Sorafenibe mais gemcitabina mostra evidências preliminares de inibição aditiva da proliferação de células HepG2 e alterações correlacionadas na expressão de p-ERK e VEGF, além de suprimir o crescimento de tumores hepáticos em camundongos NOD/SCID.
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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Sorafenibe mais gemcitabina mostra evidências preliminares de inibição aditiva da proliferação de células HepG2 e alterações correlacionadas na expressão de p-ERK e VEGF, além de suprimir o crescimento de tumores hepáticos em camundongos NOD/SCID.
O câncer de fígado continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer devido à resistência a medicamentos e às opções limitadas de tratamento. Há uma necessidade urgente de explorar estratégias terapêuticas para melhorar os resultados. Este estudo piloto apresenta um protocolo para avaliar os efeitos potenciais e os mecanismos subjacentes da combinação de sorafenibe e gemcitabina no câncer de fígado. Utilizou-se a linhagem celular HepG2 de câncer hepático, e foi estabelecido um modelo de xenoenxerto em camundongos não obesos diabéticos/imunodeficientes graves (NOD/SCID). Os principais passos do procedimento são demonstrados, incluindo: (1) cultivo celular de HepG2 e tratamento com fármacos; (2) preparação do ensaio MTT, incubação e leitura da absorbância; (3) extração de proteínas, eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), transferência e imunoblotagem para ERK e p-ERK; (4) estabelecimento de xenoenxerto subcutâneo em camundongos NOD/SCID; (5) mensuração do tumor e cálculo do volume; e (6) imuno-histoquímica para VEGF em cortes tumorais. São fornecidos passos críticos, dicas de solução de problemas e especificações de equipamentos. A combinação de sorafenibe (3 µmol/L) e gemcitabina (10 µmol/L) alcançou uma taxa de inibição de 71,23% ± 6,76% após 72 h, com um valor de q de 1,35, sugerindo um efeito sinérgico nesse par específico de doses nas condições testadas. Em comparação com o grupo controle, o tratamento combinado foi associado à redução da expressão de p-ERK, diminuição do volume tumoral e coloração imuno-histoquímica qualitativamente menor para VEGF. Esses dados mostram uma associação correlativa entre a redução da expressão de p-ERK e o efeito anti-proliferativo observado, sem estabelecer causalidade. Em células HepG2 e em um modelo de xenoenxerto em camundongos NOD/SCID, a combinação de sorafenibe e gemcitabina apresenta evidências preliminares de potencial anti-proliferativo e está associada à redução da expressão de VEGF; no entanto, esse achado não constitui evidência direta de atividade anti-angiogênica, pois análises de densidade de microvasos ou de vasos funcionais não foram realizadas. Este protocolo reprodutível fornece uma estrutura útil para avaliar combinações de fármacos em modelos de CHC e pode ser adaptado para outros regimes de terapia direcionada e quimioterapia, embora sejam necessários estudos adicionais de mecanismos e validação de doses antes que possam ser extraídas implicações clínicas.
O câncer de fígado é um dos cânceres mais comuns e letais, além de ser um dos tumores malignos de crescimento mais rápido1,2. Embora a incidência de câncer de fígado tenha diminuído, a carga global da doença continua a aumentar. Os dados epidemiológicos mundiais de 2022 revelaram que a taxa de incidência padronizada por idade do câncer de fígado no banco de dados on-line do Observatório Global do Câncer (GLOBOCAN) 2022 foi de 15,0 por 100.000 habitantes, enquanto a taxa de mortalidade padronizada por idade foi de 26,7 por 100.000 habitantes, tornando-o a segunda principal causa de mortalidade por câncer3. Atualmente, devido à falta de tratamento eficaz para o câncer de fígado, aliada ao seu início insidioso, a maioria dos pacientes morre dentro de um ano após o diagnóstico. O sorafenibe é o primeiro inibidor de quinase multialvo aprovado para uso clínico, que atua sobre tirosina quinases receptoras, como o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR) e as serina/treonina quinases4,5. O sorafenibe, um inibidor oral de múltiplas quinases, exerce efeitos anti-proliferativos e anti-angiogênicos no câncer de fígado ao atuar em múltiplas vias de fatores de crescimento. Historicamente, o sorafenibe foi a primeira terapia sistêmica de primeira linha aprovada pela FDA para pacientes com câncer de fígado avançado ou não ressecável6. No entanto, o cenário atual de tratamento de primeira linha para o carcinoma hepatocelular (CHC) avançado expandiu-se significativamente. As opções recomendadas incluem atualmente a combinação de inibidores de pontos de controle imunológico atezolizumabe mais bevacizumabe, lenvatinibe e a combinação de imunoterapia dupla durvalumabe mais tremelimumabe, entre outras. Apesar desses avanços, o sorafenibe permanece uma opção importante de primeira linha, especialmente em regiões onde as combinações de imunoterapia não estão prontamente disponíveis ou são contraindicadas. Dado seu amplo uso no câncer de fígado, eventos adversos relacionados ao medicamento têm sido uma preocupação7. Na análise do banco de dados do Sistema de Notificação de Eventos Adversos da FDA (FAERS) de 2006 a 2023, os eventos adversos do sorafenibe envolveram principalmente o sistema digestivo, a pele e os tecidos subcutâneos, bem como desconfortos físicos inespecíficos, como infecção e lesão7. Embora alguns pacientes com câncer de fígado avançado possam se beneficiar do tratamento com sorafenibe, a maioria dos pacientes eventualmente desenvolve resistência ou falha terapêutica, levando a um prognóstico desfavorável8,9,10. Apesar de seu uso, o sorafenibe beneficia apenas cerca de 30% dos pacientes com CHC; além disso, os respondentes frequentemente desenvolvem resistência dentro de 6 meses11. As vias moleculares envolvidas na resistência ao sorafenibe incluem a via da quinase regulada por sinal extracelular (ERK)/ERK fosforilada (p-ERK), a proteína quinase B (Akt), a fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K)/AKT/alvo mamífero da rapamicina (mTOR), o fator indutível por hipóxia 1α (HIF-1α)/HIF-2α e vias relacionadas à autofagia, sendo a via ERK/p-ERK especificamente destacada e selecionada nesta pesquisa11. A gemcitabina é um análogo da citidina que, ao entrar no organismo, produz difluorocitidina difosfato e difluorocitidina trifosfato, os quais exercem diferentes efeitos inibitórios sobre a síntese de DNA12. Em neoplasias hepatobiliares, a gemcitabina tem sido avaliada como componente de quimioterapia combinada. No entanto, também se tem relatado clinicamente que a gemcitabina apresenta maior resistência medicamentosa, o que limita sua eficácia12,13. Portanto, determinar o regime medicamentoso ideal de forma eficaz e eficiente é extremamente desafiador. Estudos recentes mostraram que a combinação de gemcitabina com sorafenibe pode ter eficácia terapêutica aumentada com base na predição de um novo biomarcador de "stemness" tumoral14. No entanto, até onde se sabe, nenhum estudo examinou especificamente essa combinação no câncer de fígado utilizando células HepG2 e um modelo de xenotransplante em camundongos não obesos diabéticos/imunodeficientes graves (NOD/SCID) de carcinoma hepatocelular. Assim, ainda faltam evidências experimentais que validem diretamente os efeitos aditivos do sorafenibe e da gemcitabina no câncer de fígado.
Os procedimentos descritos neste manuscrito são amplamente utilizados, mas raramente apresentados em um formato detalhado, visual e passo a passo adequado para replicação por pesquisadores em início de carreira. Levantamos a hipótese de que a combinação de sorafenibe e gemcitabina inibiria de forma aditiva a proliferação de células de câncer hepático e o crescimento tumoral, e que esse efeito estaria associado à subregulação da via ERK/p-ERK e à redução da angiogênese mediada pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Este estudo tem como objetivo explorar preliminarmente o efeito inibitório da combinação de sorafenibe com gemcitabina sobre a proliferação da linhagem celular de câncer hepático HepG2 in vitro e in vivo e seu mecanismo (Supplementary Figure 1). A novidade deste estudo reside em três aspectos: (1) é o primeiro a testar a combinação sorafenibe-gemcitabina especificamente em câncer hepático utilizando a linhagem celular HepG2, amplamente empregada, e um modelo de camundongo NOD/SCID correspondente; (2) investiga a via ERK/p-ERK, pouco estudada, como um possível mecanismo; e (3) fornece evidência experimental direta — e não previsões computacionais — do efeito aditivo dessa combinação no câncer hepático. Essas características distinguem este trabalho de relatos anteriores de terapia combinada realizados em outros tipos de tumores ou com diferentes modelos experimentais, particularmente no contexto de regimes baseados em sorafenibe.
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A aprovação ética foi concedida pelo Comitê de Bem-Estar e Ética em Animais de Laboratório da Universidade de Zhejiang (Número de Aprovação ZJU20250049).
Animais e agrupamento
Um total de 40 camundongos fêmeas NOD/SCID, com 4–5 semanas de idade e pesando 18–20 g, foram adquiridos de um fornecedor comercial autorizado (número da licença: SCXK (Xangai) 2013-0006) e mantidos em salas de animais livres de patógenos específicos (SPF). Todos os protocolos com animais seguiram as diretrizes padrão. Durante o experimento, os animais tiveram livre acesso a alimento e água, foram mantidos em grupos (5 camundongos/gaiola) em uma sala SPF com condições bem controladas, com temperatura ambiente mantida a 22 ± 2 °C, umidade de 50%–60% e ciclo claro/escuro de 12/12 h. Os animais receberam alimento e água ad libitum, e seu peso corporal foi monitorado a cada duas semanas. Quando os camundongos apresentavam dor persistente, caquexia, úlceras tumorais, quando o tamanho do tumor atingia uma dimensão máxima de 2 cm ou outros problemas de saúde irreversíveis, a eutanásia era realizada por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico 0,45% em dose ≥150 mg/kg de peso corporal, seguida pela confirmação da cessação da respiração e dos batimentos cardíacos, perda do reflexo córneo ou aplicação de um método físico secundário, se necessário, conforme os critérios de término humanitário aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal. O tamanho da amostra (n = 10 por grupo) foi determinado com base em uma análise de poder, assumindo um tamanho do efeito de 1,2 (derivado de experimentos piloto), α = 0,05 e β = 0,20 (poder de 80%), acrescido de uma margem de 20% para perdas. Os procedimentos de implante tumoral foram realizados antes da alocação ao tratamento (ver abaixo o estabelecimento de xenotransplante).
Os camundongos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos utilizando o método da tabela de números aleatórios após o implante tumoral e confirmação do enxerto tumoral: grupo controle, grupo sorafenibe, grupo gemcitabina e grupo sorafenibe combinado com gemcitabina, com 10 camundongos (5 camundongos/gaiola) em cada grupo, para construção do modelo de tumor transplantado em camundongos NOD/SCID. Como os tecidos tumorais durante o processo de modelagem podem causar mau estado geral ou até morte em camundongos NOD/SCID, e considerando que a análise estatística geralmente exige um tamanho efetivo de amostra, foram incluídos pelo menos 10 camundongos por grupo. O agrupamento aleatório foi realizado por técnicos independentes e as gaiolas foram identificadas; a cegagem não foi implementada durante a administração dos fármacos ou a mensuração dos tumores, o que constitui uma limitação significativa. As demais coletas de tecidos, bem como as avaliações bioquímicas e patológicas, foram todas realizadas por pessoal laboratorial cego em relação ao grupo. Os dados também foram analisados de forma cega por estatísticos que tinham acesso apenas a arquivos codificados até a conclusão das análises estatísticas e ao desmascaramento dos dados. Todos os animais foram incluídos na análise final. A via intraperitoneal foi escolhida para ambos os fármacos para garantir absorção sistêmica e biodisponibilidade consistente; a administração diária foi baseada em estudos farmacocinéticos prévios que demonstraram concentrações plasmáticas sustentadas com esse regime. O grupo controle recebeu injeção intraperitoneal de 0,2 mL de solução salina normal estéril. No grupo sorafenibe, foram administrados intraperitonealmente 0,2 mL de sorafenibe a 40 mg/kg. No grupo gemcitabina, foram administrados intraperitonealmente 0,2 mL de gemcitabina a 100 mg/kg. Grupo de tratamento combinado: foram administrados intraperitonealmente 0,2 mL de sorafenibe a 40 mg/kg e 0,2 mL de gemcitabina a 100 mg/kg. Cada grupo recebeu o tratamento uma vez ao dia durante 20 dias consecutivos. Todos os animais foram incluídos na análise final, e nenhum camundongo foi excluído do estudo. Nenhuma mortalidade foi observada em nenhum grupo durante o período de tratamento de 20 dias. O esquema e as doses foram escolhidos com base em estudos publicados em modelos de câncer hepatobiliar. Deve-se observar que a administração intraperitoneal diária de gemcitabina pode causar toxicidade. O comprimento e a largura dos tumores transplantados foram medidos diariamente, e o volume dos tumores transplantados foi calculado. Após 20 dias, os animais foram eutanasiados por dislocação cervical sob anestesia profunda, e os tecidos tumorais transplantados foram fixados em formalina. O peso corporal foi medido a cada 2 dias durante todo o estudo. Os camundongos foram monitorados diariamente quanto a sinais clínicos de toxicidade, incluindo piloereção, postura curvada, mobilidade reduzida, diarreia e letargia. No entanto, não foram realizadas análises de bioquímica sérica (por exemplo, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e creatinina) nem exame histopatológico dos órgãos principais. Portanto, não é possível excluir a toxicidade subclínica.
Fármacos e reagentes
O sorafenibe foi dissolvido em 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenado a -20 °C. Antes do uso, a solução foi descongelada e diluída para uma concentração final de DMSO inferior a 0,5%, o que não teve efeito sobre o crescimento celular. A gemcitabina foi obtida de uma fonte comercial. O tampão de lise para ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA), azul de tiazolil, anticorpos primários contra gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK e VEGF, anticorpos secundários, meio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) com alta concentração de glicose, soro bovino fetal e a linhagem celular HepG2 foram obtidos de fontes comerciais.
Sorafenibe e gemcitabina são agentes citotóxicos. Todos os procedimentos de preparação e manipulação de medicamentos devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica designada, utilizando equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco de laboratório, luvas de nitrila e óculos de segurança). O DMSO, metanol, xileno e outros solventes orgânicos utilizados neste protocolo são perigosos e devem ser manipulados em uma capela de exaustão para evitar inalação ou contato com a pele. As fichas de dados de segurança de materiais (MSDS) de todos os reagentes devem ser consultadas antes do uso.
Cultura Celular
A linhagem celular HepG2 foi revivida e inoculada em frascos de cultura celular contendo 10 mL de meio DMEM de alta glicose (suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina e 4 mmol/L de glutamina). As células foram incubadas a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO₂. O meio de cultura foi substituído a cada 2 dias, e as células foram repassadas a cada 4 dias para manter o crescimento logarítmico. A linhagem celular HepG2 foi obtida de uma fonte comercial; no entanto, autenticação independente da linhagem celular (por exemplo, perfilagem de repetições em tandem curtas) e teste para micoplasma não foram realizados neste estudo.
Método MTT para detectar a taxa de inibição da proliferação
O método do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi utilizado para determinar a taxa de inibição da proliferação do sorafenibe e da gemcitabina na linhagem celular HepG2. Células na fase de crescimento logarítmico foram digeridas com tripsina a 0,25% durante 2 min, e a digestão foi interrompida pela adição de volume igual de meio completo. Após centrifugação a 1000 × g durante 10 min, as células foram ressuspendidas em meio completo. A densidade celular foi ajustada para 1 × 105 células/mL, e 200 µL da suspensão celular foram semeados em cada poço de uma placa de 96 poços. Essa densidade de semeadura foi escolhida com base em experimentos preliminares de otimização nos quais foram testadas densidades celulares variando de 5 × 103 a 5 × 104 células/poço. A densidade de 2 × 104 células/poço resultou em aumento linear da absorbância ao longo de 96 h e manteve a confluência abaixo de 80% no ponto final, conforme confirmado por inspeção visual ao microscópio invertido. Para garantir que as medidas de MTT permanecessem dentro da faixa linear, experimentos pilotos foram realizados em cada ponto temporal com poços-controle tratados com veículo. O meio foi substituído a cada 48 h para evitar esgotamento de nutrientes e acúmulo de subprodutos metabólicos. A confluência foi monitorada diariamente utilizando um microscópio invertido. Após 96 h, os poços-controle atingiram aproximadamente 75%–80% de confluência, e não foram observados sinais evidentes de esgotamento de nutrientes. Após a adesão celular, o meio foi descartado e adicionou-se o meio contendo os fármacos. Um meio sem fármaco foi adicionado ao grupo controle não tratado (controle de veículo para experimentos in vivo). O experimento foi dividido em um grupo controle não tratado, um grupo sorafenibe, um grupo gemcitabina e um grupo de tratamento combinado. As doses de sorafenibe foram 1,5 µmol/L, 3 µmol/L, 4,5 µmol/L e 6 µmol/L, e as doses de gemcitabina foram 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L e 20 µmol/L. As doses de sorafenibe combinadas com gemcitabina foram 1,5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4,5 µmol/L + 15 µmol/L e 6 µmol/L + 20 µmol/L. As células de cada grupo foram cultivadas por 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. Após o cultivo, adicionaram-se 20 µL de MTT a 5 mg/mL em cada poço, e as células foram incubadas em incubadora celular por 4 h. O sobrenadante foi cuidadosamente descartado, e então adicionaram-se 150 µL de DMSO a cada poço, e a placa foi agitada por 10 min para dissolver completamente a formazana, sendo o valor da densidade óptica (DO) de cada poço medido a 490 nm utilizando um leitor multifuncional de microplacas. O experimento foi repetido três vezes, e cada grupo teve cinco poços replicados. Os dados foram apresentados como média ± DP das três réplicas biológicas. A taxa de inibição do crescimento celular (%) = (1 - DO grupo experimental / DO grupo não tratado) × 100%. A interação entre os dois fármacos foi avaliada pelo valor de q, calculado pela fórmula: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). Aqui, EA e EB são as taxas de inibição dos fármacos A e B quando usados isoladamente, e EAB é a taxa de inibição quando os dois fármacos são usados em conjunto. Quando q é maior que 1,15, indica efeito sinérgico entre os dois fármacos; valores entre 0,85 e 1,15 indicam efeito aditivo; e q menor que 0,85 indica efeito antagônico. O método do valor de q é uma ferramenta simples de triagem e não substitui análises de sinergia mais rigorosas. Apenas alguns pares de doses em proporção fixa foram testados, o que limita a robustez da afirmação de sinergia. Portanto, o termo "sinergia" neste estudo refere-se a q > 1,15 em pares específicos de doses e pontos temporais, e não a uma interação aditiva validada em toda a matriz de resposta à dose.
Análise por Western blot da expressão proteica de ERK e p-ERK
O cultivo celular e o agrupamento experimental foram realizados conforme descrito anteriormente. Para a detecção de ERK e p-ERK por Western Blotting, a dose de sorafenibe foi de 3 µmol/L; a dose de gemcitabina foi de 10 µmol/L; e a dose combinada foi de 3 µmol/L + 10 µmol/L. Após 72 h de tratamento, as células foram lisadas com tampão de lise RIPA, e as proteínas totais foram extraídas de cada grupo experimental. A concentração proteica foi determinada pelo método do ácido bicinconínico (BCA). Quantidades iguais de proteína (30 µg por poço) foram carregadas e separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) a 120 V durante 90 min. As proteínas foram transferidas para membranas de politetrafluoretileno (PVDF) (com porosidade de 0,45 µm) a 300 mA durante 90 min a 4 °C. Após o bloqueio com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 (TBST) por 1 h à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C com agitação suave. Após três lavagens com TBST (10 min cada), as membranas foram incubadas com anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas utilizando substrato de quimioluminescência aprimorada (ECL) e imagens foram obtidas com um sistema digital de imagem de géis. Os tempos de exposição foram otimizados para cada anticorpo para evitar saturação. A quantificação densitométrica foi realizada com o software ImageJ utilizando a ferramenta de análise de géis. Todas as intensidades das bandas das proteínas-alvo foram normalizadas em relação à GAPDH como controle de carga, e a expressão de p-ERK foi ainda normalizada em relação à expressão total de ERK. Nenhuma etapa adicional de bloqueio além do leite desnatado a 5% foi realizada. Os resultados da quantificação foram apresentados como variação em relação ao grupo controle, definido como 1,0. Cada experimento foi repetido independentemente três vezes. Imunoblotagens representativas são mostradas.
Detecção imuno-histoquímica da expressão de VEGF em tumores xenotransplantados de HepG2 em camundongos NOD/SCID
Para o estabelecimento do xenoenxerto: células HepG2 na fase de crescimento logarítmico foram coletadas por tripsinização, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e suspensas em DMEM sem soro. Um total de 2 × 106 células em 0,2 mL de DMEM sem soro (sem Matrigel) foram injetadas subcutaneamente na região axilar direita (uma área com rica irrigação sanguínea) de cada camundongo NOD/SCID utilizando uma seringa de 1 mL para estabelecer um modelo de xenoenxerto subcutâneo de HepG2 em camundongos NOD/SCID. A enxertia tumoral foi monitorada a cada dois dias. O tamanho do tumor foi medido a cada dois dias e, quando o diâmetro tumoral atingiu 0,3–0,5 cm (aproximadamente 7–10 dias após a injeção, definido como o ponto de início do tratamento), os camundongos foram aleatoriamente divididos em 4 grupos para o experimento. O comprimento (L) e a largura (W) do xenoenxerto subcutâneo foram medidos diariamente utilizando paquímetro digital, e o volume tumoral (V) foi calculado segundo a fórmula: V = (L × W2) / 2. Todas as medições foram realizadas por um pesquisador cego quanto à alocação dos grupos. Após 20 dias, os animais foram eutanasiados por dislocação cervical sob anestesia profunda e o tecido do xenoenxerto foi fixado em formalina tamponada neutra a 10% por 24 h à temperatura ambiente, seguido de inclusão em parafina. Cortes teciduais (com espessura de 5 µm) foram obtidos utilizando micrótomo rotativo e montados em lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina. Para imuno-histoquímica, os cortes foram desparafinizados em xilol (três mudanças, 5 min cada) e reidratados em uma série gradiente de etanol (100%, 95%, 70%, 50%; 3 min cada). A recuperação de antígenos foi realizada aquecendo os cortes em tampão de citrato de sódio 10 mM em forno de micro-ondas por 15 min, seguido de resfriamento à temperatura ambiente por 20 min. A atividade peroxidásica endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 10 min à temperatura ambiente. A ligação inespecífica foi bloqueada com soro de cabra normal a 5% em PBS por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, os cortes foram incubados com anticorpo primário anti-VEGF (diluição 1 : 200) durante a noite a 4 °C em câmara umidificada. Após lavagem com PBS (três vezes, 5 min cada), os cortes foram incubados com anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado à peroxidase do rábano (HRP) (1 : 500) por 1 h à temperatura ambiente. O sinal foi detectado utilizando o substrato 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Os cortes foram contra-coloridos com hematoxilina por 30 s, desidratados, clareados e montados com lamínulas utilizando meio de montagem permanente. A aquisição de imagens foi realizada utilizando microscópio invertido com fluorescência em configuração de campo claro com aumento de ×100. Imagens representativas são apresentadas para ilustração qualitativa.
Todas as ponteiras contaminadas, tubos e resíduos de cultura celular foram coletados como resíduos biológicos perigosos e autoclavados antes da eliminação. Os resíduos químicos, incluindo soluções contendo fármacos, DMSO, xilol e metanol, foram coletados em recipientes separados e rotulados para resíduos e descartados de acordo com as regulamentações locais da instituição para resíduos químicos perigosos.
Análise estatística
O software SPSS 19.0 foi utilizado para análise estatística. Os dados experimentais foram expressos como média ± DP de três réplicas biológicas independentes para experimentos in vitro, e como média ± desvio padrão (DP) de n = 10 camundongos por grupo para experimentos in vivo. Para comparações entre dois grupos, foram utilizados testes t bicaudais não pareados. Para comparações entre múltiplos grupos, foi utilizada a análise de variância de um fator (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey. Valores de p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001 foram considerados significativos.
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O efeito inibitório de sorafenibe e gemcitabina sobre a proliferação de células HepG2
Sorafenibe e gemcitabina inibiram a proliferação de células HepG2 de forma dependente da dose, conforme mostrado na Tabela 1. A terapia combinada apresentou taxas de inibição significativamente maiores em todos os pontos temporais em comparação com a monoterapia. O ensaio MTT mede a atividade metabólica, que se correlaciona com o número de células, mas não mede diretamente a ...
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O câncer de fígado possui uma alta taxa de mortalidade devido ao seu início insidioso, progressão rápida e poucos tratamentos eficazes3,15. O câncer hepático avançado frequentemente apresenta resistência à quimioterapia e à radioterapia, e as opções atuais, incluindo ressecção cirúrgica e transplante de fígado, permanecem insuficientes15,16. A combinação de dois ou mais fármacos quimioterápicos com mecani...
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Os autores não têm nada a declarar.
Os autores não têm agradecimentos.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema digital de imagem de gel | Bio-Rad Laboratories, Inc., USA | 1708280 | |
| Meio DMEM com alta concentração de glicose | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| Anticorpo monoclonal de coelho anti-ERK | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| Soro bovino fetal | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., China | 11011-8611/11011-8615 | |
| Microscópio invertido de fluorescência | Olympus, Japan | IX73 | |
| Anticorpo policlonal de coelho anti-GAPDH | Santa Cruz, USA | sc-25778 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Anticorpo secundário de cabra anti-coelho | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., China | D111018 | |
| Software ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.8.0_112 | |
| Leitor de microplacas | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| Anticorpo monoclonal de coelho anti-p-ERK | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| Centrífuga refrigerada | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| Tampão de lise RIPA | Biyuntian Biological Technology Research Institute, China | P0013B | |
| Microtomo rotativo | Leica, Germany | CM3050 | |
| Sorafenibe | Bayer Company, Germany | 284461-73-0 | |
| Thiazolyl Blue (MTT) | Sigma, USA | M5655 | |
| Incubadora de três gases | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| Anticorpo monoclonal de coelho anti-VEGF | BioLegend, USA | B199116 |
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