Protocolo Padronizado de Citometria de Fluxo Multicolorido para Avaliação Mensurável de Doença Residual em Leucemia Aguda

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho padronizado de citometria de fluxo multicolorido para avaliação mensurável de doenças residuais em leucemia aguda, integrando processamento controlado de amostras, parâmetros harmonizados de aquisição, estratégias de gate sequencial e interpretação ajustada pelo denominador para melhorar a reprodutibilidade analítica em laboratórios clínicos rotineiros.

Resumo

A doença residual mensurável (DRM) é um importante indicador prognóstico no manejo da leucemia aguda. No entanto, a avaliação rotineira de citométricos de fluxo multicolorido (MFC) continua vulnerável à variabilidade pré-analítica e analítica, incluindo hemodilução, profundidade de aquisição inconsistente e interpretação subjetiva. Este artigo apresenta um fluxo operacional padronizado para avaliação rotineira de DRM em leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e leucemia mieloide aguda (LMA). O protocolo incorpora critérios rigorosos de aceitação de amostras, com avaliação integrada de hemodilução, e utiliza um método de lise de glóbulos vermelhos em massa para amostras de medula óssea e sangue periférico. A padronização analítica é alcançada por meio de painéis de anticorpos de dois tubos e oito cores específicos para cada doença, metas de aquisição harmonizadas que exigem pelo menos 500.000 eventos CD45-positivos e estratégias fixas de controle sequencial. Além disso, o fluxo de trabalho aplica limites ajustados pelo denominador de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) para apoiar um sistema objetivo de relatórios em três níveis. A validação em 197 amostras clínicas demonstrou forte repetibilidade, robusta linearidade dilucional e alta concordância com ensaios moleculares ortogonais pareados. Coletivamente, esse protocolo fornece uma estrutura prática para monitoramento padronizado de MRD. para monitoramento padronizado de DRM em laboratórios clínicos rotineiros, integrando manuseio pré-analítico controlado e parâmetros analíticos harmonizados.

Introdução

Mesmo após alcançar a remissão morfológica, pacientes com leucemia aguda precisam de monitoramento contínuo para detectar doença residual mensurável (DRM) para avaliar o risco de recaída com precisão. Exames morfológicos e citopatológicos convencionais carecem da sensibilidade necessária para detectar populações leucêmicas residuais de baixo nível. Consequentemente, a avaliação da MRD tornou-se um componente essencial do monitoramento da doença tanto na leucemia mieloide aguda (LMA) quanto na leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL). Recomendações recentes da European LeukemiaNet enfatizam que a avaliação confiável de DRM na LMA depende da padronização técnica e da reprodutibilidade entre observadores, e não da simples disponibilidade de^{ensaios 1,2}. Na B-ALL, a citometria de fluxo multicolorido (MFC) continua sendo particularmente importante para pacientes sem alvos moleculares estáveis. Estudos anteriores demonstraram que abordagens citométricas de fluxo multicolorido padronizadas usando painéis estruturados de anticorpos podem fornecer detecção reprodutível e sensível de doenças^{residuais 3}. A citometria de fluxo é amplamente utilizada devido à sua ampla aplicabilidade, tempo de resposta rápido e custo-benefício. O desempenho do ensaio continua altamente dependente da preparação padronizada da amostra, parâmetros de aquisição e interpretação dos^{dados 4}.

Um dos principais desafios técnicos na avaliação de MRD citométrico em fluxo é a detecção de eventos raros, que é fortemente influenciada pela profundidade de aquisição e pelo total de contagens de eventos. Painéis de anticorpos idênticos podem produzir sensibilidades analíticas diferentes se amostras forem adquiridas com tamanhos de denominador^{inconsistentes 5}. Portanto, a padronização vai além da seleção de anticorpos e exige processamento harmonizado de amostras, lise de glóbulos vermelhos em massa, compensação de instrumentos, alvos de aquisição e estratégias de gate. Em amostras de medula óssea, a hemodilução também representa uma variável pré-analítica significativa, pois a contaminação sanguínea periférica pode reduzir artificialmente a carga residual leuêmica^{aparente 6,7}. Além disso, a interpretação de eventos de baixa frequência exige limiares de reporte claramente definidos baseados na profundidade específica de aquisição do espetáculo. Estudos recentes enfatizaram a importância dos limites ajustados pelo denominador de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) para melhorar a consistência da interpretação de MRD citométrico^{de fluxo 8}.

O objetivo geral desse protocolo é fornecer um fluxo de trabalho padronizado para avaliações rotineiras de MRD baseadas em MFC em B-ALL e AML. O protocolo integra critérios de aceitação de amostras, avaliação de hemodilução, desenho de painéis de anticorpos específicos para doença, preparação de amostras por lise em massa, alvos harmonizados de aquisição, estratégias fixas de controle sequencial e critérios de relatórios ajustados pelo denominador em um único quadro^{operacional 9,10}. Ao combinar procedimentos padronizados pré-analíticos e analíticos, esse método oferece uma abordagem prática e reprodutível para a implementação rotineira em laboratórios clínicos do monitoramento de DRM. A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho padronizado pré-analítico e analítico implementado neste estudo. A Tabela 1 resume as características da coorte e da amostra dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e leucemia mieloide aguda (LMA) inscritos durante o período de validação em janelas de monitoramento pré-definidas (Fim da Indução, Consolidação e Pré-HSCT).

Figura 1: Fluxo de trabalho padronizado para avaliação rotineira de MRD citométrico multicolorido. (A) Fluxo de trabalho pré-analítico mostrando triagem de amostras e avaliação de qualidade ao longo de intervalos de monitoramento pré-definidos. (B) Fluxo de trabalho analítico desde lise de glóbulos vermelhos em massa e coloração de anticorpos até gateamento sequencial, interpretação ajustada pelo denominador e relatórios finais de DRM. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Demografia consolidada dos pacientes, características clínicas das amostras e métricas de aquisição rotineira. Esta única tabela revisada resume as características clínicas de base da coorte lista, composta por casos de leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e leucemia mieloide aguda (LMA), combinando demografia em nível de paciente com características em nível de amostra, intervalos de monitoramento de tratamento, viabilidade, escores de hemodilução, profundidades de aquisição e classificações mensuráveis ajustadas pelo denominador da doença residual. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo espéramos humanos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Popular de Neijiang (Aprovação nº PXTS887192). O estudo utilizou amostras clínicas residuals desidentificadas obtidas após testes diagnósticos de rotina. O consentimento informado foi dispensado porque o estudo não afetou o cuidado ao paciente, a alocação de tratamento ou os procedimentos de coleta de amostras. Os produtos químicos, reagentes e equipamentos usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de amostras e avaliação pré-analítica

1. Colete aspirados de medula óssea como o tipo de amostra preferido para avaliação mensurável da doença residual (MRD). Use amostras de sangue periférico apenas quando a aspiração da medula óssea for clinicamente contraindicada ou durante observância selecionada e análises comparativas.
2. Colete a amostra de medula óssea durante a primeira extração de aspirado sempre que possível. Evite extrações subsequentes de aspirado para minimizar a contaminação do sangue periférico e a subestimação de doenças residuais de baixo nível.
3. Transfira amostras para tubos de ácido etilenediaminetetraacético de dipotássio (K2-EDTA) ou anticoagulante de sódio-heparina imediatamente após a coleta. Armazene e transporte os espécimes em temperatura ambiente (18–25 °C) e proteja-os da luz solar direta.
   ATENÇÃO: Não refrigere os espécimes.
4. Processe todos os espécimes em até 24 horas após a coleta. Para estudos de estabilidade, mantenha as alíquotas para análise repetida em 24 h e 48 h, mantendo as condições de armazenamento em temperatura ambiente.
5. Verifique o identificador do paciente, o tipo de anticoagulante, a integridade da amostra e o tempo de coleta ao recebê-la. Rejeitar amostras que demonstram coagulação extensa, hemólise severa ou degeneração celular marcada
6. Avalie amostras de medula óssea para hemodilução antes da interpretação final. Calcule uma pontuação semi-quantitativa de hemodilução variando de 0,00 a 1,00 para estimar a contaminação sanguínea periférica.
7. Determine esse valor dividindo a proporção de linfócitos maduros pela soma de progenitores CD34-positivos, granulócitos imaturos e linfócitos maduros, onde um quociente maior indica maior efeito dilucional.
   NOTA: Calcule a pontuação usando a seguinte fórmula:
    
   onde uma pontuação mais alta indica maior contaminação sanguínea periférica.
8. Classifique as pontuações de hemodilução da seguinte forma: <0,20, aceitável; 0,20–0,39, levemente hemodilutado; e ≥0,40, substancialmente hemodilutado.
   NOTA: Não atribua interpretações definitivas negativas para MRD a espetáculos marcadamente hemodilutados, a menos que tamanho adequado do denominador e arquitetura preservada do precursor da medula tutano sejam confirmados.

2. Preparação de painéis de anticorpos específicos para doença

1. Prepare painéis padronizados de dois tubos e oito cores, de anticorpos específicos para doença, para análise de B-ALL e LMA. Alcançar a padronização dos painéis seguindo rigorosamente os marcadores fixos da coluna dorsal em todos os tubos para um gate populacional estável.
2. Utilize conjugados consistentes de fluorocromo para antígenos de linhagem correspondentes e siga rigorosamente os volumes de titulação recomendados pelo fabricante para minimizar a variabilidade de fluorescência de lote a lote.
3. Consulte a Tabela Suplementar 1 para combinações de marcadores, atribuições de fluorocromos, clones de anticorpos, volumes de coloração e parâmetros de aquisição.
4. Para avaliação de B-ALL, use CD19, CD45, CD34, CD10 e CD20 como marcadores da espinha dorsal em ambos os tubos para definir populações de precursores e padrões de maturação. Adicione CD38, CD58 e CD81 ao Tubo 1.
5. Adicione CD66c, CD123 e CD73 ou CD304 ao Tubo 2, de acordo com o imunofenótipo diagnóstico associado à leucemia estabelecido na avaliação inicial.
6. Para avaliação de LMA, utilize CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 e HLA-DR como marcadores da coluna dorsal em ambos os tubos para definir populações de mieloide blastoida e imatura.
7. Adicione CD7 e CD56 ao Tubo 1 para avaliar a expressão de antígenos cruzados por linhagem. Adicione CD11b e CD15 ao tubo 2 para avaliar anomalias na maturação mieloide.

3. Preparação e coloração para lise em massa

1. Transfira 2,0 mL de medula óssea bem misturada ou amostra de sangue periférico para um tubo de polipropileno de 15 mL. Se o volume da amostra for limitado, use um volume mínimo de entrada de 1,0 mL.
2. Adicione 10 mL de tampão de lise de cloreto de amônio pré-aquecido à amostra. Incube a suspensão por 10 minutos em temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos.
3. Centrifuge a amostra a 500 × g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar a pastilha de células nucleadas.
4. Ressuspenda o pellet em 2 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 0,5% de albumina sérica bovina (BSA) e 2 mM de ácido etilenediamina tetraacético (EDTA). Repita a etapa de lavagem uma vez se a contaminação residual por hemoglobina permanecer visível.
5. Determine a concentração de células nucleadas usando um analisador hematológico automatizado ou contagem manual de hemocitômetros com exclusão do azul de tripano. Considere uma concentração mínima de células nucleadas de 5 × 10⁶ células/mL como ótima para aquisição padrão.
   NOTA: Se o rendimento celular cair abaixo desse limite, concentre a amostra por centrifugação adicional a 500 × g por 5 minutos e reduza cuidadosamente o volume do buffer de ressuspension para maximizar a densidade celular.
6. Aliquota 5 × 10⁶ células nucleadas por tubo para coloração rotineira. Aumente a entrada para no máximo 1 × 10⁷ células por tubo para análise de alta sensibilidade quando a recuperação da amostra permitir ^6,7.
7. Adicione o coquetel de anticorpos titulado individualmente e o corante de viabilidade corrigível especificado na Tabela de Materiais a cada tubo, de acordo com a configuração validada do painel de coloração. O painel validado de rotina utiliza 5 μL por anticorpo conjugado com fluorocromo, a menos que a titulação recomendada pelo fabricante indique um volume específico de anticorpos diferente.
8. Certifique-se de que o volume final da reação de coloração seja mantido estritamente em 100 μL por teste para preservar a estequiometria ideal entre anticorpos e antígenos. Incube as amostras por 15 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
9. Lave as células tingidas uma vez usando o tampão de lavagem e ressuspenda o pellet final em 500 μL de tampão de aquisição.
10. Prepare controles de compensação de uma única mancha usando contas de compensação no mesmo dia da aquisição da amostra.

4. Configuração de instrumentos e aquisição de dados

1. Realize o controle de qualidade diário de partida no citômetro de fluxo antes de adquirir amostras do paciente. Verifique fluidica, alinhamento a laser, desempenho do detector e valores alvo de fluorescência usando esferas de calibração, seguindo as instruções do fabricante.
2. Prepare controles de compensação com uma única coloração usando os mesmos fluorocromos incluídos nos painéis de anticorpos. Ajuste a matriz de compensação antes da aquisição do paciente e confirme que os marcadores da espinha dorsal permanecem dentro das faixas pré-definidas do alvo de fluorescência.
3. Use o mesmo modelo de aquisição, configurações do detector, estratégia de compensação e hierarquia de portões para todas as amostras analisadas durante o período de validação.
   NOTA: Garantir a harmonização adequada entre os instrumentos estabelecendo valores padronizados de intensidade mediana de fluorescência alvo para todos os detectores usando esferas de calibração especializadas, e confirme que amostras idênticas produzem perfis de fluorescência comparáveis entre plataformas antes da aquisição de dados clínicos.
4. Adquirir dados em uma vazão baixa a moderada para reduzir eventos coincidentes e preservar a precisão da detecção de eventos raros. Monitore a taxa de eventos continuamente durante a aquisição.
5. Adquirir pelo menos 500.000 eventos nucleados CD45-positivos para cada resultado de MRD reportável. Quando a qualidade da amostra e a estabilidade do evento permitirem, estenda a aquisição para 1,0 a 1,5 milhão de eventos totais, especialmente quando se suspeita de doença residual de baixo nível.
6. Pause ou pare a aquisição se ocorrerem instabilidade fluídica, entupimentos da amostra, mudanças abruptas na taxa de eventos ou deterioração visível na qualidade do espalhamento. Refiltre ou remisture a amostra quando apropriado, e readquira a amostra somente após o fluxo estável ser restaurado.

5. Comportamento sequencial e interpretação ajustada pelo denominador

1. Analise os dados da citometria de fluxo usando um software validado de análise de citometria de fluxo. Use a mesma estratégia de gate sequencial para todos os espécimes para reduzir a variabilidade entre operadores.
2. Estabelecer padrões normais e de regeneração de maturação adquirindo e analisando independentemente um banco de referência com pelo menos 20 amostras normais ou regenerativas de medula óssea para servir como modelos de expressão de base.
3. Exclua detritos usando parâmetros de dispersão frontal e dispersão lateral. Isole células individuais aplicando o gate de área de dispersão direta versus altura de dispersão direta.
4. Exclua células não viáveis usando a porta de corante de viabilidade listada na tabela de Materiais. Elimine essas células não viáveis rotineiramente, pois elas apresentam ligação inespecífica de anticorpos e podem elevar artificialmente o ruído de fundo ou imitar populações raras e aberrantes.
   NOTA: Exigir um limiar mínimo de viabilidade de 75% para análise a jusante ideal, observando que espetáculos abaixo desse valor justificam interpretação cautelosa quanto a possíveis artefatos de eventos raros. Defina o denominador leucócitos por meio de um limite para eventos viáveis CD45-positivos com características apropriadas de dispersão lateral.
5. Para amostras B-ALL, restringa a análise ao compartimento precursor CD19-positivo. Implementar um framework alternativo de portões para pacientes que recebem terapias direcionadas ao anti-CD19.
6. Desloque a avaliação primária para compartimentos CD22, CD24 ou CD34-positivo para capturar a população leucêmica independentemente da expressão do CD19. Avaliar os padrões de maturação dos CD34, CD10 e CD20 e identificar populações aberrantes usando padrões de expressão dos CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123, CD73 ou CD304.
7. Para amostras de LMA, defina a região do blast ou precursor usando a expressão CD45, dispersão lateral, CD34 e CD117.
8. Avaliar a expressão aberrante ou assíncrona de marcadores mieloides e de linhagem cruzada, incluindo CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b e CD15.
9. Calcule o limite específico de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) específicos da amostra usando o número total de eventos viáveis adquiridos para CD45 positivos como denominador:
    
    
10. Classifique a interpretação final da MRD em uma de três categorias: MRD-positiva, abaixo do LOD, ou limitada analiticamente.
    1. Atribuir o resultado como MRD-positivo quando um agrupamento claro e contíguo de eventos aberrantes excede o LOD específico da amostra e demonstra um imunofenótipo internamente consistente distinto das populações hematopoéticas normais ou regenerativas.
       NOTA: Não classifique eventos dispersos e não agrupados como MRD-positivos. Utilize uma abordagem de análise integrada que combine tanto o imunofenótipo associado à leucemia (LAIP) acompanhado a partir da amostra diagnóstica inicial quanto estratégias de reconhecimento de padrões diferentes do normal (DfN).
    2. Atribua o resultado abaixo do LOD quando eventos suspeitos raros estiverem presentes, mas não atingirem o limiar notificável específico da amostra.
    3. Atribuir o resultado como limitado analiticamente quando o tamanho do denominador é insuficiente, a hemodilução é substancial, a qualidade da amostra é ruim, ou limitações pré-analíticas ou analíticas impedem uma interpretação negativa confiante.
11. Revise todos os casos de MRD positivo e borderline low level de forma independente por um segundo analista qualificado.
12. Finalize a interpretação da citometria de fluxo antes de revisar dados de comparadores moleculares pareados, incluindo resultados quantitativos de reação em cadeia da polimerase ou sequenciamento de próxima geração.

6. Metodologia analítica de validação

1. Avalie a repetibilidade analítica preparando alíquotas duplicadas a partir da mesma suspensão celular pós-lisis. Adquira e analise pelo menos 30 espécimes pareados de forma independente.
2. Avalie a linearidade dilucional preparando diluições seriadas em seis níveis dentro da faixa esperada de baixa carga. Compare os valores de MRD observados com os valores esperados de MRD ao longo da série de diluição.
3. Avalie a reprodutibilidade entre operadores e entre instrumentos analisando amostras de referência entre múltiplos operadores qualificados e citômetros de fluxo harmonizados.
4. Transforme os percentuais citométricos de fluxo e MRD molecular pareados usando transformação log10 antes da comparação estatística. Avalie a concordância quantitativa usando análise de correlação e análise de Bland-Altman.

Resultados

Características do conjunto de dados de implementação rotineira

Durante o período do estudo, 197 amostras consecutivas passaram pela triagem de elegibilidade e avaliação pré-analítica da qualidade e entraram no fluxo de trabalho reportável. A coorte do estudo incluiu 98 pacientes, 62 (63,3%) com leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) e 36 (36,7%) com leucemia mieloide aguda (LMA). A coorte consistia em 64 homens (65,3%) e 34 mulheres (34,7%), com idade mediana de 32 anos (faixa interquartil [IQR], 13–49 anos; faixa, 2–73 anos). A porcentagem mediana de explosão no início do dia foi de 67,2% (IQR, 56,9% – 80,2%).

A maioria dos espetáculos analisados era aspirada de medula óssea (174/197, 88,3%), enquanto amostras de sangue periférico representaram 23/197 (11,7%). De acordo com os intervalos de monitoramento pré-definidos, 86 amostras (43,7%) foram coletadas ao final da terapia de indução, 65 (33,0%) durante a terapia de consolidação e 46 (23,4%) antes do transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT) (Tabela 1).

A viabilidade mediana da amostra foi de 88,3% (IQR, 84,4% – 92,6%). O fluxo de trabalho de aquisição gerou uma mediana de 1.116.901 eventos totais (IQR, 908.521–1.258.946) antes da limpeza dos dados. Após a exclusão analítica sequencial de detritos, duplos coincidentes e células não viáveis, a estratégia de gate alcançou uma mediana de 907.325 eventos-alvo simples viáveis positivos para CD45 (IQR, 690.112–1.095.836), com um tempo mediano de aquisição de 11,9 min. A pontuação mediana de hemodilução foi 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Seguindo a interpretação ajustada pelo denominador, 41 espécimes (20,8%) foram classificados como MRD-positivos, e 156 espetáculos (79,2%) foram classificados como abaixo do limite específico de detecção (LOD) específico da amostra (Tabela 1).

Validação analítica: repetibilidade, linearidade e estabilidade

O desempenho analítico do fluxo de trabalho padronizado foi avaliado por meio de estudos de repetibilidade, linearidade dilucional e estabilidade de curto prazo (Figura 2). Aliquotas duplicadas preparadas a partir dos mesmos exemplares lisados em massa demonstraram forte repetibilidade, com um coeficiente mediano de variação duplicada (CV) de 0,101% e um percentil 95 de CV de 0,222%.

Figura 2: Validação analítica do fluxo de trabalho padronizado MRD de citometria de fluxo multicolorido. (A) Distribuição da viabilidade da amostra entre amostras analisadas. (B) Correlação entre os valores esperados e observados de MRD em experimentos seriais de diluição em análise logarítmica. (C) Concordância entre análises replicadas independentes durante a avaliação de repetibilidade. (D) Estabilidade das medições de MRD após armazenamento em temperatura ambiente em 0 h, 24 h e 48 h. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para avaliar o comportamento de detecção em baixo nível, 12 experimentos de diluição em série, totalizando 72 observações, foram analisados na faixa inferior esperada de MRD. Os valores observados de MRD mostraram forte concordância com os esperados em uma análise logarítmica (r = 0,999, ajustado^{R 2} = 0,998, inclinação = 1,009, intercepto = 0,018), indicando linearidade preservada em intervalos de eventos de baixa frequência.

Testes de estabilidade de curto prazo demonstraram reduções progressivas na viabilidade da amostra ao longo do tempo, com a mediana diminuindo de 89,1% às 0 horas para 84,9% às 24 horas e 80,6% às 48 horas. Em contraste, a variação relativa absoluta mediana na carga de DRM permaneceu limitada em 24 horas (6,2%) e 48 horas (12,0%), apoiando o processamento rotineiro dentro de um intervalo de 24 horas após a coleta.

Reprodutibilidade entre operador e entre instrumentos

A reprodutibilidade entre operadores e entre instrumentos foi avaliada usando 24 amostras de referência analisadas em múltiplos operadores e citômetros de fluxo harmonizados, gerando um total de 96 avaliações. O desvio relativo absoluto mediano em relação aos valores de referência foi de 13,7%. Esses achados demonstram desempenho analítico consistente após a padronização da preparação da amostra, configurações de aquisição e estratégias de gate sequencial (Tabela 2).

Tabela 2: Indicadores analíticos de validação e comparação de métodos para o fluxo de trabalho padronizado mensurável da doença residual. Esta tabela é limitada a resultados de validação, incluindo repetibilidade intra-ensaio, linearidade dilucional, estabilidade de curto prazo, reprodutibilidade entre operadores e entre instrumentos, e métricas de comparação de métodos moleculares ortogonais; não duplica a demografia dos pacientes nem as características do espécime relatadas na Tabela 1. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Aplicação clínica e comparação de métodos ortogonais

Foi realizada uma comparação ortogonal usando 117 amostras pareadas, incluindo 75 analisadas por reação em cadeia quantitativa da polimerase (qPCR) e 42 por sequenciamento de próxima geração (NGS). As avaliações qPCR monitoraram principalmente transcritos de fusão específicos da doença estabelecidos no diagnóstico, incluindo BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 e PML::RARA. As abordagens NGS avaliaram os rearranjos clonais de imunoglobulina ou receptor de células T para leucemia linfoblástica e rastrearam mutações somáticas recorrentes usando painéis mieloides direcionados para leucemia mieloide aguda. Os valores de MRD citométricos em fluxo demonstraram forte correlação com resultados moleculares pareados entre níveis mensuráveis de doença (r = 0,893 na análise logarítmica).

A análise de Bland-Altman demonstrou uma diferença média logarítmica de −0,093 com limites de concordância variando de −0,848 a 0,663 (Figura 3). Entre os casos dissonantes, um resultado falso negativo foi identificado entre 25 amostras molecularmente positivas. O fluxo de trabalho demonstrou uma concordância percentual positiva de 78,1%, uma concordância negativa de 97,6% e uma taxa geral de concordância de 92,3%.

Figura 3: Aplicação clínica e validação ortogonal da avaliação padronizada de DRM. (A) Distribuição dos casos positivos para MRD entre grupos de doenças e intervalos de monitoramento. (B) Correlação entre os valores de MRD citométricos em fluxo e os resultados de comparadores moleculares pareados na análise logarítmica. (C) Análise Bland-Altman comparando medições citométricas de fluxo e MRD molecular pareadas, com linhas horizontais indicando o viés médio e os limites de concordância de 95% ao longo da faixa analítica. (D) Distribuição dos resultados positivos para MRD entre intervalos de monitoramento de tratamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Esses achados demonstram que o fluxo padronizado de citometria de fluxo multicolorido alcançou forte concordância com ensaios MRD moleculares ortogonais em amostras clínicas rotineiras.

Tabela Suplementar 1: Parâmetros operacionais abrangentes para o fluxo de trabalho padronizado de citometria de fluxo multicolorido mensurável para doenças residuais. Esta tabela unificada delimita os componentes metodológicos essenciais divididos em seções distintas. A Seção A detalha as configurações específicas de painéis de anticorpos para doença, nas quais a seleção CD73 ou CD304 é baseada no imunofenótipo diagnóstico associado à leucemia de base. A Seção B descreve os alvos padronizados de processamento pré-analítico de amostras e aquisição citométrica de fluxo. A Seção C define os limiares de reporte ajustados pelo denominador, juntamente com critérios finais de interpretação. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O objetivo principal deste estudo foi estabelecer um fluxo de trabalho padronizado para a avaliação citométrica de fluxo multicolorido da doença residual mensurável (DRM) em leucemia aguda. A avaliação confiável da DRM depende não apenas da seleção do painel de anticorpos, mas também do manuseio consistente da amostra, parâmetros de aquisição e interpretação dos^{dados 11}. Os resultados deste estudo demonstram que o processamento harmonizado de amostras, a profundidade controlada de aquisição e os critérios de reporte ajustados pelo denominador podem melhorar a reprodutibilidade analítica em ambientes de laboratório clínico rotineiros. Esses achados são consistentes com esforços recentes para padronizar a avaliação de MRD citométrica de fluxo em diferentes instituições e^{operadores 12}.

Um componente importante desse fluxo de trabalho é o procedimento de lise de glóbulos vermelhos a granel à base de cloreto de amônio. A detecção de MRD em eventos raros requer a aquisição de grandes denominadores celulares para alcançar sensibilidade analítica adequada. A preparação padronizada para lise em massa permitiu a recuperação consistente de números suficientes de células nucleadas, frequentemente ultrapassando 1,0–1,5 milhão de eventos adquiridos, mantendo a viabilidade aceitável da amostra. Estudos anteriores do EuroFlow Consortium também enfatizaram que a aquisição de altos eventos é necessária para apoiar a detecção sensível e reprodutível de^{MRD 13}. Em amostras com sensibilidade analítica subótima, a solução de problemas deve incluir avaliação do volume da amostra, recuperação celular e profundidade de aquisição.

Esse protocolo também inclui avaliação rotineira da hemodilução antes de interpretar os resultados negativos de baixo nível para MRD. A hemodilução continua sendo uma grande limitação pré-analítica nos testes de MRD à base de medula óssea, pois a contaminação por sangue periférico pode reduzir artificialmente a carga leukêmica aparente. Incorporar uma pontuação semi-quantitativa de hemodilução diretamente no fluxo de trabalho de relatórios oferece uma salvaguarda adicional contra interpretações erradas como falso negativo. Estudos anteriores relataram que a hemodilução afeta significativamente a confiabilidade da análise de MRD citométrica de fluxo na leucemia mieloide^{aguda 7}. Espécimes que demonstrem hemodilução substancial (≥0,40) devem, portanto, ser interpretados com cautela, especialmente quando a profundidade de aquisição ou a preservação dos precursores da medula tutano são inadequadas.

A comparação ortogonal realizada neste estudo demonstrou forte concordância geral entre os métodos de avaliação de citométrico de fluxo e de MRD molecular. No entanto, os casos discordantes também ressaltam que citometria de fluxo e ensaios moleculares avaliam aspectos biológicos distintos da doença residual. Estudos anteriores mostraram que mudanças fenotípicas, evolução clonal e hematopoiese regenerativa podem contribuir para discrepâncias entre as plataformas^{analíticas 14}. Na B-ALL, distinguir precursores leucêmicos residuais de hematógonos normais continua sendo particularmente desafiador em baixos níveis de carga da doença e requer interpretação integrada de padrões imunofenotípicos multidimensionais, em vez de anomalias isoladas de^{antígenos 15}. Por esse motivo, todos os casos de DRM borderline e de baixo nível nesse fluxo de trabalho foram revisados de forma independente por um segundo analista.

Este estudo apresenta várias limitações. Primeiro, a validação foi realizada em uma única instituição usando um número limitado de instrumentos harmonizados. Segundo, amostras de sangue periférico foram incluídas apenas em situações clínicas selecionadas, pois não podem substituir a medula óssea para avaliação rotineira pós-tratamento de DRM na maioria dos contextos de leucemia aguda. Além disso, alguns parâmetros analíticos, incluindo pontuação de hemodilução e interpretação de eventos de baixo nível, ainda exigem revisão experiente do operador, apesar do fluxo de trabalho padronizado. No entanto, o protocolo fornece uma estrutura prática para a implementação clínica rotineira da avaliação padronizada de MRD em fluxo multicolorido^{e citométrico 16,17}. Ao integrar avaliação pré-analítica da qualidade, estratégias harmonizadas de aquisição e critérios de interpretação ajustados pelo denominador, esse fluxo de trabalho apoia relatórios de DRM mais reprodutíveis e clinicamente consistentes na prática laboratorial rotineira.

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acquisition buffer	Laboratory-prepared	PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µL	Final resuspension before flow cytometric acquisition
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Aberrant blast-associated phenotyping
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Cross-lineage aberrancy detection
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation-discordance assessment
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Different-from-normal myeloid pattern assessment
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
Ammonium chloride-based red blood cell lysis buffer	Laboratory-prepared / commercial supplier	Ammonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperature	Bulk red blood cell lysis
Analysis software	Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Kaluza 2.1	Data analysis and sequential gating
Automated hematology analyzer	Commercial supplier	Automated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessment	Nucleated cell concentration and viability assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Precursor B-cell definition
B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	B-lineage identification and entry into precursor compartment
B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation pattern assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs