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Artigo de método

Protocolo Padronizado de Citometria de Fluxo Multicolorido para Avaliação Mensurável de Doença Residual em Leucemia Aguda

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DOI:

10.3791/71756

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7 de agosto de 2026

1Department of Clinical Laboratory, The Second People's Hospital of Neijiang

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho padronizado de citometria de fluxo multicolorido para avaliação mensurável de doenças residuais em leucemia aguda, integrando processamento controlado de amostras, parâmetros harmonizados de aquisição, estratégias de gate sequencial e interpretação ajustada pelo denominador para melhorar a reprodutibilidade analítica em laboratórios clínicos rotineiros.

Resumo

A doença residual mensurável (DRM) é um importante indicador prognóstico no manejo da leucemia aguda. No entanto, a avaliação rotineira de citométricos de fluxo multicolorido (MFC) continua vulnerável à variabilidade pré-analítica e analítica, incluindo hemodilução, profundidade de aquisição inconsistente e interpretação subjetiva. Este artigo apresenta um fluxo operacional padronizado para avaliação rotineira de DRM em leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e leucemia mieloide aguda (LMA). O protocolo incorpora critérios rigorosos de aceitação de amostras, com avaliação integrada de hemodilução, e utiliza um método de lise de glóbulos vermelhos em massa para amostras de medula óssea e sangue periférico. A padronização analítica é alcançada por meio de painéis de anticorpos de dois tubos e oito cores específicos para cada doença, metas de aquisição harmonizadas que exigem pelo menos 500.000 eventos CD45-positivos e estratégias fixas de controle sequencial. Além disso, o fluxo de trabalho aplica limites ajustados pelo denominador de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) para apoiar um sistema objetivo de relatórios em três níveis. A validação em 197 amostras clínicas demonstrou forte repetibilidade, robusta linearidade dilucional e alta concordância com ensaios moleculares ortogonais pareados. Coletivamente, esse protocolo fornece uma estrutura prática para monitoramento padronizado de MRD. para monitoramento padronizado de DRM em laboratórios clínicos rotineiros, integrando manuseio pré-analítico controlado e parâmetros analíticos harmonizados.

Introdução

Mesmo após alcançar a remissão morfológica, pacientes com leucemia aguda precisam de monitoramento contínuo para detectar doença residual mensurável (DRM) para avaliar o risco de recaída com precisão. Exames morfológicos e citopatológicos convencionais carecem da sensibilidade necessária para detectar populações leucêmicas residuais de baixo nível. Consequentemente, a avaliação da MRD tornou-se um componente essencial do monitoramento da doença tanto na leucemia mieloide aguda (LMA) quanto na leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL). Recomendações recentes da European LeukemiaNet enfatizam que a avaliação confiável de DRM na LMA depende da padronização técnica e da reprodutibilidade entre observadores, e não da simples disponibilidade deensaios 1,2. Na B-ALL, a citometria de fluxo multicolorido (MFC) continua sendo particularmente importante para pacientes sem alvos moleculares estáveis. Estudos anteriores demonstraram que abordagens citométricas de fluxo multicolorido padronizadas usando painéis estruturados de anticorpos podem fornecer detecção reprodutível e sensível de doençasresiduais 3. A citometria de fluxo é amplamente utilizada devido à sua ampla aplicabilidade, tempo de resposta rápido e custo-benefício. O desempenho do ensaio continua altamente dependente da preparação padronizada da amostra, parâmetros de aquisição e interpretação dosdados 4.

Um dos principais desafios técnicos na avaliação de MRD citométrico em fluxo é a detecção de eventos raros, que é fortemente influenciada pela profundidade de aquisição e pelo total de contagens de eventos. Painéis de anticorpos idênticos podem produzir sensibilidades analíticas diferentes se amostras forem adquiridas com tamanhos de denominadorinconsistentes 5. Portanto, a padronização vai além da seleção de anticorpos e exige processamento harmonizado de amostras, lise de glóbulos vermelhos em massa, compensação de instrumentos, alvos de aquisição e estratégias de gate. Em amostras de medula óssea, a hemodilução também representa uma variável pré-analítica significativa, pois a contaminação sanguínea periférica pode reduzir artificialmente a carga residual leuêmicaaparente 6,7. Além disso, a interpretação de eventos de baixa frequência exige limiares de reporte claramente definidos baseados na profundidade específica de aquisição do espetáculo. Estudos recentes enfatizaram a importância dos limites ajustados pelo denominador de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) para melhorar a consistência da interpretação de MRD citométricode fluxo 8.

O objetivo geral desse protocolo é fornecer um fluxo de trabalho padronizado para avaliações rotineiras de MRD baseadas em MFC em B-ALL e AML. O protocolo integra critérios de aceitação de amostras, avaliação de hemodilução, desenho de painéis de anticorpos específicos para doença, preparação de amostras por lise em massa, alvos harmonizados de aquisição, estratégias fixas de controle sequencial e critérios de relatórios ajustados pelo denominador em um único quadrooperacional 9,10. Ao combinar procedimentos padronizados pré-analíticos e analíticos, esse método oferece uma abordagem prática e reprodutível para a implementação rotineira em laboratórios clínicos do monitoramento de DRM. A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho padronizado pré-analítico e analítico implementado neste estudo. A Tabela 1 resume as características da coorte e da amostra dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e leucemia mieloide aguda (LMA) inscritos durante o período de validação em janelas de monitoramento pré-definidas (Fim da Indução, Consolidação e Pré-HSCT).

figure-introduction-1
Figura 1: Fluxo de trabalho padronizado para avaliação rotineira de MRD citométrico multicolorido. (A) Fluxo de trabalho pré-analítico mostrando triagem de amostras e avaliação de qualidade ao longo de intervalos de monitoramento pré-definidos. (B) Fluxo de trabalho analítico desde lise de glóbulos vermelhos em massa e coloração de anticorpos até gateamento sequencial, interpretação ajustada pelo denominador e relatórios finais de DRM. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Demografia consolidada dos pacientes, características clínicas das amostras e métricas de aquisição rotineira. Esta única tabela revisada resume as características clínicas de base da coorte lista, composta por casos de leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e leucemia mieloide aguda (LMA), combinando demografia em nível de paciente com características em nível de amostra, intervalos de monitoramento de tratamento, viabilidade, escores de hemodilução, profundidades de aquisição e classificações mensuráveis ajustadas pelo denominador da doença residual. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo espéramos humanos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Popular de Neijiang (Aprovação nº PXTS887192). O estudo utilizou amostras clínicas residuals desidentificadas obtidas após testes diagnósticos de rotina. O consentimento informado foi dispensado porque o estudo não afetou o cuidado ao paciente, a alocação de tratamento ou os procedimentos de coleta de amostras. Os produtos químicos, reagentes e equipamentos usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de amostras e avaliação pré-analítica

  1. Colete aspirados de medula óssea como o tipo de amostra preferido para avaliação mensurável da doença residual (MRD). Use amostras de sangue periférico apenas quando a aspiração da medula óssea for clinicamente contraindicada ou durante observância selecionada e análises comparativas.
  2. Colete a amostra de medula óssea durante a primeira extração de aspirado sempre que possível. Evite extrações subsequentes de aspirado para minimizar a contaminação do sangue periférico e a subestimação de doenças residuais de baixo nível.
  3. Transfira amostras para tubos de ácido etilenediaminetetraacético de dipotássio (K2-EDTA) ou anticoagulante de sódio-heparina imediatamente após a coleta. Armazene e transporte os espécimes em temperatura ambiente (18–25 °C) e proteja-os da luz solar direta.
    ATENÇÃO: Não refrigere os espécimes.
  4. Processe todos os espécimes em até 24 horas após a coleta. Para estudos de estabilidade, mantenha as alíquotas para análise repetida em 24 h e 48 h, mantendo as condições de armazenamento em temperatura ambiente.
  5. Verifique o identificador do paciente, o tipo de anticoagulante, a integridade da amostra e o tempo de coleta ao recebê-la. Rejeitar amostras que demonstram coagulação extensa, hemólise severa ou degeneração celular marcada
  6. Avalie amostras de medula óssea para hemodilução antes da interpretação final. Calcule uma pontuação semi-quantitativa de hemodilução variando de 0,00 a 1,00 para estimar a contaminação sanguínea periférica.
  7. Determine esse valor dividindo a proporção de linfócitos maduros pela soma de progenitores CD34-positivos, granulócitos imaturos e linfócitos maduros, onde um quociente maior indica maior efeito dilucional.
    NOTA: Calcule a pontuação usando a seguinte fórmula:
      figure-protocol-1
    onde uma pontuação mais alta indica maior contaminação sanguínea periférica.
  8. Classifique as pontuações de hemodilução da seguinte forma: <0,20, aceitável; 0,20–0,39, levemente hemodilutado; e ≥0,40, substancialmente hemodilutado.
    NOTA: Não atribua interpretações definitivas negativas para MRD a espetáculos marcadamente hemodilutados, a menos que tamanho adequado do denominador e arquitetura preservada do precursor da medula tutano sejam confirmados.

2. Preparação de painéis de anticorpos específicos para doença

  1. Prepare painéis padronizados de dois tubos e oito cores, de anticorpos específicos para doença, para análise de B-ALL e LMA. Alcançar a padronização dos painéis seguindo rigorosamente os marcadores fixos da coluna dorsal em todos os tubos para um gate populacional estável.
  2. Utilize conjugados consistentes de fluorocromo para antígenos de linhagem correspondentes e siga rigorosamente os volumes de titulação recomendados pelo fabricante para minimizar a variabilidade de fluorescência de lote a lote.
  3. Consulte a Tabela Suplementar 1 para combinações de marcadores, atribuições de fluorocromos, clones de anticorpos, volumes de coloração e parâmetros de aquisição.
  4. Para avaliação de B-ALL, use CD19, CD45, CD34, CD10 e CD20 como marcadores da espinha dorsal em ambos os tubos para definir populações de precursores e padrões de maturação. Adicione CD38, CD58 e CD81 ao Tubo 1.
  5. Adicione CD66c, CD123 e CD73 ou CD304 ao Tubo 2, de acordo com o imunofenótipo diagnóstico associado à leucemia estabelecido na avaliação inicial.
  6. Para avaliação de LMA, utilize CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 e HLA-DR como marcadores da coluna dorsal em ambos os tubos para definir populações de mieloide blastoida e imatura.
  7. Adicione CD7 e CD56 ao Tubo 1 para avaliar a expressão de antígenos cruzados por linhagem. Adicione CD11b e CD15 ao tubo 2 para avaliar anomalias na maturação mieloide.

3. Preparação e coloração para lise em massa

  1. Transfira 2,0 mL de medula óssea bem misturada ou amostra de sangue periférico para um tubo de polipropileno de 15 mL. Se o volume da amostra for limitado, use um volume mínimo de entrada de 1,0 mL.
  2. Adicione 10 mL de tampão de lise de cloreto de amônio pré-aquecido à amostra. Incube a suspensão por 10 minutos em temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos.
  3. Centrifuge a amostra a 500 × g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar a pastilha de células nucleadas.
  4. Ressuspenda o pellet em 2 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 0,5% de albumina sérica bovina (BSA) e 2 mM de ácido etilenediamina tetraacético (EDTA). Repita a etapa de lavagem uma vez se a contaminação residual por hemoglobina permanecer visível.
  5. Determine a concentração de células nucleadas usando um analisador hematológico automatizado ou contagem manual de hemocitômetros com exclusão do azul de tripano. Considere uma concentração mínima de células nucleadas de 5 × 106 células/mL como ótima para aquisição padrão.
    NOTA: Se o rendimento celular cair abaixo desse limite, concentre a amostra por centrifugação adicional a 500 × g por 5 minutos e reduza cuidadosamente o volume do buffer de ressuspension para maximizar a densidade celular.
  6. Aliquota 5 × 106 células nucleadas por tubo para coloração rotineira. Aumente a entrada para no máximo 1 × 107 células por tubo para análise de alta sensibilidade quando a recuperação da amostra permitir 6,7.
  7. Adicione o coquetel de anticorpos titulado individualmente e o corante de viabilidade corrigível especificado na Tabela de Materiais a cada tubo, de acordo com a configuração validada do painel de coloração. O painel validado de rotina utiliza 5 μL por anticorpo conjugado com fluorocromo, a menos que a titulação recomendada pelo fabricante indique um volume específico de anticorpos diferente.
  8. Certifique-se de que o volume final da reação de coloração seja mantido estritamente em 100 μL por teste para preservar a estequiometria ideal entre anticorpos e antígenos. Incube as amostras por 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
  9. Lave as células tingidas uma vez usando o tampão de lavagem e ressuspenda o pellet final em 500 μL de tampão de aquisição.
  10. Prepare controles de compensação de uma única mancha usando contas de compensação no mesmo dia da aquisição da amostra.

4. Configuração de instrumentos e aquisição de dados

  1. Realize o controle de qualidade diário de partida no citômetro de fluxo antes de adquirir amostras do paciente. Verifique fluidica, alinhamento a laser, desempenho do detector e valores alvo de fluorescência usando esferas de calibração, seguindo as instruções do fabricante.
  2. Prepare controles de compensação com uma única coloração usando os mesmos fluorocromos incluídos nos painéis de anticorpos. Ajuste a matriz de compensação antes da aquisição do paciente e confirme que os marcadores da espinha dorsal permanecem dentro das faixas pré-definidas do alvo de fluorescência.
  3. Use o mesmo modelo de aquisição, configurações do detector, estratégia de compensação e hierarquia de portões para todas as amostras analisadas durante o período de validação.
    NOTA: Garantir a harmonização adequada entre os instrumentos estabelecendo valores padronizados de intensidade mediana de fluorescência alvo para todos os detectores usando esferas de calibração especializadas, e confirme que amostras idênticas produzem perfis de fluorescência comparáveis entre plataformas antes da aquisição de dados clínicos.
  4. Adquirir dados em uma vazão baixa a moderada para reduzir eventos coincidentes e preservar a precisão da detecção de eventos raros. Monitore a taxa de eventos continuamente durante a aquisição.
  5. Adquirir pelo menos 500.000 eventos nucleados CD45-positivos para cada resultado de MRD reportável. Quando a qualidade da amostra e a estabilidade do evento permitirem, estenda a aquisição para 1,0 a 1,5 milhão de eventos totais, especialmente quando se suspeita de doença residual de baixo nível.
  6. Pause ou pare a aquisição se ocorrerem instabilidade fluídica, entupimentos da amostra, mudanças abruptas na taxa de eventos ou deterioração visível na qualidade do espalhamento. Refiltre ou remisture a amostra quando apropriado, e readquira a amostra somente após o fluxo estável ser restaurado.

5. Comportamento sequencial e interpretação ajustada pelo denominador

  1. Analise os dados da citometria de fluxo usando um software validado de análise de citometria de fluxo. Use a mesma estratégia de gate sequencial para todos os espécimes para reduzir a variabilidade entre operadores.
  2. Estabelecer padrões normais e de regeneração de maturação adquirindo e analisando independentemente um banco de referência com pelo menos 20 amostras normais ou regenerativas de medula óssea para servir como modelos de expressão de base.
  3. Exclua detritos usando parâmetros de dispersão frontal e dispersão lateral. Isole células individuais aplicando o gate de área de dispersão direta versus altura de dispersão direta.
  4. Exclua células não viáveis usando a porta de corante de viabilidade listada na tabela de Materiais. Elimine essas células não viáveis rotineiramente, pois elas apresentam ligação inespecífica de anticorpos e podem elevar artificialmente o ruído de fundo ou imitar populações raras e aberrantes.
    NOTA: Exigir um limiar mínimo de viabilidade de 75% para análise a jusante ideal, observando que espetáculos abaixo desse valor justificam interpretação cautelosa quanto a possíveis artefatos de eventos raros. Defina o denominador leucócitos por meio de um limite para eventos viáveis CD45-positivos com características apropriadas de dispersão lateral.
  5. Para amostras B-ALL, restringa a análise ao compartimento precursor CD19-positivo. Implementar um framework alternativo de portões para pacientes que recebem terapias direcionadas ao anti-CD19.
  6. Desloque a avaliação primária para compartimentos CD22, CD24 ou CD34-positivo para capturar a população leucêmica independentemente da expressão do CD19. Avaliar os padrões de maturação dos CD34, CD10 e CD20 e identificar populações aberrantes usando padrões de expressão dos CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123, CD73 ou CD304.
  7. Para amostras de LMA, defina a região do blast ou precursor usando a expressão CD45, dispersão lateral, CD34 e CD117.
  8. Avaliar a expressão aberrante ou assíncrona de marcadores mieloides e de linhagem cruzada, incluindo CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b e CD15.
  9. Calcule o limite específico de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) específicos da amostra usando o número total de eventos viáveis adquiridos para CD45 positivos como denominador:
     figure-protocol-2
      figure-protocol-3
  10. Classifique a interpretação final da MRD em uma de três categorias: MRD-positiva, abaixo do LOD, ou limitada analiticamente.
    1. Atribuir o resultado como MRD-positivo quando um agrupamento claro e contíguo de eventos aberrantes excede o LOD específico da amostra e demonstra um imunofenótipo internamente consistente distinto das populações hematopoéticas normais ou regenerativas.
      NOTA: Não classifique eventos dispersos e não agrupados como MRD-positivos. Utilize uma abordagem de análise integrada que combine tanto o imunofenótipo associado à leucemia (LAIP) acompanhado a partir da amostra diagnóstica inicial quanto estratégias de reconhecimento de padrões diferentes do normal (DfN).
    2. Atribua o resultado abaixo do LOD quando eventos suspeitos raros estiverem presentes, mas não atingirem o limiar notificável específico da amostra.
    3. Atribuir o resultado como limitado analiticamente quando o tamanho do denominador é insuficiente, a hemodilução é substancial, a qualidade da amostra é ruim, ou limitações pré-analíticas ou analíticas impedem uma interpretação negativa confiante.
  11. Revise todos os casos de MRD positivo e borderline low level de forma independente por um segundo analista qualificado.
  12. Finalize a interpretação da citometria de fluxo antes de revisar dados de comparadores moleculares pareados, incluindo resultados quantitativos de reação em cadeia da polimerase ou sequenciamento de próxima geração.

6. Metodologia analítica de validação

  1. Avalie a repetibilidade analítica preparando alíquotas duplicadas a partir da mesma suspensão celular pós-lisis. Adquira e analise pelo menos 30 espécimes pareados de forma independente.
  2. Avalie a linearidade dilucional preparando diluições seriadas em seis níveis dentro da faixa esperada de baixa carga. Compare os valores de MRD observados com os valores esperados de MRD ao longo da série de diluição.
  3. Avalie a reprodutibilidade entre operadores e entre instrumentos analisando amostras de referência entre múltiplos operadores qualificados e citômetros de fluxo harmonizados.
  4. Transforme os percentuais citométricos de fluxo e MRD molecular pareados usando transformação log10 antes da comparação estatística. Avalie a concordância quantitativa usando análise de correlação e análise de Bland-Altman.

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Resultados

Características do conjunto de dados de implementação rotineira

Durante o período do estudo, 197 amostras consecutivas passaram pela triagem de elegibilidade e avaliação pré-analítica da qualidade e entraram no fluxo de trabalho reportável. A coorte do estudo incluiu 98 pacientes, 62 (63,3%) com leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e 36 (36,7%) com leucemia mieloide aguda (LMA). A coorte consistia em 64 homens (65,3%) e 34 mulhere...

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Discussão

O objetivo principal deste estudo foi estabelecer um fluxo de trabalho padronizado para a avaliação citométrica de fluxo multicolorido da doença residual mensurável (DRM) em leucemia aguda. A avaliação confiável da DRM depende não apenas da seleção do painel de anticorpos, mas também do manuseio consistente da amostra, parâmetros de aquisição e interpretação dosdados 11. Os resultados deste estudo demonstram que o processamento harmonizado de amostras, a profundid...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O autor agradece ao Departamento de Laboratório Clínico do Second People's Hospital de Neijiang pelo fornecimento de instalações laboratoriais e suporte técnico para este estudo. O autor também reconhece a equipe do laboratório e o pessoal clínico pela ajuda no processamento de amostras e coleta de dados. Por fim, o autor agradece aos pacientes cujos espasmes clínicos residuais contribuíram para este trabalho. Essa pesquisa não recebeu financiamento específico de órgãos públicos, comerciais ou sem fins lucrativos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Acquisition bufferLaboratory-preparedPBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µLFinal resuspension before flow cytometric acquisition
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsEarly myeloid/blast identification
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsImmaturity marker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsLeukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsAberrant blast-associated phenotyping
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsCross-lineage aberrancy detection
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation and subtype discrimination
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsEarly myeloid/blast identification
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation-discordance assessment
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsDifferent-from-normal myeloid pattern assessment
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMyeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsImmaturity marker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsLeukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation and subtype discrimination
Ammonium chloride-based red blood cell lysis bufferLaboratory-prepared / commercial supplierAmmonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperatureBulk red blood cell lysis
Analysis softwareBeckman Coulter (Brea, CA, USA)Kaluza 2.1Data analysis and sequential gating
Automated hematology analyzerCommercial supplierAutomated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessmentNucleated cell concentration and viability assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsPrecursor B-cell definition
B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsB-lineage identification and entry into precursor compartment
B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differsMaturation pattern assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibodyBD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs

Referências

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