Artigo de método

Lipossomas Ativados por Luz e Raios-X para Edição Gênica Controlada e Entrega de Fármacos

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DOI:

10.3791/71788

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14 de agosto de 2026

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1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve métodos para fabricar nanopartículas lipídicas integradas com verteporfina que são ativadas por luz visível ou radiação de raios X para entrega espacialmente e temporalmente controlada de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 e agentes quimioterápicos, com possível relevância translacional para aplicações oftálmicas e oncológicas.

Resumo

A terapia fotodinâmica (PDT) explora a ativação de fotossensibilizadores para gerar espécies reativas de oxigênio (ROS), principalmente oxigênio singlete. Além da citotoxicidade direta, essa fotoquímica pode ser reaproveitada para liberação sob demanda de cargas a partir de sistemas de nanocarreadores lipídicos, permitindo controle espaço-temporal sobre a entrega terapêutica que não é alcançável com nanopartículas lipídicas convencionais. Este protocolo apresenta métodos para fabricação e caracterização de duas formulações distintas de nanopartículas lipídicas integradas com verteporfina (VP): (1) lipossomos acionados por luz, compostos por DOTAP, DOPE, colesterol e VP, para entrega de complexos ribonucleoproteicos (RNP) CRISPR-Cas9; e (2) lipossomos acionados por raios X, compostos por DOTAP, DOPC, VP e nanopartículas de ouro, para liberação controlada de fármacos quimioterápicos. Após ativação em 690 nm (luz visível) ou por radiação clínica de raios X (6 MeV), a VP gera oxigênio singlete que oxida componentes lipídicos insaturados, desestabilizando a membrana da nanopartícula e liberando as cargas encapsuladas. São fornecidos protocolos para formulação de lipossomos por hidratação de filme fino e extrusão de membrana, caracterização físico-química, avaliação da liberação de carga acionada por luz e raios X, derrubamento gênico in vitro em células humanas e validação in vivo utilizando um sistema quantitativo de relatório visual em peixe-zebra e um modelo de tumor xenoenxertado em camundongo. Resultados representativos demonstram o derrubamento de até aproximadamente 326 fibras musculares lentas por embrião de peixe-zebra por ativação com luz e supressão significativa do crescimento tumoral por liberação de doxorrubicina acionada por raios X. O precedente clínico para ativação da verteporfina em 689–690 nm no olho motiva a avaliação dessa plataforma para entrega oftálmica, embora a biodistribuição retiniana, farmacocinética e segurança em animais de grande porte ainda precisem ser estabelecidas. Estes métodos fornecem uma abordagem experimental com potencial translacional para liberação terapêutica de cargas controlada externamente. 

Introdução

As nanopartículas lipídicas (LNPs) surgiram como a plataforma de entrega não viral mais clinicamente validada para terapêuticas com ácidos nucleicos, conforme demonstrado por sua utilização nas vacinas de mRNA contra a COVID-191. No entanto, as LNPs convencionais liberam seu conteúdo após a internalização celular por meio da fuga endossomal, não oferecendo controle externo sobre o momento, localização ou extensão da entrega do carregamento2. A ausência desse controle espaço-temporal limita sua utilidade em aplicações nas quais a liberação precisa e sob demanda é terapeuticamente vantajosa, incluindo edição gênica específica de local, quimioterapia direcionada em tumores heterogêneos e silenciamento gênico titulado em órgãos anatomicamente acessíveis, como o olho3,4.

A terapia fotodinâmica (TFD) oferece um mecanismo bem estabelecido para efeitos biológicos acionados externamente. Após a ativação em comprimentos de onda específicos, os fotossensibilizadores geram oxigênio singlete (1O2) e outras ESP que podem oxidar biomoléculas próximas5. O verteporfirina (VP), um derivado de benzoporfirina aprovado clinicamente como Visudyne para o tratamento fotodinâmico de neovascularização coroidal subfóvea na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), é particularmente adequado como componente fotossensibilizador em nanopartículas6. O VP é ativado clinicamente em 689 nm para terapia fotodinâmica oftálmica, fornecendo um precedente estabelecido de entrega de luz ocular6,7,8. O VP apresenta atividade fotodinâmica aproximadamente quatro vezes maior do que os derivados de hematoporfirina de primeira geração em comprimentos de onda com boa penetração nos tecidos6.

Essa dupla funcionalidade, na qual o VP atua simultaneamente como um fotossensibilizador aprovado clinicamente e como um gatilho sensível à luz para a liberação de carga de nanopartículas, constitui a base mecanicista dos protocolos descritos aqui. Quando integrado à bicamada lipídica em baixas razões molares, o VP gera 1O2 sob iluminação, o qual, de acordo com a literatura anterior, propõe-se oxidar as cadeias acil de fosfolipídios insaturados, desestabilizando a membrana e liberando as cargas encapsuladas9. O curto raio de difusão do 1O2 (~20 nm em ambientes biológicos) restringe a desestabilização da membrana à vizinhança imediata do fotossensibilizador, minimizando danos à carga enquanto interrompe eficientemente a bicamada9,10. Além disso, o modo de ativação por raios X supera a limitação da profundidade de penetração nos tecidos imposta pela luz visível. Quando nanopartículas de ouro (3–5 nm) são coembutidas na bicamada lipídica, a irradiação clínica com raios X (6 MeV) potencializa a ativação do VP por meio da transferência de energia mediada por elétrons Auger, ampliando a aplicabilidade para tumores profundos11,12. Medições diretas de oxigênio singlete utilizando o corante Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) confirmam que a geração de 1O2 aumenta com a dose de raios X e é potencializada em aproximadamente 1,4 vez pela co-carga com nanopartículas de ouro em comparação ao VP isolado11.

Esta plataforma possui relevância translacional particular para a terapia gênica oftálmica. Os tratamentos atuais com anti-VEGF para a DMA exsudativa exigem injeções intravítreas frequentes, cujos resultados no mundo real declinam em caso de subtratamento crônico13,14, enquanto as terapias gênicas emergentes com AAV reduzem esse ônus, mas expressam o anti-VEGF constitutivamente15,16 e, portanto, não podem ser tituladas nem interrompidas, o que representa uma preocupação diante da associação entre supressão sustentada do VEGF e atrofia geográfica, isquemia retiniana e fibrose17,18. Uma abordagem baseada em CRISPR acionada por luz, utilizando lipossomos VP, poderia, ao contrário, permitir uma eliminação do VEGF-A controlada pelo clínico e delimitada espacialmente, proporcionando controle clínico sobre o direcionamento espacial e temporal do evento inicial de edição, ao mesmo tempo que mantém a durabilidade da edição gênica. O mesmo princípio de liberação acionada se estende às distrofias retinianas de genes grandes, como a doença de Stargardt (ABCA4)19,20, e ao melanoma uveal, em que os mecanismos convergentes do VP se ajustam bem à biologia do tumor21,22.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer métodos abrangentes e reproduzíveis para fabricar nanopartículas lipídicas integradas com VP utilizando duas formulações distintas, uma ativada por luz visível (690 nm) e outra por radiação de raio-X, além de avaliar a eficácia da entrega em sistemas modelo in vitro e in vivo. Como essas formulações diferem em sua composição lipídica, estratégia de carregamento do fármaco e modalidade de ativação, elas são apresentadas como protocolos separados. Este protocolo destina-se a pesquisadores que investigam plataformas de nanopartículas com liberação acionada, estratégias de entrega baseadas em terapia fotodinâmica, edição gênica controlada espaciotemporalmente ou entrega de fármacos oftálmicos e oncológicos ativada por luz.

Protocolo

Todos os experimentos com animais envolvendo peixe-zebra foram realizados em condições padrão de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Macquarie (ARA: 2015-034). Os experimentos de xenotransplante em camundongos foram realizados em conformidade com o Comitê de Ética Animal da Universidade Macquarie (número de aprovação 2017/001). Todos os procedimentos foram conduzidos em conformidade com a Lei de Pesquisa com Animais de 1985 e o Regulamento de Pesquisa com Animais de 2010.

Parte A: VP-lipossomos ativados pela luz para entrega de CRISPR-Cas9 (baseado em Aksoy et al.9)

1. Preparação de VP-lipossomos ativados por luz encapsulando RNP CRISPR-Cas9

  1. Dissolva DOTAP, DOPE, colesterol (Chol) e VP em 500 µL de clorofórmio numa razão molar de 1:0,94:1:0,06 em um frasco de vidro de fundo redondo9.
    ATENÇÃO: O clorofórmio é tóxico e volátil. Realize todos os passos que envolvem clorofórmio em uma capela de exaustão química utilizando equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas de nitrila e óculos de segurança.
  2. Evapore o clorofórmio sob um fluxo de gás argônio até que uma película fina de lipídio se forme na parede do frasco.
  3. Coloque o frasco sob vácuo (por exemplo, em um liofilizador ou dessecador conectado a uma bomba de vácuo) durante a noite (≥12 h) para remover completamente o solvente residual.
  4. Prepare a solução de hidratação combinando o sgRNA (concentração final de 0,01 µM) e a proteína Cas9 (concentração final de 0,1 mg/mL) em 500 µL de água livre de nucleases9. Incube previamente o sgRNA e a Cas9 à temperatura ambiente por 5 min para permitir a formação do complexo de ribonucleoproteína (RNP) antes da hidratação.
    OBSERVAÇÃO: O complexo RNP é carregado durante a etapa de hidratação, não sendo adicionado após a formação. Isso garante o encapsulamento no interior aquoso do lipossoma.
  5. Hidrate o filme lipídico seco adicionando diretamente 500 µL da solução RNP sobre o filme e misture até que a suspensão fique homogeneizada. Deixe a suspensão lipídica hidratada por 2 h à temperatura ambiente para permitir a hidratação completa dos lipídios.
  6. Extruda-se a suspensão multilamelar resultante 11 vezes através de uma membrana de policarbonato de 200 nm utilizando um mini-extrusor para produzir lipossomos unilamelares de tamanho uniforme9.
    OBSERVAÇÃO: A extrusão, e não a sonicação, é o método de redução de tamanho para esta formulação. Passe a suspensão através da membrana um número ímpar de vezes (11) para garantir que o produto final esteja no lado oposto da membrana em relação ao material inicial, reduzindo a contaminação com vesículas não extrudadas.
  7. Armazene os VP-lipossomos a 4 °C, protegidos da luz. Utilize dentro de 48 h após a preparação para atividade ótima. Esse limite de uso de 48 h é conservador: a liberação de VP permanece abaixo de 3% ao longo de 96 h em FBS a 10%9.
    OBSERVAÇÃO: Para aplicações in vitro e in vivo, prepare e manipule lipossomos utilizando técnica asséptica padrão e esterilize a suspensão final por filtração através de um filtro de 0,22 µm antes do uso.

2. Caracterização físico-química de VP-lipossomos

  1. Dilua a suspensão de lipossomos em uma proporção de 1:100 em água livre de nucleases. Meça o diâmetro hidrodinâmico, o índice de polidispersão (PDI) e o potencial zeta por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Realize todas as medições de DLS em triplicata (n = 3 réplicas técnicas) por amostra e apresente os valores como média ± desvio padrão.
    NOTA: As características esperadas de uma formulação bem-sucedida da Parte A são um diâmetro hidrodinâmico de 167,5 ± 1,9 nm, PDI < 0,3, potencial zeta de +28 ± 1,1 mV e eficiência de encapsulação de Cas9 de aproximadamente 75,09%. As características físico-químicas representativas de formulações bem-sucedidas são resumidas na Tabela 1.9
  2. Para microscopia eletrônica de transmissão (MET), deposite 10 µL da suspensão diluída de lipossomos em uma grade de cobre revestida com carbono. Contracolora com acetato de uranila 2% por 20 s. Obtenha imagens a 100 kV9, adquirindo pelo menos 10 imagens representativas por lote.
ParâmetroParte A: VP-lipossomo
(acionado por luz)		Parte B: VP/AuNP-lipossomo
(acionado por raios X)
Diâmetro hidrodinâmico167,5 ± 1,9 nm~100–150 nm
Índice de polidispersão (PDI)<0,3< 0,3 (típico)
Potencial zeta+28 ± 1,1 mVPositivo (baseado em DOTAP)
Eficiência de encapsulaçãoRNP Cas9: 75,09%Doxorrubicina: carregamento remoto com sulfato de amônio; quantificado após lise com Triton X-100 0,1%
Carregamento de nanopartículas de ouroNão aplicável156 ± 24 AuNPs por lipossomo (ICP-MS)
Estabilidade na liberação de carga<3% de liberação de VP em 96 h em FBS 10%Estável por 48 h em concentrações de 0%, 10%, 25% e 50% de FBS e em pH 7,4, 6,0 e 5,0
Condição de ativaçãoIrradiação com LED em 690 nm, 0,15 mW/cm²Irradiação clínica com raios X de 6 MeV
Carga principalComplexo RNP CRISPR-Cas9Doxorrubicina
Modalidade de ativaçãoLuz visívelRadiação de raios X
Aplicação pretendidaEdição gênica acionadaLiberação acionada de fármaco quimioterápico

Tabela 1: Parâmetros de caracterização físico-química e perfis de estabilidade das duas formulações de verteporfina (VP) em lipossomos. Características representativas das formulações, parâmetros de carregamento, perfis de estabilidade e condições de ativação para a formulação de VP em lipossomos ativada por luz (Parte A) e para a formulação de VP/AuNP em lipossomos ativada por raios X (Parte B). Esses valores fornecem parâmetros esperados de controle de qualidade para a preparação e caracterização bem-sucedidas das formulações e podem ser utilizados como critérios de referência ao reproduzir os protocolos descritos neste trabalho.

3. Liberação de carga acionada por luz e medição de oxigênio singlete

  1. Para ensaios de liberação acionados por luz, prepare VP-lipossomos utilizando a mesma formulação lipídica e protocolo de hidratação/extrusão. Distribua 100 µL da suspensão de lipossomos em PBS em um dispositivo de diálise suspenso em 12 mL de PBS sob agitação a 80 rpm.
  2. Irradie as amostras com uma fonte de luz LED de 690 nm a 0,15 mW/cm2 por intervalos definidos (2, 4 e 6 min)9.
  3. Colete amostras do dializado externo aos 0, 1, 3, 6 e 24 h e quantifique o VP liberado por fluorescência; obtenha o VP total lisando uma alíquota equivalente com 0,1% de Triton X-100.
  4. Calcule a liberação de VP como Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, em que Ft, F0 e Fmax são os valores de fluorescência no tempo t, na linha de base e após a lise com Triton, respectivamente (n = 3).
  5. Confirme a desestabilização da membrana medindo a alteração no diâmetro hidrodinâmico por DLS antes e após a irradiação.
    NOTA: Proteja todas as amostras contendo VP da luz ambiente durante a preparação e o armazenamento. Utilize tubos âmbar ou envolva com papel alumínio.

4. Transfecção in vitro e ensaio de eliminação gênica

  1. Semeie células HEK293-GFP (ou uma linha repórter equivalente) em placas de 96 poços numa densidade apropriada para cerca de 70% de confluência no momento do tratamento. Cultive as células em meio completo (DMEM + 10% FBS + 1% penicilina–estreptomicina) a 37°C e 5% CO2.
  2. Adicione VP-lipossomos encapsulando RNP de sgRNA/Cas9 anti-GFP aos poços a 50 ug/mL. Para análise por microscopia de fluorescência, incube por 2 h; para análise por citometria de fluxo, incube por 1 h.
  3. Substitua o meio por meio completo fresco. Irradie os poços tratados com luz LED de 690 nm a 0,15 mW/cm². Para análise por microscopia de fluorescência, irradie por 2, 4 ou 6 min; para análise por citometria de fluxo, irradie por 4 min. Inclua controles escuros (lipossomos sem irradiação) e controles de luz apenas (irradiação sem lipossomos).
  4. Avalie a interrupção do GFP 48 h após o tratamento por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
    NOTA: Os RNAs guia devem ser validados antes do uso. No estudo original, os guias candidatos a eGFP foram testados quanto à eficiência de corte por meio de análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), e o guia selecionado (sg_eGFP_06) alcançou 88,24% de corte. O risco de efeitos fora do alvo foi minimizado in silico mediante confirmação da unicidade do guia (BLASTN contra o genoma de referência usando Bowtie/Bowtie2, sem tolerância a erros nas dez primeiras bases 3’). A sequenciação genômica abrangente para detecção de alvos fora do alvo não foi realizada e é uma etapa recomendada para a translação terapêutica9.
  5. Para medir a eficiência de encapsulação, centrifugue uma amostra de lipossomos a 15.000 rpm durante 1 h a 4 °C, seguido de filtração do sobrenadante através de um filtro de seringa Whatman Anotop 10 de 20 nm.
  6. Quantifique a Cas9 livre (não encapsulada) no filtrado por ensaio proteico BCA.
  7. Calcule a eficiência de encapsulação como EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, onde Ctot é a quantidade total de Cas9 adicionada e Csup é a quantidade de Cas9 não encapsulada recuperada no sobrenadante. Consulte Tabela 1 para obter métricas representativas de desempenho da formulação e eficiências de encapsulação esperadas.

5. Validação in vivo: ensaio com repórter visual em peixe-zebra

  1. Prepare a MasterMix de injeção combinando lipossomos VP encapsulando sgRNA direcionado ao eGFP e proteína Cas9 nas proporções especificadas no protocolo original9. A MasterMix final de 8 µL contém 3,5 µL de sgRNA (75 ng/µL), 1,0 µL de proteína Cas9 (500 ng/µL), 2,5 µL de lipossomos VP e 1,0 µL de fenol vermelho. Para a MasterMix controle, substitua 2,5 µL de lipossomos por água livre de nucleases.
  2. Microinjete 2 nL da MasterMix na célula (não na gema) de embriões de peixe-zebra em estágio de uma célula, utilizando um sistema de microinjeção calibrado9.
    CAUTION: Realize todos os procedimentos com peixe-zebra sob protocolos éticos de animais aprovados. Manipule os embriões com cuidado para minimizar danos mecânicos durante a injeção.
  3. Às 2 horas pós-fertilização (hpf), irradie os embriões injetados com luz LED de 690 nm a 0,15 mW/cm2 por durações definidas (por exemplo, 0, 1, 2 e 5 min) para ativar a liberação da carga9.
  4. Às 72 hpf, anestesie os embriões em Tricaine e monte-os em agarose de ponto de fusão baixo a 1%. Utilizando a linhagem transgênica repórter smyhc1:eGFP, quantifique a eliminação de fibras musculares lentas pela perda de fluorescência de eGFP, utilizando um microscópio de fluorescência invertido e um microscópio confocal.
  5. Adquira imagens com foco empilhado e conte as fibras musculares lentas negativas para eGFP (eliminadas) por embrião, analisando tipicamente 16 embriões por grupo (por exemplo, no Imaris)9.
    NOTE: Este ensaio fornece uma leitura visual e quantitativa da eficiência de eliminação gênica. Na linhagem repórter smyhc1:eGFP, as fibras musculares lentas normalmente são positivas para eGFP; a eliminação bem-sucedida é determinada pela perda de fluorescência de eGFP nessas fibras9.

Parte B: VP-lipossomos ativados por raios X para entrega de fármacos quimioterápicos (baseado em Deng et al.11)

6. Preparação de lipossomos VP/AuNP ativados por raios X carregados com doxorrubicina

  1. Combine 350 µL de DOTAP (100 mg/mL em clorofórmio) e 370 µL de DOPC (100 mg/mL em clorofórmio) em um frasco de vidro de fundo redondo e complete até um volume total de 1,0 mL com clorofórmio11.
    NOTA: A Parte B utiliza DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina), não DOPE. As duas formulações diferem em seu lipídio auxiliar, e essa distinção é crítica para a reprodutibilidade.
  2. Adicione 50 µL de VP (2,3 mg/mL em DMSO) e 40 µL de uma suspensão de nanopartículas de ouro (diâmetro de 3–5 nm) à mistura lipídica. Isso resulta em aproximadamente 156 ± 24 nanopartículas de ouro por lipossomo, conforme quantificado por ICP-MS11.
    NOTA: As nanopartículas de ouro devem ter diâmetro de 3–5 nm para se incorporarem à bicamada lipídica. Partículas maiores (por exemplo, 50 nm) não se incorporarão à membrana e não mediarão a transferência de energia de elétrons Auger necessária para a ativação por raios X11.
    NOTA: A formulação básica descrita aqui é não direcionada. No estudo original, uma modificação opcional de direcionamento ativo foi introduzida pela inserção pós-síntese de DSPE-PEG2000-Folato para direcionar os lipossomos a células tumorais que expressam receptores de folato; este passo pode ser adicionado sem alterar o mecanismo central de liberação de VP/AuNP11.
  3. Evapore o clorofórmio sob argônio e seque sob vácuo durante a noite conforme descrito nos passos 1.2–1.3.
  4. Hidrate o filme lipídico com 1,0 mL de tampão sulfato de amônio 250 mM (pH 5,5). Agite em vórtex, deixe a suspensão hidratada durante a noite e, em seguida, extruda 11 vezes através de uma membrana de policarbonato de 200 nm11.
  5. Remova o sulfato de amônio livre por diálise contra PBS (pH 7,4) a 4 °C com quatro trocas de tampão, para estabelecer um gradiente transmembranar de sulfato de amônio.
  6. Carregue a doxorrubicina (Dox) incubando os lipossomos dialisados numa razão ponderal fármaco/lipídio de 1:10 a 60 °C por 1 h11. O gradiente de sulfato de amônio promove o acúmulo de Dox no interior do lipossomo.
  7. Remova a Dox não encapsulada por diálise contra PBS a 4 °C com quatro trocas de tampão.
  8. Caracterize os lipossomos carregados por DLS (tamanho esperado: ~100–150 nm) e meça a eficiência de encapsulação lise os lipossomos com 0,1% de Triton X-100 e quantifique a fluorescência de Dox (excitação em 485 nm, emissão em 590 nm).
    NOTA: Formulações bem-sucedidas da Parte B tipicamente exibem um diâmetro hidrodinâmico de aproximadamente 100–150 nm, PDI < 0,3 e incorporação de aproximadamente 156 ± 24 nanopartículas de ouro por lipossomo. As características físico-químicas representativas são resumidas na Tabela 1.11

7. Liberação de fármaco acionada por raios X e citotoxicidade in vitro

  1. Irradie vesículas lipossomais VP/AuNP carregadas com cálcina usando um acelerador linear clínico (feixe de fótons de 6 MeV) em doses definidas (1, 2 e 4 Gy)11. Quantifique a liberação da carga mensurando a fluorescência da cálcina (excitação em 485 nm, emissão em 510 nm) e obtenha a liberação total após a desestabilização com Triton X-100 a 0,1%."
  2. Para ensaios de citotoxicidade, plaque células de câncer colorretal humano HCT116 em placas de 96 poços (por exemplo, 2 × 104 células/mL em FBS a 10%).
  3. Trate as células com vesículas lipossomais VP/AuNP carregadas com Dox e irradie com raios X conforme descrito acima, incluindo controles apenas com LipoDox, apenas com raios X e sem tratamento. Avalie a viabilidade celular pelo ensaio MTS em 0, 2, 4 e 24 h após irradiação com 4 Gy11.

8. Validação in vivo: modelo de tumor a xenotransplante em camundongo

  1. Inocule camundongos fêmeas BALB/c nu de 6–7 semanas de idade subcutaneamente na região lateral com 5 × 106 células HCT116 em 100 µL de meio McCoy’s 5A sem soro11.
  2. Quando os tumores atingirem aproximadamente 100 mm3, injete lipossomos de VP/AuNP carregados com Dox (equivalente a 10 mg/kg de Dox) diretamente no tumor, em um volume de 20 µL11.
  3. Após 24 h da injeção, irradie os tumores com radiação de raios X de 4 Gy (6 MeV) utilizando um acelerador linear clínico, com proteção adequada dos tecidos não-alvo.
  4. Monitore o volume tumoral a cada dois dias utilizando paquímetros digitais. Calcule o volume tumoral pela fórmula V = (π/6) × L × W2, onde L é a maior dimensão e W é a largura perpendicular11.
  5. No ponto final do experimento, excise os tumores, fixe-os em formalina tamponada neutra a 10% e prepare seções criostáticas de 6 µm para análise histológica (coloração H&E)11.

9. Análise estatística

  1. Dados quantitativos são apresentados como média ± desvio padrão (DP), salvo indicação em contrário.
  2. As análises estatísticas para os estudos de eliminação gênica em peixe-zebra foram realizadas utilizando ANOVA a um critério, enquanto comparações entre dois grupos foram analisadas utilizando o teste t de Student bicaudal, conforme relatado nos estudos originais. A significância estatística foi definida como p < 0,05.
  3. Para os estudos com lipossomos ativados por raios X, os conjuntos de dados de crescimento tumoral, peso corporal, liberação de carga e análises histológicas foram analisados utilizando testes t de Student, conforme descrito na publicação original.
  4. A definição de n para cada experimento é fornecida nas legendas das figuras correspondentes.
  5. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism versão 7.0 (GraphPad Software).
    NOTA: Este protocolo reproduz fluxos de trabalho experimentais e conjuntos de dados representativos de estudos previamente publicados. Os leitores devem consultar as publicações originais para obter detalhes completos de análise estatística, quando aplicável9,11.

Resultados

Edição gênica acionada por luz (Parte A):

Seguindo o protocolo da Parte A, os lipossomos VP que encapsulam o RNP CRISPR-Cas9 exibiram liberação de carga dependente da luz. Uma liberação mínima foi observada em condições de escuro, enquanto a irradiação em 690 nm (0,15 mW/cm2) produziu uma liberação dependente da dose, que aumentou com o tempo de iluminação (Figura 1A)9. O ensaio com o relatório eGFP em peixe-zebra forneceu uma leitura visual quantitativa da eficiência de interrupção gênica. Embriões ativados pela luz mostraram interrupção de 308,37 ± 40,21 fibras musculares lentas positivas para eGFP por embrião, em comparação com 53,15 ± 35,38 fibras nos controles em escuro (n = 80), aumentando para 326,12 ± 36,55 fibras após 5 minutos de irradiação (n = 60) (Figura 1B,C)9. In vitro, os lipossomos VP ativados pela luz alcançaram silenciamento de GFP comparável ao do Lipofectamine 2000 (redução de aproximadamente 53% versus 50%), fornecendo exclusivamente controle espaciotemporal regulado por luz (Figura 1C)9. Esses resultados demonstram controle espaciotemporal, já que a mesma formulação de nanopartículas produziu eficiências de interrupção gênica claramente distintas dependendo da exposição à luz (Figura 1A–C).

Método de edição gênica fotoquímica; CRISPR-Cas9, microscopia de fluorescência induzida por LED, resultados experimentais, medição de intensidade.
Figura 1. Liberação do CRISPR-Cas9 acionada por luz e interrupção gênica espacial e temporal em embriões de peixe-zebra. (A) Ilustração esquemática de lipossomos contendo verteporfina (VP) (DOTAP:DOPE:Col:VP = 1:0,94:1:0,06) encapsulando complexos de ribonucleoproteína Cas9/sgRNA (RNP). Após irradiação com luz de 690 nm, a VP gera espécies reativas de oxigênio que desestabilizam a membrana lipossomal e desencadeiam a liberação intracelular da carga do CRISPR-Cas9. (B) Imagens representativas de fluorescência de embriões de peixe-zebra smyhc1:eGFP 72 horas após a fertilização (hpf), após tratamento com lipossomos contendo VP e durações crescentes de exposição à luz (0, 1, 2 e 5 min; 690 nm, 0,15 mW/cm2). A perda da fluorescência eGFP indica a interrupção das fibras musculares lentas. Os quadros internos mostram vistas ampliadas das regiões destacadas. (C) Quantificação da intensidade de fluorescência e do número de fibras musculares lentas interrompidas por embrião, demonstrando a ativação do CRISPR-Cas9 e a interrupção gênica dependentes da luz. Os dados são apresentados como média ± DP. Os experimentos com peixe-zebra foram analisados por ANOVA unidirecional (n = 80 embriões para medições de intensidade de fluorescência e n = 60 embriões para análise de contagem de fibras; p < 0,0001). Os experimentos de validação em HEK293-GFP foram analisados usando um teste t bicaudal (n = 4). Barras de escala = 500 µm (imagens gerais) e 100 µm (imagens ampliadas). Adaptado com permissão de Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados subótimos no ensaio com peixe-zebra podem incluir: (a) menos de 50 fibras rompidas por embrião, indicando qualidade inadequada dos lipossomos, atividade insuficiente de Cas9 ou dose de luz subótima; (b) mortalidade de embriões superior a 20%, sugerindo dano mecânico durante a microinjeção ou fototoxicidade excessiva do VP; ou (c) fibras rompidas em controles não irradiados, indicando vazamento prematuro de carga da formulação lipossomal.

Liberação de fármacos acionada por raios X (Parte B):

Os lipossomos VP/AuNP preparados de acordo com o protocolo da Parte B mostraram liberação de calceína dependente da dose ao longo de 1–4 Gy (Figura 2A,B)11. No modelo de xenoenxerto HCT116, camundongos que receberam lipossomos VP/AuNP carregados com Dox seguidos de irradiação com raios X de 4 Gy apresentaram supressão significativa do crescimento tumoral em comparação com Dox livre, raios X isolados e controles de lipossomos não irradiados (Figura 2C)11. A análise histológica de seções tumorais revelou áreas necróticas maiores no grupo com tratamento combinado, conforme avaliado pela coloração H&E (Figura 2D).

Terapia contra o câncer com lipossomos direcionados por raios X; gráficos sobre liberação de calceína, tamanho do tumor e análise de necrose.
Figura 2. Liberação de doxorrubicina acionada por raios X e supressão do crescimento tumoral. (A) Ilustração esquemática de lipossomos integrados com verteporfina (VP) e nanopartículas de ouro (AuNP), contendo doxorrubicina (Dox). A exposição à radiação de raios X ativa a VP por meio da transferência de energia mediada por AuNP, gerando oxigênio singlete que desestabiliza a bicamada lipídica e desencadeia a liberação da carga. (B) Perfis de liberação de calceína de lipossomos expostos a doses crescentes de raios X (0–4 Gy), demonstrando liberação da carga dependente da dose a partir de lipossomos VP/AuNP. As barras de erro representam o desvio padrão de quatro medições. (C) Medidas de volume tumoral (esquerda) e peso corporal (direita) em camundongos com xenoenxertos HCT116 tratados com PBS, LipoDox, raios X isolados ou LipoDox acionado por raios X. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 4 camundongos por grupo). A significância estatística foi avaliada usando o teste t (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001). (D) Cortes tumorais representativos corados com hematoxilina e eosina (H&E) e análise morfométrica da área média de necrose tumoral. Setas indicam regiões necróticas representativas. Os gráficos de caixa mostram a mediana e o intervalo interquartílico, com os bigodes estendendo-se até 1,5 × IQR. Os dados foram analisados usando o teste t (n = 5). Barra de escala = 50 µm. Adaptado de Deng et al.11 nos termos da Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Internacional. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados subótimos no modelo de xenotransplante podem incluir: (a) nenhuma diferença no crescimento tumoral entre os grupos de lipossomos irradiados e não irradiados, indicando liberação insuficiente mediada pelo VP ou incorporação inadequada de nanopartículas de ouro; ou (b) toxicidade sistêmica (perda de peso > 15%), sugerindo vazamento de Dox dos lipossomos antes da ativação por raios X.

Discussão

Várias etapas desses protocolos são fundamentais para o sucesso. Na Parte A, a proporção molar dos lipídios (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) deve ser mantida com precisão, pois a concentração de VP determina diretamente a magnitude da geração de 1O2 e, consequentemente, a eficiência da liberação da carga9. A incorporação do RNP Cas9/sgRNA durante a etapa de hidratação, e não por meio de complexação pós-formação, é essencial para o encapsulamento no núcleo aquoso. A extrusão através de uma membrana de policarbonato de 200 nm (11 passagens) produz vesículas unilamelares uniformes; a sonicação não deve ser substituída, pois pode desnaturar a proteína Cas9. Para a Parte B, o tamanho das nanopartículas de ouro (3–5 nm) é crítico, pois as partículas devem ser pequenas o suficiente para se incorporarem à bicamada lipídica, permitindo uma transferência eficaz de energia por elétrons Auger ao VP sob irradiação com raios X11. O método de gradiente de sulfato de amônio utilizado para o carregamento da Dox exige a diálise completa do sulfato de amônio externo antes da adição do fármaco; uma diálise incompleta reduzirá a eficiência de carregamento.

A composição lipídica pode ser adaptada para diferentes aplicações mantendo o mecanismo de liberação mediado pelo VP. Por exemplo, substituir uma fração do DOTAP por um lipídio PEGilado (por exemplo, DSPE-PEG2000 a 5 mol%) pode melhorar o tempo de circulação para administração sistêmica, embora isso reduza a carga superficial positiva e possa diminuir a captação celular in vitro2. Se as medidas de DLS mostrarem PDI > 0,3, aumente o número de passagens de extrusão ou verifique a integridade da membrana. Se a geração de oxigênio singlete for baixa apesar da incorporação correta do VP, verifique o comprimento de onda e a densidade de potência da fonte de luz LED com um medidor de potência calibrado, já que a ativação do VP é específica para o comprimento de onda (excitação máxima a 425 nm para a banda de Soret e ativação terapêutica a 689–690 nm para a banda Q)9. Para o ensaio com peixe-zebra, se a mortalidade de embriões exceder 20% nos grupos tratados, reduza o volume de injeção ou a concentração de lipossomos para minimizar a fototoxicidade associada ao VP. Um quadro estruturado de solução de problemas, vinculado aos parâmetros da Tabela 1, é o seguinte. PDI > 0,3: aumente o número de passagens de extrusão e verifique a integridade da membrana. Liberação induzida baixa ou ausente apesar da incorporação correta do VP: confirme a emissão a 690 nm com um medidor de potência calibrado e verifique a razão molar do VP. Menos de cerca de 50 fibras musculares lentas com genes interrompidos por embrião: refaça os lipossomos, confirme a atividade do RNP ou aumente o tempo de irradiação. Perda do sinal de eGFP em controles não irradiados: verifique as condições de armazenamento utilizando os lipossomos dentro de 48 h após a preparação e armazenando-os a 4°C no escuro, e confirme a estabilidade da membrana. No modelo de xenoenxerto, ausência de diferença entre os grupos de lipossomos irradiados e não irradiados indica a necessidade de confirmar a incorporação de nanopartículas de ouro de 3–5 nm e verificar a dose de raios X administrada.

A principal limitação do modo acionado por luz (Parte A) é a profundidade de penetração da luz de 690 nm, o que restringe a ativação direta a tecidos superficialmente acessíveis ou àqueles passíveis de entrega de luz por fibra óptica5. O modo acionado por raios X (Parte B) supera essa limitação de profundidade, mas exige acesso a um acelerador linear clínico e expõe os tecidos circundantes à radiação ionizante, ainda que em doses terapêuticas11,12. Ambas as formulações dependem atualmente do DOTAP, um lipídio catiônico associado à citotoxicidade dependente da dose, o que pode limitar a janela terapêutica para administração sistêmica2. A natureza transitória da edição gênica mediada por RNP é vantajosa para a segurança, mas significa que uma eliminação incompleta em uma população-alvo de células não pode ser potencializada por doses repetidas no mesmo local sem a readministração de nanopartículas. Além disso, esses protocolos foram validados em linhagens celulares e modelos de pequenos animais; a transposição para modelos de animais maiores e, eventualmente, para aplicação clínica humana exigirá otimização da formulação, estudos farmacocinéticos e avaliação toxicológica formal sob condições GLP. Em particular, este protocolo não inclui dados farmacocinéticos, de biodistribuição ou de penetração na retina. Embora a penetração da luz através dos tecidos oculares e outros seja bem caracterizada na literatura quanto à dependência de comprimento de onda, pigmentação e tipo tecidual (e possa ser aumentada com agentes de clareamento óptico), estudos quantitativos farmacocinéticos, de biodistribuição e de entrega retiniana permanecem como próximos passos importantes antes que reivindicações translacionais possam ser comprovadas.

Sistemas convencionais de nanopartículas lipídicas (LNP), incluindo aqueles utilizados em vacinas de mRNA, liberam cargas de forma passiva após a internalização celular por escape endossomal e não oferecem controle temporal ou espacial sobre a entrega1,2. Vetores virais como o AAV proporcionam entrega gênica eficiente, mas são limitados pela capacidade de empacotamento (~4,7 kb), imunogenicidade em doses repetidas e expressão constitutiva do transgene que não pode ser modulada após a administração3. A plataforma de lipossomos VP resolve essas limitações ao fornecer um mecanismo de liberação controlável externamente, independente do tipo de carga, compatível com grandes cargas (proteínas, complexos RNP e moléculas pequenas), não viral e potencialmente compatível com administração repetida, sujeita a estudos de imunogenicidade e toxicologia em doses repetidas. Diferentemente de sistemas optogenéticos ou termicamente responsivos, a abordagem baseada em VP utiliza um fotossensibilizador aprovado clinicamente com dados de segurança já estabelecidos e infraestrutura clínica de laser já existente, especialmente na oftalmologia, onde o laser Visudyne de 689 nm já é equipamento padrão6. Sang et al. demonstraram ainda que nanopartículas híbridas lipídio-polímero contendo VP aumentam a eficácia da terapia radiodinâmica em modelos de câncer colorretal, confirmando a adaptabilidade da geração de ESP mediada por VP em diferentes arquiteturas de nanopartículas12.

Os métodos descritos aqui têm relevância particular para três condições oftálmicas. Na DMAE neovascular, a carga de injeções anti-VEGF continua sendo uma barreira crítica para resultados ideais. Dados de registros do mundo real mostram subtratamento acentuado em comparação com os protocolos dos ensaios clínicos (uma média de 7,3 versus 12 injeções no primeiro ano, com 38,8% dos pacientes descontinuando o tratamento e ganho mínimo de acuidade visual)14, bem como declínio visual a longo prazo apesar da administração frequente23. As terapias gênicas com AAV em desenvolvimento para reduzir essa carga—ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416 e o 4D-150 com designação RMAT (redução de 83% nas injeções)24—expressam transgenes anti-VEGF constitutivamente e não podem ser titulados nem interrompidos. Isso representa uma preocupação potencial, dada a evidência que associa a supressão contínua do VEGF à atrofia geográfica (CATT17; uma meta-análise com 4.609 olhos18; e prevalência de atrofia aumentando para 78,3% ao longo de oito anos25). Um sistema de lipossomos ativado por luz carregando CRISPR-Cas9 direcionado ao VEGF-A poderia, em vez disso, permitir um desligamento gênico espacialmente delimitado, proporcionando ao clínico controle espacial e temporal sobre o evento inicial de edição, ao mesmo tempo que mantém a durabilidade da edição gênica. Estudos pré-clínicos apoiam a viabilidade dessa abordagem. A coentrega por LNP de mRNA de Cas9 e sgRNA direcionado ao VEGFA reduziu a neovascularização coroidal induzida por laser (CNV) em camundongos26, variantes de LNP com PEG alcançaram edição genômica no epitélio pigmentado da retina (RPE)27, e LNPs guiados por peptídeos entregaram mRNA aos fotorreceptores em primatas não humanos28. No entanto, nenhuma terapia gênica retiniana baseada em LNP entrou em ensaios clínicos até o início de 202629, destacando a oportunidade translacional. Na doença de Stargardt, a sequência codificadora do ABCA4, com aproximadamente 6,8 kb, excede a capacidade de empacotamento do AAV, exigindo estratégias com vetores duplos que apresentam eficiência de transdução reduzida19. Os candidatos clínicos incluem as plataformas de AAV duplo SB-007 e VG80130, juntamente com a terapia modificadora independente de gene OCU410ST31. A entrega não viral de ácidos nucleicos pode contornar as limitações de empacotamento do AAV. Nanopartículas PEG-ECO carregando um plasmídeo ABCA4 reduziram o acúmulo de A2E em camundongos Abca4-/-20, enquanto outros estudos demonstraram a entrega de grandes construtos de DNA retiniano32 e a expressão mediada por LNP de mRNA em tecidos oculares33. Como o tratamento localizado da mácula e da fóvea é suficiente para preservar a visão central, os lipossomos VP são particularmente adequados para entregar altas concentrações de carga terapêutica gênica precisamente nessas regiões. No melanoma uveal, a verteporfina age por meio de três mecanismos complementares: citotoxicidade mediada por PDT, inibição da via YAP/TAZ (com a expressão de YAP1 correlacionando-se com os marcadores metastáticos mais fortes, monossomia 3 e perda de BAP1)21 e morte celular imunogênica por ativação da via cGAS-STING. A combinação da inibição de YAP mediada por VP e PDT com terapia anti-PD-L1 converteu tumores imunologicamente frios em tumores imunologicamente ativos, suprimindo acentuadamente o crescimento tumoral e prolongando a sobrevida em modelos ortotópicos22. Esses achados são consistentes com a taxa de resposta de 80% relatada para a PDT baseada em verteporfina como tratamento primário para melanoma coroidal34. A acessibilidade óptica do olho para ativação em 689 nm, juntamente com a localização bem definida da maioria dos melanomas uveais, posiciona os lipossomos VP como uma plataforma promissora para entregar tratamento localizado, potencialmente reduzindo a morbidade associada às abordagens atuais de braquiterapia e feixe de prótons.

Além das aplicações oftálmicas e oncológicas discutidas acima, a plataforma de lipossomos VP é aplicável a qualquer contexto terapêutico que exija liberação de carga útil controlada externamente e sob demanda. Aplicações potenciais incluem edição gênica acionada por luz em condições dermatológicas acessíveis à iluminação transcutânea, liberação de quimioterapia acionada por raios X sincronizada com os esquemas clínicos de fracionamento da radioterapia e interrupção gênica espacialmente padronizada para estudos em biologia do desenvolvimento. Vários sistemas de edição gênica fotoativáveis já foram demonstrados em tecidos não retinianos, incluindo o editor de bases fotoativável Mag-ABE para edição do genoma com controle espaço-temporal in vivo35 e um sistema de nanopartículas de conversão ascendente ativadas por luz NIR para edição espacialmente e temporalmente controlada do CRISPR-Cas9 e terapia fotodinâmica36. Em oftalmologia, o crescente interesse em estratégias duradouras de supressão do VEGF destaca ainda mais a necessidade de sistemas de entrega que combinem eficácia terapêutica de longo prazo com controle externo sobre o momento e a localização da atividade biológica37. A integração desses métodos de fabricação com tecnologias emergentes de entrega de LNP na retina e sistemas de edição gênica fotoativáveis representa uma convergência de componentes individualmente validados, cuja aplicação combinada no olho permanece como uma fronteira de pesquisa aberta e potencialmente de alto impacto. O trabalho contínuo em nosso grupo está voltado para a otimização de formulações para vias de administração subretiniana e intravítrea, avaliação de perfis de segurança em modelos oculares de grandes animais e adaptação do modo acionado por raios X para uso simultâneo com protocolos clínicos padrão de radioterapia.

Divulgações

Y.A.A. é diretor e co-fundador da EosGene Therapeutics Pty Ltd, empresa que detém patentes relacionadas à tecnologia de nanopartículas lipídicas ativadas por luz descrita neste documento. E.M.G. e W.D. são co-fundadores da EosGene Therapeutics.

Agradecimentos

Os autores agradecem às instalações e à assistência técnica fornecidas pela Zebrafish Facility da Macquarie University (trabalho com zebrafish) e pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Macquarie University. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo ARC Centre of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CE140100003). Os autores também agradecem ao apoio da EosGene Therapeutics Pty Ltd.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Membrana de filtração de 20 nm (Anotop 10 ou equivalente)Whatman (Cytiva)N/AUtilizada para separação do Cas9 livre durante medições de eficiência de encapsulamento
Fonte de luz LED de 690 nmThorlabsM690L4Fonte de luz para acionamento da liberação do conteúdo lipossomal mediada por VP; densidade de potência ajustável
Antibiótico–Antimicótico (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Suplemento para cultura celular; concentração final de 1%
Cilindro e regulador de gás argônioN/AN/AUtilizados para evaporação do solvente durante a preparação do filme lipídico
Extrusor manual Avanti MiniAvanti Polar Lipids610000Sistema de extrusão manual utilizado com membranas de policarbonato de 200 nm para padronização do tamanho dos lipossomos
Camundongos BALB/c nu (fêmeas, 5–6 semanas)Animal Resources CentreN/ACamundongos imunodeficientes utilizados para modelo de tumor xenoenxertado HCT116
Kit de ensaio de proteína BCAThermo Fisher ScientificN/AUtilizado para quantificação do Cas9 livre e medições de eficiência de encapsulamento
Sistema de imagem Bio-Rad ChemiDoc MPBio-Rad Laboratories12003154Sistema de imagem para géis e blotagens de western
CalceínaSigma-AldrichC0875Corante fluorescente para ensaios de liberação; autoextinção em altas concentrações
Espectrofotômetro Cary 5000 UV-Vis-NIRAgilent TechnologiesN/AEspectroscopia de absorção UV-Vis de lipossomos e verteporfina
Células CCD841 CoN (epiteliais normais do cólon humano)ATCCCRL-1790Linhagem celular de epitélio do cólon normal; utilizada como controle não canceroso
ClorofórmioSigma-Aldrich288306Solvente orgânico para preparação do filme lipídico
ColesterolSigma-AldrichC8667Componente da membrana lipossomal utilizado na formulação acionada por luz
Acelerador linear clínico (feixe de fótons de 6 MeV)Varian Medical SystemsN/AFonte clínica de raios X para estudos de irradiação
Paquímetro digitalN/AN/AUtilizado para medições do volume de tumores xenoenxertados
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)Sigma-Aldrich472301Solvente para preparação do estoque de verteporfina
DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina)Avanti Polar Lipids850375PComponente lipídico utilizado na formulação acionada por raios X
DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina)Sigma-AldrichP1223Lipídio auxiliar utilizado na formulação acionada por luz
DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano)Avanti Polar Lipids890890PLipídio catiônico utilizado em ambas as formulações
Doxicorrubicina cloridratoSigma-AldrichD1515Fármaco quimioterápico carregado em lipossomos acionados por raios X
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PLipídio PEGilado utilizado na formulação acionada por raios X
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092Meio de cultura celular para células HEK293 e PC12
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144Tampão de lavagem
Soro bovino fetal (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141Suplemento para cultura celular; concentração final de 10%
Espetrofluorômetro Fluorolog-Tau3HORIBA ScientificN/AEspectroscopia de fluorescência para caracterização da verteporfina
Software de empilhamento de foco (por exemplo, Zerene Stacker)N/AN/AUtilizado para geração de imagens empilhadas em foco em imagens de peixe-zebra
Liofilizador (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/AUtilizado para secagem a vácuo e remoção de solvente
sgRNA GFPThermo Fisher ScientificA35943RNA-guia único direcionado ao eGFP; utilizado para validação de interrupção gênica
Nanopartículas de ouro (3–5 nm, estabilizadas com citrato)NanoComposixN/ARadiossensibilizador utilizado na formulação acionada por raios X
GraphPad PrismGraphPad Software7.0Análise estatística e visualização de dados
Células HCT116 (carcinoma colorretal humano)ATCCCCL-247Linhagem celular de câncer colorretal utilizada em estudos in vitro e in vivo
Células HEK293/GFPGenTargetSC001Linhagem celular estável que expressa GFP, utilizada para validação de interrupção por CRISPR
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Corante nuclear; concentração de trabalho de 5 µg/mL
Software de análise de imagem (por exemplo, Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/AUtilizado para quantificação de fibras musculares de contração lenta com interrupção gênica
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open sourceSoftware de análise de imagem
Microscópio de fluorescência invertidoLeica MicrosystemsDMi3000Utilizado para imagem de repórter em peixe-zebra e avaliação de fluorescência GFP
Sistema de imagem in vivo IVIS SpectrumCTPerkinElmer128201Sistema de imagem de fluorescência in vivo
Microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM-1400JEOLJEM-1400Imagem de TEM de lipossomos
Microscópio confocal Leica SP2Leica MicrosystemsN/AImagem confocal da captação celular
Agarose de ponto de fusão baixoN/AN/AUtilizada para montagem de embriões de peixe-zebra durante a imagem
Lipofectamina 2000Thermo Fisher Scientific11668019Reagente de transfeção utilizado como controle positivo
Software Living ImagePerkinElmerN/ASoftware de aquisição e análise de imagem
Meio McCoy's 5AThermo Fisher Scientific16600082Meio de cultura celular para células HCT116
Sistema de microinjeçãoN/AN/AUtilizado para microinjeção em embriões de peixe-zebra em estágio de uma célula
Ensaio de proliferação celular MTSPromegaG3582Ensaio de viabilidade celular
Espectrofotômetro NanoDropThermo Fisher ScientificND-2000Medições de pureza e concentração de RNA
Água livre de nucleasesThermo Fisher ScientificR0582Utilizada para preparação do RNP CRISPR-Cas9
Meio reduzido de soro Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985070Meio de transfeção
Paraformaldeído (4%)Sigma-AldrichP6148Fijador para análise histológica
Células PC12 (feocromocitoma de rato)ATCCCRL-1721Linhagem celular semelhante a neuronal utilizada para estudos de captação
Filtros de membrana de policarbonato (200 nm)Avanti Polar Lipids610006Membranas de extrusão para dimensionamento de lipossomos
Kit RNeasy Plus MiniQIAGEN74134Kit de extração de RNA
Sensor Verde de Oxigênio Singlete (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002Prob fluorescente para detecção de oxigênio singlete
Dispositivos de diálise Slide-A-Lyzer MINI (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570Dispositivos de diálise para preparação de lipossomos e carregamento de fármacos
Corante para gel de ácidos nucleicos SYBR GoldThermo Fisher ScientificS11494Corante para géis de ácidos nucleicos
Peixe-zebra transgênico Tg(ubi:EGFP)Zebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2Peixe-zebra transgênico utilizado para validação in vivo do CRISPR
TNF-α (recombinante humano)Life TechnologiesRTNFAICitocina utilizada em estudos de indução de TNFAIP3
sgRNA TNFAIP3Thermo Fisher ScientificN/AsgRNA direcionado ao TNFAIP3
Tricaina metanosulfonato (MS-222)N/AN/AAnestésico para peixe-zebra utilizado antes da imagem
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Detergente utilizado para lise lipossomal e ensaios de liberação
Proteína Cas9 TrueCut v2Thermo Fisher ScientificA36498Nuclease Cas9 utilizada para preparação do RNP CRISPR-Cas9
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200056Reagente de dissociação celular
Acetato de uranila (2%)Electron Microscopy Sciences22400Coloração negativa para imagem de TEM
VerteporfinaSigma-AldrichSML0534-5MGFotossensibilizador incorporado nas formulações lipossomais
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600Medições de espalhamento dinâmico de luz e potencial zeta

Referências

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