 e a síntese de IgE, amplificando ainda mais as respostas imunes adaptativas e agravando a inflamação das vias aéreas32. Estudos demonstraram que a ablação genética das ILC2s reduz significativamente a duração da inflamação das vias aéreas em modelos de AA, destacando seu papel central na manutenção da inflamação tipo 218. As ILC2s são reguladas por citocinas (por exemplo, IL-25, IL-33, TSLP), mediadores inflamatórios (por exemplo, leucotrienos) e neuropeptídeos (por exemplo, CGRP, VIP, NMU)33. Dentre estes, os neuropeptídeos desempenham papéis fundamentais na regulação da imunidade inata. A neuromedina U (NMU) potencializa diretamente a atividade das ILC2s, induzindo rapidamente a liberação de IL-5 e IL-1334. O peptídeo intestinal vasoativo (VIP) contribui para a ingestão de nutrientes e a regulação circadiana, promovendo a produção de IL-5 pelas ILC2s e mantendo a homeostase dos eosinófilos33. O CGRP aumenta acentuadamente a liberação de IL-5 pelas ILC2s, promovendo assim a inflamação das vias aéreas na AA. Notavelmente, RAMP1, a subunidade do receptor para CGRP, é expressa em níveis muito mais altos nas ILC2s em comparação com os receptores para outros neuropeptídeos, sugerindo que o CGRP é o ligante mais potente para a ativação das ILC2s35. Neste estudo, a análise transcriptômica identificou o CGRP como um dos neuropeptídeos com maior diferença de expressão em camundongos com AA, e ensaios em nível proteico confirmaram sua superexpressão nos tecidos pulmonares. A administração exógena de CGRP aumentou ainda mais o número de ILC2s e a liberação de citocinas tipo 2, agravando a inflamação das vias aéreas.
Mecanicamente, o CGRP liga-se ao RAMP1 em ILC2s para regular suas respostas imunes downstream. Embora parte da literatura existente caracterize o CGRP como um regulador negativo que limita a expansão dos ILC2s para proteger contra hiperinflamação20,21, evidências contrárias indicam que o CGRP pode colaborar com alarminas para provocar robustamente a imunidade inata do grupo 2 em microambientes patológicos específicos. Nossos pontos experimentais alinham-se especificamente com essa cascata, demonstrando uma upregulação induzida pelo CGRP na infiltração pulmonar de ILC2s no microambiente alérgico induzido por OVA. Por outro lado, o bloqueio da via do CGRP com o antagonista do receptor BIBN-4096 atenua significativamente a inflamação das vias aéreas mediada por ILC2s. Em vez de fornecer evidência direta de ablação genética, nossos achados utilizam variações transcriptômicas associativas e experimentos paralelos de intervenção farmacológica (utilizando CGRP exógeno e o antagonista BIBN-4096) para demonstrar que a proteção terapêutica do KAST está fortemente correlacionada com a supressão dos aglomerados de sinalização CGRP/RAMP1 em ILC2s.
Apesar desses resultados promissores, várias limitações inerentes devem ser reconhecidas. Primeiramente, embora o modelo murino induzido por OVA forneça informações mecanicistas valiosas, ele pode não recapitular completamente a paisagem fisiopatológica e imunológica complexa da asma alérgica humana devido a diferenças entre espécies. Em segundo lugar, o tamanho relativamente pequeno da amostra em certos ensaios exploratórios indica que coortes maiores são necessárias para alcançar uma generalização estatística mais ampla. Terceiro, este estudo priorizou principalmente o eixo de sinalização CGRP/RAMP1/ILC2, o que significa que outras vias potencialmente relevantes de interação neuro-imune e redes sobrepostas de citocinas merecem uma exploração mais aprofundada no futuro. De modo particular, uma limitação técnica importante é a ausência de um grupo controle com ponto simulado dedicado, utilizando adesivos não medicados ou locais não acupunturais. Consequentemente, fatores de confusão não específicos—como o estresse mecânico causado pela depilação, manipulação experimental e a estimulação adesiva do próprio curativo—não podem ser totalmente isolados das propriedades terapêuticas específicas do KAST. Para resolver essas limitações, nossos futuros projetos de pesquisa incorporarão rigorosamente controles simulados bem delineados e validações de múltiplas vias, a fim de consolidar ainda mais a especificidade e reprodutibilidade desses achados. Em relação à redução observada nos níveis de proteína CGRP após a intervenção com BIBN-4096, é fundamental esclarecer que, embora o BIBN-4096 funcione principalmente como antagonista competitivo que atua no complexo receptor RAMP1/CRLR, e não como inibidor direto da síntese de CGRP, sua administração in vivo pode reduzir o acúmulo tecidual local do ligante. Esse fenômeno secundário provavelmente é mediado pela interrupção do circuito de retroalimentação positiva neuro-imune. Ao bloquear o RAMP1 em células imunes-alvo, como as ILC2s, o BIBN-4096 suprime a liberação downstream de citocinas efetoras, o que, por sua vez, diminui a ativação inflamatória retrógrada dos terminais nervosos sensoriais e das células pulmonares neuroendócrinas (PNECs), atenuando indiretamente a síntese e retenção tecidual de CGRP.
Em resumo, nossos achados empíricos demonstram que o KAST remodela efetivamente o microambiente imune inato pulmonar ao direcionar o eixo neural CGRP/RAMP1. Embora reconheçamos que a extrapolação clínica direta exija uma otimização cuidadosa devido às diferenças biológicas entre roedores e humanos, esses desfechos fornecem uma base mecanicista crítica, até então ausente, que corrobora a teoria tradicional "Fei Wai He Pi Mao" (o Pulmão combinando-se com a pele e os pelos). Ao oferecer uma perspectiva neuroimunológica refinada, este protocolo estabelece uma referência científica confiável para orientar e apoiar futuras traduções clínicas prospectivas e multicêntricas das terapias tradicionais de aplicação de ervas em pontos de acupuntura no manejo da asma alérgica.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82274632), Projeto de Formação de Líderes em Medicina Tradicional Chinesa da Província de Jiangsu (nº SLJ0309), Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (nº BK20231381), Projeto do Plano de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa da Província de Jiangsu (nº ZT202205) e Laboratório-Chave de Pesquisa de Acupuntura e Medicina do Ministério da Educação na Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (nº AML202304).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fita respirável médica 3M | 3M, EUA | 1530C | Fixação de curativo |
| Cloreto de acetilcolina | Sigma-Aldrich, EUA | A6625 | Provocação brônquica |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, EUA | G2939BA | Avaliação da qualidade e integridade do RNA |
| Alexa Fluor 488 anticorpo secundário caprino anti-coelho IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, EUA | (pedido personalizado) | Imunofluorescência (secundário) |
| Hidróxido de alumínio | Sigma-Aldrich, EUA | 239186 | Adjuvante |
| Anticorpo anti-CGRP (coelho) | Abcam, Reino Unido | ab81887 | Western blot / IF |
| Camundongo BALB/c (fêmea, SPF, 8–10 semanas, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | Modelo animal |
| BB700 rato anti-murino CD90.2 (clone 53-2.1) | BD Biosciences, EUA | 566465 | Citometria de fluxo |
| Citômetro de fluxo BD FACSCanto II | BD Biosciences, EUA | FACSCanto II | Citometria de fluxo |
| BIBN-4096 (Olcegepant hidrocloreto) | MedChemExpress LLC, EUA | HY-10095A | Antagonista do receptor CGRP |
| Coquetel de biotina para linhagem | BD Biosciences, EUA | (Personalizado, clones conforme descrito) | Citometria de fluxo |
| Streptavidina Brilliant Violet 605 | BD Biosciences, EUA | 563260 | Citometria de fluxo |
| Albumina BSA Fração V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Alemanha | 4240GR100 | Bloqueio |
| Proteína Calcitonina/CALCA | MedChemExpress LLC, EUA | HY-P77587 | Intervenção com CGRP |
| Anticorpo CD11c/ITGAX (coelho) | Abmart, Xangai, China | MU115408S | Imunofluorescência |
| Tampão de recuperação de antígeno citrato | Boster, China | AR0024 | Imunohistoquímica |
| Solução de coloração DAPI | Beyotime, Xangai, China | C1006 | Coloração nuclear |
| ddH2O (água bidestilada) | Sigma-Aldrich, EUA | 10977015 | Reconstituição proteica e dissolução de pós |
| DESeq2 | Bioconductor (pacote R) | Versão 1.42.0 | Software de análise de expressão diferencial |
| DNase I | Roche Diagnostics, Alemanha | 10104159001 | Digestão de tecido pulmonar |
| Anticorpo secundário jumento anti-murino IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, Reino Unido | ab150106 | Imunofluorescência (secundário) |
| Substrato ECL (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Quimioluminescência em Western blot |
| Kit aprimorado de ensaio de proteína BCA | Beyotime, Xangai, China | P0010 | Quantificação de proteína |
| Solução de coloração Eosina Y | Sigma-Aldrich, EUA | HT110216 | Histologia (coloração HE) |
| Etanol (absoluto, grau analítico) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | Desidratação tecidual e histologia |
| Anticorpo F4/80 (rato, clone C-7) | Santa Cruz Biotechnology, EUA | sc-377009 | Imunofluorescência |
| fastp | Código aberto (GitHub) | Versão 0.23.4 | Software de controle de qualidade de dados brutos de RNA-seq |
| FITC anti-murino CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences, EUA | 553080 | Citometria de fluxo |
| FlowJo | BD Biosciences, EUA | 10 | Análise de citometria de fluxo |
| Anticorpo monoclonal GAPDH (rato) | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Western blot |
| Anticorpo GATA3 (rato, clone L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, EUA | sc-268 | Imunofluorescência |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, EUA | 13-0865-T100 | Exclusão de células mortas |
| Anticorpo secundário caprino anti-coelho IgG (H+L) com adsorção cruzada | Thermo Fisher Scientific, EUA | A11008 | Imunofluorescência (secundário) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, EUA | 10.1.2 | Análise estatística |
| Solução de hematoxilina (Harris) | Sigma-Aldrich, EUA | HHS16 | Histologia (coloração HE) |
| HISAT2 | Universidade Johns Hopkins (Código aberto) | Versão 2.2.1 | Software de alinhamento ao genoma de referência de RNA-seq |
| Anticorpo secundário caprino anti-murino IgG (H+L) conjugado com HRP | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | Western blot (secundário) |
| Anticorpo secundário caprino anti-coelho IgG (H+L) conjugado com HRP | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Western blot (secundário) |
| HTSeq-count | EMBL (utilitário Python) | Versão 2.0.3 | Utilitário de contagem de leituras por característica genômica em RNA-seq |
| Peróxido de hidrogênio (H2O2, solução a 3%) | Sigma-Aldrich, EUA | H1009 | Bloqueio de peroxidase endógena |
| Anticorpo caprino anti-coelho IgG conjugado com iFluor™ 488 | Huabio, China | HA1121 | Imunofluorescência (secundário) |
| Anticorpo monoclonal IL-4 | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Western blot |
| Anticorpo IL13 | Affinity Biosciences, EUA | DF6813 | Western blot |
| Anticorpo IL5 | Affinity Biosciences, EUA | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, EUA | – | Sequenciamento de RNA |
| ImageJ | NIH, EUA | 1.8 | Quantificação de Western blot |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, EUA | Versão 6.0 | Quantificação da densidade óptica de imagens |
| Fórmula herbácea KAST | Departamento de Farmácia, Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing | – | Intervenção |
| Anticorpo monoclonal KLRG1 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, EUA | 58-5893-82 | Imunofluorescência |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Alemanha | 4.5 | Quantificação de imunofluorescência |
| Microscópio confocal Leica STELLARIS 8 DIVE | Leica Microsystems, Alemanha | STELLARIS 8 | Imagem de imunofluorescência |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Alemanha | 5401119001 | Digestão de tecido pulmonar |
| Marca-dor (escada de proteína pré-marcada) | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Western blot |
| Kit ELISA de CGRP murino | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ELISA |
| Kit ELISA de IL-13 murino | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ELISA |
| Kit ELISA de IL-4 murino | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ELISA |
| Kit ELISA de IL-5 murino | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ELISA |
| Meio de montagem com bálsamo neutro | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | Montagem de lâminas histológicas |
| Soro normal de cabra (para bloqueio) | Abcam, Reino Unido | ab7481 | Bloqueio em imunohistoquímica/IF |
| Composto de inclusão OCT | Sakura, EUA | 4583 | Inclusão para criosecção |
| Kit de preparação rápida de gel PAGE em um passo | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | Preparação de gel SDS-PAGE |
| Ovalbumina (OVA) | Sigma-Aldrich, EUA | A5503 | Sensibilização/desafio |
| Paraformaldeído (4% em PBS) | Biosharp, China | BL539A | Fixação tecidual |
| PE anti-murino/humano KLRG1 (clone 2F1) | BD Biosciences, EUA | 564022 | Citometria de fluxo |
| Cocktail de inibidor de fosfatase (50×) | Beyotime, Xangai, China | P1092 | Extração de proteína |
| Solução de poli-L-lisina | Boster, China | AR0003 | Revestimento de lâminas histológicas |
| Inibidor de protease e fosfatase | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | Extração de proteína |
| Membrana PVDF (0,22 μm) | Merck Millipore, EUA | ISEQ00010 | Western blot |
| Anticorpo policlonal RAMP1 (coelho) | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | Imunofluorescência |
| Tampão de lise de eritrócitos (RBC) | Beyotime, Xangai, China | C3702 | Preparação de amostra para citometria de fluxo |
| Tampão de lise RIPA (forte) | Beyotime, Xangai, China | P0013B | Extração de proteína |
| Meio RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific, EUA | 11875093 | Base para digestão celular tecidual |
| Meio de montagem antifade aprimorado SuperKine™ | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | Montagem para imunofluorescência |
| Triton X-100 (detergente) | Sigma-Aldrich, EUA | T8787 | Permeabilização para imunofluorescência |
| Reagente TRIzol | Thermo Fisher Scientific, EUA | 15596026 | Extração de RNA |
| Kit VAHTS Universal V10 para preparação de biblioteca de RNA-seq | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | Construção de biblioteca de RNA-seq |
| Sistema de pletismografia de corpo inteiro | Guangyuanda, Pequim, China | WBP-4 | Função pulmonar (Penh) |
| Xilol (grau analítico) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | Desparafinização e clareamento |
Referências
- Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
- Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
- Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
- Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
- Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
- Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
- Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
- Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
- Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
- Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
- Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
- Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
- Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
- Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
- Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
- Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
- Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
- Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
- Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
- Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
- Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
- Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
- Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
- Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
- Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
- Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
- Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
- Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
- van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
- Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
- Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
- Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
- Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
- Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
- Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.