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Artigo de método

Ensaio ELISpot para Quantificar Células Secretoras de Anticorpos Totais e Antígeno-Específicas no Sangue e na Medula Óssea de Macacos Rhesus Imunizados

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DOI:

10.3791/71836

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21 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

Neste artigo

Resumo

O ELISpot de células B é um método validado para quantificar a magnitude e a durabilidade de plasmócitos de longa duração específicos para antígenos IgG, IgM e IgA, bem como células secretoras de anticorpos (ASCs) totais, tanto no sangue (refletindo plasmablastos de curta duração após imunização) quanto nas ASCs da medula óssea, mais duradouras.

Resumo

A avaliação de novos antígenos e adjuvantes vacinais tradicionalmente depende da medição de títulos de anticorpos, que exigem tempo para se desenvolver após a imunização. A quantificação de células secretoras de anticorpos (ASCs) após imunizações primária e de reforço fornece uma medida mais precoce e mecanicamente informativa da imunidade humoral induzida pela vacina e pode facilitar a otimização de formulações vacinais e estratégias de imunização. Aqui, descreve-se um protocolo para enumerar ASCs de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) e de células da medula óssea (BM) de macacos-ruivos; esses animais são um modelo pré-clínico importante para a pesquisa de vacinas contra o HIV. Este ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISpot) permite a quantificação de ASCs específicas para antígenos e de ASCs totais de IgG, IgM e IgA, medindo suas frequências absolutas e relativas. No sangue periférico, o ensaio capta a resposta de plasmablastos no pico após a imunização, enquanto na medula óssea detecta o acúmulo de plasmócitos específicos para antígenos de diferentes isotipos, avaliando assim a durabilidade das ASCs de longa vida. Este protocolo oferece uma abordagem robusta e reprodutível para avaliar combinações de imunógenos e adjuvantes em estudos pré-clínicos de vacinas e fornece dados valiosos para apoiar a transição de candidatos vacinais promissores para o desenvolvimento clínico.

Introdução

As células secretoras de anticorpos (ASCs) são componentes-chave da imunidade adaptativa e incluem tanto plasmablastos de vida curta, gerados rapidamente após a imunização, quanto plasmócitos de vida longa, responsáveis pela produção sustentada de anticorpos. Os plasmablastos são detectáveis de forma transitória no sangue periférico e nos órgãos linfoides secundários, atingindo frequências máximas em momentos definidos após a imunização, que variam de acordo com a formulação da vacina e a espécie do hospedeiro (tipicamente entre os dias 4 e 5 em macacos-ruivos e aproximadamente no dia 7 em humanos). Em contraste, os plasmócitos maduros são de longa duração e residem principalmente nos tecidos linfoides secundários e na medula óssea (BM). Uma vacina eficaz deve induzir respostas imunes humoral e mediada por células robustas. A medição das respostas de memória, refletida pela rápida expansão de plasmablastos em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) após imunização de reforço, fornece informações valiosas sobre a magnitude da resposta imune induzida pela vacina. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método robusto para quantificar as respostas precoces de plasmablastos e de plasmócitos de longa duração após imunização específica para Env em macacos-ruivos.

Em um ensaio imunoenzimático (ELISpot), as células secretoras de anticorpos (ASCs) são cultivadas em placas de 96 poços com fundo de membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou éster misto de celulose (MCE), revestidas com antígeno (Ag), permitindo que as células viáveis secretem proteínas que são capturadas diretamente na superfície da membrana. As proteínas capturadas são posteriormente detectadas usando anticorpos em um formato convencional de imunoensaio em sanduíche. Nos ensaios cromogênicos de ELISpot, as manchas são geradas pela conversão do substrato 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) pela peroxidase do rabanete (HRP) em um precipitado colorido insolúvel, permitindo a visualização e contagem individual das ASCs. O ELISpot oferece várias vantagens importantes, incluindo a capacidade de detectar respostas específicas ao antígeno ex vivo, avaliação funcional altamente sensível de células imunes individuais e monitoramento quantitativo das respostas imunes de células T e B em estudos pré-clínicos e clínicos1,2,3.

Aqui, é descrito um protocolo de ELISpot para células B para quantificar ASCs totais e específicas para antígeno de IgG, IgM e IgA em PBMCs e células de MO de macacos-ruivos. O protocolo detalha todas as etapas críticas, incluindo revestimento da placa, bloqueio, semeadura celular, desenvolvimento do ensaio, contagem de manchas e análise de dados, para caracterizar a cinética das respostas de plasmablastos e células plasmáticas totais e específicas para Env. Este método fornece uma abordagem reprodutível para avaliar e comparar a imunogenicidade de diferentes formulações de antígeno e adjuvante em estudos pré-clínicos de vacinas e auxilia na otimização de estratégias vacinais para subsequente tradução clínica.

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Protocolo

Os macacos-rajados utilizados neste protocolo foram obtidos a partir de colônias livres de patógenos específicos (SPF) do New Iberia Research Center e mantidos no Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, do University of Texas MD Anderson Cancer Center. O cuidado com os animais e todos os procedimentos experimentais seguiram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do University of Texas MD Anderson Cancer Center (Protocolo nº 2616RN00).

Este protocolo representa uma otimização da técnica descrita em estudos pré-clínicos de imunização anteriores4,5,6,7, desenvolvida para detectar respostas de células secretoras de anticorpos (ASC). O protocolo abaixo descreve o procedimento de ELISpot utilizando PBMCs e preparações celulares de MO  frescas de macacos-ruivos envolvidos em um protocolo experimental de vacina contra o HIV.

OBSERVAÇÃO: Realize todos os procedimentos das Seções 1–4 em uma cabine de segurança biológica Classe II certificada, utilizando técnica asséptica. Utilize pipetas multicanais sempre que possível.

1. Preparação das placas de ELISpot

  1. Revestir as placas de ELISpot
    1. Revestir as placas de imunoglobulina total (Ig) 1 e 3 com 100 µL/por poço de 5 µg/mL de anticorpo de cabra anti-macaco IgG + IgM + IgA não conjugado, diluído em DPBS estéril. Incubar as placas a 4 °C por pelo menos 8 h, preferencialmente durante a noite (Figura 1A,C).
    2. Revestir as placas específicas para antígeno 2 e 4 com 100 µL/por poço de 20 µg/mL de lectina de Galanthus nivalis (GNL) diluída em DPBS. Incubar as placas a 4 °C por pelo menos 8 h, preferencialmente durante a noite (Figura 1B,D).
    3. Armazenar as placas revestidas a 4 °C até o uso.
  2. Lavar e bloquear as placas de imunoglobulina total
    1. Remover a solução de revestimento das placas 1 e 3 invertendo rapidamente cada placa sobre um recipiente de resíduos. Bater firmemente a placa invertida em papel absorvente para remover o líquido residual.
    2. Lavar cada placa duas vezes com 200 µL/por poço de PBS contendo 0,05% de Tween 20. Em seguida, lavar as placas duas vezes com 200 µL/por poço de DPBS para remover o detergente residual.
      NOTA: O Tween 20 é citotóxico. Removê-lo completamente antes de semear as células.
    3. Adicionar 200 µL/por poço de RPMI-10 a cada poço. Incubar as placas por 2 h a 37 °C em incubadora umidificada.
  3. Lavar e bloquear as placas específicas para antígeno
    1. Remover a solução de revestimento de GNL das placas 2 e 4 invertendo rapidamente cada placa sobre um recipiente de resíduos. Bater firmemente as placas invertidas em papel absorvente para remover o líquido residual.
    2. Lavar cada placa quatro vezes com 200 µL/por poço de DPBS.
      NOTA: Não utilizar PBS contendo Tween 20 para placas revestidas com GNL.
    3. Adicionar 200 µL/por poço de RPMI-10 a cada poço. Incubar as placas por 2 h a 37 °C em incubadora umidificada.
    4. Descartar a solução de bloqueio. Lavar cada placa quatro vezes com 200 µL/por poço de DPBS.
    5. Adicionar 100 µL/por poço de antígeno CH505 SOSIP numa concentração final de 5 µg/mL. Incubar as placas por 2 h a 37 °C.
    6. Descartar a solução de antígeno e lavar cada placa quatro vezes com DPBS estéril.
      NOTA: Deixar DPBS nos poços após a lavagem final para evitar que a membrana MCE seque antes da semeadura celular.

2. Preparação das amostras: isolamento de PBMCs e células mononucleares da medula óssea

  1. Isolar PBMCs do sangue total
    1. Centrifugar tubos de sangue com EDTA de 10 mL a 450 x g por 20 min à temperatura ambiente sem aplicar o freio.
    2. Remover o plasma e adicionar 4 mL de DPBS sem Ca2+ e Mg2+. Misturar suavemente usando uma pipeta serológica de 10 mL.
    3. Aplicar cuidadosamente o sangue diluído sobre 4 mL de Ficoll em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 800 x g por 30 min à temperatura ambiente com aceleração lenta e desaceleração lenta.
    4. Transferir a camada de buffy coat contendo células mononucleares do sangue periférico para um tubo cônico de 15 mL novo. Adicionar 8–10 mL de DPBS e centrifugar a 450 x g por 10 min à temperatura ambiente.
    5. Descartar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet celular.
    6. Adicionar 2 mL de tampão de lise de cloreto de amônio e potássio (ACK) à suspensão celular. Incubar por 5 min à temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: Não exceder o período de incubação de 5 min, pois a exposição prolongada ao tampão de lise ACK reduz a viabilidade celular.
    7. Interromper a lise de eritrócitos adicionando 10 mL de DPBS contendo 2% de soro bovino fetal (FBS). Centrifugar as células a 300 x g por 10 min à temperatura ambiente.
    8. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em RPMI-10.
    9. Contar os PBMCs utilizando um método apropriado de contagem celular e garantir que a viabilidade seja >90%, por exemplo, por meio da coloração com azul de tripano.
    10. Ajustar uma alíquota para 5 × 106 células/mL para ensaios de ELISpot específicos para antígeno. Ajustar uma segunda alíquota para 1 × 106 células/mL para ensaios de ELISpot de imunoglobulina total.
  2. Isolar células mononucleares da medula óssea
    1. Colocar um filtro celular de 70 µm em um tubo cônico de 50 mL. Umedecer previamente o filtro com 1 mL de DPBS.
    2. Adicionar 4 mL de DPBS a 1 mL de aspirado de medula óssea. Misturar completamente usando uma pipeta serológica.
    3. Passar a suspensão de medula óssea através do filtro celular de 70 µm. Enxaguar o filtro com 2 mL de DPBS antes de descartá-lo.
    4. Aplicar a suspensão filtrada sobre 4 mL de Ficoll em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 800 x g por 30 min à temperatura ambiente com aceleração lenta e desaceleração lenta.
    5. Transferir a camada de células mononucleares para um tubo cônico de 15 mL novo. Adicionar 8–10 mL de DPBS e centrifugar a 450 x g por 10 min à temperatura ambiente.
    6. Descartar o sobrenadante e ressuspender suavemente o pellet celular.
    7. Adicionar 2 mL de tampão de lise ACK à suspensão celular. Incubar por 5 min à temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: Não exceder o tempo de lise recomendado para preservar a viabilidade celular.
    8. Interromper a lise de eritrócitos adicionando 10 mL de DPBS contendo 2% de FBS. Centrifugar as células a 300 x g por 10 min à temperatura ambiente.
    9. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em RPMI-10.
    10. Contar as células mononucleares da medula óssea utilizando um método apropriado de contagem celular e garantir que a viabilidade seja >90%, por exemplo, por meio da coloração com azul de tripano.
    11. Ajustar uma alíquota para 5 × 106 células/mL para ensaios de ELISpot específicos para antígeno. Ajustar uma segunda alíquota para 1 × 106 células/mL para ensaios de ELISpot de imunoglobulina total.

3. Semeadura e incubação de células

  1. Plaquear as placas de imunoglobulina total
    1. Remova o meio bloqueador das placas 1 e 3 invertendo rapidamente cada placa sobre um recipiente de resíduos. Bata firmemente as placas invertidas em papel absorvente para remover o meio residual.
    2. Adicione 100 µL de RPMI-10 a cada poço da primeira linha e 133 µL de RPMI-10 a cada poço das segunda e terceira linhas. Realize esses passos em duplicatas técnicas.
    3. Adicione 100 µL de suspensão de PBMC (1 × 106 células/mL) ao primeiro poço de cada coluna da placa 1. Organize as amostras de acordo com o layout da placa [por exemplo, poços A1–A6 para macaco-ruivo 1 (RM1) e A7–A12 para macaco-ruivo 2 (RM2)].
    4. Adicione 100 µL de suspensão de células da medula óssea (1 × 106 células/mL) ao primeiro poço de cada coluna da placa 3. Organize as amostras de acordo com o layout da placa.
    5. Prepare diluições seriadas em triplo ao transferir 67 µL de um poço para o próximo, misturando completamente após cada transferência. Continue a diluição seriada nos poços designados e descarte os últimos 67 µL para manter um volume final de 133 µL por poço.
    6. Incube as placas durante a noite a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO2.
      ​NOTA: Evite mover ou perturbar as placas durante a incubação para prevenir a formação de manchas duplas.
  2. Plaquear as placas antígeno-específicas
    1. Remova o DPBS das placas 2 e 4 invertendo rapidamente cada placa sobre um recipiente de resíduos. Bata firmemente as placas invertidas em papel absorvente para remover o tampão residual.
    2. Adicione 100 µL de RPMI-10 a cada poço da primeira linha e 133 µL de RPMI-10 a cada poço das segunda e terceira linhas.
    3. Adicione 100 µL de suspensão de PBMC (5 × 106 células/mL) ao primeiro poço de cada coluna da placa 2. Adicione as amostras de acordo com o layout da placa.
    4. Adicione 100 µL de suspensão de células da medula óssea (5 × 106 células/mL) ao primeiro poço de cada coluna da placa 4. Adicione as amostras de acordo com o layout da placa.
    5. Prepare diluições seriadas em triplo ao transferir 67 µL de um poço para o próximo, misturando completamente após cada transferência. Continue a diluição seriada nos poços designados e descarte os últimos 67 µL para manter um volume final de 133 µL por poço.
    6. Incube as placas durante a noite a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO2.
      NOTA: Evite perturbar a incubadora durante a incubação, pois vibrações podem produzir manchas duplas ou artefatos em forma de cauda de cometa.

4. Processar as placas de ELISpot

  1. Processar as placas de imunoglobulina total
    1. Remova as placas do incubador após aproximadamente 18 h de incubação.
    2. Descarte as células e o meio de cultura invertendo rapidamente cada placa sobre um recipiente de resíduos contendo 10% de hipoclorito. Bata firmemente as placas invertidas em papel absorvente para remover o líquido residual.
      NOTA: Realize os passos restantes de processamento em condições não estéreis.
    3. Lave cada placa quatro vezes com 200 µL/poço de DPBS contendo 0,05% de Tween 20.
      NOTA: Deixe o último tampão de lavagem nos poços para evitar que as membranas sequem.
    4. Alternativamente, lave as placas usando um lavador automático de microplacas ao processar grandes quantidades de placas.
    5. Prepare a solução de anticorpo de detecção diluindo os anticorpos biotinilados anti-macaco IgG e IgM em 1:1.000 e o anticorpo biotinilado anti-macaco IgA em 1:500 em DPBS contendo 0,05% de Tween 20 e 1% de FBS.
    6. Remova o último tampão de lavagem batendo as placas em papel absorvente. Adicione 100 µL/poço do anticorpo anti-IgG diluído nas colunas 1 e 2, 7 e 8, anticorpo anti-IgM nas colunas 3 e 4, 9 e 10, e anticorpo anti-IgA nas colunas 5 e 6, 11 e 12.
      NOTA: Processe uma placa por vez para evitar que as membranas sequem.
    7. Incube as placas por 2 h à temperatura ambiente.
    8. Descarte a solução de anticorpo de detecção e lave as placas quatro vezes com DPBS contendo 0,05% de Tween 20.
    9. Prepare o conjugado enzimático diluindo a avidina-HRP em 1:1.000 em DPBS contendo 0,05% de Tween 20 e 1% de FBS.
    10. Adicione 100 µL/poço de avidina-HRP diluída em cada poço. Incube as placas por 2 h à temperatura ambiente, protegidas da luz.
    11. Descarte a solução de avidina-HRP e lave as placas quatro vezes com DPBS contendo 0,05% de Tween-20.
      ​NOTA: Mantenha o último tampão de lavagem nos poços até que o desenvolvimento do substrato esteja completo.
  2. Processar as placas específicas para antígeno
    NOTA: O procedimento é semelhante ao usado para as placas de imunoglobulina total. No entanto, realize todas as etapas de lavagem usando DPBS sem Tween 20 para preservar o revestimento de GNL.
    1. Remova as placas do incubador após aproximadamente 18 h de incubação.
    2. Descarte as células e o meio de cultura invertendo rapidamente cada placa sobre um recipiente de resíduos contendo 10% de hipoclorito. Bata firmemente as placas invertidas em papel absorvente para remover o líquido residual.
      NOTA: Realize os passos restantes de processamento em condições não estéreis.
    3. Lave cada placa quatro vezes com 200 µL/poço de DPBS.
      NOTA: Deixe o último tampão de lavagem nos poços para evitar que as membranas sequem.
    4. Prepare a solução de anticorpo de detecção diluindo os anticorpos biotinilados anti-macaco IgG e IgM em 1:1.000 e o anticorpo biotinilado anti-macaco IgA em 1:500 em DPBS contendo 1% de FBS.
    5. Remova o último tampão de lavagem batendo as placas em papel absorvente. Adicione 100 µL/poço do anticorpo anti-IgG diluído nas colunas 1 e 2, 7 e 8, anticorpo anti-IgM nas colunas 3 e 4, 9 e 10, e anticorpo anti-IgA nas colunas 5 e 6, 11 e 12.
      NOTA: Processe uma placa por vez para evitar que as membranas sequem.
    6. Incube as placas por 2 h à temperatura ambiente.
    7. Descarte a solução de anticorpo de detecção e lave as placas quatro vezes com 200 µL/poço de DPBS.
    8. Prepare o conjugado enzimático diluindo a avidina-HRP em 1:1.000 em DPBS contendo 1% de FBS.
    9. Adicione 100 µL/poço de avidina-HRP diluída em cada poço. Incube as placas por 2 h à temperatura ambiente, protegidas da luz.
    10. Descarte a solução de avidina-HRP e lave as placas quatro vezes com 200 µL/poço de DPBS.
      NOTA: Deixe o último tampão de lavagem nos poços até que o desenvolvimento do substrato esteja completo.
  3. Realizar lavagem automatizada (Opcional)
    1. Priming do lavador automático de microplacas com DPBS de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Selecione o programa de lavagem ELISpot predefinido e realize todas as etapas de lavagem usando DPBS.
      NOTA: Use DPBS em todas as lavagens automatizadas para eliminar a necessidade de priming repetido do equipamento com diferentes tampões de lavagem.
    3. Use as configurações do lavador listadas na Tabela 1 para o lavador de microplacas.

5. Detecção

  1. Prepare a solução substrato
    1. Prepare o substrato de trabalho AEC imediatamente antes do uso, adicionando uma gota de solução cromogênica a cada 1 mL de solução substrato. Misture bem por vortexagem.
      NOTA: Prepare aproximadamente 40 mL de substrato de trabalho para quatro placas de 96 poços.
  2. Desenvolva as placas de ELISpot à temperatura ambiente
    1. Processe uma placa por vez. Descarte o tampão final de lavagem e adicione imediatamente 100 µL/poço do substrato de trabalho AEC.
    2. Monitore visualmente o desenvolvimento das manchas até que manchas vermelhas distintas se tornem visíveis, geralmente dentro de 2–4 min.
      CAUÇÃO: Não desenvolva demais as placas, pois o excesso de desenvolvimento aumenta a coloração de fundo e compromete a resolução das manchas.
    3. Interrompa a reação enzimática lavando a placa abundantemente sob água corrente da torneira.
    4. Lave a placa de quatro a cinco vezes com água da torneira. Remova o excesso de água utilizando papel toalha absorvente.
    5. Remova o dreno inferior da placa e deixe as placas secarem ao ar por aproximadamente 24 h antes de contar as manchas.
      NOTA: Interrompa a reação assim que as manchas se tornarem visíveis nos poços contendo as maiores concentrações celulares para evitar desenvolvimento excessivo.
    6. Repita os Passos 5.2.1–5.2.5 para cada placa restante.

6. Quantificação de manchas

  1. Adquirir imagens de ELISpot
    1. Escaneie cada placa usando um leitor de ELISpot equipado com software de aquisição de imagens.
    2. Selecione o modelo de placa apropriado, defina as poças a serem analisadas e adquira as imagens de acordo com as instruções do software.
    3. Salve os dados brutos e exporte as imagens da placa em formato TIFF para fins de arquivamento.
  2. Contar células secretoras de anticorpos
    1. Revise as contagens automatizadas de manchas para cada poça.
    2. Verifique manualmente cada poça para identificar manchas incorretamente mescladas ou divididas. Marque as manchas individuais manualmente quando necessário para obter contagens precisas.
      NOTA: A verificação manual é recomendada porque manchas grandes podem ser contadas múltiplas vezes pelo software de análise automatizada.
    3. Registre as contagens de manchas juntamente com os fatores de diluição correspondentes em uma planilha conforme descrito na Tabela 2.
    4. Analise as poças em duplicata separadamente para IgG, IgM e IgA antes de calcular a contagem média de manchas para cada diluição.
    5. Calcule o número de células secretoras de anticorpos por milhão de células inicial multiplicando a contagem média de manchas pelo fator de diluição correspondente.
      NOTA: Utilize fatores de diluição de 15×, 45× e 135× para ensaios de imunoglobulina total e 3×, 9× e 27× para ensaios específicos para antígeno.
    6. Realize todos os cálculos em software de planilha e gere gráficos usando software estatístico de criação de gráficos.

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Resultados

Neste ensaio ELISpot de linfócitos B, células secretoras de anticorpos (ASCs) foram detectadas utilizando CH505 SOSIP, um trímero solúvel da glicoproteína do envelope (Env) do HIV-1, como antígeno revestidor em um estudo vacinal destinado a induzir anticorpos neutralizantes amplamente ativos (bnAbs) contra o HIV-1. Figura 1 ilustra o arranjo da placa ELISpot utilizado para quantificar ASCs totais e específicas para o antígeno em placas separadas. O arranjo identifica os animais individuais e...

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Discussão

O ELISpot de células B é um método sensível para detectar respostas de células secretoras de anticorpos (ASC) totais de imunoglobulina e específicas para antígenos em sangue, plasma e células da medula óssea8,9,10,11. Várias etapas são fundamentais para garantir a reprodutibilidade do protocolo. Primeiramente, as membranas devem ser revestidas com precisão com a concentração ideal do anticorpo ...

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Divulgações

Os autores não têm interesse financeiro a declarar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos animais e à equipe de cuidados com a pesquisa no Keeling Center for Comparative Medicine and Research pelo seu cuidado, bem como a muitos ex-membros da equipe e colaboradores pelas melhorias sucessivas ao procedimento. O financiamento para este projeto de vacina contra o HIV em primatas não humanos foi fornecido pelas concessões NIH 5R01AI183472 a MBZ e R24OD010947 a FJV.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Lise ACKQuality Biological118-156-101500 ml
Filtro de 70µmFisher22363548Filtro celular estéril, adequado para tubos cônicos de 50 mL
Substrato de trabalho AECBD Biosciences551951Reagentes para 10 placa(s)
Análise: ExcelMicrosoft OfficeVersão 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel para Microsoft 365
Análise: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersão 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti-IgA Rhesus biotiniladoNHPRRAB-3086851liofilizado
Anti-IgG de macaco biotiniladoRocklandP/N 617-106-012lifoilizado
Anti-IgM de macaco biotiniladoRocklandP/N 617-106-007lifoilizado
Meio bloqueadorReagentes preparados no laboratórioformulação internaRPMI-10
Tampão para diluição do anticorpo secundário e HRPReagentes preparados no laboratórioformulação internaDPBS 1X com 1% de FBS
Centrífuga Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, Fabricação: 2013, rotor TX-750 e 75003608 (balde redondo)
Tampão de revestimentoReagentes preparados no laboratórioformulação internaDPBS 1X
DPBSGibco14190-1361X
Placas ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50Pacote com 50 placas
Soro bovino fetal (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL não conjugadoVector LaboratoriesL-1240-5lifoilizado
Avidina conjugada à peroxidase do rabanete (HRP)Vector LaboratoriesA-20045 mg/mL, pronto para uso
Leitor Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N: 2000Imagem automatizada e análise para ensaios ELISpot e Fluorospot
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122100X
Lavador de placasBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRSLavador de microplacas 405 TS
RPMI-10Reagentes preparados no laboratórioformulação internaRPMI-1640 + 10% Soro bovino fetal e 1% Penicilina/Estreptomicina 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life SciencesP7949500 ml
Anticorpo policlonal de cabra não conjugado anti-macaco IgG+IgA+IgM (IgG/IgM/IgA)LS-BioC347340lifoilizado
Tampão de lavagem (Placas Específicas para Antígeno)Reagentes preparados no laboratórioformulação interna(apenas DPBS 1X)
Tampão de lavagem (Placas de Ig Total)Reagentes preparados no laboratórioformulação interna(DPBS 1X + 0,05% Tween 20)

Referências

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

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