Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.
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Artigo de método
Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento de sistemas modelos humanos fisiologicamente relevantes que recapitulam a arquitetura dos tecidos e a dinâmica do estado celular continua sendo um grande desafio no estudo do desenvolvimento mamário e dos primeiros eventos na carcinogênese. Culturas bidimensionais convencionais e muitos sistemas tridimensionais não capturam a organização estrutural e os sinais microambientais que definem a glândula mamária humana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para gerar organoides mamários humanos tridimensionais a partir de células epiteliais primárias embutidas em uma matriz de hidrogel definida composta por colágeno tipo I, laminina, fibronectina e ácido hialurônico. Esse sistema apoia a progressão de células individuais através de estágios-chave da morfogênese mamária, incluindo a expansão dos progenitores, o padrão epitelial e a formação de estruturas semelhantes a unidades lobulares ductais terminais, bem como o surgimento de um compartimento semelhante a mesênquima, ao longo de um período de cultivo de 21 dias. Fornecemos um protocolo passo a passo para preparação de hidrogel, semeadura celular e condições de cultura. O método é compatível com imagens de alto conteúdo e análise quantitativa do número de organoides, distribuição de tamanho e complexidade arquitetônica. Essa plataforma possibilita estudos mecanicistas da plasticidade epitelial e perturbações ambientais, fornecendo um sistema escalável e biologicamente relevante para investigar alterações precoces nos níveis de tecido associadas ao risco de câncer de mama.
Introdução
Compreender o desenvolvimento das glândulas mamárias humanas e os eventos iniciais que predispõem o tecido à transformação maligna requer sistemas experimentais que recapitulem fielmente a arquitetura tecidual, a hierarquia celular e a sinalização microambiental. Embora culturas epiteliais bidimensionais tenham fornecido importantes insights mecanicistas, elas carecem do contexto estrutural necessário para modelar a organização epitelial e amorfogênese 1. Os sistemas de cultura tridimensional existentes, incluindo aqueles baseados em extratos de membrana basal, avançaram o campo, mas permanecem limitados pela composição variável, controle incompleto sobre componentes da matriz extracelular e suporte inconsistente à arquitetura tecidual de ordemsuperior 1. Além disso, muitos sistemas organoides baseados em extratos de membrana basal são limitados pela incapacidade de suportar consistentemente o surgimento de uma organização semelhante a tecido1. Em particular, muitos sistemas dependem de componentes estromais exógenos em vez de permitir o desenvolvimento endógeno de microambientes de suporte, limitando assim sua capacidade de modelar interações epitelial–mesenquimatosas que são centrais para o desenvolvimento e doenças dos tecidos. Essas limitações restringem o estudo reprodutível dos processos de desenvolvimento, da plasticidade epitelial e dos efeitos de perturbações ambientais ou moleculares na organização dos tecidos.
Para enfrentar essas limitações, desenvolvemos um modelo tridimensional definido de organoide humano da mama à base de hidrogel, que permite que células epiteliais primárias gerem estruturas organizadas dentro de uma matriz extracelulardefinida 2,3,4,5,8. O hidrogel consiste em colágeno tipo I, laminina, fibronectina e ácido hialurônico, componentes selecionados com base em seus papéis estabelecidos no desenvolvimento das glândulas mamárias e na morfogênese epitelial. Essas moléculas da matriz extracelular envolvem receptores celulares distintos, incluindo integrinas, receptores do domínio discoidinal, CD44 e RHAMM, e são conhecidas por regular a polaridade epitelial, morfogênese ramificada, manutenção de células-tronco, mecanotransdução e organização dos tecidos na glândulamamária 6,7. Estudos anteriores que descreveram esse sistema de hidrogel demonstraram que a incorporação desses componentes da matriz extracelular melhorou significativamente a morfogênese ductal-lobular e a maturação epitelial em comparação com condições baseadas apenas em colágeno ou baseadas emMatrigel 3,8. Além disso, as propriedades físicas dessa formulação de hidrogel foram previamente caracterizadas por microscopia de força atômica, demonstrando que o hidrogel composto de matriz extracelular exibia menor rigidez e aumento do inchaço em relação aos géis apenas de colágeno (módulo de Young: 256,7 ± 20,0 Pa versus 559,2 ± 204,0 Pa, respectivamente), consistente com um ambiente de matriz mais macio ehidratado 8.
Importante destacar que esse modelo apoia o surgimento de um compartimento semelhante a mesênquima que surge ao lado das estruturas epiteliais, fornecendo suporte estrutural e de sinalização endógeno que reflete mais de perto a organização dos tecidosnativos 3. A relevância fisiológica desse sistema de hidrogel foi avaliada por meio de comparações diretas com culturas organoides convencionais baseadas em Matrigel, utilizando análises morfológicas e transcriptômicas. Estudos anteriores demonstraram que culturas de hidrogel suportavam a formação de tecido ductal-lobular mais organizada e a diferenciação multilinhagem do que as culturas baseadas em Matrigel, ao mesmo tempo em que preservavam a respostahormonal 8. Mais recentemente, análises integradas de sequenciamento de RNA unicelular comparando organoides derivados de hidrogel, organoides cultivados em Matrigel e tecido mamário humano primário demonstraram que organoides cultivados em hidrogel recapitulam de forma mais fiel a hierarquia epitelial, a diversidade celular e as interações epitelial-mesenquimal presentes no tecido mamário humanonativo 3. Em contraste, organoides cultivados em Matrigel foram enriquecidos para estados basais híbridos proliferativos e careceram de populações semelhantes a estromas, consistentes com auto-montagem epitelial em vez de organogênese dirigida.
O protocolo descrito aqui fornece um método reprodutível e escalável para gerar organoides a partir do tecido humano primário, com etapas opcionais para depleção e dissociação de fibroblastos em células individuais. Como essa plataforma é compatível com imagens ao vivo, imagens de alto conteúdo, análise morfométrica quantitativa, rastreamento celular e estudos de perturbação genética, ela pode ser integrada a abordagens posteriores que avaliam número de organoides, tamanho, arquitetura e dinâmicas de crescimento. Portanto, essa plataforma fornece um sistema biologicamente relevante para estudar o desenvolvimento mamário humano, plasticidade epitelial, interações epitelial-microambiente e respostas em nível tecidal a perturbações do desenvolvimento, moleculares ou ambientais.
Uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho, incluindo processamento de tecidos, preparação de hidrogel, cultura de organoides, progressão do desenvolvimento e análises a jusante, é apresentada na Figura 1, enquanto morfologias representativas de organoides geradas por esta plataforma são mostradas na Figura 2.
Figura 1. Visão geral do fluxo de trabalho de geração de organoides à base de hidrogel. (A) Fluxograma que resume o fluxo de trabalho do protocolo, incluindo coleta de tecidos, processamento de tecidos, criopreservação, recuperação e preparação celular opcional, preparação de hidrogel, cultura de organoides, desenvolvimento de organoides e aplicações analíticas a jusante. (B) Esquema visual que representa as principais etapas do protocolo de geração de organoides à base de hidrogel, incluindo processamento e preparação de tecidos, recuperação e preparação opcional de células, preparação de hidrogel e semeadura de organoides. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 2. Morfologias organoides representativas geradas no sistema de hidrogel definido. Imagens representativas em campo claro de organoides derivadas de diferentes tecidos humanos cultivados na matriz de hidrogel definida. Organoides mamários gerados a partir de células epiteliais únicas derivadas da mamoplastia de redução foram fotografados no dia 21 de cultura. Organoides de xenoenxertos derivados do paciente gerados a partir de fragmentos tumorais foram fotografados no dia 16 de cultivo. Organoides das glândulas salivares gerados a partir de fragmentos epiteliais foram analisados no terceiro dia de cultivo. Organoides renais gerados a partir de fragmentos epiteliais foram analisados no dia 17 de cultivo. Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocolo
Tecidos primários que, de outra forma, teriam sido descartados como resíduos médicos após cirurgias foram obtidos em conformidade com todas as leis relevantes, utilizando protocolos aprovados pelos comitês institucionais de revisão do Maine Medical Center e do Tufts Medical Center. Todos os tecidos foram anonimizados antes da transferência e não puderam ser rastreados até pacientes específicos. Por essa razão, essa pesquisa recebeu status de isenção pelo Comitê de Uso de Humanos como Sujeitos Experimentais do Instituto de Tecnologia de Massachusetts e da Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Todos os pacientes inscritos neste estudo assinaram um formulário de consentimento informado concordando em participar do estudo e com a publicação dos resultados.
1. Processamento e Preparação de Tecidos
NOTA: Realize todos os procedimentos envolvendo tecido humano de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e éticas. Consulte os esquemas do fluxo de trabalho mostrados nas Figuras 1A e 1B para uma visão visual dos passos do protocolo e do fluxo de trabalho de preparação dos organoides antes de iniciar o procedimento.
- Prepare MEGM usando meio basal epitelial mamário suplementado com 52 μg/mL de extrato de hipófise bovina, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano, 5 μg/mL de insulina, 500 ng/mL de hidrocortisona, 1% (v/v) de GlutaMAX e 1% (v/v) de antibiótico-antimicoótico (100X).
- Prepare o meio de dissociação adicionando 1,5 mg/mL de colagênase A (armazenada a −20°C) e 100 U/mL de hialuronidase (armazenada a 4°C) ao meio de crescimento epitelial mamário (MEGM).
- Receba tecido mamário humano obtido de mastectomias profiláticas e mammoplastias de redução dentro de 24 horas após a excisão, não fixado em soro tampão fosfatado (PBS) e mantido a 4°C. Pese o tecido em uma balança de precisão para determinar o peso total do tecido.
- Coloque o tecido em um armário de biossegurança estéril. Pice mecanicamente o tecido em fragmentos de 3–5mm 3 usando bisturis estéreis. Transfira aproximadamente 2–3 g de tecido picado para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 10 mL de meio dissociativo a cada tubo.
- Incube os tubos a 37°C em um rotador orbital a 8 rpm por 12–18 horas para digerir enzimaticamente o tecido. Considere a digestão completa quando não restam grandes fragmentos de tecido e uma suspensão homogênea de material uniformemente fragmentado é visível em todo o meio.
- Deixe os fragmentos epiteliais se acalmarem por gravidade por 5 minutos. Confirme que não restam fragmentos visíveis suspensos no meio e que há uma protuberância distinta presente. Decante cuidadosamente e descarte o sobrenadante sem mexer na pastilha.
NOTA: O sobrenadante contém células estromais e componentes da matriz, podendo ser lavado e usado ou preservado para outros estudos. - Ressuspenda o pellet em meio de lavagem de 10 mL que contém 5% de soro fetal bovino (FBS) em PBS. Centrifuge a 250 × g por 5 minutos em uma centrífuga de balde oscilante em temperatura ambiente.
- Repita a etapa de lavagem mais três vezes ou até que o sobrenadante esteja limpo e livre de detritos visíveis.
- Ressuspenda o pellet final em meio congelante que consome 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) em MEGM a um volume de 1 mL por grama do peso inicial do tecido.
ATENÇÃO: O DMSO é prejudicial ao contato ou inalação. Manuse-se com o uso de equipamentos de proteção individual adequados e use um capuz de segurança química, se exigido pelas diretrizes institucionais. - Aliquota 1 mL da suspensão em cada criovial. Coloque os cryovials a −80°C em um recipiente congelante antes do armazenamento prolongado em nitrogênio líquido.
NOTA: Este passo representa um ponto de pausa. Armazene as amostras a −80°C antes de transferi-las para condições de armazenamento de longo prazo.
2. Recuperação e Preparação Celular Opcional
- Descongelamento e recuperação inicial
- Remova tecido criopreservado do armazenamento a −80°C após congelamento por pelo menos 24 horas, ou do armazenamento prolongado de nitrogênio líquido. Imediatamente submerga o criovial até a tampa em um banho-maria a 37°C e descongele rapidamente por 1 minuto para minimizar a morte celular.
NOTA: Agite suavemente o cryovial durante o descongelamento para garantir um aquecimento uniforme. - Uma vez totalmente descongelado, transfira imediatamente o conteúdo do criovial para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de MEGM. Centrifuge a 250 × g por 5 minutos.
- Remova tecido criopreservado do armazenamento a −80°C após congelamento por pelo menos 24 horas, ou do armazenamento prolongado de nitrogênio líquido. Imediatamente submerga o criovial até a tampa em um banho-maria a 37°C e descongele rapidamente por 1 minuto para minimizar a morte celular.
- Esgotamento opcional de fibroblastos
NOTA: A depleção de fibroblastos por pré-placagem é uma etapa opcional de enriquecimento usada para reduzir populações de estromas ou fibroblastos que aderem rapidamente quando se deseja uma população inicial mais enriquecida epitelialmente. Essa etapa não é necessária para a formação do organoide e pode ser ajustada dependendo do objetivo experimental.- Resuspenda o pellet em 10 mL de MEGM.
- Transfira o tecido ressuspenso para uma placa de cultura celular de 10 cm. Incubar a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por 90 minutos para permitir a fixação dos fibroblastos.
NOTA: Não perturbe o prato de cultura durante a incubação para garantir a adesão eficiente dos fibroblastos. - Colete as células não aderentes contendo sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 10 mL enquanto inclina suavemente a placa de cultivo até aproximadamente 45°. Enxágue suavemente o prato com 5 mL de PBS e combine o enxágue com o sobrenadante coletado.
- Centrifuge a suspensão combinada a 250 × g por 5 minutos para recuperar material enriquecido epitelialmente.
NOTA: As células que aderiram à placa são enriquecidas para fibroblastos das glândulas mamárias, podendo ser propagadas separadamente adicionando meio composto por DMEM + 10% FBS e antibióticos.
- Dissociação Opcional a Células Individuais
- Ressuspenda o pellet em 500 μL de solução enzimática de dissociação pré-aquecida (37°C) contendo 0,25% de tripsina. Reagentes alternativos de dissociação podem exigir otimização. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Triture a amostra 20 vezes usando uma pipeta P1000 para promover a dissociação.
ATENÇÃO: Reagentes enzimáticos de dissociação podem ser prejudiciais. Manuse-se usando equipamentos de proteção individual adequados e evite contato visual ou com a pele. - Incube o tubo a 37°C por 3-5 minutos. Dissocie mecanicamente a amostra imediatamente após a incubação, triturando 20 vezes usando uma pipeta P1000.
- Adicione 1 mL de meio de lavagem contendo sérum para neutralizar a reação enzimática. Centrifuge a 500 × g por 5 minutos.
- Ressuspenda o pellet em solução de dispase de 300 μL (5 U/mL) e solução de DNase de 30 μL (1 mg/mL). Incube a 37°C por 3–5 minutos.
- Dissocie mecanicamente a amostra pipetando de 15 a 20 vezes. Adicione 700 μL de meio de lavagem contendo soro à suspensão.
- Filtre a suspensão da célula através de um filtro de 40 μm para um tubo limpo. Podem ser usados um peneiro padrão de 40 μm ou um peneiro de ponta de pipeta Flowmi. Os filtradores Flowmi podem reduzir a perda de amostras ao trabalhar com números celulares limitados.
- Determine o número de célula viável usando exclusão do azul de tripano. Misture 10 μL da suspensão da célula com azul de tripano em uma proporção 1:1 e coloque 10 μL da mistura em uma câmara de contagem de células ou lâmina de contagem. Determine a viabilidade celular usando um contador celular automatizado ou hemocitometro.
- Centrifuge a suspensão a 500 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Ressuspenda o pellet celular em MEGM na concentração desejada para semeadura de hidrogel.
NOTA: Para experimentos de semeadura de célula única, as entradas típicas variam de aproximadamente 1.000 a 5.000 células por hidrogel de 200 μL, dependendo do objetivo experimental e das características da amostra doadora. Densidades de semeadura mais baixas são geralmente usadas para imagens ao vivo e estudos de morfogênese para facilitar o acompanhamento do desenvolvimento individual de organoides, enquanto densidades mais altas são comumente usadas para análises moleculares de desfechos, incluindo coleta de RNA e proteínas.
- Ressuspenda o pellet em 500 μL de solução enzimática de dissociação pré-aquecida (37°C) contendo 0,25% de tripsina. Reagentes alternativos de dissociação podem exigir otimização. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Triture a amostra 20 vezes usando uma pipeta P1000 para promover a dissociação.
3. Preparação de hidrogel e semeadura de organoides
- Preparação de Estoques e Cálculos de Volume
- Coloque a solução de laminina (1,18 mg/mL), a solução de ácido hialurônico (1 mg/mL em água estéril), a solução de fibronectina (2 mg/mL em água estéril) e a PBS 1× sobre gelo antes do uso. Armazene aliquotas de laminina e fibronectina a −80°C e armazene a solução de ácido hialurônico a 4°C. Descongele os componentes lentamente sobre gelo a 0°C–4°C antes do uso.
- Prepare uma solução de suplemento extracelular matriz de 25×. Para preparar 1 mL, combine 425 μL de laminina, 250 μL de ácido hialurônico, 250 μL de fibronectina e 75 μL de PBS em um tubo mantido no gelo. Misture suavemente invertendo o tubo 3 a 4 vezes. Armazene a solução a 4°C por até 1 mês.
- Determine o volume e a composição final de hidrogel desejados antes da preparação. Prepare pelo menos 20% de volume excedente para compensar a perda de material durante a pipeteação e transferência.
NOTA: A formulação de hidrogel consiste em colágeno I, uma concentração final de 1× de suplementos da matriz extracelular (de um estoque de 25×) e 12,5% (v/v) de hidróxido de sódio 0,1 N em relação ao volume de colágeno I para neutralização do pH e polimerização.
NOTA: As concentrações finais de hidrogel são 1,7 mg/mL de colágeno I, 20 μg/mL laminina, 20 μg/mL de fibronectina e 10 μg/mL de ácido hialurônico. - Calcule o volume necessário de colágeno I (colágeno V) usando a seguinte fórmula:
Aqui, Cfinal = 1,7 mg/mL, Vtotal é o volume final desejado de hidrogel, e Cstock é a concentração da solução de colágeno. Use concentrações de estoque de colágeno entre 2 e 12 mg/mL.
NOTA: A concentração do estoque de colágeno pode variar entre os lotes. Concentrações mais altas aumentam a viscosidade e devem ser pipetadas lentamente. - Calcule o volume de 0,1 N hidróxido de sódio (V NaOH) usando a seguinte fórmula:
VNaOH = 0,125 x Vcolágeno
Prepare uma solução de trabalho com hidróxido de sódio de 0,1 N diluindo 1 hidróxido de sódio de N em água estéril. - Calcule o volume do suplemento da matriz extracelular (VES) usando a seguinte fórmula:
- Calcule o volume restante a ser preenchido com meio de crescimento usando a seguinte fórmula:
Meio de crescimento V = V total - (Vcolágeno + V NaOH + V ES + V-células/tecido)
NOTA: Determine o volume de células ou fragmentos de tecido para cada experimento individualmente. Use uma faixa típica de 10–100 μL dentro do volume permitido. A contagem precisa dos fragmentos não é realizada porque o tamanho e a composição dos fragmentos variam substancialmente entre as preparações. Padronizar a semeadura por meio da avaliação visual da abundância e distribuição dos fragmentos.
- Preparação da Mistura Mestre de Hidrogel
- Coloque colágeno I, suplemento de matriz extracelular, hidróxido de sódio (0,1 N) e meio de crescimento sobre gelo a 0°C–4°C. Mantenha todos os componentes em baixa temperatura para evitar polimerização prematura.
- Adicione o volume calculado de colágeno I a um tubo de microcentrífuga refrigerado.
- Adicione o volume calculado do meio de crescimento pré-resfriado à solução de colágeno.
- Adicione o volume calculado de 0,1 hidróxido de sódio de N para neutralizar a solução.
NOTA: Otimizações anteriores estabeleceram que essas condições produzem o pH adequado do gel; portanto, não é necessário teste rotineiro de pH da mistura de hidrogel.
NOTA: Realize rapidamente todas as etapas subsequentes para evitar a polimerização prematura do colágeno. - Misture a solução agitando vigorosamente o tubo a uma taxa de aproximadamente um sacudido por segundo por pelo menos 6 sacudidas.
- Adicione o volume calculado do suplemento da matriz extracelular à mistura.
- Adicione o volume calculado de células individuais ou fragmentos de tecido usando uma pipeta P1000 ou ponta de pipeta de grande diâmetro. Misture imediatamente sacudindo conforme descrito no Passo 3.2.5 e prossiga imediatamente para o próximo passo.
- Deposição de hidrogel
- Pipete a mistura de hidrogel em vasos de cultura no volume desejado por poço. Use 200 μL de hidrogel por poço para lâminas de câmara de 4 poços, 100 μL por poço para lâminas de câmara de 8 poços e 20 μL por poço para placas de 96 poços.
- Espalhe o hidrogel em uma almofada fina na superfície ao usar lâminas de câmara. Posicione a ponta da pipeta na borda central superior da câmara e arraste a ponta pela superfície enquanto dispensa o gel para criar uma almofada uniforme. Para placas de 96 poços, posicione a ponta da pipeta no centro do poço mantendo contato com a superfície e dispense o gel centralmente para manter a estrutura em cúpula. Evite pipetar ar no gel, pois isso criará bolhas.
- Incube os vasos de cultura a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% deCO2 por 60 minutos para permitir a polimerização completa.
NOTA: As condições de polimerização descritas aqui foram otimizadas para os formatos de cultura usados neste estudo. Pequenos ajustes no tempo de polimerização podem ser necessários dependendo da geometria do vaso de cultura, volume de hidrogel e condições de incubação.
- Cultura e Manutenção
- Adicione MEGM pré-aquecido em cada poço. Ajuste o volume de acordo com o formato de cultura utilizado.
- Desprenda suavemente o hidrogel da superfície da cultura usando uma ponta de pipeta para permitir que o gel flutue. Deslize a ponta da pipeta ao redor do perímetro do gel e levante suavemente sob o hidrogel polimerizado para liberá-lo da superfície.
- Troque o MEGM duas vezes por semana por meio fresco pré-aquecido. Mantenha culturas em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por aproximadamente 3–4 semanas e interrompa as culturas antes que ocorra o colapso completo do hidrogel. Identifique hidrogéis colapsados pelo aparecimento de estruturas densas, opacas, semelhantes a tampões, resultantes do crescimento celular extenso dentro do gel (veja exemplos representativos na Figura Suplementar 1).
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Resultados
A execução bem-sucedida desse protocolo resulta na formação de estruturas organoides tridimensionais que exibem morfologia epitelial organizada e características arquitetônicas específicas do tecido. Os organoides começam a se formar entre 3 e 7 dias após a semeadura e continuam a se desenvolver durante todo o período de cultura. Caracterizações anteriores desse sistema organoide hidrogel demonstraram formação reprodutível de organoides em múltiplos doadores humanos primários
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Discussão
O protocolo descrito aqui permite a geração reprodutível de organoides mamários humanos tridimensionais dentro de um microambiente hidrogel definido que apoia características-chave da morfogênesemamária 3. Vários passos são fundamentais para o sucesso desse método. Primeiro, o processamento de tecidos e a dissociação enzimática devem ser cuidadosamente controlados para preservar a viabilidade epitelial enquanto minimizam a superdigestão, o que pode reduzir o rendi...
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Divulgações
C.K. é cofundador e consultor da Naveris.
Agradecimentos
Agradecemos muito Karla Murga, Daniela Requena e Megan Maloney do Tufts Biomedical Repository pelo suporte tecidual. Essa pesquisa foi apoiada pela Fundação Find The Cause para o Câncer de Mama e pelo Prêmio Tufts CTSI NIH de Ciência Clínica e Translacional (UM1TR0043, G.R.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-664 | Tubos estéreis para processamento de tecidos e centrifugação |
| 40 μm cell strainer | VWR | 732-2757 | Dispositivo de filtração para preparação de suspensão de células únicas |
| 40 μm cell strainer for low volumes | Bel-Art | 136800040 | Dispositivo de filtração para preparação de suspensão de células únicas |
| Automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Dispositivo usado para contar células e determinar a viabilidade |
| Bovine pituitary extract | Thermo Scientific | 13028014 | Suplemento para meio de células epiteliais |
| Cell counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | Lâminas de câmara dupla usadas para contagem de células |
| Centrifuge | N/A | N/A | Centrífuga de mesa/s precisa ter pelo menos capacidade de velocidade de 500 x g e acomodação de tubos de 15 mL e 1,5 mL. |
| Collagen I | Millipore Sigma | 08-115 | Proteína da matriz extracelular usada para formação de hidrogel |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | 11088793001 | Enzima usada para dissociação de tecidos |
| Cryovials | Corning | 976171 | Frascos estéreis para armazenamento criogênico de amostras |
| Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates) | Corning | 354104 354108 3603 | Plataformas para deposição de hidrogel e cultura de organoides. |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 317275 | Crioprotetor usado em meio de congelamento |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Enzima usada para dissociação secundária de tecidos |
| DNase I | Roche | 10104159001 | Enzima usada durante a dissociação celular. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437 | Suplemento sérico usado em meio de lavagem e neutralização |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Componente da proteína da matriz extracelular |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050061 | Suplemento para meio de células epiteliais |
| Human epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | Suplemento para meio de células epiteliais |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Suplemento para meio de células epiteliais |
| Hyaluronic acid | Millipore Sigma | 385908 | Componente da matriz extracelular para formulação de hidrogel |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Enzima usada para dissociação de tecidos |
| Incubator | Thermo Scientific | 3598 | Dispositivo usado para incubação de cultura de tecidos |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Suplemento para meio de células epiteliais |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Componente da proteína da matriz extracelular |
| Mammary epithelial basal medium | Thermo Scientific | M171500 | Meio de crescimento para células epiteliais |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | 3451 | Tubos usados para reações de pequeno volume |
| Orbital rotator | Thermo Scientific | 400110 | Rotador usado para dispersão de tecidos durante a dissociação enzimática |
| P1000 pipette | Gilson | P1000 | Dispositivo usado para misturar e transferir volumes de até 1.000 μL |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | Suplemento antibiótico para meio de células epiteliais |
| Phosphate-buffered saline | Gibco | 20012-027 | Solução tamponada com fosfato usada para lavagem e enxágue |
| Precision balance | Mettler Toledo | ML303E | Balança usada para pesagem de tecidos |
| Serological pipette | Nunc | 170356N | Pipeta usada para colher células epiteliais não aderentes |
| Sodium hydroxide (1 N) | Fisher Chemical | SS261 | Reagente usado para neutralização de colágeno |
| Sterile scalpels | Bard-Parker | 372615 | Ferramentas usadas para picar mecanicamente tecidos |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | Corante usado para avaliação da viabilidade celular |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200056 | Reagente enzimático usado para dissociação celular |
| Water bath (37 °C) | VWR | 10LA | Dispositivo usado para descongelamento controlado de amostras |
Referências
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