Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

Resumo

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Resumo

O desenvolvimento de sistemas modelos humanos fisiologicamente relevantes que recapitulam a arquitetura dos tecidos e a dinâmica do estado celular continua sendo um grande desafio no estudo do desenvolvimento mamário e dos primeiros eventos na carcinogênese. Culturas bidimensionais convencionais e muitos sistemas tridimensionais não capturam a organização estrutural e os sinais microambientais que definem a glândula mamária humana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para gerar organoides mamários humanos tridimensionais a partir de células epiteliais primárias embutidas em uma matriz de hidrogel definida composta por colágeno tipo I, laminina, fibronectina e ácido hialurônico. Esse sistema apoia a progressão de células individuais através de estágios-chave da morfogênese mamária, incluindo a expansão dos progenitores, o padrão epitelial e a formação de estruturas semelhantes a unidades lobulares ductais terminais, bem como o surgimento de um compartimento semelhante a mesênquima, ao longo de um período de cultivo de 21 dias. Fornecemos um protocolo passo a passo para preparação de hidrogel, semeadura celular e condições de cultura. O método é compatível com imagens de alto conteúdo e análise quantitativa do número de organoides, distribuição de tamanho e complexidade arquitetônica. Essa plataforma possibilita estudos mecanicistas da plasticidade epitelial e perturbações ambientais, fornecendo um sistema escalável e biologicamente relevante para investigar alterações precoces nos níveis de tecido associadas ao risco de câncer de mama.

Introdução

Compreender o desenvolvimento das glândulas mamárias humanas e os eventos iniciais que predispõem o tecido à transformação maligna requer sistemas experimentais que recapitulem fielmente a arquitetura tecidual, a hierarquia celular e a sinalização microambiental. Embora culturas epiteliais bidimensionais tenham fornecido importantes insights mecanicistas, elas carecem do contexto estrutural necessário para modelar a organização epitelial e a^{morfogênese 1}. Os sistemas de cultura tridimensional existentes, incluindo aqueles baseados em extratos de membrana basal, avançaram o campo, mas permanecem limitados pela c....

Protocolo

Tecidos primários que, de outra forma, teriam sido descartados como resíduos médicos após cirurgias foram obtidos em conformidade com todas as leis relevantes, utilizando protocolos aprovados pelos comitês institucionais de revisão do Maine Medical Center e do Tufts Medical Center. Todos os tecidos foram anonimizados antes da transferência e não puderam ser rastreados até pacientes específicos. Por essa razão, essa pesquisa recebeu status de isenção pelo Comitê de Uso de Humanos como Sujeitos Experimentais do Instituto de Tecnologia de Massachusetts e da Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Todos os pacientes inscritos neste....

Resultados

A execução bem-sucedida desse protocolo resulta na formação de estruturas organoides tridimensionais que exibem morfologia epitelial organizada e características arquitetônicas específicas do tecido. Os organoides começam a se formar entre 3 e 7 dias após a semeadura e continuam a se desenvolver durante todo o período de cultura. Caracterizações anteriores desse sistema organoide hidrogel demonstraram formação reprodutível de organoides em múltiplos doadores humanos primários

Discussão

O protocolo descrito aqui permite a geração reprodutível de organoides mamários humanos tridimensionais dentro de um microambiente hidrogel definido que apoia características-chave da morfogênese^{mamária 3}. Vários passos são fundamentais para o sucesso desse método. Primeiro, o processamento de tecidos e a dissociação enzimática devem ser cuidadosamente controlados para preservar a viabilidade epitelial enquanto minimizam a superdigestão, o que pode reduzir o rendi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Tubos estéreis para processamento de tecidos e centrifugação
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Dispositivo de filtração para preparação de suspensão de células únicas
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Dispositivo de filtração para preparação de suspensão de células únicas
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Dispositivo usado para contar células e determinar a viabilidade
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Suplemento para meio de células epiteliais
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Lâminas de câmara dupla usadas para contagem de células
Centrifuge	N/A	N/A	Centrífuga de mesa/s precisa ter pelo menos capacidade de velocidade de 500 x g e acomodação de tubos de 15 mL e 1,5 mL.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Proteína da matriz extracelular usada para formação de hidrogel
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzima usada para dissociação de tecidos
Cryovials	Corning	976171	Frascos estéreis para armazenamento criogênico de amostras
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Plataformas para deposição de hidrogel e cultura de organoides.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Crioprotetor usado em meio de congelamento
Dispase II	Roche	4942078001	Enzima usada para dissociação secundária de tecidos
DNase I	Roche	10104159001	Enzima usada durante a dissociação celular.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Suplemento sérico usado em meio de lavagem e neutralização
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Componente da proteína da matriz extracelular
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Suplemento para meio de células epiteliais
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Suplemento para meio de células epiteliais
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Suplemento para meio de células epiteliais
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Componente da matriz extracelular para formulação de hidrogel
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzima usada para dissociação de tecidos
Incubator	Thermo Scientific	3598	Dispositivo usado para incubação de cultura de tecidos
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Suplemento para meio de células epiteliais
Laminin	Gibco	23017-015	Componente da proteína da matriz extracelular
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Meio de crescimento para células epiteliais
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubos usados para reações de pequeno volume
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotador usado para dispersão de tecidos durante a dissociação enzimática
P1000 pipette	Gilson	P1000	Dispositivo usado para misturar e transferir volumes de até 1.000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Suplemento antibiótico para meio de células epiteliais
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Solução tamponada com fosfato usada para lavagem e enxágue
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Balança usada para pesagem de tecidos
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipeta usada para colher células epiteliais não aderentes
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagente usado para neutralização de colágeno
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Ferramentas usadas para picar mecanicamente tecidos
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Corante usado para avaliação da viabilidade celular
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Reagente enzimático usado para dissociação celular
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Dispositivo usado para descongelamento controlado de amostras