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Artigo de método

Projeto e Operação de uma Instalação Interna de Criomicroscopia Eletrônica com Infraestrutura de TI e Pipelines de Processamento de Dados em Tempo Real

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DOI:

10.3791/71837

⸱

1 de setembro de 2026

 , 
1ITS-Technology Engineering, Information Technology Services, Physical & Biological Sciences Division, University of California-Santa Cruz, 2Biomolecular Cryo-Electron Microscopy Facility, University of California-Santa Cruz, 3Chemistry and Biochemistry Department, University of California-Santa Cruz

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece uma estrutura prática para o projeto e operação da infraestrutura de TI de uma instalação interna de microscopia eletrônica criogênica (crio-EM). Ele abrange o planejamento da instalação, arquitetura de rede, armazenamento, computação com GPU, acesso remoto e processamento de dados em tempo real, permitindo a gestão eficiente de conjuntos de dados de vários terabytes, ao mesmo tempo que garante operações de crio-EM escaláveis, sustentáveis e de alto desempenho.

Resumo

A microscopia crioeletrônica (crio-EM) tornou-se um método dominante para a determinação de estruturas de macromoléculas biológicas em alta resolução. Com o aumento no número de instalações institucionais de crio-EM em todo o mundo, surgiu um desafio persistente: a infraestrutura de dados necessária para apoiar essas instalações é frequentemente subdimensionada. Instrumentos modernos de crio-EM acoplados a detectores diretos de elétrons (DEDs) geram entre 2 e 5 TB de dados brutos por dia, e uma instalação com 20 usuários pode acumular aproximadamente 2 PB de dados em um único ano de operação. O processamento desses dados exige nós computacionais dedicados com GPU, rede interna de alta velocidade e estratégias robustas de arquivamento de longo prazo — todos os quais devem estar implementados antes do início da coleta de dados. Este protocolo apresenta uma estrutura integrada para o projeto de TI e computacional de uma instalação própria de crio-EM. Abordamos os requisitos físicos da instalação (projeto da sala, energia, refrigeração e isolamento contra vibrações), seleção de equipamentos (microscópios, DEDs e instrumentos auxiliares) e toda a pilha computacional: configuração de switches de rede, seleção e dimensionamento de servidores de armazenamento, provisionamento de nós computacionais com GPU e arquitetura de acesso remoto. Em seguida, fornecemos um protocolo detalhado para implementar pipelines de processamento de dados em tempo real — cobrindo correção de movimento, estimativa da função de transferência de contraste (CTF), seleção de partículas e classificação em 2D em tempo real durante a coleta de dados — utilizando ferramentas padrão da indústria. Também são abordadas estratégias de transferência de dados para usuários externos. Este guia preenche uma lacuna crítica na literatura e permitirá que pesquisadores e administradores construam instalações de crio-EM plenamente preparadas computacionalmente desde o primeiro dia.

Introdução

A revolução da resolução em criomicroscopia eletrônica transformou a biologia estrutural, permitindo a visualização em resolução atômica de proteínas, ácidos nucleicos e complexos macromoleculares sem a necessidade de cristalização1,2. Três avanços técnicos impulsionaram essa transformação: o desenvolvimento de detectores eletrônicos diretos com altas taxas de quadros, melhorias na óptica eletrônica e na mecânica dos microscópios, e a otimização de softwares de processamento de imagens acelerados por GPU3,4,5,6. Juntos, esses avanços tornaram a criomicroscopia eletrônica o método preferencial para uma comunidade crescente de biólogos estruturais.

A demanda por acesso à microscopia criogênica de elétrons (cryo-EM) tem impulsionado investimentos significativos tanto em grandes centros nacionais quanto em instalações institucionais menores. Centros nacionais — como o NCCAT, S2C2, PNCC e MCCET nos Estados Unidos, e o eBIC, NeCEN e SciLifeLab na Europa3,5,6 — oferecem acesso aos instrumentos mais avançados para projetos aprovados. As instalações internas complementam esses recursos ao apoiar pesquisas específicas de projetos de forma iterativa, com tempos de resposta mais rápidos e interação mais estreita entre usuários e equipe técnica. No entanto, estabelecer uma instalação interna funcional exige muito mais do que adquirir um microscópio: a infraestrutura de TI de apoio é igualmente crítica, e sua inadequação é uma das principais causas de falhas operacionais em novas instalações6.

Uma única sessão de alta qualidade em microscopia eletrônica de criotransmissão (cryo-EM) pode gerar de 2 a 5 TB de dados brutos de filmes em 24 horas. Com múltiplos microscópios e usuários, a carga de dados atinge rapidamente a escala de petabytes. O processamento desses dados exige pipelines acelerados por GPU que devem operar simultaneamente à coleta de dados7,8. Atrasos no pré-processamento significam atrasos no feedback sobre a qualidade dos dados e perda de tempo do instrumento. Apesar dessa realidade, a maioria dos guias publicados sobre gestão de instalações de cryo-EM dedica pouca atenção aos componentes de TI, e nenhum fornece um protocolo operacional passo a passo para configurar e validar uma infraestrutura completa de dados.

Este protocolo aborda essa lacuna. Descrevemos os requisitos físicos e técnicos para a construção da instalação, os critérios de seleção para microscópios e detectores e, mais importante ainda, o projeto e a implementação da infraestrutura de TI que torna uma instalação de criomicroscopia eletrônica viável operacionalmente6. Uma atenção especial é dada ao processamento de dados em tempo real: o pré-processamento automatizado e simultâneo dos dados durante a coleta, que permite controle de qualidade em tempo real, orienta as decisões de coleta e reduz drasticamente o tempo de processamento após a sessão9,10,11. Ao seguir este protocolo, os desenvolvedores de instalações estarão preparados para construir uma operação completa e integrada de criomicroscopia eletrônica que atenda de forma sustentável e eficiente uma ampla comunidade científica.

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Protocolo

Os detalhes dos equipamentos, softwares e materiais utilizados ao longo deste protocolo estão fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Planejamento do design físico da instalação, pessoal e infraestrutura

  1. Realize uma avaliação do local. Selecione um local que ofereça: piso isolado contra vibrações (níveis de vibração ambiente, idealmente < 1 µm/s RMS em 1–100 Hz); estabilidade do campo magnético (< 1 mG/m de gradiente espacial e < 0,1 mG/m de variação temporal para instrumentos de 300 kV); temperatura ambiente estável (18–22 °C com flutuação < 0,5 °C); controle de umidade (40–60% UR); e baixo ruído acústico (<50 dB). Consulte os requisitos de instalação do fabricante do microscópio já na fase de planejamento.
    NOTA: Reformar um ambiente existente pode custar tanto quanto uma construção nova. Como regra geral, reserve aproximadamente 20% do preço de compra do microscópio para a preparação do ambiente.
  2. Projete o layout da instalação com separação espacial clara entre zonas funcionais: (a) sala(s) de microscopia para microscópios eletrônicos de transmissão criogênicos (crio-TEMs); (b) antessala para preparação de amostras, manipulação e armazenamento de grades; (c) sala de controle com chillers de água, unidades de UPS e sistemas de refrigeração do microscópio; e (d) sala de servidores ou centro de dados separado para infraestrutura de armazenamento e processamento.
    NOTA: Mantenha a sala de controle sempre abaixo de 26 °C e forneça alimentação elétrica e refrigeração de reserva dedicadas. Variações de temperatura na sala de controle são uma causa comum de interrupções no funcionamento do microscópio.
  3. Planeje a infraestrutura elétrica. Instale circuitos elétricos trifásicos dedicados para crio-TEMs de alto desempenho. Conecte todos os microscópios, câmeras e equipamentos de servidor à infraestrutura elétrica protegida designada. Coordene-se com a equipe de infraestrutura da instituição para incluir um gerador de emergência capaz de manter o funcionamento do microscópio e o fluxo de água de refrigeração durante interrupções no fornecimento de energia.
    NOTA: Vários instrumentos em uma instalação de crio-EM exigem mais de um dia para ciclagem segura de energia. A perda de energia não planejada pode danificar placas de circuito sensíveis e resultar na perda de sessões ativas de aquisição de dados.
  4. Instale sistemas de água de refrigeração para o microscópio eletrônico e os equipamentos associados. Estabeleça um circuito de refrigeração de reserva com comutação automática. Monitore continuamente a vazão, temperatura e condutividade da água utilizando o sistema integrado de monitoramento do microscópio ou uma matriz de sensores dedicada.
  5. Instale cabos de fibra óptica entre a(s) sala(s) de microscopia e a sala de servidores durante a construção ou reforma. Especifique no mínimo fibra multimodo OM4 ou monomodo OS2, com folga suficiente e painéis de conexão rotulados em ambas as extremidades.
    NOTA: A pré-instalação de fibra é significativamente mais barata do que a instalação posterior.
  6. Designe operadores de microscópio dedicados ou cientistas da instalação para realizar manutenção dos instrumentos, treinamento de usuários, agendamento, otimização de amostras e suporte à aquisição de dados. Designe pessoal de TI dedicado para gerenciar a infraestrutura, desempenho da rede, segurança cibernética, backup de dados, implantação de software, recursos computacionais com GPU e acesso remoto de usuários.
  7. Determine os requisitos de pessoal com base no nível de suporte oferecido aos usuários e na complexidade da infraestrutura computacional. Em instalações menores, como a UCSC Biomolecular cryo-EM Facility, essas responsabilidades podem ser compartilhadas por um gerente da instalação com conhecimento computacional ou pelos serviços centralizados de TI da instituição; no entanto, à medida que aumenta o número de microscópios, usuários e sessões anuais de aquisição de dados, o pessoal especializado torna-se cada vez mais necessário.
  8. Forneça suporte de TI dedicado para instalações que operam múltiplos crio-TEMs, garantindo aquisição contínua de dados, gerenciamento eficiente de dados e recursos computacionais escaláveis. Invista cedo em infraestrutura e pessoal de TI robustos durante o desenvolvimento da instalação para minimizar interrupções operacionais, facilitar futuras expansões e fornecer uma estrutura sustentável capaz de apoiar comunidades crescentes de usuários e fluxos de trabalho de crio-EM cada vez mais intensivos em dados.

2. Seleção do microscópio e do detector

  1. Defina a missão científica principal da instalação antes de selecionar um microscópio. Considere: (a) se o fluxo de trabalho principal será análise de partículas isoladas (SPA), tomografia crioeletrônica (cryo-ET), microdifração eletrônica (microED) ou uma combinação; (b) o tamanho esperado da base de usuários e a diversidade de projetos; (c) as restrições orçamentárias tanto para aquisição quanto para contratos de serviço contínuos.
  2. Avalie as plataformas de criomicroscopia eletrônica disponíveis de acordo com as aplicações pretendidas. Para SPA de alta resolução e média de subtomogramas (STA), considere instrumentos de 300 kV. Para triagem e coleta de dados de resolução média, considere instrumentos de 200 kV. Para um ponto de entrada de menor custo com capacidade de triagem, avalie instrumentos de 100–120 kV (resumido na Tabela 1).
    NOTA: As fichas técnicas mudam com frequência. Solicite sempre detalhes atualizados de configuração e preços diretamente ao fabricante antes de finalizar decisões sobre equipamentos.
  3. Selecione um detector de elétrons direto (DED) compatível com o microscópio e a aplicação. Para SPA de alta resolução em instrumentos da Thermo Fisher Scientific (TFS), o Falcon 4i é atualmente a principal opção nas séries Krios e Glacios.
  4. Para instrumentos JEOL CryoARM, o Gatan K3 oferece excelente sensibilidade e taxas de quadros. Para instalações que visam tanto SPA quanto microED, confirme a compatibilidade do detector com modos de coleta de dados de difração eletrônica (Tabela 2).
    NOTA: O DED é um dos componentes mais caros da instalação e impacta significativamente a qualidade dos dados e os requisitos de armazenamento. O modo Electron Event Register (EER), por exemplo, produz arquivos brutos substancialmente maiores do que formatos comprimidos convencionais, exigindo armazenamento e largura de banda de rede proporcionais maiores.
  5. Avalie o papel de um filtro de energia ao selecionar a configuração do instrumento de criomicroscopia eletrônica, pois ele pode influenciar significativamente a qualidade da imagem, a escolha do detector e o desempenho geral do sistema. Ao remover elétrons espalhados inelasticamente, os filtros de energia melhoram o contraste e a relação sinal-ruído, o que é particularmente benéfico para amostras desafiadoras, aplicações de SPA de alta resolução (benéfico), cryo-ET (crítico) e microED (benéfico).
  6. Avalie os sistemas de filtro de energia disponíveis durante a seleção do instrumento. Os sistemas Gatan Bioquantum e Biocontinuum ou Thermo Fisher Scientific Selectris e SelectrisX geralmente custam aproximadamente US$ 0,3–1,5 milhão, dependendo da configuração.
  7. Avalie o custo e a complexidade adicionais associados aos filtros de energia em conjunto com as capacidades do detector, os objetivos da instalação e as aplicações esperadas dos usuários antes de selecionar a configuração final do instrumento.
  8. Considere os contratos de serviço ao calcular o custo total de aquisição. Os contratos de serviço geralmente cobrem o microscópio, o filtro de energia, o detector e o sistema de refrigeração a água.
  9. Negocie os termos do contrato de serviço — incluindo garantias de tempo de resposta e disponibilidade de peças emprestadas — no momento da compra do instrumento. Reserve de 8 a 15% do preço de compra do instrumento por ano para cobertura de serviços.

3. Projeto e implementação da arquitetura da rede

  1. Projetar a rede interna da instalação em torno de um switch central de alta velocidade. Conectar todos os dispositivos geradores e consumidores de dados diretamente a este switch na velocidade mais alta suportada: controlador do microscópio, controlador da câmera (frequentemente uma estação de trabalho separada), servidores de armazenamento e nós de computação com GPU.
  2. Garantir uma conexão mínima de 10 Gbps para cada dispositivo. Implementar enlaces de subida de 25 Gbps ou mais rápidos entre o switch e os nós de armazenamento e computação, conforme o orçamento permitir.
    NOTA: A 1 Gbps, a transferência de 20 TB de dados brutos levaria 2–3 dias. A 10 Gbps, a mesma transferência levaria 5–6 h. A 25 Gbps, levaria aproximadamente 2 h. A velocidade da rede determina diretamente se o processamento em tempo real pode acompanhar a aquisição de dados.
  3. Especificar o switch central. Requisitos: (a) matriz de comutação sem bloqueio na taxa máxima de linha; (b) número suficiente de portas SFP+ ou QSFP para todos os dispositivos da instalação; (c) funcionalidade de switch gerenciável (suporte a VLAN, monitoramento de tráfego, espelhamento de portas para diagnóstico); (d) módulos de alimentação redundantes. Selecionar um switch gerenciável de nível corporativo que ofereça matriz de comutação sem bloqueio, portas de alta velocidade suficientes, funções de gerenciamento de tráfego e fontes de alimentação redundantes.
  4. Segmentar a rede utilizando VLANs para separar: (a) a VLAN de aquisição de dados (controladores do microscópio e da câmera, servidores de armazenamento); (b) a VLAN de computação (estações de trabalho e nós do cluster com GPU); (c) a VLAN de gerenciamento (acesso remoto, monitoramento, administração).
    NOTA: A segmentação da rede reduz o tráfego de broadcast, melhora a segurança e permite a solução de problemas independente de cada subsistema.
  5. Conectar a rede da instalação à WAN institucional por meio de uma porta de subida dedicada no switch central. Um enlace de subida de 1–10 Gbps para a rede do campus é suficiente para acesso remoto e transferência externa de dados.
  6. Coordenar-se com a equipe de TI institucional para provisionar endereços IP estáticos, entradas DNS e regras apropriadas de firewall para todos os dispositivos acessíveis pela instalação (Figura 1).
  7. Instalar e rotular todos os cabos de rede. Utilizar cabos diretamente conectados ou cabos ópticos ativos para conexões de 10+ Gbps até 100 m (cabos Cat6A blindados também funcionam para 10 Gbps até 100 m); usar conjuntos de fibras pré-terminadas (LC-LC ou MTP) para enlaces entre racks de 25+ Gbps.
  8. Documentar todo o esquema de cabeamento com um diagrama de rede especificando nomes dos dispositivos, endereços IP, atribuições de portas e participação nas VLANs.
    NOTA: Consultar Figura 2 para obter um esquema da topologia de rede mínima recomendada para uma instalação pequena de criomicroscopia eletrônica.

4. Projeto e implantação do servidor de armazenamento

  1. Calcule os requisitos de armazenamento antes de adquirir o hardware. Como referência: uma única sessão de alto desempenho de microscopia crioeletrônica gera de 2 a 5 TB de dados brutos por dia.
  2. Estime os requisitos de armazenamento de longo prazo com base no uso previsto da instalação. Uma instalação com 20 usuários operando dois microscópios pode gerar aproximadamente 2 PB de dados em um período de 3 a 6 meses de operação. Planeje tanto o armazenamento de dados brutos (curto prazo, alto desempenho) quanto o armazenamento de dados processados (médio prazo, maior volume), já que os conjuntos de dados processados frequentemente são 10 a 20 vezes maiores que os dados brutos originais.
  3. Selecione uma arquitetura de armazenamento robusta. Servidores autônomos baseados em ZFS são o ponto de partida recomendado para a maioria das instalações, oferecendo uma relação custo-capacidade favorável, verificação integrada de integridade dos dados (checksum), configurações flexíveis equivalentes a RAID (RAIDZ, RAIDZ2) e suporte a instantâneos. Sistemas de arquivos distribuídos em cluster (Gluster, Ceph, GPFS/IBM Spectrum Scale) podem oferecer maior desempenho e escalabilidade, mas exigem múltiplos servidores físicos e administração mais complexa.
  4. Configure pools de armazenamento ZFS. Configuração inicial recomendada: dois vdevs RAIDZ2 (cada um composto por 6 a 8 discos rígidos SAS de alta capacidade, com 16 a 20 TB cada), fornecendo cerca de 60 a 70% de capacidade utilizável com proteção contra falhas simultâneas de até dois discos.
  5. Adicione um vdev dedicado de cache de gravação em SSD (L2ARC) utilizando 2 a 4 SSDs NVMe para acelerar o desempenho de leitura aleatória em tarefas de processamento ativas.
    NOTA: Não utilize discos SATA de uso doméstico em matrizes de armazenamento produtivo. Discos empresariais SAS ou NL-SAS com capacidade de carga de trabalho especificada (por exemplo, 550 TB/ano) são essenciais para os padrões sustentados de I/O aleatório dos fluxos de trabalho de microscopia crioeletrônica.
  6. Configure exportações NFS (para clientes Linux) e compartilhamentos SMB (para clientes Windows) no servidor de armazenamento ZFS. Monte o compartilhamento principal de dados em todos os nós de computação com GPU e na estação de trabalho do controlador da câmera para permitir acesso direto aos dados sem cópias intermediárias.
  7. Estabeleça uma política de retenção e ciclo de vida dos dados. Defina: (a) período de retenção dos filmes brutos (tipicamente de 3 a 6 meses após a coleta); (b) retenção dos micrografos corrigidos quanto ao movimento; (c) retenção dos conjuntos de dados processados finais (indefinida até a publicação); (d) procedimento de arquivamento para projetos concluídos.
  8. Implemente alertas automatizados quando a utilização do armazenamento exceder 70% da capacidade, para permitir a aquisição oportuna de armazenamento adicional.
    NOTA: O armazenamento é o custo mais frequentemente subestimado no planejamento de instalações de microscopia crioeletrônica. Não confunda a aprovação para a aquisição do microscópio com a disponibilidade de financiamento adequado para armazenamento. A aquisição de armazenamento deve ser planejada em paralelo com a instalação do equipamento, e não após o início da coleta de dados.

5. Infraestrutura computacional de GPU

  1. Determine os requisitos de computação com base na taxa de transferência esperada. Para um único microscópio gerando 3.000–5.000 micrografias por sessão de 24 h, são necessários no mínimo dois nós de computação, cada um equipado com 4 placas de GPU NVIDIA (Maxwell ou mais recente, 11+ GB de memória de vídeo, por exemplo, RTX 3090, RTX 4090 ou A100), para sustentar o pré-processamento em tempo real na velocidade de aquisição.
  2. Para instalações maiores ou fluxos de trabalho de criotomografia eletrônica (crio-ET) com alto volume de séries de inclinação, forneça nós adicionais.
  3. Especifique o hardware dos nós de computação com GPU. Cada nó deve incluir: (a) 4 GPUs NVIDIA com suporte a CUDA (mínimo de 24 GB de memória de vídeo por GPU para refinamentos 3D no CryoSPARC e RELION); (b) uma CPU com alto número de núcleos (AMD EPYC ou Intel Xeon, ≥32 núcleos) para suportar etapas paralelas dependentes da CPU (estimativa de CTF, entrada/saída de arquivos); (c) ≥256 GB de memória RAM do sistema; (d) espaço local de armazenamento temporário NVMe SSD de 2–4 TB para dados intermediários de trabalhos ativos; (e) uma placa de interface de rede de 10/25 Gbps (NIC); (f) armazenamento local suficiente para conjuntos de dados em uso (tipicamente um volume RAID). OBSERVAÇÃO: GPUs voltadas ao consumidor (RTX 4090) podem oferecer desempenho comparável ao de alternativas voltadas para empresas (A100) a um custo significativamente menor para cargas de trabalho de criomicroscopia eletrônica (crio-EM). Avalie benchmarks específicos para CryoSPARC e RELION, já que seus padrões de acesso à memória favorecem GPUs com alta largura de banda de memória.
  4. Instale a pilha de drivers da NVIDIA, o kit de ferramentas CUDA (versão compatível com CryoSPARC e RELION) e o cuDNN em cada nó de computação. Utilize uma ferramenta de gerenciamento de configuração para padronizar ambientes de software em todos os nós e simplificar atualizações futuras.
  5. Implante o CryoSPARC em uma configuração autônoma ou em cluster. Para uma instalação com múltiplos nós, instale o CryoSPARC-master em um nó principal dedicado e o CryoSPARC-worker em cada nó de computação com GPU.
  6. Configure o agendamento de tarefas para permitir que múltiplos usuários submetam trabalhos de processamento simultaneamente. Siga a documentação oficial de arquitetura do CryoSPARC para requisitos mínimos de sistema e configuração de rede.
  7. Instale o RELION ao lado da plataforma principal de processamento para fornecer aos usuários ambos os ecossistemas de processamento. Configure o software para utilizar os nós de computação locais por meio de um agendador (SLURM ou PBS/Torque).
  8. Instale ferramentas complementares: MotionCor2 (correção de movimento), CTFFIND4 e Gctf (estimativa de CTF), TOPAZ (seleção de partículas baseada em aprendizado de máquina), crYOLO (selecionador de partículas baseado em rede neural) e cryoDRGN (análise de heterogeneidade). Consulte Tabela 3 para obter uma visão geral dos pacotes de software disponíveis para SPA, crio-ET, STA e microED. 
  9. Utilize a implantação do consórcio SBGrid ou gerenciamento de software baseado em contêineres (Singularity/Apptainer para ambientes HPC; Docker para estações de trabalho) para manter ambientes de software reprodutíveis e com controle de versão.
    OBSERVAÇÃO: O SBGrid fornece versões pré-compiladas e validadas de todas as principais ferramentas de software de criomicroscopia eletrônica com gerenciamento automatizado de atualizações para instituições acadêmicas.

6. Infraestrutura de acesso remoto

  1. Estabeleça o acesso remoto baseado em VPN como o principal ponto de entrada seguro para todos os usuários e funcionários fora do local. Trabalhe com a equipe de TI institucional para provisionar um perfil ou túnel de VPN específico para a instalação, que permita o acesso à rede de computação e armazenamento da instalação sem expor os dispositivos à internet pública mais ampla.
  2. Implemente autenticação multifator (2FA) em todos os pontos de acesso remoto (Figura 2).
  3. Implante um software de área de trabalho remota para acesso gráfico aos controladores de microscópio e estações de trabalho com GPU. Opções recomendadas: (a) TeamViewer (comercial, multiplataforma, ultrapassa NAT — adequado para acesso ao controlador do microscópio); (b) NoMachine (comercial, multiplataforma, suporta encaminhamento de gráficos 3D OpenGL — recomendado para estações de trabalho com GPU que executam ferramentas de visualização); (c) TurboVNC com VirtualGL (código aberto, apenas Linux, suporta renderização 3D remota).
    NOTA: Muitas ferramentas de visualização de criomicroscopia eletrônica utilizam OpenGL para renderização 3D. O encaminhamento X11 padrão não suporta OpenGL com aceleração por hardware. Utilize NoMachine ou VirtualGL/TurboVNC para essas aplicações.
  4. Configure o acesso remoto ao software de aquisição de dados do microscópio. Utilize Leginon ou SerialEM para operação remota por meio da VPN institucional. O software de aquisição do microscópio pode ser acessado remotamente por meio de um aplicativo de área de trabalho remota aprovado.
  5. Teste a conectividade remota a partir de locais externos representativos (redes domésticas, instituições colaboradoras) antes de iniciar as operações com usuários (Tabela 4).
  6. Configure um painel de monitoramento da instalação baseado na web para permitir que funcionários e usuários monitorem remotamente o status da coleta de dados, saídas de pré-processamento, utilização de armazenamento e status da fila de processamento. O Leginon inclui uma interface de monitoramento web integrada.
  7. Para o fluxo de trabalho do CryoSPARC, configure o Grafana ou um painel web personalizado alimentado por saídas de logs do pipeline e ferramentas de monitoramento do sistema (Prometheus, node_exporter).
  8. Estabeleça um mecanismo de entrega de dados para usuários externos. Configure um serviço autenticado de transferência de dados, como o Globus Connect Server, no armazenamento da instalação.
  9. Para usuários sem acesso ao Globus, prepare procedimentos para envio de discos rígidos USB com somas de verificação documentadas. Uma conexão de subida de internet de 10 Gbps é necessária para tornar viável o download direto de conjuntos de dados de vários TB por usuários externos.

7. Fluxo de trabalho de processamento de dados em tempo real: implementação

  1. Pré-configure o caminho do fluxo de dados antes de cada sessão de coleta de dados. Confirme que: (a) o controlador da câmera grava filmes brutos diretamente no armazenamento de alto desempenho montado via NFS da instalação; (b) o compartilhamento NFS está montado e acessível em todos os nós de computação com GPU; (c) existe capacidade de armazenamento livre suficiente para a sessão planejada (mínimo de 5 TB livres para uma sessão de SPA de 24 h); (d) os nós de computação com GPU estão disponíveis e não há tarefas de longa duração que disputarão recursos.
  2. Configure uma correção de referência de ganho. Antes de cada sessão, adquira uma imagem de referência de ganho conforme especificado pelo fabricante do detector (normalmente uma exposição ao feixe vazio em uma área vazia da grade).
  3. Coloque o arquivo de referência de ganho no diretório de entrada designado para pré-processamento. Todos os softwares de correção de movimento (MotionCor2, implementação própria do RELION) aplicarão essa referência automaticamente se configurados corretamente.
  4. Inicie o pipeline de pré-processamento em tempo real usando o CryoSPARC-Live (preferido para visualização em tempo real). O pipeline deve ser iniciado assim que os primeiros filmes aparecerem no diretório de saída — normalmente dentro dos primeiros 5–10 minutos da coleta automatizada de dados.
    NOTA: O CryoSPARC-Live continua monitorando um diretório designado em busca de novos arquivos de filme e os processa conforme chegam. A principal diferença é que o CryoSPARC-Live fornece uma interface web interativa em tempo real para monitoramento.
  5. Fluxo de trabalho do CryoSPARC-Live
    1. No interface web, navegue até um projeto novo ou existente e crie uma nova sessão ao vivo11,36.
    2. Configure a fonte de entrada: especifique o caminho do diretório para o qual o controlador da câmera está gravando (a 'pasta de monitoramento'), o padrão de nome de arquivo que corresponde aos filmes brutos (por exemplo, *.tif, *.mrc ou *.eer para dados no formato EER do Falcon 4i) e o caminho do arquivo de referência de ganho.
    3. Defina os parâmetros de correção de movimento: número de quadros a serem usados, correção de movimento baseada em blocos (recomendado: blocos 5x5), fator de binning de saída (normalmente 1 para coleta de dados próxima ao limite de Nyquist; 2 para triagem inicial) e dose de elétrons por quadro (calculada a partir da dose total e do número de quadros).
    4. Defina os parâmetros de estimativa da CTF: resolução mínima e máxima para ajuste (normalmente 30 Å e 4 Å), intervalo de busca de defoco (recomendado 0,5–5 µm para SPA) e astigmatismo máximo aceitável. Habilite a estimativa de CTF por inclinação para conjuntos de dados de criotomografia eletrônica (cryo-ET).
    5. Configure a seleção de partículas: selecione o método de seleção (selecionador por bolhas para sessões iniciais; selecionador por modelo após a disponibilidade das primeiras boas classes 2D; selecionador TOPAZ para amostras difíceis). Defina o diâmetro esperado das partículas e o espaçamento mínimo/máximo entre partículas.
    6. Para reduzir substancialmente os requisitos de armazenamento, a carga de transferência de dados e o custo computacional, recomenda-se o corte em Fourier durante a extração de partículas por um fator de 4 (resultando em um tamanho de pixel físico 4 vezes maior). Para avaliação rotineira da qualidade dos dados, resoluções intermediárias de 3–5 Å são tipicamente suficientes durante o processamento em tempo real.
    7. Habilite a classificação 2D dentro da sessão ao vivo. Defina o número de classes 2D (normalmente 50–200), o tamanho do lote para atualizações incrementais (200–500 partículas) e o limite de resolução para classificação (6–8 Å para avaliação inicial).
    8. Inicie a sessão ao vivo. Monitore o painel em tempo real quanto ao: número e taxa de filmes recebidos, qualidade da correção de movimento (movimento total por filme — rejeite filmes com movimento total >30 Å como regra prática), qualidade do ajuste da CTF (rejeite micrografias com resolução de ajuste da CTF >6–8 Å), rendimento de partículas por micrografia e qualidade evolutiva das médias das classes 2D.
    9. Defina limiares de aceitação para curadoria automatizada. No painel de Filtros, defina critérios de rejeição para movimento (limite de corte do movimento total), qualidade da CTF (limite de corte da resolução de ajuste) e intervalo de defoco (exclua micrografias com defoco extremamente alto ou baixo). Partículas curadas são automaticamente encaminhadas para a tarefa subsequente de classificação 2D.

8. Controle de qualidade em tempo real e feedback durante a coleta de dados

  1. Monitore continuamente as estatísticas da CTF durante toda a sessão. Plote os valores de desfoque para cada micrografia: a distribuição deve se concentrar dentro da faixa de desfoque desejada (tipicamente −0,5 a −3,0 µm para SPA).
  2. Um desvio sistemático para valores mais altos de desfoque pode indicar deriva da platina ou calibração incorreta da altura eucentrica. Comunique imediatamente à equipe do laboratório se a resolução do ajuste da CTF degradar abaixo de 6 Å, pois isso geralmente indica contaminação do gelo, instabilidade do feixe ou desvio de foco que exige intervenção.
  3. Monitore as saídas da correção de movimento. O movimento total dentro do quadro por filme deve ser inferior a 10–30 Å para dados de alta qualidade. É esperado movimento elevado sistemático nos quadros iniciais, que é corrigido; no entanto, movimento elevado persistente ao longo do filme (>40 Å total) pode indicar instabilidade mecânica da platina ou carregamento da amostra e deve ser investigado.
  4. Inspeccione as médias 2D à medida que forem atualizadas durante a sessão (a cada 30–60 min). Indicadores de um conjunto de dados de alta qualidade: médias de classes mostrando características de estrutura secundária, múltiplas vistas distintas da partícula e ausência de artefatos de empilhamento ou agregação.
  5. Monitore indicadores que exijam intervenção: todas as partículas classificadas em classes sem características definidas ('lixo'), indicando amostra ou qualidade do gelo insuficientes; ausência completa de certas vistas (sugerindo orientação preferencial — o que pode exigir otimização da grade); ou baixíssimo rendimento de partículas por micrografia.
  6. Registre todas as observações em um log estruturado da sessão. Registre: horários de início e fim da sessão, configurações do microscópio e da câmera, resumo das estatísticas em tempo real (número total de filmes coletados, fração que passou pelo filtro de CTF, fração que passou pelo filtro de movimento, número total de partículas selecionadas, avaliação das classes 2D) e quaisquer intervenções realizadas. Esse log é essencial para avaliação retrospectiva da qualidade e para relatórios de desempenho do laboratório.
  7. No término da sessão, gere um relatório resumido da qualidade dos dados. A plataforma de processamento em tempo real exporta automaticamente um resumo da sessão.
    OBSERVAÇÃO: Outra opção para gerar resumos e relatórios é utilizar ferramentas de IA, como o Vitreum. Na UCSC Biomolecular Cryo-EM Facility, a plataforma Vitreum é usada para gerenciar fluxos de trabalho laboratoriais e documentação experimental. O Vitreum registra os passos experimentais conforme ocorrem, aplica restrições em nível de protocolo, verifica a execução do fluxo de trabalho contra critérios pré-definidos de qualidade e fornece um registro auditável das atividades laboratoriais. Ao integrar as operações laboratoriais com a infraestrutura computacional e de gerenciamento de dados do laboratório, a plataforma minimiza o registro manual, melhora a reprodutibilidade, facilita a comunicação entre a equipe e os usuários e permite o rastreamento consistente dos experimentos, desde a preparação da amostra até a coleta de dados e a análise computacional subsequente.

9. Pipeline de processamento de dados pós-coleta

  1. Após a conclusão do pré-processamento em tempo real, exporte a pilha de partículas agrupadas curada juntamente com os filmes pré-processados curados.
  2. Desconecte o projeto CryoSPARC da estação de trabalho principal e, em seguida, reconecte-o a outra estação de trabalho compartilhada e acessível remotamente. Isso permite uma rápida transferência e liberação para iniciar a próxima sessão de aquisição de dados.
    NOTA: Uma coleta típica de dados pode variar entre 1 e 2 dias, facilmente monitorada pelo CryoSPARC-Live. No entanto, as etapas de processamento 3D podem levar semanas ou meses, justificando assim a transferência do projeto entre estações de trabalho e servidores de armazenamento.
  3. No CryoSPARC, exporte as partículas agrupadas curadas da sessão em tempo real para um projeto padrão destinado ao processamento 3D offline36. 
  4. Realize a reconstrução 3D ab initio. No CryoSPARC, utilize a tarefa de Reconstrução Ab Initio (recomendam-se 3–5 modelos iniciais para amostras heterogêneas). Gere 1–4 modelos iniciais para avaliar a heterogeneidade estrutural.
  5. Uma vez que os valores reconstruídos forem satisfatórios, extraia novamente as partículas não agrupadas para melhorar a resolução global.
  6. Realize o refinamento 3D utilizando refinamento heterogêneo (se forem suspeitas múltiplas conformações ou classes), seguido por refinamento homogêneo para a melhor classe. No CryoSPARC, utilize refinamento heterogêneo seguido por refinamento não uniforme. 
  7. Aplique o polimento bayesiano no RELION13 ou utilize a correção de movimento por partícula e o refinamento da CTF (tarefa de refinamento da CTF no CryoSPARC) para melhorar o sinal por partícula, considerando o movimento induzido pelo feixe e o desfoque por partícula, conforme preferência do usuário. Esta etapa normalmente melhora a resolução final do mapa em 0,2–0,5 Å. Adicionalmente, a correção de movimento baseada em referência (RBMC) no CryoSPARC também pode ser uma opção para melhorar a resolução e a qualidade do mapa.
  8. Valide o mapa final utilizando o procedimento de correlação de casca de Fourier (FSC) padrão-ouro. Divida a pilha de partículas em dois subconjuntos independentes, refine-os separadamente e calcule o FSC entre os dois mapas parciais. Informe a resolução final no valor FSC = 0,143.
  9. Calcule o FSC entre mapa e modelo (FSC-Q) e as pontuações Q após o ajuste do modelo atômico como métricas independentes de validação37.
  10. Realize a construção e validação do modelo atômico. Utilize o ModelAngelo para a construção automatizada de modelos de novo a partir do mapa de densidade20. Refine o modelo utilizando o refinamento no espaço real do PHENIX e valide com o MolProbity.
  11. Utilize o COOT35 após a geração do modelo inicial para visualizar o mapa de densidade, ajustar ou corrigir coordenadas atômicas, corrigir erros de modelagem, construir regiões ausentes e otimizar estruturas de proteínas, ácidos nucleicos ou ligantes. Ele permite a edição interativa de resíduos, conformações de cadeias laterais, estruturas secundárias e atribuições de sequência, seguida por refinamento no espaço real para melhorar a concordância entre o modelo atômico e a densidade experimental.
  12. Finalmente, deposite o modelo atômico final no Protein Data Bank (PDB), o mapa de densidade no Electron Microscopy Data Bank (EMDB) e os dados brutos ou pré-processados no Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR).

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Resultados

A successfully implemented facility IT infrastructure and on-the-fly data processing pipeline will produce the following verifiable outcomes at each stage:

Network and storage
Internal data transfer between the camera controller and storage server should sustain ≥800 MB/s (approaching theoretical 10 Gbps throughput) when measured with tools such as iperf3 or fio. This throughput is sufficient to transfer a 10–12 GB movie stack from the detector in under 15 seconds, ensurin...

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Discussão

A infraestrutura de TI de uma instalação de microscopia crioeletrônica não é um detalhe secundário de apoio — é um pré-requisito operacional. Instalações que iniciam a coleta de dados sem capacidade adequada de armazenamento, rede e processamento enfrentam inevitavelmente a escolha entre descartar dados brutos, interromper a coleta de dados ou aceitar atrasos de meses na determinação de estruturas. Os protocolos descritos aqui foram projetados para evitar esses resultados, garantindo que a base computacional seja projeta...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesses.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Instalação de Microscopia Eletrônica Criogênica Biomolecular do Departamento de Química e Bioquímica da Universidade da Califórnia–Santa Cruz (RRID: SCR_021755) pelo apoio científico e técnico (programa NIH High-End Instrumentation, S10OD02509).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Krios 5ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/br/pt/home/microscopia-eletronica/produtos/microscopios-eletronicos-de-transmissao/krios-5-cryo-tem.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
Krios G4ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/br/pt/home/microscopia-eletrônica/produtos/microscópios-eletrônicos-de-transmissão/krios-g4-cryo-tem.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
GláciosThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/br/pt/home/microscopia-eletronica/produtos/microscopios-eletronicos-de-transmissao/glacios-cryo-tem.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
Glacios 2ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/br/pt/home/microscopia-eletronica/produtos/microscopios-eletronicos-de-transmissao/glacios-2-cryo-tem.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
Glacios 3ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/ (nova geração; a página do produto pode variar conforme a região)Microscópio Eletrônico de Transmissão
Talos ArcticaThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/br/pt/home/microscopia-eletronica/produtos/microscopios-eletronicos-de-transmissao/talos-arctica.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
Talos L120CThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/talos-l120c.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
CRYO ARM 300 II (JEM-Z300FSC)JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm300ii.phpMicroscópio Eletrônico de Transmissão
CRYO ARM 200JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm200.phpMicroscópio Eletrônico de Transmissão
JEM-3200FSCJEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/jem3200fsc.phpMicroscópio Eletrônico de Transmissão
HF8300Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/hf8300.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
HT7800Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/ht7800.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
SU9000 (MET/MEV)Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/sem-tem/su9000.htmlMicroscópio Eletrônico de Transmissão
Falcon 4iThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/br/pt/casa/microscopia-eletronica/produtos/detectores-diretos-de-eletrons/falcon-4i.htmlDetector Direto de Elétrons
Gatan K3Gatan (AMETEK)https://gatan.com/products/tem-cameras/k3-is-cameraDetector Direto de Elétrons
Gatan K2Gatanhttps://gatan.com/products/tem-cameras/k2-cameraDetector Direto de Elétrons
ApolloElétron Diretohttps://directelectron.com/apollo/Detector Direto de Elétrons
DE64Elétron Diretohttps://directelectron.com/de-64/Detector Direto de Elétrons
RELIONLaboratório de Biologia Molecular do MRC (MRC-LMB), Universidade de Cambridgehttps://relion.readthedocs.iopacote de software SPA
cryoSPARCStructura Biotecnologiahttps://cryosparc.compacote de software SPA
EMAN2Baylor College of Medicine (Desenvolvido pelo Laboratório de Steven Ludtke)https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2pacote de software SPA
cisTEMConselho Nacional de Pesquisas do Canadá (Desenvolvido por Tim Grant e colegas)https://cistem.orgpacote de software SPA
SPHIREInstituto Max Planck de Fisiologia Molecular e Faculdade de Medicina Baylorhttps://sphire.mpg.depacote de software SPA
cryoDRGNUniversidade de Princeton (Desenvolvido pelo Laboratório de Ellen Zhong)https://cryodrgn.cs.princeton.edupacote de software SPA
TopazHarvard Medical School (Desenvolvido pelo Laboratório Travis Bepler)https://github.com/tbepler/topazpacote de software SPA
crYOLOInstituto Max Planck de Biofísicahttps://cryolo.readthedocs.iopacote de software SPA
DeformaçãoLaboratório de Biologia Molecular do MRC (Desenvolvido por Dmitry Tegunov)http://www.warpem.compacote de software de criotomografia eletrônica e análise de subtomogramas
ModelAngeloLaboratório de Biologia Molecular do MRChttps://www.modelangelo.orgpacote de software de criotomografia eletrônica e análise por subtomogramas médios
IMODUniversidade do Colorado em Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/imodpacote de software de crioeletrotomografia e análise de médias estruturais (STA)
DynamoCentro Nacional de Biotecnologiaía (CNB-CSIC)https://www.dynamo-em.orgpacote de software de criotomografia eletrônica e análise de subtomogramas
emClarityUniversidade da Califórnia, São Franciscohttps://github.com/StochasticAnalytics/emClaritycryo-ET e pacote de software de STA
RELION (módulo ET)Laboratório de Biologia Molecular do MRC (MRC-LMB), Universidade de Cambridgehttps://relion.readthedocs.iocryo-ET e pacote de software de STA
EMAN2 (SPT)Baylor College of Medicinehttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2pacote de software de criotomografia eletrônica e análise por subtomografia média
Warp/MLaboratório de Biologia Molecular do MRChttps://warpem.github.iocryo-ET e pacote de software de STA
AreTomoUniversidade de Stanford (Desenvolvido pelos grupos de Fei Sun e Wah Chiu)https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo2cryo-ET e pacote de software de STA
PEETUniversidade do Colorado Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/PEETpacote de software de criotomografia eletrônica e análise de subtomogramas
PyTomInstituto Max Planck de Bioquímicahttps://pytom.orgcryo-ET e pacote de software de STA
Tomo3DCentro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3dcryo-ET e pacote de software de STA
crYOLO (3D)Instituto Max Planck de Biofísicahttps://cryolo.readthedocs.iocryo-ET e pacote de software STA
AITomUniversidade Carnegie Mellonhttps://github.com/xulabs/aitomcryo-ET e pacote de software de STA
DIALSDiamond Light Source e colaboradoreshttps://dials.github.iopacote de software microED
XDSInstituto Max Planck de Pesquisa Médica (Desenvolvido por Wolfgang Kabsch)https://xds.mr.mpg.depacote de software microED
MOSFLMLaboratório de Biologia Molecular do MRC (MRC-LMB), Universidade de Cambridgehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/mosflmpacote de software microED
SHELXUniversidade de Göttingen (Desenvolvido por George M. Sheldrick)https://shelx.uni-goettingen.depacote de software microED
PhenixLaboratório Nacional Lawrence Berkeley (Consortium PHENIX)https://phenix-online.orgpacote de software microED
CootLaboratório de Biologia Molecular do MRC (MRC-LMB), Universidade de Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/cootpacote de software microED
Linux (Ubuntu, CentOS/Rocky)Ubuntu: Canonical Ltd.; CentOS: Projeto CentOS; Rocky Linux: Rocky Enterprise Software Foundation (RESF)https://ubuntu.com / https://www.centos.org (legado) /  https://rockylinux.orgSistema Operacional
WindowsMicrosofthttps://www.microsoft.com/windowsSistema Operacional
ZFSOracle Corporation (originalmente Sun Microsystems); OpenZFS mantido pela comunidade OpenZFShttps://openzfs.orgSistema de arquivos
NFSSun Microsystems (atualmente mantido como um padrão da IETF)https://www.rfc-editor.org/rfc/rfc8881Protocolo
SMB (CIFS)Microsofthttps://learn.microsoft.com/windows-server/storage/file-server/file-server-smb-overviewProtocolo
Microsoft Remote Desktop (RDP)Microsofthttps://learn.microsoft.com/windows-server/remote/remote-desktop-servicesAcesso Remoto
NoMachineNoMachinehttps://www.nomachine.comAcesso Remoto
TeamViewerTeamViewer SEhttps://www.teamviewer.comAcesso Remoto
VirtualGL + TurboVNCVirtualGL: O Projeto VirtualGL; TurboVNC: O Projeto TurboVNChttps://virtualgl.org e https://turbovnc.orgAcesso Remoto
CUDANVIDIAhttps://developer.nvidia.com/cuda-toolkitEstrutura Computacional

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