Geração de neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas usando expressão induzida por doxiciclina de ASCL1/DLX2 em AAVS1

Resumo

Este protocolo descreve um método para gerar neurônios GABAérgicos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas, integrando transgenes induzíveis por doxiciclina no locus de porto seguro AAVS1 . A expressão estável e homogênea do transgene oferece uma abordagem eficiente para diferenciação direta em neurônios GABAérgicos, enquanto limita o silêncio do transgene, um problema comum em abordagens lentivirais.

Resumo

As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) oferecem uma oportunidade sem precedentes de modelar doenças neurológicas humanas in vitro. A geração confiável de populações neuronais definidas, como os neurônios do ácido gama-aminobutírico (GABAérgico), é essencial para esses estudos. Esse protocolo detalha um método robusto para diferenciar hiPSCs em neurônios GABAérgicos usando um sistema induzível por doxiciclina. A abordagem baseia-se na integração estável dos transgenes que codificam os fatores de transcrição ASCL1 e DLX2 no locus de integração viral adeno-associado 1 (AAVS1.) de porto seguro via knock-in mediado por CRISPR/Cas9. Essa integração direcionada evita o silenciamento do transgene frequentemente observado na integração lentiviral aleatória. O protocolo abrange a manutenção dos hiPSCs, o processo de nucleofecção para integração de transgenes, a seleção de puromicina para enriquecer células engenheiradas com sucesso e o procedimento de diferenciação passo a passo. Após a indução com doxiciclina, as hiPSCs modificadas rapidamente saem do ciclo celular, adquirem morfologia neuronal e expressam marcadores de linhagem GABAérgica em até 21 dias. Etapas principais incluem a neuroindução e a maturação subsequente usando fatores de crescimento específicos, bem como abordagens potenciais para melhorar a adesão celular durante a maturação. Esse método padronizado gera populações enriquecidas de neurônios induzidos que expressam marcadores de linhagem GABAérgica, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisas em neurociência e modelagem celular.

Introdução

As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) fornecem uma plataforma única para modelar doenças neurológicas humanas in vitro. e para investigar os complexos mecanismos moleculares que impulsionam o desenvolvimento e a^{degeneração 1}. Essa tecnologia permite a geração de modelos celulares específicos para pacientes para investigar uma ampla variedade de condições, que vão desde anomalias neurodesenvolvimentais precoces em ciliopatias^{sindrômicas 2} até alterações epigenômicas sutis observadas em doença de^{Alzheimer esporádica 3}. Consequentemente, a diferenciação direcionada dos hiPSCs tornou-se uma pedra angular da neurociência molecular moderna.

Para capturar efetivamente as nuances dos processos neurológicos humanos, gerar subtipos neuronais altamente específicos e puros é essencial. Por exemplo, populações neuronais definidas são necessárias para elucidar os papéis transcricionais específicos de proteínas como o MECP2 nos neurônios^{humanos 4}, ou para avaliar as vulnerabilidades direcionadas dos neurônios sensoriais periféricos a infecções virais, como o SARS-CoV-2⁵. Além disso, construir microambientes complexos e fisiologicamente relevantes, como incorporar microglia funcional em organoides cerebrais 3D, depende fundamentalmente da geração robusta e previsível de linhagens neurais e gliais^distintas. Entre esses subtipos, os neurônios GABAérgicos são de particular interesse devido ao seu papel inibitório crucial no sistema nervoso central e suas implicações em vários distúrbios neurológicos e^{psiquiátricos 7}. O objetivo geral desse método é fornecer um protocolo confiável, eficiente e reprodutível para a diferenciação direcionada de hiPSCs em neurônios induzidos que expressam marcadores de linhagem GABAérgica. Protocolos tradicionais de diferenciação direcionada para neurônios GABAérgicos, que dependem de moléculas de sinalização extrínsecas, podem ser demorados, altamente variáveis e resultar em populações celulares^{heterogêneas 8}.

Para superar essas limitações, a programação direta mediada por fatores de transcrição surgiu como uma alternativa poderosa⁹. Esse protocolo utiliza um sistema de expressão induzível por doxiciclina para impulsionar a expressão dos fatores de transcrição proneural ASCL1 e DLX2¹⁰. Ao direcionar esses transgenes para o locus de porto seguro do sítio de integração viral adenoassociado 1 (AAVS1.) usando CRISPR/Cas9, esse método contorna o problema comum do silenciamento do transgene associado à integração lentiviral^{aleatória 10}. O construto do doador inclui um repórter fluorescente, como o mCherry, para monitorar células trans-positivas após a seleção. Essa estratégia tem como objetivo suportar uma expressão transgênea mais homogênea do que abordagens de integração aleatória, embora a estabilidade da expressão e a reprodutibilidade da diferenciação devam ser validadas para cada linha engenheirada. Esse método padronizado gera populações enriquecidas de neurônios induzidos que expressam marcadores de linhagem GABAérgica em aproximadamente 21 dias, um período de tempo menor do que o das abordagens tradicionais de pequenas^{moléculas 8,10}. Esse protocolo é altamente apropriado para pesquisadores que necessitam de populações neuronais escaláveis e consistentes para aplicações posteriores, como microscopia de alto conteúdo, transcriptômica de célula única ou ensaios fisiológicos funcionais.

Protocolo

ATENÇÃO: Culturas humanas de hiPSC devem ser manuseadas como material potencialmente bio-perigoso sob procedimentos institucionais de biossegurança. Realize todos os procedimentos de cultura hiPSC humana em um gabinete certificado de segurança biológica Classe II, utilizando técnica estéril. Todos os resíduos contendo células humanas, meios expostos a células humanas e material plasmídico CRISPR/Cas9 devem ser descontaminados de acordo com as diretrizes locais de biossegurança antes do descarte. Doxiciclina, puromicina, DMSO e outros reagentes químicos devem ser manuseados com luvas e proteção adequada para olhos e pele, e resíduos devem ser descartados de acordo com os procedimentos institucionais de resíduos químicos. O extrato de membrana do basamento (BME) deve ser manuseado com técnica estéril e armazenado no gelo antes do uso para evitar polimerização prematura. O armazenamento de nitrogênio líquido e o manuseio criovial devem ser realizados com luvas criogênicas apropriadas, proteção facial e cautela para evitar queimaduras a frio ou explosão de frascos durante o descongelamento.

NOTA: Antes da edição mediada por CRISPR/Cas9 e da diferenciação neuronal, as culturas de hiPSC devem atender a critérios pré-definidos de controle de qualidade. As células devem ser confirmadas negativas para micoplasma, apresentar um cariótipo normal ou perfil aceitável de integridade genômica e manter expressão robusta de marcadores de pluripotência, incluindo OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 e/ou SSEA4. As culturas devem apresentar morfologia típica compacta de colônias hiPSC, com alta razão nuclear-citoplasmática, bordas definidas da colônia e diferenciação espontânea mínima. Apenas culturas que proliferam ativamente dentro da faixa recomendada de passagem devem ser usadas, e as células não devem exceder o número máximo de passagens definido pelo laboratório, tipicamente abaixo de 40 passagens (passage 40), a menos que validadas em contrário. Culturas que apresentem morfologia anormal, diferenciação espontânea excessiva, crescimento deficiente, contaminação confirmada ou evidências de instabilidade genômica devem ser excluídas dos experimentos de edição e diferenciação. Todos os materiais necessários para este protocolo, incluindo receitas de mídia, estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes e placas de cultura

1. Prepare o meio congelante combinando 40 mL de substituição sérica knock-out (KOSR) e 10 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) em um tubo cônico de 50 mL.
2. Homogeneize o meio de congelamento pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Armazene a solução a 4 °C por até 1 mês.
3. Dilua o extrato da membrana basal (BME) no meio Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) da Dulbecco em concentração final de 80 μg/mL.
   NOTA: Antes da diluição, verifique a concentração da solução BME recebida usando o número do lote no site do fornecedor.
4. Adicione 1 mL do BME diluído por poço a uma placa de 6 poços. Imediatamente devolva o BME original para 4 °C por até 1 mês.
5. Incline a placa para distribuir a solução uniformemente por toda a superfície dos poços. Certifique-se de que não haja áreas sem revestimento.
6. Incube a placa por pelo menos 30 minutos a 37 °C antes do uso.
   NOTA: Não há tempo máximo de incubação. Se estiver incubando por mais de 1 dia, certifique-se de que o DMEM/F-12 não evapore. A solução BME usada em um poço pode ser reutilizada apenas uma vez para revestir um segundo poço. A manipulação da EMB em temperatura ambiente deve ser breve devido à sua rápida polimerização.

2. Manutenção e passagem de hiPSCs

NOTA: Neste protocolo, meio de manutenção hiPSC refere-se ao mTeSR plus. MTeSR plus é o meio recomendado para manutenção rotineira, passagem, recuperação após a nucleofecção e seleção da puromicina.

1. Realize a passagem hiPSC aproximadamente a cada 4 a 6 dias quando as células atingem 60% de confluência.
2. Aspire o meio de cultivo dos poços usando uma pipeta aspiradora.
3. Adicione 1 mL de ReLeSR ao poço e incube por 30 s em temperatura ambiente.
4. Aspire o reagente de dissociação e incube a placa por 8 minutos a 37 °C.
5. Adicione delicadamente 1 mL de médio de manutenção hiPSC usando uma pipeta de 5 mL. Colete a suspensão da célula em um tubo de 50 mL.
6. Misture 10 μL da suspensão da célula com 10 μL de azul de tripan em um tubo de microcentrífuga. Coloque 10 μL da mistura em uma lâmina de contagem celular para determinar a concentração viável da célula.
7. Aspire o revestimento BME de um poço previamente preparado. Adicione 2 mL de meio de manutenção hiPSC suplementado com inibidor de quinase enrolada associada à Rho (ROCK) (Y-27632; 10 μM final).
8. Semear 100.000 hiPSCs no poço, buscando uma viabilidade de >90%. Mova a placa em um movimento em forma de oito para garantir uma distribuição homogênea das células.
9. Incube as células a 37 °C com 5% de CO₂.
10. Após 24 horas, substitua o meio por 2 mL de mTeSR novo mais meio sem inibidor de ROCK.
    NOTA: Espera-se uma mudança transitória na morfologia celular (elongação celular) na presença do inibidor ROCK. Verifique se as células recuperam sua morfologia característica após a remoção.

3. Nucleofecção de hiPSCs

1. Passe as células quando a confluência atingir cerca de 60%.
   NOTA: Neste protocolo, aproximadamente 60% de confluência corresponde a colônias de hiPSC em crescimento ativo cobrindo pouco mais da metade da superfície do poço, com espaço visível entre as colônias e diferenciação espontânea mínima. Colônias não devem estar cobertas de vegetação, extensivamente fundidas, ou apresentar centros densos e multicamadas no momento da nucleofecção.
2. Certifique-se de que o dispositivo de nucleofecção esteja ligado e que o suplemento de nucleofecção seja adicionado à solução de nucleofecção P3. Prepare um balde de gelo.
3. Adicione 110 μL da solução de nucleofecção P3 a um tubo de microcentrífuga colocado sobre gelo.
4. Adicione 1 μg do plasmídeo CRISPR/Cas9 e 1 μg do plasmídeo doador contendo o cassete induzível por doxiciclina ASCL1-P2A-DLX2. ao tubo. Misture suavemente sem criar bolhas.
5. Prepare a placa de destino aspirando o BME de dois poços revestidos. Adicione 2 mL de meio de manutenção hiPSC contendo um inibidor de ROCK em cada poço e incube a placa a 37 °C.
6. Dissocie os hiPSCs em 60% de confluência de um poço de uma placa de 6 poços, conforme descrito nos passos 2.2 a 2.5. Transfira a suspensão para um tubo estéril e centrifuge por 5 minutos a 500 x g em temperatura ambiente.
7. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet celular nos 110 μL da solução de nucleofecção P3 contendo os plasmídeos. Pipete suavemente para evitar a formação de bolhas.
8. Transfira 100 μL da suspensão celular para uma cubeta de nucleofecção colocada no gelo.
9. Insira a cuveta no dispositivo nucleofector e execute o programa CB-150 para hiPSCs.
10. Imediatamente recupere as células usando uma pipeta plástica Pasteur. Transfira volumes iguais da suspensão da célula para os dois poços previamente preparados.
11. Distribua as células em movimento em forma de oito e incube a 37 °C.
12. Após 24 horas, substitua o meio por mTeSR mais um inibidor de ROCK sem substrato. Verifique a eficiência da nucleofecção observando a fluorescência, se aplicável.

4. Seleção de antibióticos

ATENÇÃO: Puromicina é tóxica. Manuseie com equipamentos de proteção individual apropriados e descarte resíduos de acordo com as diretrizes institucionais.

NOTA: Antes de selecionar hiPSCs editados, determine a concentração ótima de puromicina para cada linha de hiPSC. Semear hiPSCs não editados a 100.000 células por poço em uma placa de 6 poços revestida com BME em meio de manutenção de hiPSC suplementado com inibidor de ROCK. Após 24 horas, substitua o meio por um novo meio de manutenção hiPSC contendo puromicina em 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 e 1,5 μg/mL. Substitua diariamente o meio contendo puromicina e monitore a morfologia celular e a sobrevivência por microscopia de campo claro por 5 dias. A concentração selecionada deve eliminar todas as hiPSCs não editadas em 3–5 dias, minimizando a toxicidade excessiva. Neste protocolo, a concentração ótima de puromicina é tipicamente 0,4–0,6 μg/mL.

1. Espere por 3 passagens pós-nucleofecção, tipicamente aproximadamente 1–2 semanas dependendo da taxa de recuperação e crescimento, para permitir a perda de plasmídeos não integrados antes de iniciar a seleção.
2. Realize uma passagem celular e seme 100.000 células por poço.
3. Após 24 horas, adicione puromicina na concentração determinada pela curva de eliminação, tipicamente 0,4–0,6 μg/mL.
4. Mantenha a seleção de puromicina pelo tempo determinado, geralmente cerca de 5 dias.
5. Valide a população selecionada por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo para estimar a proporção de células repórter-positivas.
   NOTA: Prossiga apenas com populações agrupadas que mostrem expressão relatora amplamente homogênea, idealmente >80–90% de células positivas para relatores. Se a expressão do repórter permanecer em mosaico, estenda a seleção, repita o enriquecimento ou considere o isolamento clonal antes da diferenciação.
6. Confirme o direcionamento correto do AAVS1 por PCR de junção antes de iniciar a diferenciação neuronal.
7. Quando for necessária validação rigorosa, verifique os produtos de PCR por sequenciamento Sanger e avalie o número de cópias do transgene por qPCR, ddPCR ou outro ensaio apropriado de número de cópia.
8. Avalie a integração aleatória usando ensaios baseados em PCR para sequências de espinha dorsal plasmídica ou análise de integração genômica mais ampla, dependendo da aplicação pretendida a jusante.
9. Confirme que a população selecionada de hiPSC permanece mycoplasma-negativa, mantém a morfologia típica da colônia de hiPSC e mantém crescimento robusto após a seleção da puromicina.
10. Reavalie a integridade genômica por meio de cariotipagem, matriz SNP ou outro ensaio validado, especialmente quando células editadas serão usadas para modelagem de doenças, ensaios funcionais ou estudos de longo prazo.
11. Avaliar os potenciais efeitos off-target do CRISPR/Cas9 por meio de sequenciamento direcionado de locais off-target previstos ou, quando necessário, abordagens genômicas mais amplas.
    NOTA: Não use culturas para diferenciação se apresentarem morfologia anormal, recuperação ruim após seleção, expressão persistente do mosaic reporter, confirmação de anomalias genômicas ou falha na integração do AAVS1 . Neste protocolo, hiPSCs selecionados e engenheirados são usados como uma população agrupada e podem ser crioppreservados antes da indução por doxiciclina, uma vez que a expressão do repórter, a alvo, morfologia e crescimento do AAVS1 . tenham sido validados. A criopreservação após indução de doxiciclina ou durante a maturação neuronal não faz parte do fluxo de trabalho padrão e deve ser validada empiricamente antes do uso.

5. Diferenciação em neurônios gabaérgicos

1. Prepare o número necessário de poços revestidos com BME. Note que um bem semeado no Dia 0 gerará um poço de neurônios GABAérgicos.
2. Prepare 6,9 mL de meio de neuroindução por poço, suplementando com doxiciclina (1 μg/mL). Inclua um volume extra de 15% para compensar erros de evaporação ou pipeteamento.
   NOTA: A doxiciclina é usada em uma concentração final de 1 μg/mL, a partir do Dia 0, e mantida durante a diferenciação e maturação. Um meio fresco contendo doxiciclina é preparado a cada mudança de meio para manter a indução consistente do transgene. Essa dose foi selecionada porque produzia expressão robusta de repórteres e conversão neuronal eficiente em nossas mãos. Uma dose-resposta formal à doxiciclina não foi realizada nesse protocolo; portanto, laboratórios que adaptam o método podem testar empiricamente 0,1–2 μg/mL de doxiciclina se a indução do transgene parecer subótima.
3. No Dia 0, dissocie os hiPSCs modificados e semeie 200.000 células nos poços preparados revestidos com BME. Incubar a 37 °C.
4. Nos dias 1, 2 e 3, aspire o meio e adicione 2 mL de meio de neuroindução fresco contendo doxiciclina.
   NOTA: Ao terceiro dia, a expansão celular deve diminuir significativamente, e estruturas semelhantes a dendríticas podem começar a aparecer. Se for necessária confirmação experimental da saída do ciclo celular, imunocoloração com Ki-67 ou incorporação de EdU/BrdU podem ser realizadas no dia 3–4.
5. No dia 4, prepare um meio de neuromaturação contendo fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF) e neurotrofina-3 (NT-3), cada um com concentração final de 10 ng/mL, doxiciclina a 1 μg/mL e PluriSln a 20 μM.
6. Aspire o meio de neuroindução. Adicione cuidadosamente 2 mL do meio de neuromaturação gota a gota ao longo da parede do poço para evitar perturbar os neurônios recém-formados.
7. No dia 7, aspire o meio e adicione suavemente 2 mL de meio de neuromaturação contendo as neurotrofinas e a doxiciclina, mas omitindo o inibidor de sobrevivência celular pluripotente.
8. Para manutenção a longo prazo, substitua completamente o meio de neuromaturação a cada 3 a 4 dias, adaptando a frequência com base na densidade celular.
   NOTA: O dia 21 é o ponto final padrão para avaliar a identidade neuronal gabaérgica. Até o dia 21, as células devem apresentar características neuronais GABAérgicas, incluindo DLX1.e continuam a amadurecer suas redes axonais. Uma densidade de semeadura de 200.000 células/poço foi empiricamente selecionada para produzir colônias bem espaçadas, evitando superlotação e morte celular associada à maturação. Densidades de 150.000–300.000 células/poço são compatíveis, com densidades menores preferidas para morfologia e densidades maiores para recuperação de materiais. Para reduzir o descolamento, realize mudanças mais frequentes de meio a médio usando uma pipeta de 1.000 μL em baixo fluxo sem inclinar a placa. Se necessário, as células podem ser replacadas uma vez após a indução de doxiciclina de 3 dias, antes da adição do meio de maturação, utilizando revestimentos aprimorados como poli-L-lisina/laminina ou laminina-521. Deve ser evitado mais passagem após o início da maturação.
9. As culturas podem ser mantidas além do Dia 21 para maturação prolongada se as redes permanecerem conectadas, viáveis e livres de colônias proliferantes semelhantes a hiPSC. Após o dia 21, realize trocas de meio médio a cada 3–4 dias com meio fresco de neuromaturação contendo doxiciclina e fatores neurotróficos.
   NOTA: Use culturas para ensaios a jusante assim que a morfologia neuronal e as redes neuritárias estiverem estáveis, o descolamento for mínimo e nenhuma colônia indiferenciada for visível. Em nossas mãos, as culturas são tipicamente usadas entre o Dia 21 e o Dia 35.

Resultados

A aplicação bem-sucedida desse protocolo resulta em uma população enriquecida de neurônios induzidos com características moleculares GABAérgicas. A estratégia baseia-se na inserção direcionada de um cassete ASCL1-P2A-DLX2 induzível por doxiciclina no locus AAVS1 (Figura 1A). Após a seleção dos hiPSCs engenheirados, a indução de doxiciclina é usada para impulsionar a diferenciação neuronal GABAérgica, conforme descrito na linha do t...

Discussão

A geração bem-sucedida de neurônios GABAérgicos depende fortemente de várias etapas críticas dentro desse protocolo. Manter hiPSCs de alta qualidade e indiferenciados é fundamental; A diferenciação espontânea antes da nucleofecção reduz drasticamente a eficiência da integração e a pureza neuronal^{a jusante 8}. Além disso, a determinação precisa da curva de eliminação da puromicina é essencial para garantir a eliminação completa das células não integradas sem estress...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	Para eletroporação/nucleofecção de hiPSCs.
6-well culture plates	Sarstedt	83.3920300	Placas tratadas para cultura de tecidos para manutenção e diferenciação de hiPSCs.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78005	Proteína humana recombinante para maturação neuronal; prepare de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 10 ng/mL.
Cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Usado para contagem de células.
Centrifuge	VWR	76468-134	Para peletagem celular.
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i ou equivalente	Incubadora de cultura celular mantendo 37 °C, atmosfera umidificada e 5% CO2.
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	Frascos criogênicos estéreis para congelamento de hiPSCs; criovial de 1,8 a 2,0 mL com rosca externa equivalente pode ser usado.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	Bio-Techne	BME001-05	Matriz de revestimento BME padrão usada no protocolo. Verifique a concentração de estoque específica do lote do certificado de análise da Bio-Techne e dilua em DMEM/F-12 para uma concentração de trabalho de 80 µg/mL.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	Meio basal usado para diluir BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich	D2650	Crioprotetor usado na preparação do meio de congelamento.
Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette	Custom plasmid	Addgene accession pending	Plasmídeo doador AAVS1 personalizado contendo a cassette indutível por doxiciclina ASCL1-P2A-DLX2 e elementos de seleção/relatado. Forneça o mapa do plasmídeo e a sequência completa como arquivo complementar ou mediante solicitação.
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Usado para induzir a expressão de ASCL1-P2A-DLX2. Prepare solução de estoque estéril, aliquote, proteja da luz, armazene congelado e use em concentração final de 1 µg/mL.
Ethanol (70%)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Para esterilização dentro do gabinete de segurança biológica; use etanol 70% aprovado institucionalmente ou equivalente.
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve R4	Microscópio usado para imagem de contraste de fase e fluorescência da expressão de relatador e morfologia neuronal.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78058	Proteína humana recombinante para maturação neuronal; prepare de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 10 ng/mL.
hiPSC line PGP1	EditCo Bio	PGP1 human iPSC line	Linha de hiPSC humana de consentimento aberto disponível comercialmente usada neste protocolo; registre o número de passagem e o status de QC antes da edição e diferenciação.
Image-analysis software	ImageJ/Fiji	Open-source; version used should be reported	Para quantificação de fluorescência e processamento de imagem representativa.
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Usado na preparação do meio de congelamento.
Laminin-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Reagente opcional de solução de problemas. Não faz parte do protocolo de revestimento padrão; pode ser usado como uma alternativa ou matriz de revestimento duplo se a desconexão neuronal persistir.
Liquid nitrogen dewar	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus ou equivalente	Armazenamento de longo prazo de hiPSCs congelados em fase de vapor ou nitrogênio líquido de acordo com os procedimentos de segurança criogênica institucionais.
Mr. Frosty™ Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Para congelamento controlado de células a -80 °C.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	Meio de manutenção livre de alimentadores para hiPSCs.
Neuro-induction medium	STEMCELL Technologies	08582	Meio comercial de indução neuronal usado para indução neuronal precoce.
Neuro-maturation base medium (BrainPhys™ Neuronal Medium)	STEMCELL Technologies	05790	Meio base para maturação neuronal; suplementar com BDNF, GDNF, NT-3, doxiciclina e PluriSln-1 conforme descrito no protocolo.
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)	STEMCELL Technologies	78074	Proteína humana recombinante para maturação neuronal; prepare de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 10 ng/mL.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit	Lonza	V4XP-3024	Kit contendo Solução P3 e cuvetes para nucleofecção de hiPSCs.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiótico opcional para reduzir o risco de contaminação bacteriana.
Plasmocin™ prophylactic	InvivoGen	ant-mpp	Antibiótico opcional para prevenir contaminação por micoplasma.
PluriSIn-1	STEMCELL Technologies	72822	Inibidor de sobrevivência de células pluripotentes para eliminar hiPSCs indiferenciadas; prepare o estoque de acordo com as instruções do fabricante e use em concentração final de 20 µM.
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803	Antibiótico usado para seleção; prepare solução estéril de estoque, aliquote, armazene congelado e determine a concentração final de trabalho por curva de morte, tipicamente 0,4-0,6 µg/mL.
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmid	Addgene	85802	Plasmídeo CRISPR/Cas9 usado para direcionamento de AAVS1; inclua a sequência gRNA AAVS1 no mapa do plasmídeo ou informações complementares.
qPCR analysis software	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	QuantStudio Design & Analysis Software ou equivalente	Para extração de Ct e análise de RT-qPCR; relatar a versão do software usada.
qPCR master mix	Thermo Fisher Scientific	PowerUp SYBR Green Master Mix, A25742	Para quantificação por RT-qPCR de marcadores neuronais e GABAérgicos.
qPCR primers: DLX1	Custom oligonucleotides	Sequence provided in comments	Direto: 5' ATGCACTGTTTACACTCGGC 3'; Reverso: 5' GACTGCAC