Interpretação de Variante Clínica com o Integrative Genomics Viewer (IGV) para Patologistas Moleculares

Resumo

O software Integrative Genomics Viewer (IGV) oferece uma interface rica e intuitiva para os dados subjacentes à identificação de variantes clínicas. Aqui apresentamos cinco estudos de caso que demonstram como realizar rapidamente a diferenciação entre eventos patogênicos genuínos e artefatos, reforçando, em última instância, a confiança diagnóstica de profissionais envolvidos na análise molecular de ensaios de sequenciamento de nova geração.

Resumo

O visualizador genômico integrativo (IGV) é uma ferramenta fundamental na genômica clínica, permitindo a visualização e interpretação de dados complexos de sequenciamento. Associar conhecimentos clínicos à avaliação visual dos resultados de sequenciamento é o principal método pelo qual patologistas moleculares e outros profissionais analisam e concluem casos. Diversas ferramentas de software podem auxiliar, mas sua relação com os dados subjacentes deve ser compreendida e aplicada de forma sistemática. Este estudo inclui informações essenciais sobre os tipos de arquivos de dados de sequenciamento de nova geração (NGS) (por exemplo, FASTQ, BAM, VCF), com uma discussão sobre seus formatos e finalidades. Em seguida, descrevemos funcionalidades do IGV que extraem nuances desses arquivos. Utilizamos uma série de casos práticos curados com base em casos clínicos nos quais o leitor interagirá com dados clínicos de sequenciamento NGS usando o software IGV para revisar vários tipos de variantes clinicamente relevantes em relação ao genoma de referência humano. Esses casos clínicos foram cuidadosamente selecionados para ilustrar exemplos das complexidades envolvidas na interpretação de dados genômicos e demonstrar como o uso do IGV como parte de um fluxo de trabalho rotineiro pode fornecer informações interpretativas adicionais sobre variantes, além das chamadas de variantes geradas por algoritmos de software bioinformático de rotina. A inspeção visual de variantes genômicas utilizando as ferramentas do IGV pode revelar pistas contextuais sutis (por exemplo, frequência alélica da variante, viés de fita, contexto específico de tecido) que podem influenciar a interpretação das variantes genômicas. Embora este estudo enfatize o uso do IGV na detecção e interpretação de variantes somáticas, as aplicações fornecidas podem ser extrapoladas para o contexto germinativo, incluindo a análise de variantes complexas e a detecção de mosaicismo.

Introdução

O cuidado oncológico foi transformado nos últimos anos pelo uso de tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS, na sigla em inglês) para orientar o diagnóstico, o prognóstico e a seleção de terapias¹. Os testes com NGS tornaram-se o padrão assistencial em diversos tipos tumorais para: 1) estabelecer um diagnóstico de tumor definido molecularmente, 2) utilizar resultados de biomarcadores independentes do tipo tumoral para decisões terapêuticas e 3) determinar a estratificação de risco para tipos tumorais específicos^2,3. Resultados precisos e oportunos de testes com NGS e outros biomarcadores tornaram-se componentes críticos para o cuidado e o planejamento do tratamento do paciente em oncologia.

Testes de NGS são geralmente realizados em grandes laboratórios de referência ou em laboratórios hospitalares/acadêmicos, quando as instituições possuem conhecimento especializado e recursos suficientes para desenvolver e manter tais testes. A organização Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) foi concebida como uma rede colaborativa, focada no compartilhamento de conhecimentos acadêmicos e nos custos de reagentes⁴. Um esforço significativo do consórcio GOAL tem envolvido sessões de treinamento sobre componentes críticos para a revisão e elaboração de relatórios de estudos clínicos. Essas sessões foram desenvolvidas como aulas práticas instrucionais e incluem um workshop interativo sobre o integrative genomics viewer (IGV), para demonstrar suas funcionalidades básicas e avançadas na medicina genômica.

O IGV é uma ferramenta de visualização de dados projetada para permitir que os usuários revisem facilmente dados de NGS e outros conjuntos de dados extensos, já que a maioria dos dados de NGS é vasta e difícil de manipular sem uma interface gráfica do usuário⁵. Inicialmente, o IGV não foi desenvolvido para análise clínica de variantes. No entanto, devido à sua facilidade de uso para todos os profissionais moleculares, independentemente do nível de experiência em bioinformática, ele tem sido amplamente adotado por muitos laboratórios como parte do fluxo de trabalho complexo de revisão de dados⁶. Este estudo foi elaborado como um mecanismo para disseminar essas informações à comunidade mais ampla de profissionais laboratoriais em genômica.

A necessidade clínica do uso do IGV como parte de um fluxo de trabalho clínico inclui a detecção de erros de sequenciamento, o manejo de complexidades na chamada de variantes genômicas e outras alterações recorrentes nas quais a visualização adicional pode auxiliar na interpretação adequada dos dados⁷. O uso do IGV exige arquivos bioinformáticos padrão provenientes de um estudo de NGS⁸. Os recursos principais do software IGV permitem a visualização de dados de sequenciamento e exigem a configuração de um conjunto de preferências e opções para a interpretação clínica de variantes (Arquivo Suplementar 1).

O fluxo de trabalho de sequenciamento de leituras curtas é caracterizado pelos padrões de arquivos FASTQ, mapa binário de alinhamento (BAM) e formato de chamada de variante (VCF). A NGS alcança seu alto rendimento gerando milhões de leituras curtas em paralelo. Embora essa estratégia acelere significativamente a produção de dados, cada leitura é apenas um fragmento do DNA ou RNA original. Ela é fixada em alguma posição na placa de fluxo de NGS por meio de sua sequência adaptadora. As informações de sequência e qualidade das bases obtidas pelo processamento óptico são registradas em arquivos FASTQ. Essas leituras brutas consistem em sequências de nucleotídeos juntamente com suas pontuações de qualidade por base. Portanto, uma etapa inicial no processamento das leituras brutas é alinhar cada leitura a um genoma de referência⁸. À medida que cada leitura é atribuída a uma localização específica no genoma de referência com a maior probabilidade de alinhamento, as leituras correspondentes à mesma posição "se acumulam" em cada locus, e esses dados são armazenados em um arquivo BAM segundo as especificações do formato de mapeamento de alinhamento de sequência (SAM) (disponível em https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; última verificação: 30/09/2025) (Figura 1A). Essas informações podem ser inspecionadas visualmente por meio de um navegador genômico, como o IGV. Conforme ilustrado na Figura 1B, a comparação entre as leituras ou entre as leituras e a própria sequência de referência pode indicar diferenças ou discrepâncias entre as sequências de nucleotídeos. Resumos apenas dessas posições "variantes" ao longo de todo o genoma são compilados em um arquivo VCF, que, portanto, pode ser muito menor em tamanho do que um arquivo BAM, mas ainda conter grande parte das informações úteis necessárias para a análise de variantes. Por esse motivo, o arquivo VCF é comumente a saída final dos pipelines de chamada de variantes (Figura 1C). Assim, enquanto os arquivos FASTQ contêm os dados brutos de leitura e qualidade, o arquivo BAM fornece informações sobre a confiança com que essas leituras são mapeadas no genoma, e o VCF representa as diferenças entre a sequência de referência e a sequência da amostra, fornecendo uma quantidade muito mais gerenciável de dados para análise e possível relato.

Os seis casos clínicos deste estudo ilustram cenários analíticos comuns associados à detecção de variantes somáticas em laboratórios moleculares, bem como os problemas que dificultam a compreensão e interpretação corretas dos dados subjacentes. No geral, esses casos foram escolhidos para ilustrar cenários interpretativos de complexidade crescente e como o uso de recursos avançados no IGV pode descrever melhor características genômicas abrangentes. Embora este estudo enfatize a interpretação de variantes somáticas, esses recursos são aplicáveis ao uso do IGV na visualização e interpretação de alterações germinativas⁶. Vale ressaltar que os termos utilizados neste artigo baseiam-se na química de sequenciamento por síntese e, quando apropriado, em outros termos ou conceitos análogos para outras plataformas.

Cada vigneta clínica começa com um contexto clínico muito breve, seguido por instruções sobre como investigar a variante ou variantes e resolver a questão: qual (se alguma) das variantes presentes é real e qual (se alguma) é um artefato. O contexto clínico, juntamente com os aspectos particulares dos dados de sequenciamento, é importante para responder a essa pergunta.

Protocolo

Os dados apresentados aqui são uma mistura de dados simulados e reais de NGS de pacientes. No entanto, todos os dados dos pacientes são desidentificados por meio de uma combinação de remoção de rótulos e extração de leituras de locus único. Este protocolo segue as diretrizes aplicáveis do comitê de ética em pesquisa com seres humanos de todas as instituições dos autores.

1. Baixando a instância mais recente do Integrative Genomics Viewer (IGV)

OBSERVAÇÃO: O IGV é um programa gratuito para download que permite visualizar diversos genomas, incluindo o genoma humano (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). O IGV é atualizado periodicamente para incluir novas versões de transcritos, características e faixas, sendo a versão mais recente geralmente exibida no topo da lista.

1. Baixe o arquivo disponível no localizador uniforme de recursos (URL) acima, denominado 'IGV para Windows, Java Incluso', para a área de trabalho, o que pode exigir credenciais administrativas, dependendo da instituição.
2. Escolha a versão do genoma humano que será utilizada nas análises a partir dos relatórios (por exemplo, hg19 ou hg38), as quais estão hospedadas dentro do IGV.
   NOTA: Este estudo utilizou o IGV 2.19.7. Neste protocolo, foi baixada a versão para Windows com Java incluso. O IGV foi executado com alocação de memória padrão de 8 GB de RAM. As configurações recomendadas na aba de preferências do IGV e em outras seções do IGV estão anotadas no Arquivo Suplementar 1.

2. Compreendendo os casos clínicos e baixando os arquivos necessários

1. Navegue até o repositório do GitHub: todos os arquivos estão disponíveis para download no repositório do GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
   NOTA: Há um arquivo de sessão no repositório do GitHub para cada vinheta, e carregar este arquivo de sessão elimina a necessidade de carregar arquivos separadamente e navegar até o locus em questão, pois o arquivo de sessão realiza essas etapas.
2. Carregue um arquivo de sessão por meio do menu de arquivos. Clique em Arquivo > Abrir Sessão e selecione o arquivo de sessão apropriado.

3. Configurando a trilha de cobertura

OBSERVAÇÃO: No IGV, a janela principal inclui uma "coverage track". Em certos contextos, mesmo uma pequena fração de leituras contendo variantes específicas de câncer pode ser clinicamente significativa. Por esse motivo, é fundamental obter uma profundidade de leitura muito alta em todas as regiões do genoma que estão sendo analisadas. Se apenas 2% das leituras contiverem uma determinada variante, pode ser necessária uma profundidade de leitura de centenas ou milhares para identificar a variante de forma convincente – daí o termo "deep sequencing".

1. Certifique-se de que a faixa de cobertura esteja presente: No menu superior, clique em Exibir > Preferências e selecione a guia Alinhamentos. Na parte superior da guia, há uma caixa marcada como 'Mostrar faixa de cobertura'. Certifique-se de que ela esteja marcada.
2. Certifique-se de um limiar clínico significativo para variante de baixo nível: Navegue até a guia Alinhamentos, conforme detalhado na etapa 3.1, e role para baixo até que a caixa marcada como Cobertura da fração alélica fique visível. Defina o valor na caixa como 0,01 e clique em Salvar (a janela de preferências deve fechar ao clicar em Salvar).

4. Configurando leituras com recorte suave

OBSERVAÇÃO: Essa configuração é extremamente valiosa para detectar variantes estruturais maiores, como rearranjos gênicos, alterações no número de cópias ou eventos combinados de inserção–deleção. Os vinhetas avançadas — como aquelas que focam em amplificações e deleções de EGFR — demonstram como reads com recorte suave (soft-clipped) podem corroborar a presença de variantes estruturais que, de outra forma, poderiam ser perdidas por métodos padrão de chamada de variantes.

1. Habilitar clipes suaves: No menu superior, clique Visualizar > Preferências, e selecione o Alinhamentos guia. Role para baixo até a caixa Mostrar bases com recorte suave e certifique-se de que está marcada (Arquivo Suplementar 1) para revelar leituras parcialmente alinhadas—aquelas cujas extremidades não são mapeadas de forma limpa para a referência e são "recortado" desligado.

5. Vignetas clínicas

1. Vinheta #1: Distinguir uma variante patogênica verdadeira de KRAS (oncogene homólogo do vírus da sarcoma de rato de Kirsten) de um artefato de sequenciamento.
   NOTA: O Caso A envolve um homem de 65 anos com adenocarcinoma pulmonar recém-diagnosticado, em que a avaliação histológica estimou aproximadamente 80% de tumor. O perfil por NGS identificou uma variante KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C), uma mutação conhecida como motor em câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). A variante de sentido trocado resultante, KRAS c.34G>T (p.G12C), ocorre em cerca de 13% dos adenocarcinomas pulmonares e confere elegibilidade para terapias direcionadas⁹. O Caso B envolve uma mulher de 54 anos com um sarcoma conhecido (estimado em 50% de tumor e 50% de tecido normal). A mesma variante KRAS c.34G>T (p.G12C) foi identificada nesta amostra. No entanto, como a variante KRAS c.34G>T (p.G12C) raramente é relatada em sarcomas, sua presença suscita suspeita de um possível artefato de sequenciamento. 
   1. Fluxo de trabalho do IGV (arquivo de sessão KRAS.xml)             
      1. Carregar dados: Selecione Hg19 no menu suspenso do genoma e carregue o arquivo bam, kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, e navegue até chr12:25.398.281–25.403.833 para focar na região do gene KRAS. Observe que o arquivo índice (com o mesmo nome do arquivo bam, mas com extensão .bai) precisa estar no mesmo diretório do arquivo bam.  
      2. Investigar cobertura e VAF: Revise o códon 12 no Éxon 2 (NM_004985.5) e clique na posição da variante na faixa de cobertura para mostrar a profundidade de leitura nessa posição. Observe uma substituição G→T (evento de transversão), com VAF de 35%–40%, altamente consistente com uma mutação clonal heterozigota como motor (Figura 2A), especialmente no contexto de aproximadamente 80% de celularidade tumoral.   
      3. Buscar viés de fita (StrandBias): Codifique por cor de acordo com a fita (veja o Arquivo Suplementar 1, Etapa 4) para revelar uma distribuição quase 50:50 de leituras diretas (vermelho): inversas (azul) na amostra pulmonar.  
      4. Repita os passos 5.1.1.1–5.1.1.3 para o Caso B, a amostra de sarcoma: Carregue o arquivo bam, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, e observe o VAF <1% e suporte quase exclusivo na fita direta, indicando um artefato de PCR/alinhamento (Figura 2B).
2. Vinheta #2: Resolver uma classificação incorreta de variante multinucleotídica (MNV).
   NOTA: Uma mulher de 50 anos com melanoma metastático realiza um perfil tumoral baseado em NGS. A análise identifica uma possível mutação BRAF (proto-oncogene B-Raf, quinase serina/treonina) c.1798_1799delinsAA. Embora a mutação BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) seja mais comum em diversos tumores sólidos, a mutação BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) é relativamente específica para melanoma, já que a luz UV pode induzir transições C>T em dímeros de pirimidina¹⁰. De acordo com as regras da HGVS, duas variantes de nucleotídeo único (SNVs) em cis devem ser nomeadas como uma única MNV. Em muitos casos, um pipeline bioinformático pode identificar incorretamente essa variante complexa como duas SNVs adjacentes em cis: BRAF c.1798G>A e BRAF c.1799T>A. Como existem considerações técnicas (ou seja, relacionadas ao chamador de variantes) e biológicas (distinção entre cis e trans), há preocupação de que a mutação possa ser relatada incorretamente no momento da assinatura, a menos que haja visualização dos dados durante a revisão clínica.      
   1. Fluxo de trabalho do IGV (arquivo de sessão BRAF.xml)           
      1. Carregar dados: Selecione Hg38 no menu suspenso do genoma e carregue o arquivo bam, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, e navegue até chr7:140.453.136–140.753.336. Observe que o arquivo índice (com o mesmo nome do arquivo bam, mas com extensão .bai) precisa estar no mesmo diretório do arquivo bam.
      2. Amplie o códon 600 do BRAF: Observe uma mudança dinucleotídica GT→AA com base nas posições adjacentes da faixa de cobertura que são verdes e azuis em vez de cinzas, consistente com p.V600K. 
      3. Examine para identificar duas SNVs individuais e determinar se estão em cis ou trans: Observe que ambas as SNVs estão mapeadas nas mesmas leituras e estão em cis.  
      4. Investigar fita e cobertura: Codifique as leituras por cor para mostrar suporte aproximadamente equilibrado entre as fitas direta/inversa (veja o Arquivo Suplementar 1, Etapa 4), e um VAF superior a 50%, consistente com um motor clonal. Um limiar de faixa de cobertura de 0,01 (veja o Arquivo Suplementar 1, Etapa 3 para configuração) garante que subclones parciais (se presentes) permanecerão visíveis (Figura 2C).  
      5. Observe o contexto e a nomenclatura da MNV: As duas mudanças nucleotídicas são adjacentes entre si. Com base no consenso especializado, classifique SNVs dentro de uma distância de 50 pb que mapeiam na mesma leitura de sequência como uma única variante "complexa" ou "delins"¹¹. 
3. Vinheta #3: Investigar uma inserção no éxon 9 de KIT (proto-oncogene KIT, tirosina quinase receptora) em um tumor estromal gastrointestinal (GIST)
   NOTA: Um paciente masculino de 58 anos com tumor estromal gastrointestinal realiza ressecção e é solicitado teste de NGS. Os resultados mostram uma possível variante em KIT. As mutações em KIT são frequentemente motoras em GISTs, ocorrendo em aproximadamente 75% dos casos, e são alvo terapêutico. Após as mutações ativadoras no éxon 11, as mutações ativadoras no éxon 9 de KIT são os motores mais comuns identificados, embora GISTs com mutações no éxon 9 e no éxon 11 apresentem comportamentos diferentes em relação à sensibilidade aos inibidores da tirosina quinase¹². 
   1. Fluxo de trabalho do IGV (arquivo de sessão KIT.xml)
      1. Carregar dados: Selecione o genoma Hg19 e carregue o arquivo BAM, KITdupmod2.bam, e certifique-se de que o arquivo índice (com o mesmo nome do bam, mas com extensão .bai) esteja no mesmo diretório. Navegue até chr4:55.592.144-55.592.257, correspondente a uma porção do éxon 9 do gene KIT.
      2. Comprimir a visualização: Clique com o botão direito na faixa de alinhamento e selecione Comprimido para condensar a visualização (Figura 3A).
      3. Localizar a inserção: Identifique o marcador de inserção, com formato de ponta de flecha, imediatamente acima da faixa de cobertura, localizado entre as posições 55.592.178 e 55.592.179, indicando uma inserção curta (Figura 3B,C).
      4. Interagir com a inserção: Clique na ponta de flecha para expandir a visualização e clique em uma das leituras com bases preenchendo a lacuna para visualizar os detalhes em uma janela pop-up. Compare a sequência inserida com a sequência de referência para determinar se é uma duplicação (Figura 3D,E).
      5. Observar a cobertura: Clique na faixa de cobertura imediatamente adjacente ao marcador de inserção para exibir o número de leituras de suporte, que pode ser comparado com a contagem total de leituras para determinar a frequência alélica da variante (VAF) aproximada, neste caso ~28%.
      6. Verificar viés de fita: Ordene as leituras por fita da leitura e visualize as bases com corte mole (veja o Arquivo Suplementar 1, seção 3) para mostrar uma região de interesse adjacente à inserção nas leituras inversas (Figura 3F).
4. Vinheta #4: Investigar uma deleção no éxon 19 de EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) em câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
   NOTA: Uma mulher de 70 anos com NSCLC recém-diagnosticado realiza ressecção cirúrgica da massa. É solicitado NGS em uma seção de tecido com pureza tumoral suficiente, e os resultados mostram uma possível variante em EGFR. Muitas mutações em EGFR são suscetíveis aos inibidores da tirosina quinase, e esta variante pode ter impacto na terapia e no prognóstico do paciente¹³.
   1. Fluxo de trabalho do IGV (arquivo de sessão EGFR.xml)
      1. Carregar dados: Selecione o genoma Hg19, carregue o arquivo bam EGFRE746_A750delmod.bam, e certifique-se de que o arquivo índice (com o mesmo nome do bam, mas com extensão .bai) esteja no mesmo diretório, e navegue até chr7:55.242.420-55.242.513, correspondente a uma porção do éxon 19 do gene EGFR.
      2. Investigar deleção usando a faixa de cobertura: Revise a faixa de cobertura para identificar uma pequena região de menor cobertura não posicionada nas extremidades das leituras (Figura 4A,B). A análise da faixa de cobertura mostra menor cobertura em uma pequena porção do éxon 19.
      3. Investigar deleção usando as leituras: Expanda a visualização de alinhamento para mostrar leituras com uma lacuna de alinhamento, representada como uma linha preta dentro da leitura (Figura 4C,D).
      4. Considerar o contexto genômico: Investigar a sequência nucleotídica da referência envolvida e nas imediações imediatas da deleção. Avalie a chamada de deleção no contexto da posição dentro da sequência de referência, pois deleções em regiões de homopolímeros ou repetitivas podem representar um artefato de sequenciamento, especialmente quando presentes em baixa frequência alélica da variante. Veja a seção Visualizando uma pequena deleção do Arquivo Suplementar 2 para uma descrição detalhada do fluxo de trabalho.
5. Vinheta #5: Investigar alterações em EGFR em um paciente com glioblastoma.
   NOTA: Uma mulher de 77 anos com glioblastoma do tipo selvagem para IDH realiza teste de sequenciamento de nova geração (NGS). Seus resultados indicam um possível ganho de número de cópias de EGFR e uma possível rearranjo EGFRvIII (deleção dos éxons 2–7). Tanto a amplificação de EGFR quanto as alterações em EGFRvIII têm significado prognóstico e terapêutico no glioblastoma. Além disso, essas duas alterações frequentemente coocorrem, o que significa que a presença de uma pode apoiar a validade da outra quando detectada em baixos níveis.
   1. Fluxo de trabalho do IGV (arquivo de sessão copynumber.xml):
      1. Carregar dados: Selecione o genoma Hg38, carregue o arquivo de segmentação, proband.seg, e amostras comparadoras, c1.seg-c9.seg, arrastando e soltando-os na janela do IGV. Navegue até o Chr7.
         NOTA: Os arquivos de segmentação gerados pelo CNVKit estão disponíveis para download. O fluxo de trabalho completo para uso do CNVKit na geração da quantificação do número de cópias está fora do escopo deste estudo. No entanto, brevemente, foi usado o CNVKit versão 0.9.9 (disponível para download em https://github.com/etal/cnvkit) com uma referência agrupada pré-fabricada consistindo em espécimes normais e euploides. A entrada consiste em um arquivo bed contendo 9.144 locais de sonda do esqueleto CNV, distribuídos pelo genoma. Uma consideração importante aqui é que os detalhes específicos das entradas e parâmetros do pipeline de número de cópias são menos importantes do que o fato de que as amostras são processadas usando uma configuração idêntica para todas as amostras em um ensaio. Isso facilita o reconhecimento de viés sistêmico.
      2. Avaliar o mapa de calor: Compare a intensidade relativa da cor entre a amostra de interesse (localize a linha do mapa de calor correspondente a esta amostra, rotulada como proband) e outras amostras (c1-9) para distinguir mudanças reais no número de cópias de artefatos.
         NOTA: A comparação visual vertical de um locus em todas as amostras é o meio para identificar anomalias (diferenças qualitativas baseadas em diferenças de cor entre linhas, em vez de diferenças quantitativas) em um dado locus em cada amostra em relação ao fundo. Consulte a Figura 5 e a seção Visualizando mudanças no número de cópias do Arquivo Suplementar 2 para etapas detalhadas.
6. Vinheta #6: Investigar EGFRvIII em um paciente com glioblastoma.
   NOTA: A mesma paciente também apresenta evidência de um rearranjo EGFRvIII (deleção dos éxons 2–7). Tanto a amplificação de EGFR quanto as alterações em EGFRvIII têm significado prognóstico e terapêutico no glioblastoma. Além disso, essas duas alterações frequentemente coocorrem, o que significa que a presença de uma pode apoiar a validade da outra quando detectada em baixos níveis.
   1. Fluxo de trabalho do IGV (arquivo de sessão egfr_vIII.xml):
      1. Carregar dados: Selecione o genoma Hg19, carregue o arquivo bam do paciente, proband.bam, e certifique-se de que o arquivo índice (com o mesmo nome do bam, mas com extensão .bai) esteja no mesmo diretório, e navegue até o gene EGFR.
      2. Visualizar pontos de quebra de EGFRvIII: Ajuste a visualização para examinar individualmente os pontos de quebra candidatos (acima do éxon 2 e abaixo do éxon 7 para EGFRvIII), e realize 'ordenar por base'  (ou use o atalho Ctrl-s no Windows/Linux ou Cmd-s no Mac) nos pontos de quebra para visualizar acúmulos de leituras com corte mole.
      3. Alinhar leituras com BLAT: Clique com o botão direito em uma sequência com corte mole e selecione BLAT sequence (o IGV usa os padrões do UCSC; veja https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html para os parâmetros padrão do BLAT). Clique na primeira linha e observe a faixa Blat que aparece na parte inferior da seção de faixas do IGV.
         NOTA: Mesmo uma única leitura que se alinhe à junção do éxon 1/intron 1 e à junção do intron 6/éxon 7 pode ser evidência suficiente de EGFRvIII, desde que a contaminação cruzada de outra amostra seja descartada como razão para essa leitura. Consulte a Figura 6 e a seção Visualizando rearranjo estrutural do Arquivo Suplementar 2 para etapas detalhadas.

Resultados

Vale ressaltar que este estudo foca na descrição das particularidades da análise de variantes no IGV para fins de relato clínico. O relato clínico final deve depender do pipeline validado de cada laboratório individual, critérios de qualidade e política de relato. Uma discussão completa desse tópico importante está além do escopo do presente estudo; no entanto, padrões e diretrizes recomendados foram elaborados pelo Colégio Americano de Genética Médica e Genômica e pela Associação de Patologia Molecular⁷ e são regularmente implementados em laboratórios clínicos.

Interpretação do Caso Clínico nº 1:

Dada a alta FVA, distribuição equilibrada entre as fitas e a incidência conhecida da mutação KRAS c.34G>T (p.G12C) no câncer de pulmão (Figura 2A), a variante no caso A pode resultar em terapia direcionada e, portanto, é essencial relatá-la clinicamente. Apesar da detecção positiva da mesma variante KRAS c.34 G>T no segundo caso (sarcoma) (Figura 2B), existem múltiplos sinais de alerta indicativos de um falso positivo: (1) a fração alélica da variante relatada (FVA) é de aproximadamente 1%, valor muito abaixo do esperado para um evento condutor em uma amostra com celularidade tumoral estimada, ainda que baixa (20%), e (2) as leituras que suportam essa variante apresentam viés de fita, aparecendo quase exclusivamente na fita direta. Juntamente com a falta de plausibilidade biológica para esse tipo de câncer, as evidências sugerem que a alteração detectada no caso B é um artefato.

Interpretação do Caso Clínico nº 2:

Este artigo ilustra diversos erros distintos dos quais os clínicos devem estar cientes. Primeiramente, chamadores de variantes podem identificar variantes genéticas adjacentes correta ou incorretamente como dois SNVs ou como um único MNV (Figura 2C). Isso ocorre devido à diferença na implementação do algoritmo de chamada de variantes com reconhecimento de haplótipos em chamadores de variantes somáticas. Apenas alguns chamadores de variantes, mais recentemente publicados, incorporam esse recurso^14,15. Em segundo lugar, variações técnicas e baseadas em nomenclatura como essas são inseridas em bancos de dados externos por centros de sequenciamento que utilizam diferentes pipelines bioinformáticos. Assim, eles podem conter múltiplos registros distintos do que deveria ser listado como uma única variante genética. A menos que ocorra periodicamente a faseamento dos bancos de dados, isso pode ter diversos efeitos indesejáveis na interpretação clínica subsequente. Em conjunto, essas possíveis fontes de erro podem colaborar para um laudo incorreto ao paciente. Esse cenário complexo destaca o valor da visualização de variantes utilizando softwares de alta qualidade, como o IGV.

Interpretação do Caso Clínico nº 3:

Dado o suporte multi-leitura para a duplicação e o mecanismo conhecido de ativação constitutiva de KIT com duplicações do éxon 9 em GIST, podemos concluir que isso KIT A variante c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) é real e não um artefatoFigura 3). As mutações no KIT são frequentes impulsionadoras nos GISTs, ocorrendo em aproximadamente 90% dos casos. A caracterização precisa das variantes é fundamental aqui, pois, embora as mutações ativadoras no éxon 11 sejam as mais comuns, os GISTs com mutações no éxon 9 apresentam comportamento distinto quanto à sensibilidade aos inibidores da tirosina quinase, alterando assim a abordagem terapêutica. Dada a importância clínica de KIT mutações nos GISTs, esta variante deve ser incluída no relatório final.

Interpretação do Caso Clínico nº 4:

Dado o perfil de cobertura, a aparência típica de pequenas deleções, o suporte das leituras e o mecanismo conhecido de ativação constitutiva das deleções no éxon 19 de EGFR em CCRP, podemos concluir que esta variante EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) é real e não um artefato (Figura 4). Muitas mutações em EGFR, incluindo essa bem conhecida deleção no éxon 19, são altamente suscetíveis a inibidores de tirosina quinase. Dada a importância clínica das mutações em EGFR nos CCRP, essa variante deve ser incluída no relatório final.

Interpretação da Vigneta Clínica nº 5 e da Vigneta nº 6:

As visualizações em mapa de calor confirmam a amplificação de EGFR e a junção do ponto de quebra entre os éxons 1 e 8, avaliada com BLAT, o que corrobora ambas as descobertas neste paciente (Figura 5 e Figura 6). A amplificação de EGFR é geralmente considerada um fator prognóstico de doença mais agressiva, e a rearrumação gênica de EGFRvIII é um biomarcador específico de glioblastoma (GBM) e potencialmente passível de alvo terapêutico^16,17.

Fluxos de trabalho selecionados podem ser reproduzidos usando arquivos salvos na branch principal do repositório do GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (atualizado em 6/9/2026), que contém seis arquivos de sessão, um para cada vinheta, cinco pares de arquivos bam e bai, um para cada vinheta que utiliza um arquivo de alinhamento, e 10 arquivos seg para a vinheta cinco, que utiliza arquivos de segmento em vez de arquivos de alinhamento.

Figura 1: Padrões de arquivos de NGS e fluxo de trabalho de sequenciamento. (A) Leituras curtas geradas em uma célula de fluxo são rastreadas por medições ópticas e armazenadas no formato FASTQ, que inclui tanto os dados de sequência quanto as pontuações de qualidade por base. Essas leituras são então classificadas e alinhadas a um genoma de referência, gerando um arquivo BAM com cada leitura "empilhada" em seu locus correspondente. (B) Discrepâncias entre a referência e as leituras (por exemplo, mutações pontuais, pequenas inserções/deleções) são identificadas por algoritmos de chamada de variantes. (C) Por fim, essas variantes detectadas são compiladas em um arquivo VCF, resumindo suas posições, bases de referência/alternativas e outros dados de anotação. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visualização baseada no IGV da variante KRAS c.34G>T (p.G12C) e da BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (A) Visualização de uma variante real (KRAS c.34G>T (p.G12C)) no IGV, demonstrando alta profundidade de leitura (milhares de leituras) e cerca de 35–40% das leituras apresentando a alteração G→T. As leituras diretas (vermelhas) e reversas (azuis) estão equilibradas, sugerindo uma mutação heterozigótica verdadeira. (B) Artefato suspeito em tecido não relevante mostrando uma variante com suporte mínimo de leituras (1% de VAF). A maioria das leituras da variante aparece na fita direcional (vermelha), indicando viés de fita. (C) Uma variante complexa, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K), observada no IGV, revelando uma substituição de duas bases (GT→AA) em cis. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Visualização de uma pequena inserção. (A) Visualização "comprimida" do éxon 9 do KIT no IGV ajuda a identificar a região de interesse. (B) Região de interesse (caixa vermelha) identificada ao visualizar a barra de inserção e as bases recortadas parcialmente. (C) Configuração da visualização "expandida" no IGV para permitir a visualização da inserção. (D) Clicar na barra de inserção (caixa vermelha) exibe a sequência inserida. (E) A sequência inserida é comparada à sequência de referência para identificar as bases duplicadas. (F) Ordenação das leituras por fita da leitura, mostrando que as bases recortadas parcialmente correspondem à inserção nas leituras reversas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4: Visualização de uma pequena deleção. (A) Visualização "comprimida" do éxon 19 de EGFR, mostrando a deleção presente em diversas leituras. (B) Uso da trilha de cobertura para revisar o número de leituras em posições dentro e adjacentes à deleção. (C) Visualização "expandida" mostrando a deleção, identificando o número de bases deletadas. (D) Comparação com a sequência de referência (caixa vermelha) identifica as bases deletadas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 5: Visualização de um ganho de número de cópias. (A) Existem seis colunas em um arquivo seg: ID da amostra, cromossomo, início, fim, marcadores no segmento e média do segmento. (B) Carregar os arquivos seg diretamente no IGV permite uma visualização conveniente. (C) Visualização dos dados em uma visão genoma-wide. Cada amostra aparecerá como uma linha de dados, com cores especificando valores, vermelho para >0 e azul para <0, sendo cores mais intensas indicativas de valores mais distantes de 0. Após abrir a amostra de interesse e nove amostras aleatórias do mesmo experimento, os resultados formam um mapa de calor multiamostra com dez linhas. A amostra de interesse é destacada na parte inferior dentro da caixa vermelha. (D) Ao restringir a visualização para o locus EGFR, uma barra vermelha é observada na amostra de interesse na parte inferior, enquanto barras brancas ou azuis são vistas nas amostras aleatórias. Essa diferença de cor entre a amostra de interesse e as amostras aleatórias nas demais linhas demonstra que a chamada de amplificação na amostra de interesse está acima do ruído de fundo neste locus. (E) Ao ampliar a visão para o chr7, observa-se um contraste entre o locus contendo EGFR na nossa amostra e sua ausência nas amostras aleatórias. A amplificação de EGFR aparece como uma faixa vermelha fina na amostra inferior. (F) Ao restringir a visualização para o locus MET, a amplificação de MET é replicada em graus variados nas nove amostras aleatórias, juntamente com a amostra de interesse, sugerindo que essa chamada de amplificação é um artefato. Isso destaca a diferença na aparência entre uma chamada real de número de cópias no locus EGFR e um artefato. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 6: Visualização de uma reorganização gênica do EGFRvIII. Antes de analisar este caso, certifique-se de que a visualização das bases com soft clip foi configurada (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter mais detalhes). (A) Navegue até a primeira junção candidata e defina a exibição da trilha de alinhamento como "Compactada". (B) Percorra o locus, aplicando iterativamente o atalho de ordenação por base, "control-s", até que um acúmulo de leituras com soft clip semelhantes fique visível no topo da trilha de alinhamento. Quanto maior a quantidade de leituras com soft clip semelhantes (caixa vermelha) no acúmulo, maior a confiança na ocorrência de uma reorganização estrutural. (C) A ferramenta BLAT recupera a sequência das bases com soft clip e identifica onde no genoma essa sequência está presente, juntamente com uma pontuação quantitativa que mede o grau de similaridade entre a sequência e uma sequência específica em uma base de dados de referência. A seleção de uma linha específica navegará até essa localização. (D) O uso novamente da função de ordenação por base "control-s" demonstra um acúmulo com soft clip, desta vez no lado oposto das leituras. Para confirmar que não há bases adicionais na amostra em relação ao genoma de referência hg38, clique com o botão direito em uma leitura com sequência de bases com soft clip e realize novamente o BLAT das bases com soft clip. A tabela resultante exibe o primeiro ponto de quebra da junção, o locus inicialmente visualizado, a junção entre o éxon 1 e o íntron 1. (E) A seleção da primeira linha retorna ao primeiro ponto de quebra. As bases na junção do alinhamento de referência do BLAT são idênticas às bases com soft clip usadas como consulta, indicando que toda a sequência de leituras com soft clip está contida no alinhamento da sequência de referência. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Configuração recomendada do IGV.Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Fluxos de trabalho resumidos.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A revisão precisa de variantes para relatórios clínicos depende de algoritmos bioinformáticos complexos e da incorporação da análise visual de variantes complexos utilizando o IGV^5,6. Este estudo foi elaborado para compilar um recurso conciso de configurações recomendadas para visualizar alterações genômicas simples e complexas no IGV (Arquivo Suplementar 1). Este estudo concentra-se nas alterações somáticas comuns e na forma de analisá-las no IGV.

O protocolo começa com a avaliação de uma mutação de substituição simples (Figura 2A) e uma mutação de substituição complexa (Figura 2C), com atenção especial para determinar se a alteração identificada é real ou um artefato. Em seguida, aborda uma inserção simples (Figura 3) e uma deleção simples (Figura 4), destacando como essas alterações se apresentam no IGV. Por fim, discute alterações genômicas complexas, incluindo alterações no número de cópias (Figura 5) e rearranjos estruturais (Figura 6). Fluxos de trabalho resumidos, destacando os passos principais para cada uma dessas características, são apresentados no Arquivo Suplementar 2. Este estudo tem como objetivo familiarizar o leitor com a aparência das diferentes alterações genômicas no IGV⁵.

Vale ressaltar que o IGV não é utilizado como uma ferramenta de pipeline para detecção independente de variantes. Embora fora do escopo deste manuscrito, recomenda-se fortemente que laboratórios de pesquisa e exija-se de laboratórios clínicos que as políticas e procedimentos laboratoriais abordem variantes passíveis de relato com base nas limitações da validação do ensaio quanto à fração alélica da variante e profundidade de cobertura, se é necessária confirmação ortogonal para variantes sob certas circunstâncias, as complexidades envolvendo a versão do software de bioinformática e a variação interobservador na interpretação visual^1,7.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BLAT	Pesquisa BLAT no Genoma	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	Página web independente do BLAT. A API do BLAT está disponível dentro do IGV, sem necessidade de instalação adicional
CNVKit	GitHub	https://github.com/etal/cnvkit	Repositório público no GitHub com o CNVKit disponível gratuitamente para download. Instruções para baixar e executar o CNVKit também estão disponíveis aqui.
Arquivo de segmento comparador #1 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador #2 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador #3 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador #4 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador #5 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador #6 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador #7 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador #8 para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg	Arquivos de Número de Cópias
Arquivo de segmento comparador para o tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg	Arquivos de Número de Cópias
Sequência do Genoma Humano	Sequência do Genoma Humano	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gz	Arquivo fasta disponível para download contendo a montagem do genoma humano Hg38.  Este está disponível dentro do IGV, sem necessidade de download adicional
Sequência do Genoma Humano	Sequência do Genoma Humano	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz	Arquivo fasta disponível para download contendo a montagem do genoma humano Hg19. Este está disponível dentro do IGV, sem necessidade de download adicional
Pacote de Software IGV	Software IGV	https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exe	Versão 2.19.7 do software IGV com Java (JDK 21), gratuito para download. O link fornecido é para Windows, embora links para Linux e Mac também estejam disponíveis.
Arquivo de segmento para o caso do tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg	Arquivos de Número de Cópias
Repositório GitHub do Tutorial	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main	Repositório público no GitHub com todos os arquivos necessários para reproduzir os seis tutoriais
Tutorial #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml	Arquivos de Sessão
Índice bai do caso A do tutorial #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam.bai	Arquivos de Alinhamento
Arquivo de alinhamento bam do caso A do tutorial #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam	Arquivos de Alinhamento
Índice bai do caso B do tutorial #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam.bai	Arquivos de Alinhamento
Arquivo de alinhamento bam do caso B do tutorial #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam	Arquivos de Alinhamento
Tutorial #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml	Arquivos de Sessão
Tutorial #2  índice bai	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai	Arquivos de Alinhamento
Tutorial #2  arquivo de alinhamento bam	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam	Arquivos de Alinhamento
Tutorial #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml	Arquivos de Sessão
Arquivo de índice bai do tutorial #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai	Arquivos de Alinhamento
Arquivo de alinhamento bam do tutorial #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam	Arquivos de Alinhamento
Tutorial #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml	Arquivos de Sessão
Arquivo de alinhamento do tutorial #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam	Arquivos de Alinhamento
Índice bai do tutorial #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai	Arquivos de Alinhamento
Tutorial #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml	Arquivos de Sessão
Tutorial #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml	Arquivos de Sessão
Índice bai do tutorial #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai	Arquivos de Alinhamento
Arquivo de alinhamento bam do tutorial #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam	Arquivos de Alinhamento