Um método definido à base de hidrogel para gerar organoides mamários humanos tridimensionais que recapitulam a morfogênese mamária

Summary

Este protocolo descreve um método definido baseado em hidrogel para gerar organoides mamários humanos que recapitulam características-chave da morfogênese mamária em um sistema de cultura tridimensional controlado.

Abstract

O desenvolvimento de sistemas modelos humanos fisiologicamente relevantes que recapitulam a arquitetura dos tecidos e a dinâmica do estado celular continua sendo um grande desafio no estudo do desenvolvimento mamário e dos primeiros eventos na carcinogênese. Culturas bidimensionais convencionais e muitos sistemas tridimensionais não capturam a organização estrutural e os sinais microambientais que definem a glândula mamária humana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para gerar organoides mamários humanos tridimensionais a partir de células epiteliais primárias embutidas em uma matriz de hidrogel definida composta por colágeno tipo I, laminina, fibronectina e ácido hialurônico. Esse sistema apoia a progressão de células individuais através de estágios-chave da morfogênese mamária, incluindo a expansão dos progenitores, o padrão epitelial e a formação de estruturas semelhantes a unidades lobulares ductais terminais, bem como o surgimento de um compartimento semelhante a mesênquima, ao longo de um período de cultivo de 21 dias. Fornecemos um protocolo passo a passo para preparação de hidrogel, semeadura celular e condições de cultura. O método é compatível com imagens de alto conteúdo e análise quantitativa do número de organoides, distribuição de tamanho e complexidade arquitetônica. Essa plataforma possibilita estudos mecanicistas da plasticidade epitelial e perturbações ambientais, fornecendo um sistema escalável e biologicamente relevante para investigar alterações precoces nos níveis de tecido associadas ao risco de câncer de mama.

Introduction

Compreender o desenvolvimento das glândulas mamárias humanas e os eventos iniciais que predispõem o tecido à transformação maligna requer sistemas experimentais que recapitulem fielmente a arquitetura tecidual, a hierarquia celular e a sinalização microambiental. Embora culturas epiteliais bidimensionais tenham fornecido importantes insights mecanicistas, elas carecem do contexto estrutural necessário para modelar a organização epitelial e a^{morfogênese 1}. Os sistemas de cultura tridimensional existentes, incluindo aqueles baseados em extratos de membrana basal, avançaram o campo, mas permanecem limitados pela composição variável, controle incompleto sobre componentes da matriz extracelular e suporte inconsistente à arquitetura tecidual de ordem^{superior 1}. Além disso, muitos sistemas organoides baseados em extratos de membrana basal são limitados pela incapacidade de suportar consistentemente o surgimento de uma organização semelhante a tecido¹. Em particular, muitos sistemas dependem de componentes estromais exógenos em vez de permitir o desenvolvimento endógeno de microambientes de suporte, limitando assim sua capacidade de modelar interações epitelial–mesenquimatosas que são centrais para o desenvolvimento e doenças dos tecidos. Essas limitações restringem o estudo reprodutível dos processos de desenvolvimento, da plasticidade epitelial e dos efeitos de perturbações ambientais ou moleculares na organização dos tecidos.

Para enfrentar essas limitações, desenvolvemos um modelo tridimensional definido de organoide humano da mama à base de hidrogel, que permite que células epiteliais primárias gerem estruturas organizadas dentro de uma matriz extracelular^definida 2,3,4,5,8. O hidrogel consiste em colágeno tipo I, laminina, fibronectina e ácido hialurônico, componentes selecionados com base em seus papéis estabelecidos no desenvolvimento das glândulas mamárias e na morfogênese epitelial. Essas moléculas da matriz extracelular envolvem receptores celulares distintos, incluindo integrinas, receptores do domínio discoidinal, CD44 e RHAMM, e são conhecidas por regular a polaridade epitelial, morfogênese ramificada, manutenção de células-tronco, mecanotransdução e organização dos tecidos na glândula^{mamária 6,7}. Estudos anteriores que descreveram esse sistema de hidrogel demonstraram que a incorporação desses componentes da matriz extracelular melhorou significativamente a morfogênese ductal-lobular e a maturação epitelial em comparação com condições baseadas apenas em colágeno ou baseadas em^{Matrigel 3,8}. Além disso, as propriedades físicas dessa formulação de hidrogel foram previamente caracterizadas por microscopia de força atômica, demonstrando que o hidrogel composto de matriz extracelular exibia menor rigidez e aumento do inchaço em relação aos géis apenas de colágeno (módulo de Young: 256,7 ± 20,0 Pa versus 559,2 ± 204,0 Pa, respectivamente), consistente com um ambiente de matriz mais macio e^{hidratado 8}.

Importante destacar que esse modelo apoia o surgimento de um compartimento semelhante a mesênquima que surge ao lado das estruturas epiteliais, fornecendo suporte estrutural e de sinalização endógeno que reflete mais de perto a organização dos tecidos^{nativos 3}. A relevância fisiológica desse sistema de hidrogel foi avaliada por meio de comparações diretas com culturas organoides convencionais baseadas em Matrigel, utilizando análises morfológicas e transcriptômicas. Estudos anteriores demonstraram que culturas de hidrogel suportavam a formação de tecido ductal-lobular mais organizada e a diferenciação multilinhagem do que as culturas baseadas em Matrigel, ao mesmo tempo em que preservavam a resposta^{hormonal 8}. Mais recentemente, análises integradas de sequenciamento de RNA unicelular comparando organoides derivados de hidrogel, organoides cultivados em Matrigel e tecido mamário humano primário demonstraram que organoides cultivados em hidrogel recapitulam de forma mais fiel a hierarquia epitelial, a diversidade celular e as interações epitelial-mesenquimal presentes no tecido mamário humano^{nativo 3}. Em contraste, organoides cultivados em Matrigel foram enriquecidos para estados basais híbridos proliferativos e careceram de populações semelhantes a estromas, consistentes com auto-montagem epitelial em vez de organogênese dirigida.

O protocolo descrito aqui fornece um método reprodutível e escalável para gerar organoides a partir do tecido humano primário, com etapas opcionais para depleção e dissociação de fibroblastos em células individuais. Como essa plataforma é compatível com imagens ao vivo, imagens de alto conteúdo, análise morfométrica quantitativa, rastreamento celular e estudos de perturbação genética, ela pode ser integrada a abordagens posteriores que avaliam número de organoides, tamanho, arquitetura e dinâmicas de crescimento. Portanto, essa plataforma fornece um sistema biologicamente relevante para estudar o desenvolvimento mamário humano, plasticidade epitelial, interações epitelial-microambiente e respostas em nível tecidal a perturbações do desenvolvimento, moleculares ou ambientais.

Uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho, incluindo processamento de tecidos, preparação de hidrogel, cultura de organoides, progressão do desenvolvimento e análises a jusante, é apresentada na Figura 1, enquanto morfologias representativas de organoides geradas por esta plataforma são mostradas na Figura 2.

Figura 1. Visão geral do fluxo de trabalho de geração de organoides à base de hidrogel. (A) Fluxograma que resume o fluxo de trabalho do protocolo, incluindo coleta de tecidos, processamento de tecidos, criopreservação, recuperação e preparação celular opcional, preparação de hidrogel, cultura de organoides, desenvolvimento de organoides e aplicações analíticas a jusante. (B) Esquema visual que representa as principais etapas do protocolo de geração de organoides à base de hidrogel, incluindo processamento e preparação de tecidos, recuperação e preparação opcional de células, preparação de hidrogel e semeadura de organoides. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Morfologias organoides representativas geradas no sistema de hidrogel definido. Imagens representativas em campo claro de organoides derivadas de diferentes tecidos humanos cultivados na matriz de hidrogel definida. Organoides mamários gerados a partir de células epiteliais únicas derivadas da mamoplastia de redução foram fotografados no dia 21 de cultura. Organoides de xenoenxertos derivados do paciente gerados a partir de fragmentos tumorais foram fotografados no dia 16 de cultivo. Organoides das glândulas salivares gerados a partir de fragmentos epiteliais foram analisados no terceiro dia de cultivo. Organoides renais gerados a partir de fragmentos epiteliais foram analisados no dia 17 de cultivo. Barras de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Tecidos primários que, de outra forma, teriam sido descartados como resíduos médicos após cirurgias foram obtidos em conformidade com todas as leis relevantes, utilizando protocolos aprovados pelos comitês institucionais de revisão do Maine Medical Center e do Tufts Medical Center. Todos os tecidos foram anonimizados antes da transferência e não puderam ser rastreados até pacientes específicos. Por essa razão, essa pesquisa recebeu status de isenção pelo Comitê de Uso de Humanos como Sujeitos Experimentais do Instituto de Tecnologia de Massachusetts e da Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Todos os pacientes inscritos neste estudo assinaram um formulário de consentimento informado concordando em participar do estudo e com a publicação dos resultados.

1. Processamento e Preparação de Tecidos

NOTA: Realize todos os procedimentos envolvendo tecido humano de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e éticas. Consulte os esquemas do fluxo de trabalho mostrados nas Figuras 1A e 1B para uma visão visual dos passos do protocolo e do fluxo de trabalho de preparação dos organoides antes de iniciar o procedimento.

1. Prepare MEGM usando meio basal epitelial mamário suplementado com 52 μg/mL de extrato de hipófise bovina, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico humano, 5 μg/mL de insulina, 500 ng/mL de hidrocortisona, 1% (v/v) de GlutaMAX e 1% (v/v) de antibiótico-antimicoótico (100X).
2. Prepare o meio de dissociação adicionando 1,5 mg/mL de colagênase A (armazenada a −20°C) e 100 U/mL de hialuronidase (armazenada a 4°C) ao meio de crescimento epitelial mamário (MEGM).
3. Receba tecido mamário humano obtido de mastectomias profiláticas e mammoplastias de redução dentro de 24 horas após a excisão, não fixado em soro tampão fosfatado (PBS) e mantido a 4°C. Pese o tecido em uma balança de precisão para determinar o peso total do tecido.
4. Coloque o tecido em um armário de biossegurança estéril. Pice mecanicamente o tecido em fragmentos de 3–5^{mm 3} usando bisturis estéreis. Transfira aproximadamente 2–3 g de tecido picado para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 10 mL de meio dissociativo a cada tubo.
5. Incube os tubos a 37°C em um rotador orbital a 8 rpm por 12–18 horas para digerir enzimaticamente o tecido. Considere a digestão completa quando não restam grandes fragmentos de tecido e uma suspensão homogênea de material uniformemente fragmentado é visível em todo o meio.
6. Deixe os fragmentos epiteliais se acalmarem por gravidade por 5 minutos. Confirme que não restam fragmentos visíveis suspensos no meio e que há uma protuberância distinta presente. Decante cuidadosamente e descarte o sobrenadante sem mexer na pastilha.
   NOTA: O sobrenadante contém células estromais e componentes da matriz, podendo ser lavado e usado ou preservado para outros estudos.
7. Ressuspenda o pellet em meio de lavagem de 10 mL que contém 5% de soro fetal bovino (FBS) em PBS. Centrifuge a 250 × g por 5 minutos em uma centrífuga de balde oscilante em temperatura ambiente.
8. Repita a etapa de lavagem mais três vezes ou até que o sobrenadante esteja limpo e livre de detritos visíveis.
9. Ressuspenda o pellet final em meio congelante que consome 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) em MEGM a um volume de 1 mL por grama do peso inicial do tecido.
   ATENÇÃO: O DMSO é prejudicial ao contato ou inalação. Manuse-se com o uso de equipamentos de proteção individual adequados e use um capuz de segurança química, se exigido pelas diretrizes institucionais.
10. Aliquota 1 mL da suspensão em cada criovial. Coloque os cryovials a −80°C em um recipiente congelante antes do armazenamento prolongado em nitrogênio líquido.
    NOTA: Este passo representa um ponto de pausa. Armazene as amostras a −80°C antes de transferi-las para condições de armazenamento de longo prazo.

2. Recuperação e Preparação Celular Opcional

1. Descongelamento e recuperação inicial
   1. Remova tecido criopreservado do armazenamento a −80°C após congelamento por pelo menos 24 horas, ou do armazenamento prolongado de nitrogênio líquido. Imediatamente submerga o criovial até a tampa em um banho-maria a 37°C e descongele rapidamente por 1 minuto para minimizar a morte celular.
      NOTA: Agite suavemente o cryovial durante o descongelamento para garantir um aquecimento uniforme.
   2. Uma vez totalmente descongelado, transfira imediatamente o conteúdo do criovial para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de MEGM. Centrifuge a 250 × g por 5 minutos.
2. Esgotamento opcional de fibroblastos
   NOTA: A depleção de fibroblastos por pré-placagem é uma etapa opcional de enriquecimento usada para reduzir populações de estromas ou fibroblastos que aderem rapidamente quando se deseja uma população inicial mais enriquecida epitelialmente. Essa etapa não é necessária para a formação do organoide e pode ser ajustada dependendo do objetivo experimental.
   1. Resuspenda o pellet em 10 mL de MEGM.
   2. Transfira o tecido ressuspenso para uma placa de cultura celular de 10 cm. Incubar a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por 90 minutos para permitir a fixação dos fibroblastos.
      NOTA: Não perturbe o prato de cultura durante a incubação para garantir a adesão eficiente dos fibroblastos.
   3. Colete as células não aderentes contendo sobrenadante usando uma pipeta sorológica de 10 mL enquanto inclina suavemente a placa de cultivo até aproximadamente 45°. Enxágue suavemente o prato com 5 mL de PBS e combine o enxágue com o sobrenadante coletado.
   4. Centrifuge a suspensão combinada a 250 × g por 5 minutos para recuperar material enriquecido epitelialmente.
      NOTA: As células que aderiram à placa são enriquecidas para fibroblastos das glândulas mamárias, podendo ser propagadas separadamente adicionando meio composto por DMEM + 10% FBS e antibióticos.
3. Dissociação Opcional a Células Individuais
   1. Ressuspenda o pellet em 500 μL de solução enzimática de dissociação pré-aquecida (37°C) contendo 0,25% de tripsina. Reagentes alternativos de dissociação podem exigir otimização. Transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Triture a amostra 20 vezes usando uma pipeta P1000 para promover a dissociação.
      ATENÇÃO: Reagentes enzimáticos de dissociação podem ser prejudiciais. Manuse-se usando equipamentos de proteção individual adequados e evite contato visual ou com a pele.
   2. Incube o tubo a 37°C por 3-5 minutos. Dissocie mecanicamente a amostra imediatamente após a incubação, triturando 20 vezes usando uma pipeta P1000.
   3. Adicione 1 mL de meio de lavagem contendo sérum para neutralizar a reação enzimática. Centrifuge a 500 × g por 5 minutos.
   4. Ressuspenda o pellet em solução de dispase de 300 μL (5 U/mL) e solução de DNase de 30 μL (1 mg/mL). Incube a 37°C por 3–5 minutos.
   5. Dissocie mecanicamente a amostra pipetando de 15 a 20 vezes. Adicione 700 μL de meio de lavagem contendo soro à suspensão.
   6. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de 40 μm para um tubo limpo. Podem ser usados um peneiro padrão de 40 μm ou um peneiro de ponta de pipeta Flowmi. Os filtradores Flowmi podem reduzir a perda de amostras ao trabalhar com números celulares limitados.
   7. Determine o número de célula viável usando exclusão do azul de tripano. Misture 10 μL da suspensão da célula com azul de tripano em uma proporção 1:1 e coloque 10 μL da mistura em uma câmara de contagem de células ou lâmina de contagem. Determine a viabilidade celular usando um contador celular automatizado ou hemocitometro.
   8. Centrifuge a suspensão a 500 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
   9. Ressuspenda o pellet celular em MEGM na concentração desejada para semeadura de hidrogel.
      NOTA: Para experimentos de semeadura de célula única, as entradas típicas variam de aproximadamente 1.000 a 5.000 células por hidrogel de 200 μL, dependendo do objetivo experimental e das características da amostra doadora. Densidades de semeadura mais baixas são geralmente usadas para imagens ao vivo e estudos de morfogênese para facilitar o acompanhamento do desenvolvimento individual de organoides, enquanto densidades mais altas são comumente usadas para análises moleculares de desfechos, incluindo coleta de RNA e proteínas.

3. Preparação de hidrogel e semeadura de organoides

1. Preparação de Estoques e Cálculos de Volume
   1. Coloque a solução de laminina (1,18 mg/mL), a solução de ácido hialurônico (1 mg/mL em água estéril), a solução de fibronectina (2 mg/mL em água estéril) e a PBS 1× sobre gelo antes do uso. Armazene aliquotas de laminina e fibronectina a −80°C e armazene a solução de ácido hialurônico a 4°C. Descongele os componentes lentamente sobre gelo a 0°C–4°C antes do uso.
   2. Prepare uma solução de suplemento extracelular matriz de 25×. Para preparar 1 mL, combine 425 μL de laminina, 250 μL de ácido hialurônico, 250 μL de fibronectina e 75 μL de PBS em um tubo mantido no gelo. Misture suavemente invertendo o tubo 3 a 4 vezes. Armazene a solução a 4°C por até 1 mês.
   3. Determine o volume e a composição final de hidrogel desejados antes da preparação. Prepare pelo menos 20% de volume excedente para compensar a perda de material durante a pipeteação e transferência.
      NOTA: A formulação de hidrogel consiste em colágeno I, uma concentração final de 1× de suplementos da matriz extracelular (de um estoque de 25×) e 12,5% (v/v) de hidróxido de sódio 0,1 N em relação ao volume de colágeno I para neutralização do pH e polimerização.
      NOTA: As concentrações finais de hidrogel são 1,7 mg/mL de colágeno I, 20 μg/mL laminina, 20 μg/mL de fibronectina e 10 μg/mL de ácido hialurônico.
   4. Calcule o volume necessário de colágeno I (_colágeno V) usando a seguinte fórmula:
      
      Aqui, C_final  = 1,7 mg/mL, V_total é o volume final desejado de hidrogel, e C_stock é a concentração da solução de colágeno. Use concentrações de estoque de colágeno entre 2 e 12 mg/mL.
      NOTA: A concentração do estoque de colágeno pode variar entre os lotes. Concentrações mais altas aumentam a viscosidade e devem ser pipetadas lentamente.
   5. Calcule o volume de 0,1 N hidróxido de sódio (_{V NaOH)} usando a seguinte fórmula:
      V_NaOH = 0,125 x V_colágeno
      Prepare uma solução de trabalho com hidróxido de sódio de 0,1 N diluindo 1 hidróxido de sódio de N em água estéril.
   6. Calcule o volume do suplemento da matriz extracelular (V_ES) usando a seguinte fórmula:
      
   7. Calcule o volume restante a ser preenchido com meio de crescimento usando a seguinte fórmula:
      _{Meio de crescimento} V = _{V total} - (V_colágeno + _{V NaOH} + _{V ES} + _{V-células/tecido})
      NOTA: Determine o volume de células ou fragmentos de tecido para cada experimento individualmente. Use uma faixa típica de 10–100 μL dentro do volume permitido. A contagem precisa dos fragmentos não é realizada porque o tamanho e a composição dos fragmentos variam substancialmente entre as preparações. Padronizar a semeadura por meio da avaliação visual da abundância e distribuição dos fragmentos.
2. Preparação da Mistura Mestre de Hidrogel
   1. Coloque colágeno I, suplemento de matriz extracelular, hidróxido de sódio (0,1 N) e meio de crescimento sobre gelo a 0°C–4°C. Mantenha todos os componentes em baixa temperatura para evitar polimerização prematura.
   2. Adicione o volume calculado de colágeno I a um tubo de microcentrífuga refrigerado.
   3. Adicione o volume calculado do meio de crescimento pré-resfriado à solução de colágeno.
   4. Adicione o volume calculado de 0,1 hidróxido de sódio de N para neutralizar a solução.
      NOTA: Otimizações anteriores estabeleceram que essas condições produzem o pH adequado do gel; portanto, não é necessário teste rotineiro de pH da mistura de hidrogel.
      NOTA: Realize rapidamente todas as etapas subsequentes para evitar a polimerização prematura do colágeno.
   5. Misture a solução agitando vigorosamente o tubo a uma taxa de aproximadamente um sacudido por segundo por pelo menos 6 sacudidas.
   6. Adicione o volume calculado do suplemento da matriz extracelular à mistura.
   7. Adicione o volume calculado de células individuais ou fragmentos de tecido usando uma pipeta P1000 ou ponta de pipeta de grande diâmetro. Misture imediatamente sacudindo conforme descrito no Passo 3.2.5 e prossiga imediatamente para o próximo passo.
3. Deposição de hidrogel
   1. Pipete a mistura de hidrogel em vasos de cultura no volume desejado por poço. Use 200 μL de hidrogel por poço para lâminas de câmara de 4 poços, 100 μL por poço para lâminas de câmara de 8 poços e 20 μL por poço para placas de 96 poços.
   2. Espalhe o hidrogel em uma almofada fina na superfície ao usar lâminas de câmara. Posicione a ponta da pipeta na borda central superior da câmara e arraste a ponta pela superfície enquanto dispensa o gel para criar uma almofada uniforme. Para placas de 96 poços, posicione a ponta da pipeta no centro do poço mantendo contato com a superfície e dispense o gel centralmente para manter a estrutura em cúpula. Evite pipetar ar no gel, pois isso criará bolhas.
   3. Incube os vasos de cultura a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de_CO2 por 60 minutos para permitir a polimerização completa.
      NOTA: As condições de polimerização descritas aqui foram otimizadas para os formatos de cultura usados neste estudo. Pequenos ajustes no tempo de polimerização podem ser necessários dependendo da geometria do vaso de cultura, volume de hidrogel e condições de incubação.
4. Cultura e Manutenção
   1. Adicione MEGM pré-aquecido em cada poço. Ajuste o volume de acordo com o formato de cultura utilizado.
   2. Desprenda suavemente o hidrogel da superfície da cultura usando uma ponta de pipeta para permitir que o gel flutue. Deslize a ponta da pipeta ao redor do perímetro do gel e levante suavemente sob o hidrogel polimerizado para liberá-lo da superfície.
   3. Troque o MEGM duas vezes por semana por meio fresco pré-aquecido. Mantenha culturas em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por aproximadamente 3–4 semanas e interrompa as culturas antes que ocorra o colapso completo do hidrogel. Identifique hidrogéis colapsados pelo aparecimento de estruturas densas, opacas, semelhantes a tampões, resultantes do crescimento celular extenso dentro do gel (veja exemplos representativos na Figura Suplementar 1).

Results

A execução bem-sucedida desse protocolo resulta na formação de estruturas organoides tridimensionais que exibem morfologia epitelial organizada e características arquitetônicas específicas do tecido. Os organoides começam a se formar entre 3 e 7 dias após a semeadura e continuam a se desenvolver durante todo o período de cultura. Caracterizações anteriores desse sistema organoide hidrogel demonstraram formação reprodutível de organoides em múltiplos doadores humanos primários^{independentes 3}. Nesse estudo, células epiteliais primárias isoladas de 12 doadores de mamoplastia de redução livres de doença foram avaliadas, e 11 das 12 amostras de doadores geraram com sucesso organoides sob as condições de cultura descritas. Entre os doadores, o número mediano de estruturas organoides formadas por 100 células semeadas foi de 1,775 (IC 95%: 0,45–4,10). Embora tenha sido observada variabilidade substancial entre doadores na eficiência de formação de organoides e dinâmica de crescimento, morfologias complexas ductal-lobular e acinar foram geradas de forma reprodutiva entre os doadores.

Organoides mamários derivados de células epiteliais individuais apresentam morfogênese progressiva, formando estruturas ramificadas até o 21º dia de cultivo (Figura 2). Essas estruturas são caracterizadas por projeções alongadas e organização multicelular. Os organoides apresentaram áreas projetadas variando de 10.000–90.000^{μm 2} até o dia 18, com valores de circularidade abaixo de 0,3, calculados como 4π × (Área/Perímetro²)^3,9. Organoides derivados de fragmentos de tecido tipicamente formaram estruturas superiores a 90.000^{μm 2} até o 18º dia, enquanto organoides derivados de fragmentos tumorais formaram estruturas mais densas e irregulares, com organização reduzida e projeções radiais aumentadas, consistentes com comportamento de crescimento alterado.

Organoides derivados de fragmentos epiteliais das glândulas salivares e renais também apresentam morfologias distintas sob as mesmas condições de hidrogel (Figura 2). Organoides das glândulas salivares formam estruturas compactas em pontos iniciais (dia 3), enquanto organoides renais desenvolvem morfologias alongadas e assimétricas até o dia 17. Essas observações são incluídas para demonstrar a adaptabilidade mais ampla do sistema organoide baseado em hidrogel além do tecido mamário e ilustrar sua capacidade de suportar a formação de organoides a partir de múltiplas fontes de tecido epitelial.

Imunocoloração e análises moleculares realizadas^{anteriormente 3,5,8} demonstraram a presença de marcadores de linhagem epitelial, incluindo os marcadores luminais KRT8, KRT18, KRT19, E-cadherina, GATA3, JAG1, Notch1 e MUC1, bem como os marcadores basais ou mioepiteliais KRT5, KRT14, Slug, SOX9 e TP63, indicando a preservação da heterogeneidade epitelial nos organoides. Características estruturais consistentes com a organização em forma de unidade em forma de unidade lobularem terminal ductal foram observadas por microscopia confocal e reconstrução tridimensional, sendo definidas como estruturas contendo regiões ductais alongadas conectadas a botões terminais semelhantes a lóbulos ou alveolares, semelhantes à organização das unidades lobulares terminais lobulares humanas nativas. Essas estruturas também apresentaram organização epitelial em camadas com padronização luminal e basal celular, consistente com análises previamente publicadas desta plataforma³.

Um compartimento semelhante a mesênquima foi observado em associação com e entre estruturas epiteliais e foi caracterizado por comportamento migratório e expressão de marcadores como VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 e FAPα. Juntamente com análises de microscopia em lapso de tempo, essas observações apoiam o surgimento de um microambiente de suporte dentro do sistema de cultura³.

Importante, esse protocolo tem como objetivo fornecer uma estrutura metodológica amplamente adaptável, em vez de estabelecer um único parâmetro biológico fixo. Os resultados quantitativos, incluindo eficiência de formação de organoides, tamanho, complexidade de ramificação e composição celular, podem variar dependendo da fonte doadora, status menopáusico, material inicial (por exemplo, fragmentos de tecido versus células isoladas) e condições experimentais.

Desfechos subótimos incluem redução da eficiência de formação de organoides (<1 organoide por 500 células semeadas), excesso de detritos celulares, falha na polimerização do colágeno ou falha em estabelecer estruturas organizadas. Esses desfechos são comumente associados à baixa viabilidade celular, dissociação incompleta do tecido, composição incorreta do hidrogel ou neutralização inadequada do pH.

A análise quantitativa do desenvolvimento dos organoides pode ser realizada usando imagens ao vivo e abordagens de imagem de alto conteúdo para medir o número de organoides, distribuição de tamanho, comportamento de ramificação, complexidade estrutural e dinâmica celular. Estudos anteriores que utilizavam essa plataforma realizaram imagens longitudinais vivas, rastreamento celular, análise morfométrica e estudos de perturbação genética para quantificar a dinâmica do crescimento dos organoides e o comportamento de linhagem ao longo do^{tempo 3,5}. A imagem foi realizada usando microscopia confocal, e a análise de imagem foi realizada usando o software NIS-Elements.

Figura suplementar 1. Exemplo representativo de um hidrogel colapsado durante a cultura organoide de longo prazo no dia 18. Hidrogéis colapsados aparecem como estruturas densas, opacas e semelhantes a tampões, resultantes de extenso crescimento celular e contração da matriz. Essas características morfológicas foram usadas como critério para terminar culturas antes do colapso completo do hidrogel. Barra de escala = 500 μm. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O protocolo descrito aqui permite a geração reprodutível de organoides mamários humanos tridimensionais dentro de um microambiente hidrogel definido que apoia características-chave da morfogênese^{mamária 3}. Vários passos são fundamentais para o sucesso desse método. Primeiro, o processamento de tecidos e a dissociação enzimática devem ser cuidadosamente controlados para preservar a viabilidade epitelial enquanto minimizam a superdigestão, o que pode reduzir o rendimento celular e prejudicar a morfogênese^{subsequente 10}. Em particular, tratamentos enzimáticos breves e sequenciais, combinados com dissociação mecânica suave, são essenciais para manter populações epiteliais funcionais. Segundo, a preparação de hidrogel requer controle preciso da concentração de colágeno, pH e tempo¹¹. A neutralização do colágeno inicia a polimerização; portanto, todas as etapas após a adição de hidróxido de sódio devem ser realizadas rapidamente e sobre gelo para garantir a formação consistente do gel. Polimerização incompleta ou retardada pode resultar em hidrogéis mal estruturados ou colapsados que não favorecem o desenvolvimento dos organoides. Por fim, a densidade de semeadura deve ser otimizada empiricamente para cada amostra doadora, pois carga excessiva de tecido ou célula pode levar à rápida contração do gel e perda de integridade^{estrutural 12}.

Várias considerações de solução de problemas podem melhorar a reprodutibilidade. A má formação de organoides pode resultar de baixa viabilidade celular, composição subótima de hidrogel ou manuseamento inadequado do gel durante a deposição¹³. Garantir que os estoques de colágeno sejam mantidos a 4°C e não tenham passado por polimerização prematura é essencial para garantir uma qualidade consistente do gel¹¹. Além disso, o descolamento bem-sucedido dos hidrogéis da superfície de cultura após a polimerização serve como indicador da formação adequada do gel; A falha em descolar normalmente reflete polimerização incompleta ou condições de superfície^{inadequadas 14}. A variabilidade no tamanho e morfologia dos organoides é esperada entre amostras de doadores e reflete heterogeneidade biológica, e não falha técnica. Estudos anteriores usando essa plataforma demonstraram formação de organoides reprodutíveis em um amplo conjunto de doadores humanos primários independentes, apesar da significativa variabilidade entre doadores na eficiência da formação de organoides e^{morfogênese 3}.

Esse método tem várias limitações. Embora o modelo apoie o surgimento de um compartimento semelhante a mesênquima ao lado das estruturas epiteliais, ele não recapitula totalmente a complexidade do microambiente estromal, imune e vascular in vivo. A composição do hidrogel, embora definida, representa uma matriz extracelular simplificada e pode não capturar todos os sinais biomecânicos ou bioquímicos presentes no tecido^{nativo 15,16}. Além disso, a variabilidade de doador para doador pode influenciar a dinâmica do crescimento dos organoides e a morfologia, exigindo otimização empírica para aplicações específicas. Apesar dessas limitações, a capacidade desse sistema de suportar a auto-organização e as interações endógenas epitelial–mesenquimalesa representa um avanço significativo em relação a muitos modelos de cultura^existentes.

Comparado aos sistemas comumente usados baseados em extratos de membrana basal, essa abordagem oferece maior controle sobre a composição da matriz extracelular e reduz a variabilidade associada a materiais^{indefinidos 17}. Estudos anteriores que compararam diretamente essa plataforma de hidrogel com sistemas organoides baseados em Matrigel demonstraram diferenças substanciais na organização dos tecidos e na composição^{celular 3,8}. Organoides cultivados em hidrogel assemelhavam-se mais ao tecido mamário humano nativo tanto nos níveis morfológico quanto transcriptômico, preservando populações epiteliais multilinhagem, incluindo compartimentos luminais, basais, progenitores e semelhantes a mesenquimatos, enquanto organoides cultivados em Matrigel eram dominados por estados híbridos proliferativos semelhantes a basais e careciam de populações estromalas. Além disso, ao contrário dos sistemas de co-cultura que dependem da adição de células estromais exógenas, esse modelo possibilita o surgimento intrínseco de um compartimento de suporte semelhante a mesênquima, possibilitando o estudo das interações epitelial–microambiente em um contexto mais fisiologicamente relevante e menos artificialmente engenheirado. Populações emergentes semelhantes a mesenquimatosas dentro dos hidrogéis foram previamente validadas por meio de imagens vivas complementares, imunocoloração e análises transcriptômicas de célula^{única 3}. Esses estudos demonstraram o surgimento de células altamente móveis semelhantes a estromas que expressam marcadores mesenquimatosos e associados à transição epitelial–mesenquimal, incluindo Vimentina, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 e Caracol, juntamente com interações recíprocas de sinalização epitelial–mesenquimal identificadas por meio de análises ligante-receptor. Essas características tornam o sistema particularmente adequado para investigar processos que dependem da arquitetura dos tecidos e da comunicação célula-célula, incluindo morfogênese, plasticidade epitelial e remodelação inicial^{dos tecidos 4,5}.

A plataforma descrita tem amplas aplicações em pesquisa básica e translacional. Pode ser usado para estudar o desenvolvimento mamário humano, modelar eventos precoces no início da doença e avaliar os efeitos de perturbações moleculares ou ambientais na organização dos tecidos. Estudos anteriores usando essa plataforma demonstraram que a perturbação funcional de reguladores do desenvolvimento, como DDR1 e RUNX1, altera a diferenciação de linhagem, a organização epitelial e a morfogênese ductal-lobular em cultura^{tridimensional 5,18}. A compatibilidade com imagens quantitativas e análise de alto conteúdo permite ainda mais uma análise sistemática dos resultados fenotípicos, incluindo mudanças no tamanho, estrutura e complexidade dos organoides. Assim, esse método oferece uma plataforma escalável e biologicamente relevante para estudar a organização dos tecidos humanos e sua perturbação em contextos relevantes para doenças.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos cônicos de 15 mL	VWR	89039-664	Tubos estéreis para processamento de tecidos e centrifugação
40 & mu; Filtro de células M	VWR	732-2757	Dispositivo de filtragem para preparação de suspensão de célula única
40 & mu; Filtro de célula M para baixos volumes	Bel-Art	136800040	Dispositivo de filtragem para preparação de suspensão de célula única
Contador automático de células	Bio-Rad	1450102	Dispositivo usado para contar células e determinar a viabilidade
Extrato da hipófise bovina	Termo Científica	13028014	Suplemento para meios celulares epiteliais
Slides de contagem de células	Bio-Rad	145-0011	Slides de câmara dupla usados para contagem de células
Centrífuga	N/A	N/A	Centrífugas de bancada precisam ter capacidade de velocidade de pelo menos 500 x g e acomodação de tubos de 15 mL e 1,5 mL.
Colágeno I	Millipore Sigma	08-115	Proteína da matriz extracelular usada para formação de hidrogel
Colagênase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzima usada para dissociação de tecidos
Cryovials	Corning	976171	Frascos estéreis para armazenamento criogênico de amostras
Vasos de cultura (por exemplo, slides de câmara, placas multipoço)	Corning	354104 354108 3603	Plataformas para deposição de hidrogel e cultura de organoides.
Dimetil sulfóxido	Millipore Sigma	317275	Crioprotetor usado em meio congelante
Dispase II	Roche	4942078001	Enzima usada para dissociação secundária de tecidos
DNase I	Roche	10104159001	Enzima usada durante a dissociação celular.
Soro fetal bovino	Gibco	10437	Suplemento sérico usado em meios de lavagem e neutralização
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F2006	Componente proteico da matriz extracelular
GlutaMAX	Termo Científica	35050061	Suplemento para meios celulares epiteliais
Fator de crescimento epidérmico humano	Sigma-Aldrich	E9644	Suplemento para meios celulares epiteliais
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0888	Suplemento para meios celulares epiteliais
Ácido hialurônico	Millipore Sigma	385908	Componente da matriz extracelular para formulação de hidrogel
Hialuronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzima usada para dissociação de tecidos
Incubadora	Termo Científica	3598	Dispositivo usado para incubação em cultura de tecidos
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Suplemento para meios celulares epiteliais
Laminina	Gibco	23017-015	Componente proteico da matriz extracelular
Meio basal epitelial mamário	Termo Científica	M171500	Meio de crescimento para células epiteliais
Tubos microcentrífugas (1,5 mL)	Termo Científica	3451	Tubos usados para reações de pequeno volume
Rotador orbital	Termo Científica	400110	Rotador usado para dispersão de tecidos durante dissociação enzimática
Pipeta P1000	Gilson	P1000	Dispositivo usado para misturar e transferir volumes de até 1.000 μ L
Penicilina-estreptomicina	Termo Científica	15140122	Suplemento antibiótico para meios celulares epiteliais
Soro salino tamponado com fosfato	Gibco	20012-027	Solução tampão usada para lavar e enxaguar
Equilíbrio de precisão	Mettler Toledo	ML303E	Balanço usado para pesagem de tecidos
Pipeta sorológica	Nunc	170356N	Pipeta usada para coletar células epiteliais não aderentes
Hidróxido de sódio (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagente usado para neutralização de colágeno
Bisturi estéreis	Bard-Parker	372615	Ferramentas usadas para moção mecânica de tecidos
Solução azul de tripan	Gibco	15250061	Contraste usado para avaliação de viabilidade celular
Tripsina (0,25%)	Gibco	25200056	Reagente enzimático usado para dissociação celular
Banho-maria (37 & deg; C)	VWR	10LA	Dispositivo usado para descongelamento controlado de amostras