Um modelo de sobrecarga de ferro baseado em citrato de amônio férrico com leituras associadas à ferroptose em mioblastos de C2C12

Resumo

Aqui, apresentamos um modelo rápido de sobrecarga de ferro baseado em citrato de amônio férrico em mioblastos C2C12 que produz carga de ferro, alterações moleculares associadas à ferroptose e perda precoce de viabilidade sensível à ferrostatina.

Resumo

A ferroptose é uma forma de morte celular regulada dependente de ferro, implicada no envelhecimento e doenças degenerativas. Anteriormente, descobrimos que células-tronco musculares envelhecidas acumulam ferro intracelular e sofrem morte ferroptótica ao serem ativadas. Aqui, descrevemos um modelo in vitro simples que utiliza citrato de amônio férrico para gerar sobrecarga de ferro em mioblastos murinos de C2C12. O tratamento com citrato de amônio férrico aumentou a carga intracelular de ferro, como demonstrado pelo elevado dos transcritos de ferritina de cadeia pesada e leve, aumento da proteína ferritina e aumento do sinal de um corante de ferro lábil de células vivas. A exposição ao citrato de amônio férrico (FAC) também produziu alterações moleculares associadas à ferroptose, incluindo aumento da expressão de Slc40a1 e Hmox1 e redução da proteína peroxidase 4 da glutationa. A diminuição associada à FAC na glutatione peroxidase 4 foi parcialmente revertida pela deferoxamina. Às 12 horas, o citrato de amônio férrico citotóxico reduziu a viabilidade celular, e esse efeito foi resgatado pela ferrostatina-1, consistente com um componente sensível à ferroptose da morte celular. Em momentos posteriores, o aumento da variabilidade e a redução da faixa dinâmica do ensaio limitam a interpretabilidade das medições de viabilidade. Assim, esse protocolo fornece um modelo rápido e escalável da carga de ferro mediada pelo citrato de amônio férrico, que pode ser usado para estudar respostas associadas à ferroptose e testar intervenções modificadoras de ferro ou ferroptose em células musculares.

Introdução

A ferroptose é uma forma de morte celular regulada (RCD), molecularmente distinta de outras RCD. Foi descoberto pela primeira vez usando erastina, uma pequena molécula letal seletiva para SRA (sarcoma de rato), que foi descoberto causar morte celular não^{apoptótica 1}. Em seu trabalho seminal, Dixon et al. descreveram primeiro seu mecanismo como dependente do ferro, e assim cunharam o termo ferroptose, que significa "queda (morte) pelo ferro¹." Molecularmente, a ferroptose apresenta-se como acúmulo excessivo de ferro, aumento da peroxidação lipídica e acúmulo de espécies reativas de oxigênio, levando à morte celular². É singularmente distinguível do estresse oxidativo e de outras formas de RCD por sua independência da ativação da caspase, uma característica marcante da apoptose, e pela ausência da proteína quinase 3 (RIPK3) e da pseudo-quinase semelhante a domínio de linhagem mista (MLKL), que só são observadas na necroptose³. Além disso, a ferroptose também pode ser aliviada com os antioxidantes lipídicos ferrostatina-1 e liproxstatina-1, e com o quelante de ferro^{deferoxamina 4}. Embora a ferroptose seja semelhante a outros tipos de RCD, pois todas acabam resultando na morte das células, sua apresentação a torna mecanicamente distinta de outras formas de RCD.

O estudo da ferroptose ganhou força na última década, principalmente devido aos esforços contínuos na área para identificar novas marcas e desenvolver novas ferramentas para estudar seus mecanismos subjacentes e contribuição para doenças^{humanas 5}. Um corpo recente de evidências sugere que a sobrecarga de ferro e a ferroptose são fatores pouco estudados para a fragilidade relacionada à idade e^{sarcopenia 6,7,8}. Recentemente mostramos que células-tronco musculares envelhecidas (MuSCs) são especialmente suscetíveis à morte ferroptótica resultante da inflamação crônica que suprime um programa genético antioxidativo por meio do silenciamento^{epigenético 9}. Descobrimos que MuSCs envelhecidos acumulam um nível aberrante de ferro elementar intracelular, cerca de 30 vezes maior que seu equivalente adulto. Embora a ferroptose tenha sido associada a doenças em múltiplos órgãos e tecidos — predominantemente aqueles relacionados ao envelhecimento — seu papel fisiológico permanece incerto e justifica investigação adicional.

Embora nosso estudo anterior tenha mostrado que MuSCs envelhecidos são sensibilizados à morte ferroptótica após a ativação, a contribuição específica da carga de ferro para esse fenótipo ainda precisa ser esclarecida. Aqui, estabelecemos um modelo simples de sobrecarga de ferro em mioblastos de C2C12 tratados com citrato de amônio férrico (FAC) e questionamos se o excesso de ferro é suficiente para gerar alterações moleculares associadas à ferroptose e perda de viabilidade sensível à ferrostatina. As células C2C12 fornecem um sistema progenitor muscular murino de baixa manutenção, escalável e facilmente^{disponível 10}. Prevemos que essa abordagem ofereça uma plataforma prática para estudar respostas ao estresse impulsionadas pelo ferro em células musculares e para testar intervenções que modifiquem fenótipos associados à ferroptose.

Protocolo

1. Preparação das células C2C12

1. Células de descongelamento
   NOTA: Todas as etapas da cultura celular devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança estéril.
   1. Prepare um tubo cônico contendo 9 mL de meio completo e quente (meio Eagle modificado de Dulbecco com glicose alta e piruvato + 10% soro fetal bovino + 1% can/streptococo).
   2. Descongele um frasco de células congeladas de C2C12 (~1 milhão) adicionando 800 μL de meio completo pré-aquecido ao frasco a partir do estoque principal do meio. Pipete devagar.
   3. Quando o meio adicionado ao frasco descongelante ficar frio, remova-o e adicione-o ao tubo cônico. Substitua pelo mesmo volume de meio quente do tubo. Continue pipetando para cima e para baixo e trocando o meio até que as células congeladas estejam ressuspensas.
   4. Pipete o conteúdo do frasco para o tubo cônico de mídia. Inverta para misturar, depois adicione o conteúdo a um prato de 10 cm tratado com cultura celular. Incube a 37 °C por 4 horas.
   5. Verifique as células ao microscópio para garantir que elas se fixaram. As células ligadas parecem alongadas, enquanto as células flutuantes são circulares e se movem quando a placa se move.
      NOTA: Assumindo que as células placadas estejam saudáveis, a maioria delas deve estar conectada.
   6. Aspire do substrato para remover quaisquer células mortas e detritos. Substitua por 10 mL de meio completo morno e retorne à incubadora. Deixe incubar durante a noite ou até a placa atingir 80% de confluência.
2. Semeadura de células C2C12 para tratamento com ferro
   1. Uma vez atingida a confluência desejada, aspire do meio celular. Adicione 2 mL de PBS em direção à gota, garantindo que toda a superfície esteja coberta; aspiração.
   2. Adicione 2 mL de tripsina 0,25% às células. Incube a 37 °C por 5–10 minutos, ou até que as células se separem. Uma vez descoladas, as células parecerão circulares sob o microscópio, e a tripsina e a suspensão celular ficarão turvas e espessadas.
   3. Neutralize a tripsina adicionando 8 mL de DMEM completo e quente. Use uma pipeta sorológica para misturar bem a solução e lavar a placa. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico.
   4. Inverta suavemente o tubo 3–5 vezes. Remova o volume apropriado e conte as células usando o método preferido (contador celular, hemocitômetro, etc.).
   5. Faça uma suspensão de células suficiente para semear o número desejado de poços/placas para n = 3 para cada condição: placa de 10 cm (para western blot): 100.000 células/placa, placa de 6 poços (para qPCR): 50.000 células/poço, placa de 96 poços (para ferro lábil e coloração por luminescência): 1.000 células/poço. Deixe as células incubarem a 37 °C durante a noite.
3. Aplicação do tratamento com ferro em células semeadas
   1. No dia do tratamento, adicione citrato de amônio férrico (FAC; fórmula = C₆H₁₁FeNO₇^⁺3; MW = 265 g/mol) para completar o DMEM nas seguintes concentrações sob condições estéreis: Severo: 180 μM (0,0477 mg/mL), Citotóxico: 1.800 μM (0,477 mg/mL).
      NOTA: Considere adicionar controles também, incluindo, mas não se limitando a veículos, deferoxamine severo + 150 μM (um quelante de ferro), veículo + 150 μM deferoxamina e/ou veículo + RSL3 (indutor de ferroptose; controle positivo. Além disso, vale notar que o DMEM pode conter uma pequena quantidade de nitrato de ferro (III) não hidratado, uma fonte de ferro ferrico, na fase inicial. O leitor deve interpretar as concentrações recomendadas de FAC acima como sendo adicionais a qualquer ferro férrico já presente no meio de cultivo do veículo.
   2. Inverta para misturar até que o FAC se dissolva em meio completo.
      NOTA: Como o FAC é solúvel em água, não é necessário DMSO ou solvente adicional. A adição de FAC pode alterar o pH da solução, então, se uma mudança drástica na cor do meio for observada, recomenda-se medir o pH para garantir a viabilidade das células quando o meio tratado for adicionado à cultura.
   3. Aspire o meio das células. Adicione o mesmo volume de meio completo suplementado com ferro às condições de tratamento e meio completo não tratado aos poços/placas do veículo. Incubar a 37 °C durante a duração do tratamento desejada antes de prosseguir para o ensaio de escolha: ensaio de ferro lábilo: tratamento FAC de 2 h, qPCR e western blot: 12–24 h de tratamento FAC, ensaio de luminescência: tratamento FAC de 12 h.

2. qPCR

1. Isolando mRNA para qPCR
   ATENÇÃO: O reagente de extração de RNA e o clorofórmio apresentam riscos respiratórios. Manuseio apenas em uma exaustão usando o EPI adequado (jaleco, luvas descartáveis resistentes a produtos químicos e proteção ocular).
   1. No banco, aspire o meio das células. Lave as células duas vezes com PBS estéril e aspire cuidadosamente qualquer líquido restante.
   2. Em uma exaustora exaustiva, adicione o reagente de extração de RNA às células nos seguintes volumes: placa de 6 poços: 250 μL/poço, placa de 10 cm: 1 mL/placa.
   3. Trabalhando no gelo na exaustão, use um raspador de células para raspar suavemente as células lisadas. Tenha cuidado para raspar completamente todas as partes da placa para maximizar o rendimento de RNA.
   4. Pipete o lisado em tubos microfuge estéreis, pré-refrigerados e livres de RNAse. Deixe-os descansar em temperatura ambiente por 5 minutos.
   5. Para cada mL do reagente de extração, adicione 200 μL de clorofórmio DENTRO DE UMA CAPUZ DE FUMAÇA. Agite as amostras vigorosamente por pelo menos 30 segundos para combinar o reagente de extração com o clorofórmio. Deixe-os descansar em temperatura ambiente por 5 minutos.
      NOTA: Após o tempo decorrer, ocorre a separação de fases, com a fase aquosa clara (que contém o RNA) no topo.
   6. Centrifugar amostras por 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C. Enquanto isso, rotular novos tubos autoclavados e adicionar 500 μL (por mL de reagente de extração) de isopropanol aos tubos sobre gelo.
   7. Transfira apenas a fase aquosa para cada tubo correspondente. Misture suavemente por inversão, depois deixe em temperatura ambiente por 10 minutos. Se houver baixa produção esperada, adicione 2 μL de GlycoBlue para visualizar o pellet.
   8. Centrifugar por 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C.
      NOTA: RNA precipitado pode ser visível na parte inferior do tubo.
   9. Despeje cuidadosamente o excesso de isopropanol em um béquer de resíduos designado. Adicione 1 mL de etanol 100% grau molecular no tubo no tubo, tomando cuidado para não deslocar o pellet. Centrifuge por 5 minutos a 7.500 × g a 4 °C.
   10. Despeje etanol. Inverta os tubos e deixe a tampa aberta sobre um papel toalha. Deixe o pellet secar até ficar livre de gotículas (~15–30 min).
       NOTA: A cápsula pode ficar translúcida se o GlycoBlue não for adicionado.
   11. Resuspenda o pellet em 25 μL de água estéril e livre de RNAse. Quantifique a concentração de RNA por espectrofotometria visível ao ultravioleta. Normalize para uma concentração uniforme entre amostras que permita um máximo de 1 μg de RNA em 16 μL por amostra.
2. Sintetizando cDNA para qPCR
   NOTA: Complete todas as etapas no gelo para maximizar o rendimento de RNA/cDNA.
   1. Amostras de descongelamento. Lave a área de trabalho com um limpador de RNAse.
   2. Adicione 1 μg de RNA de cada amostra a um tubo correspondente de tira de PCR.
   3. Adicione 4 μL da mistura de cDNA a cada tubo. Se necessário, adicione água estéril para atingir um volume total de 20 μL. Passe as misturas sob os seguintes parâmetros do termociclador: 25 °C por 5 minutos, 42 °C por 30 minutos, 85 °C por 5 minutos, 4 °C infinitamente.
3. Rodando qPCR
   1. Dilua o cDNA 1:10 em água estéril antes de realizar reações adicionais.
      NOTA: o cDNA pode ser congelado a -20 °C por 1 mês ou a -80 °C por 6 meses.
   2. Dilua os primers até uma concentração de 10 μM com água estéril. Inclua os controles adequados e/ou genes de manutenção (por exemplo, B2M, TBP1).
   3. Faça misturas mestras para cada gene de manutenção e gene de interesse, de modo que haja mistura de reação suficiente para processar cada condição de DNA em triplicado. A receita da mistura master (por reação) é a seguinte: 2x mistura PCR: 10 μL, primer direto (10 μM): 1 μL, primer reverso (10 μM): 1 μL, água estéril: 8 μL.
   4. Coloque uma placa de reação qPCR em um bloco metálico refrigerado com 96 poços. Adicione 5 μL de cDNA diluído a cada poço de amostra e 20 μL da mistura mestre de reação em cada poço. Inspecione cada poço para garantir que todos recebam o mesmo volume, cubra a placa com um selador de placas e use uma ferramenta de borda plana para alisar as bolhas.
   5. Centrifuge a placa a 1.000 × g e 4 °C por 1 minuto. Coloque a placa em uma máquina qPCR, garantindo que ela esteja carregada na orientação correta.
   6. No software qPCR, designe as identidades da amostra e do gene de interesse para cada poço. Considere criar um template se planejar rodar múltiplas réplicas com a mesma configuração.
   7. Execute o programa qPCR (duração: ~1:36 h) mostrado na Tabela 1.
   8. Exporte os resultados como um arquivo de . CSV ou . Arquivo XLSX. Se a máquina qPCR usada permitir que o usuário escolha quais valores exportar, verifique se os valores CT estão incluídos no arquivo exportado.
   9. Use os valores médios de CT para cada condição e gene de interesse — em comparação com os valores de CT dos genes de manutenção na condição correspondente — para calcular a mudança de dobra de cada gene. Normalize a mudança de dobra da condição do veículo para 1,0.

3. Western blot

1. Isolando proteína para western blot
   NOTA: Realize todas as etapas no gelo para maximizar o rendimento de proteína.
   1. Em um gabinete de biossegurança, aspire do meio de cultura. Enxágue as células com PBS frio suficiente para cobrir a parte inferior da placa de cultura. Aspire, depois repita.
   2. Adicione um buffer RIPA suplementado com coquetéis inibidores de protease e inibidor de fosfatase para evitar a degradação da proteína. Use 75 μL de solução RIPA para cultivo em uma placa de 6 poços, ou 200 μL de solução RIPA em uma placa de 10 cm.
   3. Trabalhando no gelo, use um raspador de células para soltar suavemente as células lisadas da placa. Tenha cuidado especial para remover células de todas as partes da placa, incluindo as bordas. A solução vai parecer clara e um tanto viscosa.
   4. Pipete a suspensão da célula RIPA em tubos microfuge resfriados. Centrifuge amostras por 10 minutos na velocidade máxima de 4 °C. Transfira o sobrenadante (o lisato de proteína) para um tubo pré-refrigerado. Descarte a cápsula.
   5. Quantifique a concentração de proteína realizando um ensaio de Bradford ou BCA. Normalize as amostras para 1 μg/μL em água pura enriquecida com coquetéis enriquecidos com protease e inibidores de fosfatase sobre congelamento.
   6. Diluir lisados em tampão de Laemmli, garantindo que as concentrações finais de proteína sejam uniformes entre as amostras. Ferva lisas a 95 °C por 10 minutos para desnaturalizar a proteína. Para melhores resultados, use para Western blotting imediatamente após o preparo. Caso contrário, armazene proteínas em Laemmli a -20 °C a curto prazo (≤ 1 mês) ou -80 °C a longo prazo.
2. Preparando géis de acrilamida para SDS-PAGE
   ATENÇÃO: A acrilamida é uma neurotoxina e só deve ser manuseada usando EPI apropriado (jaleco, luvas resistentes a produtos químicos e proteção ocular).
   1. Determine as proteínas de interesse e o tamanho dessas proteínas consultando o site da empresa com o(s) anticorpo(s) a serem utilizados. Use o tamanho previsto do(s) proté(s) de interesse para decidir qual porcentagem de acrilamida o(s) gel(ões) deve ter.
      NOTA: A acrilamida 10%-15% funciona bem para a maioria dos pesos moleculares.
   2. Montar o suporte e a estrutura de gel de fundição conforme as instruções do fabricante.
   3. Para o gel resolvente, combine acrilamida, água estéril, 1,5 M de tampão de Tris/HCl pH8,8 e dodecilo sulfato de sódio 10% em um tubo cônico, nos volumes apropriados para o número e a porcentagem de acrilamida dos géis a serem preparados, conforme a Tabela 2, que lista os componentes necessários para 2 géis. Mistura por inversão.
   4. Adicione 10% de solução de persulfato de amônio e TEMED à mistura. Inverta para misturar.
   5. Adicione imediatamente a solução à moldura de gel de fundição, preenchendo até que o volume da solução na moldura de gel fique um pouco abaixo da quantidade necessária para alcançar o fundo do pente, caso o pente seja inserido.
   6. Adicione imediatamente 100–200 μL de etanol puro gota a gota sobre o gel endurecedor. Se os lisados proteicos precisarem ser descongelados e/ou desnaturados, complete isso durante esse período de incubação. Descongelar proteínas no gelo.
      NOTA: Isso vai dispersar a solução para que o gel não endureça de forma desigual.
   7. Depois de endurcir, despeja o etanol. Para o gel de empilhamento, combine acrilamida, água estéril, tampão de 0,5 M Tris/HCl pH6,8 e dodecil sulfato de sódio 10% em um tubo cônico, nos volumes apropriados para o número e a porcentagem de acrilamida dos géis a serem preparados, de acordo com a Tabela 2, que lista os componentes necessários para dois géis. Mistura por inversão.
   8. Adicione a solução de persulfato de amônio a 10% e o TEMED à mistura. Mistura por inversão.
   9. Adicione imediatamente a solução de empilhamento à moldura de gel até que o volume chegue ao topo. Adicione o pente gel imediatamente após despejar o gel. Deixe repousar por ~1 hora ou até que o formato dos poços não mude quando o suporte de gel for levemente balançado.
3. Géis de carga
   1. Preencha a(s) câmara(s) de eletroforese com o buffer de corrida até a linha de preenchimento apropriada para o número de géis a serem operados.
   2. Transfira a estrutura do gel com os pentes ainda dentro para a câmara de eletroforese. Adicione mais buffer de corrida ao espaço entre os géis até que esse reservatório esteja cheio. Retire delicadamente os pentes dos géis imersos.
   3. Pipete 5–10 μL de escada em um poço de cada gel.
   4. Pipete 5–20 μL de proteína extraída e amostras de tampão de Laemmli em cada poço. Adicione 5–10 μL de 1x tampão de Laemmli a quaisquer poços vazios.
      NOTA: O volume que você adicionar pode exigir otimização com base na prevalência da(s) proteína(s) de interesse e/ou eficácia do(s) anticorpo(s).
4. Executando SDS-PAGE
   1. Conecte a câmara de eletroforese a uma fonte de energia. Configurado para funcionar a 150 V por 45 minutos.
      NOTA: Dependendo da configuração, pode ser necessário mais tempo ou uma voltagem maior para que a migração ocorra, então ajuste conforme necessário.
   2. Quando a proteína migrar para a extremidade do gel (onde o conjurador e a estrutura do gel se encontram na parte inferior do aparelho), pare a operação e desligue a fonte de energia.
5. Completando a transferência de proteínas
   NOTA: Esta seção foi desenvolvida usando um aparelho de transferência rápida de proteínas.
   1. Despeje o buffer de transferência em uma bandeja de gel. Adicione uma pilha de transferência, seguida de uma membrana de nitrocelulose e outra pilha de transferência ao líquido para formar um sanduíche com a membrana no meio. Certifique-se de que a pilha de sanduíches esteja completamente imersa no buffer de transferência.
   2. Ligue o aparelho de transferência rápida de proteínas e selecione o protocolo adequado para o número de géis e o tamanho da(s) proteína(s) de interesse.
      NOTA: 1,3 A e 25 V por 10 minutos foram comprovados funcionando bem, mas pode ser necessário otimizar.
   3. Remova a pilha de transferência superior com pinças e deixe o excesso de líquido escorrer para a bandeja de gel. Mova a pilha para o aparelho de transferência de proteínas e coloque-a o mais plano e reto possível; Use um tubo de rolo ou cônico para alisar qualquer ruga. Repita com a membrana.
   4. Use uma ferramenta de ponta romba para separar suavemente as metades superior e inferior da moldura de fundição. Transfira o gel para a membrana do aparelho de transferência de proteínas.
   5. Use pinças para levantar a pilha de transferência restante da bandeja de gel. Drene o excesso de líquido, depois coloque sobre a membrana e a outra pilha. Feche a caixa de gel e execute o programa.
6. Bloqueio e coloração com anticorpos
   1. Abra a caixa de gel e use pinças para remover a pilha superior, depois levante o gel. Confirme que há faixas da escada na membrana. Corte a membrana para incluir apenas a faixa de tamanho de interesse.
   2. Transfira a membrana para uma caixa de blot limpa. Adicione 5 mL de buffer bloqueante, ou o suficiente para cobrir a membrana. Bloqueie sob agitação à temperatura ambiente por 1 hora.
   3. Enquanto isso, prepare-se para a coloração por anticorpos adicionando a concentração recomendada de anticorpos primários a 5 mL de albumina sérica bovina 2% em tampão de lavagem por membrana. Mancha também para proteína(s) doméstica(s) (por exemplo, GAPDH, β-actina).
   4. Remova da agitação e despeje o buffer de bloqueio. Adicione 5 mL da solução primária de anticorpos. Incubar no escuro sob agitação a 4 °C durante a noite (~12–16 h).
      NOTA: Daqui para frente, todas as etapas devem ser concluídas na escuridão.
   5. Lave a membrana 3 x 5 minutos sob agitação em temperatura ambiente com o buffer de lavagem.
   6. Adicione a concentração recomendada de anticorpos secundários a 5% de BSA no buffer de lavagem. Prepare 5 mL de solução para cada membrana.
   7. Derrame o excesso de buffer de lavagem. Adicione 5 mL de solução secundária de anticorpos a cada blot. Incubar no escuro sob agitação em temperatura ambiente por 1 hora.
   8. Lave a membrana 3 x 10 minutos sob agitação em temperatura ambiente com buffer de lavagem. Imagem imediatamente.
7. Detecção e análise de proteínas de interesse
   1. Imagine proteínas usando a plataforma de sua escolha.
   2. Use o ImageJ ou outra plataforma para quantificar a intensidade de cada faixa de interesse.

4. Ensaio de corante de ferro lábil

1. Corante de ferro lábil
   1. Complete toda a seção 1, semeando células em uma placa de 96 poços sob tratamento com ferro por 2 horas. Certifique-se de que existam pelo menos três poços para cada condição de tratamento com ferro, bem como controles negativos (veículo; meio de cultura + 150 μM do quelador de ferro deferoxamina) e positivo (meio de cultura + 180 μM FAC + co-tratamento com corante de ferro lábil).
   2. Prepare uma diluição suficiente de 1:200 da solução estocada de 1 mM de corante de ferro lábil em meio sem soro, para obter 200 μL para cada poço de amostra.
   3. Aspire do meio de cultura. Lave 2 vezes com PBS.
   4. Adicione a solução de coloração a cada poço e incube por 1 hora a 37 °C.
   5. Lave uma vez com PBS. Substitua por PBS.
   6. Faça imagens das células usando o canal vermelho distante de um microscópio de fluorescência (646/662 nm). Salve e exporte as imagens como . TIF.
2. Análise de coloração
   1. Abra as imagens na ImageJ.
   2. Abra a janela de medição pressionando m. Dentro da janela de medição, em Resultados | Defina as medições, selecione a área, a densidade integrada e o valor médio de cinza. Selecione OK.
   3. Use a ferramenta Polygon para desenhar ao redor de cada célula da imagem. Pressione m após cada célula para adicionar as medições à janela de medição.
   4. Depois que todas as células da imagem estiverem quantificadas, copie e cole todos os valores em uma planilha. Use a ferramenta círculo para fazer pelo menos três medições de fundo em áreas não ocupadas por células.
   5. Use a seguinte fórmula para calcular a fluorescência total de células (CTCF) corrigida para cada célula:
      CTCF = densidade integrada – (área da célula selecionada x valor médio cinza das leituras de fundo)
   6. Compare os valores CTCF das células tratadas com ferro com os das células veiculares. O aumento do CTCF indica níveis elevados de ferro lábil.

5. Ensaio de luminescência celular

1. Tratamento de células para ensaio de luminescência
   1. Complete a seção 1, garantindo que o número de poços corresponda a n = 3 para cada condição que você deseja incluir. Adicione pelo menos três poços de controle sem células (somente com mídia completa). 100 μL de células e meio total devem ser adicionados a cada poço.
   2. Após incubar as células não tratadas durante a noite, aplique tratamentos e controles conforme desejar. Certifique-se de incluir uma condição veicular (não tratada), condições com apenas FAC, citotóxico + 10 μM ferrostatina-1 (um agente antiferroptótico), veículo + 1 μM RSL3 e/ou veículo + 10 μM ferrostatina-1 + 1 μM RSL3. Incubar pelo tempo desejado (12–24 horas para maximizar os efeitos do tratamento enquanto previne a morte celular excessiva).
2. Completando o ensaio de luminescência
   1. Ao tratar as células, descongele os componentes do buffer de luminescência até a temperatura ambiente. Combine os componentes necessários e armazene no escuro até estar pronto para uso. Veja as instruções do kit para requisitos de armazenamento de temperatura.
   2. Após o tratamento das células, siga as instruções do kit para tratar as células.
      NOTA: Isso provavelmente incluirá equilíbrio em temperatura ambiente, seguido pela adição do tampão de luminescência e um período final curto de incubação em temperatura ambiente. Uma vez que o buffer de luminescência é adicionado, todos os passos devem ser realizados no escuro.
   3. Complete e registre a luminescência usando um leitor de placas ou instrumento similar.
      NOTA: Para este protocolo, foi usado um tempo de integração de 0,3 s.
   4. Normalize os valores de luminescência dos poços experimentais para a luminescência média dos poços de controle sem células.
      NOTA: Valores de luminescência mais altos indicam um número maior de células vivas.

Resultados

Com base em trabalhos anteriores nossos e de outros, hipotetizamos que aumentar o ferro extracelular geraria sobrecarga intracelular de ferro nas células musculares murinas e nos permitiria monitorar respostas associadas à ferrose a jusante. Por isso, desenvolvemos o fluxo de trabalho C2C12 descrito na Figura 1, no qual as células foram expostas a concentrações definidas de citrato de amônio férrico por 2 a 24 horas, dependendo do ensaio a jusante.

O primeiro passo para validar nosso modelo foi confirmar que o FAC poderia entrar nas células. Usando os primers validados descritos na Tabela 3, realizamos qPCR tanto para as cadeias pesadas quanto leves da ferritina e determinamos que o aumento da entrada de ferro correlaciona com níveis elevados de mRNA de ferritina (Figuras 2A,B). No nível de proteína, um aumento semelhante nos níveis de ferritina foi visível com o aumento da concentração de FAC, embora isso não parecesse ser dependente da dose (Figura 2C). De forma semelhante, a coloração de células C2C12 vivas tratadas com FAC mostrou que aquelas tratadas com uma dose citotóxica de ferro — assim como células tratadas com a dose severa e a coloração lábil de ferro simultaneamente como controle positivo — apresentam visual e quantitativamente aumento no armazenamento de ferro em comparação com células não tratadas e aquelas expostas apenas ao quelante de ferro deferoxamina (DFO; Figura 2D). No geral, esses resultados sugerem que o ferro introduzido via FAC no meio celular está, de fato, entrando nas células.

Tendo estabelecido que a FAC aumentava a carga intracelular de ferro, buscamos determinar se a sobrecarga de ferro era acompanhada de mudanças moleculares e funcionais associadas à ferroptose. O FAC aumentou a expressão de Slc40a1 (ferroportina) (Figura 3A) e elevou o Hmox1 (Figura 3B). A FAC também diminuiu a proteína GPX4, e essa redução foi parcialmente revertida pela deferoxamina (Figura 3C). O tratamento com RSL3 produziu uma redução semelhante na GPX4, situando a resposta do FAC dentro de um contexto molecular mais amplo associado à ferroptose. Funcionalmente, uma dose citotóxica de FAC reduziu a viabilidade baseada em luminescência em 12 horas, e essa perda precoce de viabilidade foi salva pela ferrostatina-1 (Figura 3D). Em contraste, às 24 horas, a separação entre as condições torna-se menos pronunciada e mais variável (Figura 3E). Embora as amostras tratadas com ferrostatina-1 permaneçam elevadas em relação apenas ao FAC citotóxico, a faixa dinâmica geral do ensaio é reduzida neste ponto posterior. Em conjunto, esses dados mostram que o tratamento com FAC produz sobrecarga de ferro, alterações moleculares associadas à ferroptose e uma redução dependente do tempo na viabilidade sensível à ferrostatina em células C2C12.

Figura 1: Resumo gráfico do modelo de sobrecarga de ferro. Neste modelo, as células de C2C12 são semeadas e deixadas incubar durante a noite antes do tratamento com várias doses fisiologicamente significativas de meio de cultura infundido com ferro e análise molecular direta. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Aumento do armazenamento de ferro lábil e síntese de ferritina após a adição de citrato de amônio férrico. Os níveis de mRNA de (A) cadeia pesada de ferritina e (B) cadeia leve de ferritina aumentam com a adição de citrato de amônio férrico no sistema. (C) Os níveis de proteína FTH1 aumentam com a adição de ferro férrico ao sistema. (D) Os níveis de ferro lábil aumentam em células C2C12 tratadas com ferro férrico antes e simultaneamente com a coloração com um corante de ferro lábil de vermelho extremo, em comparação ao controle veicular + deferoxamina. A condição de cotratamento indica tratamento simultâneo com meio de cultura + 180 μM de FAC + corante de ferro lábil. Barras de erro são +/- SD. Abreviações: FTH1 = cadeia pesada de ferritina; FTL1 = cadeia leve de ferritina; DFO = deferoxamina. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Alterações moleculares associadas à ferroptose e redução dependente do tempo na viabilidade celular após a adição de FAC. Os níveis de mRNA (A) ferroportina (Slc40a1) e (B) Hmox1 aumentam após o tratamento com FAC. (C) A proteína GPX4 diminui após o tratamento com FAC e na presença do controle positivo RSL3; a deferoxamina reverte parcialmente a diminuição associada à FAC na GPX4. (D) Luminescência das células C2C12 após tratamento de 12 horas com FAC, RSL3 e/ou ferrostatina-1, normalizada para poços sem células (apenas meio). (E) Luminescência normalizada das células C2C12 tratadas após tratamento de 24 horas com FAC, RSL3 e/ou ferrostatina-1. As barras de erro são +/- SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Segure o palco
1	Aumente para 50 °C a 1,6 °C/s, mantenha por 2 minutos
2	Aumente para 95 °C a 1,6 °C/s, mantenha por 10 minutos
Estágio de PCR (Run x 40)
1	Mantenha 95 °C por 15 s
2	Diminua para 60 °C a 1,6 °C/s, mantenha por 1 min
Estágio de Curva de Fusão
1	Aumente para 95 °C a 1,6 °C/s, mantenha por 15 s
2	Diminua para 60 °C a 1,6 °C/s, mantenha por 1 min
3	Aumente para 95 °C a 0,15 °C/s, mantenha por 1 s

Tabela 1: programa qPCR (duração: ~1:36 h) na seção 2 do protocolo.

	Gel de resolução			Gel de empilhamento
Componente	10%	12.50%	15%
Acrilamida (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
Água estéril (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Tris/HCl, 1,5 M pH 8,8 (mL)	4.2			-
Tris/HCl, 0,5 M pH 6,8 (mL)	-			1.25
10% de dodecilsulfato de sódio (μL)	166			50
0,1 g/mL Persulfato de amônio (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

Tabela 2: Resumo dos componentes e volumes necessários para a configuração bem-sucedida dos géis de resolução e empilhamento para western blot. Os volumes fornecidos são suficientes para dois géis e podem ser escalados de acordo. As porcentagens indicam a quantidade de acrilamida na mistura.  NOTA: APS e TEMED devem ser adicionados por último e somente quando prontos para moldagem, pois eles acionam o processo de polimerização em gel.

Gene Target	Símbolo Genético	Função	Espécies	Sequência Direta	Sequência Reversa
Beta-2-microglobulina	B2m	Gene de limpeza	Rato	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
Proteína de ligação à caixa TATA	TBP	Gene de limpeza	Rato	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Cadeia pesada de ferritina	Fth1	Subunidade da proteína de armazenamento de ferro ferritina	Rato	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA
Cadeia leve de ferritina	Ftl1	Subunidade da proteína de armazenamento de ferro ferritina	Rato	AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT
Heme oxigenase 1	Hmox1	Converte biliverdina em bilirrubina na presença de hemo, CO2 e ferro; Níveis elevados estão presentes na ferroptose	Rato	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ferroportin 1	SLC40a1	Transporta excesso de ferro para fora das células	Rato	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Tabela 3: Lista de primers qPCR validados para transporte de ferro e genes de ferroptose de interesse. Os primers são específicos para camundongos devido ao seu uso em mRNA originado de células C2C12.

Discussão

O objetivo deste estudo foi estabelecer um modelo prático in vitro da sobrecarga de ferro em progenitores musculares murinos e definir condições sob as quais respostas associadas à ferroptose possam ser detectadas de forma confiável. Usando esse fluxo de trabalho, mostramos que o tratamento com citrato de amônio férrico leva a um acúmulo robusto de ferro intracelular, acompanhado por aumento da expressão de ferritina e aumento do sinal de ferro lábil. A carga de ferro está ainda associada a mudanças moleculares consistentes com o estresse relacionado à ferroptose, incluindo aumento da expressão de Slc40a1 e Hmox1 e diminuição da proteína GPX4. Funcionalmente, a exposição citotóxica ao FAC induz uma redução na viabilidade celular que é resgatada pela ferrostatina-1 em momentos iniciais, apoiando a presença de um componente sensível à ferroptose que contribui para a morte celular observada.

A dose de ferro e a duração do tratamento são parâmetros críticos que influenciam diretamente a interpretabilidade desse sistema. Em nossas mãos, os primeiros momentos de tempo (aproximadamente 12 horas) proporcionam a separação mais clara entre as condições, permitindo que a ferrostatina-1 resgate a citotoxicidade induzida por FAC de forma reprodutível. Em momentos posteriores (por exemplo, 24 horas), a viabilidade geral diminui e a variabilidade aumenta entre condições, reduzindo a faixa dinâmica do ensaio. Isso é consistente com a perda e adaptação celular acumulada da população sobrevivente, como aumento da capacidade antioxidante ou alteração no manuseamento do ferro.

A administração de ferro férrico (Fe³⁺) em vez de ferro ferroso (Fe²⁺), assim como a concentração de ferro administrado e a duração do tratamento, também são aspectos críticos do protocolo. O uso de ferro férrico é essencial porque o ferro férrico é facilmente absorvido pela transferrina, o principal transportador responsável pela importação de ferro^{férrico 11}. Embora o ferro ferroso possa ser absorvido por outros transportadores (mais notavelmente o transportador metálico divalente DMT1), nesse contexto, o ferro férrico parecia ser incorporado de forma mais eficaz do que o ferro^{ferroso 12}. As concentrações de FAC escolhidas para este protocolo foram selecionadas devido à sua relevância fisiológica e uso em modelos similares anteriores^13,14. A duração do tratamento com ferro, sendo de 24 horas, também foi baseada em modelos semelhantes de nós e outros. No entanto, em alguns contextos (principalmente os ensaios de coloração lábil de ferro e luminescência celular), 24 horas se mostraram uma duração de tratamento longa demais. Nesses casos, um tratamento de 24 horas resultou em morte celular tão significativa que nenhuma conclusão pôde ser tirada devido à destruição do material celular. Por exemplo, o RSL3 é um agente de peroxidação lipídica tão potente que uma duração de tratamento de 12 h foi suficiente para induzir a peroxidação lipídica e também garantir que os efeitos da sobrecarga de ferro fossem visíveis simultaneamente (Figura 3C-E). Além disso, para o corante de ferro lábil, as células foram tratadas com FAC apenas por uma duração de 2 h antes da coloração (após tentar corar após tratamentos de ferro de 2, 4 e 24 horas) para capturar a resposta inicial à sobrecarga de ferro antes que pudesse ocorrer destruição celular excessiva (Figura 2D). No geral, parece que as alterações em nível gênico e proteico foram melhor medidas após 12–24 horas de tratamento com ferro, provavelmente porque essas alterações levam mais tempo para as células agirem, enquanto a coloração era melhor realizada após um período de tratamento mais curto.

Outros desenvolveram modelos semelhantes. Um grupo gerou um modelo de C2C12 tratado com ferro férrico para estudar o papel do eixo p53-Slc7a11 na ferroptose. Eles descobriram que o tratamento com ferro férrico por 48 horas aumentou a peroxidação lipídica e diminuiu os níveis de Slc7a11 , indicando^{ferroptose 13}. Outro modelo semelhante — desta vez usando células C2C12 tratadas com sulfato ferroso para estudar a relação entre a via da ligase ubiquitina Akt-FoxO3-E3 e a ferroptose — envolveu tratamento com ferro ao longo de 4^{horas e 14} horas. Um fio condutor entre esses é que envolvem o tratamento com ferro das células C2C12 que foram diferenciadas em miotubos, em vez de permanecer em seu estado mais semelhante a células-tronco. Isso torna nosso sistema particularmente relevante para o acúmulo de ferro previamente observado em MuSCs.

Apesar de ser uma forma direta de estudar os efeitos da sobrecarga de ferro nos músculos in vitro, o método apresenta limitações, pois só foi usado no contexto das células C2C12. Trabalhos anteriores mostraram que células-tronco musculares são suscetíveis à sobrecarga de ferro durante o envelhecimento, sugerindo que um método semelhante pode ser válido nesse^{contexto 9}.

Em conjunto, esse modelo demonstra que a sobrecarga de ferro é suficiente para induzir um conjunto reprodutível de alterações moleculares associadas à ferroptose e uma redução da viabilidade sensível à ferrostatina em células C2C12. Embora ensaios ortogonais adicionais possam refinar ainda mais a classificação da morte celular em contextos específicos, as respostas moleculares e farmacológicas combinadas observadas aqui são consistentes com o estresse celular associado à ferroptose. Prevemos que essa abordagem facilitará estudos mecanicistas sobre a desregulação do ferro no envelhecimento muscular e doenças.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Store at -20 °C. Thaw on ice.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Is a neurotoxin. Handle only when wearing appropriate PPE (lab coat, gloves, eye protection).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Polymerizing agent for acrylamide gel casting as a 10% weight/volume solution in sterile water. Powder is room temperature stable, but solution should be stored long-term at -20 °C and short-term at 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Use at a 1:2000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Follow manufacturer's instructions for use. Be advised that standards must be kept at 4 °C after first use.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Use in preparation of Laemmli buffer.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Store at 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Store in the vapor phase of liquid nitrogen.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Store at -20 °C. Thaw on ice.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Since larger, use for extraction of cells from 10 cm and larger dishes.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Since they have a small head, they are best suited for removing cells from multi-well plates.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Use in a fume hood only, and dispose of waste in a separate container.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Dissolve 1 tablet in 500 µL of sterile water to create a 100× solution.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Model version CBS 170-120 V. Use for cell culture.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO is an iron chelator, so adding it to cells decreases iron content. Dissolve in water for a stock concentration of 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Use in labile iron staining and reconstitution.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Add to 5% BSA in wash buffer at a ratio of 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Prepare stock solution by adding 50 µL DMSO to a room temperatureerature aliquot. Light sensitive. Stock concentration: 1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Sequesters lipid peroxidation byproducts, inhibiting ferroptosis in vitro. Dissolve in DMSO for a stock concentration of 10 mM.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Use to supplement DMEM for C2C12 cell culture. Added at 10% by volume.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Use at a 1:1000 concentration in 2% BSA + wash buffer. Runs at ~20 kDa.
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	Use in 6x Laemmli buffer prep.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Use to visualize pellet during RNA purification.
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	Ready to use. Light sensitive. Stock concentration: 10 mM
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A	Use to quantify western blot band intensity and corrected total cell fluorescence from microscopy images.
Inverted Light Microscope	Zeiss	415510-1100-000	Use in cell culture applications.
Isopropanol, 99.5%, 1 L bottle	Thermo Fisher Scientific	327270010
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate, 10 /cs	Thermo Fisher Scientific	N8010560	Use in qPCR.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems	4311971