Artigo de método

Fluxo de Trabalho Padronizado para Imagem de Alto Conteúdo e Processamento de Dados

DOI:

10.3791/71863

⸱

21 de agosto de 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem de alto conteúdo padronizada e processamento de dados de células coradas com iodeto de propídio (PI)/Hoechst 33342 para realizar análises reprodutíveis de viabilidade celular utilizando fluxos de trabalho automatizados de aquisição e análise de imagens.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para enfrentar os desafios da baixa reprodutibilidade decorrentes de variações operacionais em imagens na pesquisa científica e da complexidade na análise de um grande número de amostras por métodos convencionais, apresentamos um protocolo para coloração de células HT22 com PI e Hoechst 33342, seguido de aquisição de imagens e análise dos dados utilizando o Sistema de Imagem de Alto Conteúdo. Este fluxo de trabalho tem como objetivo estabelecer parâmetros robustos de configuração de imagem e padrões rigorosos de controle de qualidade. Ele demonstra as configurações de imagem do equipamento e o fluxo de trabalho para três métodos diferentes de processamento de imagem fornecidos pelo instrumento: Pontuação Celular Multicomprimento de Onda (Multi), Vivas-Mortas (Live) e Editor de Módulo Personalizado (CME). Os métodos de processamento de imagem são comparados e validados frente ao método tradicional, ImageJ, para garantir sua eficácia. O estudo conclui com um resumo do fluxo de trabalho para utilização do Sistema de Imagem de Alto Conteúdo na determinação da viabilidade celular pelo método de dupla coloração com PI e Hoechst. Ao padronizar todo o fluxo de trabalho de aquisição de imagens e processamento de dados, o estudo aumenta significativamente a reprodutibilidade e a confiabilidade das imagens em pesquisa científica, fornecendo assim suporte metodológico sólido para comparação de dados entre laboratórios e avançando a pesquisa científica.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O Sistema de Imagem de Alto Conteúdo atua como uma ferramenta essencial na pesquisa científica moderna, permitindo a aquisição de imagens em alta velocidade e a avaliação multiparamétrica de células lesadas ou não lesadas1,2,3. Desempenha um papel insubstituível em diversas áreas do conhecimento. No campo das ciências da vida, auxilia os pesquisadores na exploração do mundo microscópico de células e tecidos4,5. Por exemplo, a detecção precisa de moléculas e estruturas marcadas com fluorescência dentro das células permite a visualização clara de estruturas celulares finas e mudanças dinâmicas6. Na pesquisa em neurociência, é capaz de realizar imagens tridimensionais de neurônios, auxiliando na análise das conexões complexas e dos mecanismos de transdução de sinais das redes neuronais, fornecendo pistas fundamentais para a compreensão das funções cerebrais e da patogênese de doenças neurológicas7,8,9.

Apesar das vantagens significativas da tecnologia de sistemas de imagem de alto conteúdo, vários problemas permanecem em seu processo de aquisição de imagens. Na etapa de preparação da amostra, há um alto grau de subjetividade. Na preparação de amostras biológicas, processos como o manuseio celular e a coloração carecem de padrões relevantes. Em termos de parâmetros de imagem, existem diferenças notáveis nos tempos de exposição e na seleção de placas de poços entre laboratórios e modelos de microscópios de alto conteúdo. Na fase de processamento de dados, há uma falta de padronização, desde a redução de ruído e o ajuste de contraste das imagens brutas até a identificação de parâmetros e a determinação de características-alvo. Esses problemas levam diretamente a vieses nos resultados de imagem microscópica, causando uma crise de reprodutibilidade.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza uma linhagem celular comercial (HT22, ATCC) e não envolve seres humanos ou tecidos humanos primários. Nenhum animal foi utilizado neste estudo.

1. Preparação padronizada de amostras

  1. Preparar células HT22
    1. Quando a confluência das células HT22 atingir 80%10,11, descarte o meio antigo. Utilize tripsina a 0,25% para destacar as células, incubando por 1–2 min à temperatura ambiente.
    2. Adicione o Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) em volume três vezes maior que o da tripsina a 0,25% para interromper o destacamento. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
    3. Centrifugue a 175 x g durante 3 min à temperatura ambiente, depois descarte o sobrenadante. Re-suspenda as células em DMEM completo para criar uma suspensão de células individuais.
    4. Conte as células utilizando uma câmara de contagem. Plaque 5.000 células por poço em 100 µL de meio completo em uma placa de 96 poços12.
    5. Incube a placa a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h. Realize o agrupamento das amostras, administração de tratamentos e coloração na placa de 96 poços conforme o delineamento experimental.
      ​NOTA: Utilize uma placa de 96 poços compatível com o sistema de imagem. Escolha uma placa com espessura e geometria de fundo adequadas, conforme as especificações do fabricante. Placas com fundo de vidro (espessura do fundo entre 130–170 µm) são recomendadas quando for necessária maior qualidade de imagem13,14,15,16.
  2. Procedimento de coloração
    1. Assegure-se de que as células formem uma monocamada única e bem dispersa, sem exceder 70% de confluência, para minimizar a sobreposição celular (Figura 1B).
    2. Agrupe as amostras conforme os requisitos experimentais e prossiga com a coloração após o tratamento. Prepare as soluções de corante em trabalho com concentração final de 6,684 µg/mL para PI e 10 µg/mL para Hoechst 3334217,18.
    3. Descarte o meio antigo da placa de 96 poços e lave cada poço duas vezes com 100 µL de PBS. Adicione a solução de corante em trabalho e incube à temperatura ambiente, no escuro, por 30 min para coloração.
    4. Lave cada poço duas vezes com 100 µL de PBS, depois adicione DMEM.
      NOTA: Diferentes delineamentos experimentais podem apresentar variações nos parâmetros de carregamento e coloração das amostras.

2. Especificações de imagem e configurações de parâmetros

  1. Padrões de parâmetros de imagem
    ​NOTA: Este estudo demonstra apenas o fluxo de trabalho de imagem em campo amplo para o instrumento após coloração com PI e Hoechst 33342.
    1. Ligue o instrumento e, em seguida, inicie o computador. Abra o software de análise fornecido com o dispositivo.
    2. Carregue a placa de 96 poços no instrumento. Selecione o campo de visão com as amostras para aquisição de imagem.
    3. Nas configurações de Objetiva e Câmera, defina a Ampliação para "20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), binning da câmera para "2" e Modo de Aquisição para "Widefield".
    4. No modo de placa, selecione os parâmetros correspondentes da placa de 96 poços e ajuste os parâmetros da placa de acordo com os dados de tamanho do produto.
    5. Na Opção de Sítio, selecione normalmente 9 campos por poço para imagem densa. Nas opções de Autofoco, selecione Habilitar focagem baseada em laser.
    6. Ajuste os parâmetros de autofoco a laser em Autofoco, com base na espessura média do fundo da placa medida em pelo menos três poços amostrais. Ajuste a espessura do fundo, variação máxima da espessura do fundo, variação máxima entre poços adjacentes, variação máxima intra-poco e variação máxima da placa conforme necessário.
    7. Em Comprimentos de Onda, defina o Número de comprimentos de onda para 3. Para a primeira Iluminação, selecione DAPI. Em Correção de Sombreamento, escolha "Correção Automática para FL" (Figura 2B).
    8. Após encontrar a imagem, defina a Exposição inicial (ms) para 20–30. Observe as imagens capturadas e ajuste continuamente a exposição para obter uma intensidade de fluorescência moderada sem superexposição, e defina a profundidade de bits para 16 (Figura 2A).
    9. Escolha Laser com deslocamento z para ajuste de foco. Se o foco não estiver nítido, marque Usar pilha Z, clique em Calcular Deslocamento e selecione uma distância focal apropriada. Marque Confocal Digital (info) e defina os parâmetros de ajuste para Aumentar Nitidez e Reduzir Ruído para 0,200.
      NOTA: Se a exposição ou clareza da imagem não for satisfatória, ajuste a exposição e recalcule os parâmetros de deslocamento.
    10. Para a segunda Iluminação, selecione Cy3. Siga as mesmas configurações dos passos 2.1.7–2.1.9.
    11. Para a terceira Iluminação, selecione TL 25. Siga as mesmas configurações dos passos 2.1.7–2.1.9.
      NOTA: Defina a correção de sombreamento com base no canal, e o canal TL 25 deve escolher Correção Automática para TL. Em Comprimentos de Onda, o canal TL deve ser configurado para posicionamento celular e observação morfológica.
    12. Na aba Executar, nomeie a placa de acordo com a convenção de nomenclatura: nome da placa-tipo celular-ID do experimento-data-ampliação da objetiva-tipo de imagem. Confirme os parâmetros relacionados ao canal de imagem em Descrição.
    13. Clique em Adquirir Placa para iniciar a aquisição de imagem. Após a conclusão da aquisição, desligue o software, o instrumento e o computador em sequência.
      ​NOTA: Posteriormente, o computador poderá ser ligado apenas para exportação de imagens, processamento de dados e análise de resultados.
  2. Padrões e requisitos de operação de imagem
    1. Centralize o campo de visão no poço para evitar efeitos de borda (Figura 1A). Durante a configuração dos parâmetros de imagem, use o controle positivo com maior intensidade de fluorescência como referência. Além disso, ao focar, escolha um campo de visão com uma única camada de células, limpo e livre de detritos.
    2. Para a câmera, controle rigorosamente os valores dos pixels abaixo de 60000 (o valor máximo é 65535) para evitar saturação, que pode causar perda permanente de informação. Se surgirem pontos ou áreas brilhantes saturados, reduza a exposição. Ao mesmo tempo, não mantenha o tempo de exposição muito baixo; caso contrário, o ruído dominará a imagem.
    3. Para sinais de fluorescência fracos, priorize um leve aumento da exposição em vez de elevar forçadamente os parâmetros, para evitar danos irreversíveis causados por fotodesvanecimento.
      NOTA: Para imagens em campo claro, esses princípios podem ser apropriadamente relaxados, mas o foco principal permanece na integridade do sinal e na proteção da amostra.
    4. Garanta que os contornos das bordas da amostra sejam claramente distinguíveis e certifique-se de que as estruturas internas finas (como grânulos, fibras, organelas) apresentem texturas distintas, sem desfoque, e que a luz dispersa de fundo esteja uniformemente distribuída, sem pontos brilhantes locais ou halos desfocados. Evite rigorosamente super e subfocalização.
    5. Garanta a presença de grupos normais, positivos, negativos e experimentais, e que cada grupo de tratamento tenha pelo menos 3 poços paralelos. Recomenda-se organizar os poços paralelos verticalmente.

3. Processamento e análise de imagens

OBSERVAÇÃO: Este documento descreve três métodos de processamento de imagem fornecidos pelo software complementar do instrumento, todos adequados para o protocolo de coloração utilizado neste estudo. Embora esses métodos compartilhem o mesmo princípio subjacente de reconhecimento, diferem nas técnicas específicas de processamento e nos tipos de resultados de dados. O fluxo de trabalho de processamento de imagem foi o mesmo: Abrir o arquivo → Carregar a imagem original com o método de processamento correspondente → Definir os parâmetros adequados do canal → Gerar uma Máscara → Definir o tipo de dado de medição em Medir → Executar a análise → Observar os resultados → Exportar os dados.

  1. Abra o software de análise fornecido com o dispositivo → Revisar Placa → Selecionar Placa.
  2. Na visualização de data, selecione Arranjo de poços e escolha um campo de visão do grupo positivo como referência.
  3. Em Executar Análise, selecione o programa de processamento correspondente e defina os parâmetros de processamento de imagem ou exporte a imagem.
  4. Após definir e salvar os parâmetros, selecione Executar em todos os poços/Executar nas seleções/Executar no local exibido com base no objeto de configuração de parâmetros.
  5. Após o computador concluir o processamento dos dados, na aba Medidas, selecione o programa de processamento de dados correspondente em Análise e escolha diferentes resultados de medição em Medida para verificar os dados.
  6. Clique em Abrir Log para iniciar a exportação dos dados. Defina os seguintes detalhes nas configurações de parâmetros para os três métodos de processamento de imagem:
    1. Método de processamento de imagem um: Pontuação Celular Multicomprimento de Onda
      1. Selecione o programa Pontuação Celular Multicomprimento de Onda e configure as configurações. Defina o Número de comprimentos de onda. Escolha Padrão para o Algoritmo.
      2. Defina os parâmetros de reconhecimento para todos os núcleos com base nos resultados da coloração com PI. A imagem fonte padrão W1 é o canal DAPI.
      3. Defina a largura mínima aproximada para 8–10 µm e a largura máxima aproximada para 30–35 µm, com base no tamanho dos objetos individuais a serem reconhecidos.
      4. Defina a intensidade acima do fundo local para 2.000–10.000 níveis de cinza. Use Visualização para testar e ajustar as configurações com base nos resultados de reconhecimento.
      5. Defina os parâmetros W2 com base nos resultados da coloração com Hoechst 33342. Nomeie este canal. A imagem fonte W2 é Cy3.
      6. No campo Área colorida, selecione a região colorida por este canal como Núcleo. Siga as mesmas configurações dos passos 3.6.1.3–3.6.1.4 para as configurações subsequentes. Em Configurar Log de Resumo ou Configurar Log de Dados (Células), selecione a Configuração de Parâmetros correspondente com base nos parâmetros de resultado desejados.
        NOTA: Normalmente, Configurar Log de Resumo é usado para definir os tipos de dados necessários, enquanto Configurar Log de Dados (Células) é usado quando for necessário marcar células individuais de forma específica.
      7. Realize uma Execução de Teste para observar o reconhecimento. Se os resultados de reconhecimento forem satisfatórios, salve as configurações.
    2. Método de processamento de imagem dois: Viva-Morta
      1. Selecione o programa Viva-Morta e comece a configurar as configurações. Defina sequencialmente os Parâmetros do Comprimento de Onda 1 e os Parâmetros do Comprimento de Onda 2.
      2. Em Parâmetros do Comprimento de Onda 1, defina a Fonte do Comprimento de Onda 1 como DAPI. O Algoritmo padrão é "Padrão".
      3. Defina o tipo de célula colorida como Todas as Células e a área colorida como Núcleo com base nas condições de coloração. Defina largura mínima aproximada, largura máxima aproximada e intensidade acima do fundo local usando as mesmas configurações do método Pontuação Celular Multicomprimento de Onda.
      4. Marque Dividir objetos que se tocam e use Visualização para testar.
      5. Em Parâmetros do Comprimento de Onda 2, defina a Fonte do Comprimento de Onda 2 como Cy3.
      6. Defina o tipo de célula colorida como Morta e a área colorida como Núcleo com base na coloração específica. Defina largura mínima aproximada, largura máxima aproximada e intensidade acima do fundo local usando as mesmas configurações do método Pontuação Celular Multicomprimento de Onda.
      7. Clique em Configurar Log de Resumo e selecione a Configuração de Parâmetros com base nos tipos de dados necessários. Realize uma Execução de Teste para observar o reconhecimento. Se os resultados de reconhecimento forem satisfatórios, salve as configurações.
    3. Método de processamento de imagem três: modo desenvolvedor CME
      1. Selecione o programa Módulo Personalizado (CME) e comece a configurar as configurações. Configure Nomes de Imagem e canais.
        NOTA: Para facilitar as configurações de parâmetros subsequentes, defina-os geralmente como os nomes dos canais usados durante a aquisição de imagens.
      2. Em Encontrar Objetos, abra Limiar Simples para definir o reconhecimento para todo o conjunto.
      3. Defina Fonte para corresponder ao Nome da Imagem. Com base na faixa de valores de escala de cinza de 16 bits, preencha 0 em Limiar Baixo e 65535 em Limiar Alto.
      4. Nomeie o resultado do processamento em Resultado, aplique e observe a situação de marcação. Em Encontrar Objetos, abra Encontrar Aglomerados para gerar um resultado de Máscara.
      5. Defina Fonte para corresponder ao Nome da Imagem, como em Limiar Simples. Defina largura mínima aproximada, largura máxima aproximada e intensidade acima do fundo local conforme as configurações do método Pontuação Celular Multicomprimento de Onda.
      6. Nomeie o resultado do processamento em Resultado, aplique e observe o resultado de marcação. Para o resultado de reconhecimento Encontrar Aglomerados, use a ferramenta Modificar Objetos para filtrar, expandir, contrair e inverter.
      7. Em Medir, defina Modificado. Em Entradas de Medição, insira 1 para Valor de Área Padrão e marque Criar Sobreposição de Objetos.
      8. Em Objetos para Medir, selecione a fonte dos objetos marcados em Máscara de Objetos e a imagem fonte a ser medida em Imagem para Medir. Escolha o Nome de Medição correspondente com base nos parâmetros do resultado de processamento necessários, aplique e observe o resultado de reconhecimento de parâmetros.
      9. Após confirmar as configurações de parâmetros, salve a configuração.
    4. Método geral: ImageJ
      ​NOTA: Analise os resultados de imagem usando o método ImageJ para imagens fluorescentes19 e depois realize uma análise comparativa com os três métodos deste instrumento.
      1. Abra o software ImageJ. Importação de Imagem: Arquivo → Abrir → Selecione a imagem original em escala de cinza a ser analisada.
      2. Converta a imagem para 8 bits: Imagem → Tipo → 8 bits. Reconhecimento de Valor de Escala de Cinza: Imagem → Ajustar → Limiar → Padrão, Vermelho → Marque Fundo escuro → Definir → OK.
        NOTA: Se o reconhecimento da área vermelha for insatisfatório, substitua Padrão por um dos outros 16 modelos de reconhecimento embutidos no ImageJ ou ajuste o controle deslizante na caixa de diálogo.
      3. Defina Parâmetros: Analisar → Definir Medidas. Na caixa de diálogo pop-up, marque Área, Valor médio de cinza, Densidade integrada, Limitar ao limiar, Exibir rótulo, Redirecionar para Nenhum por padrão e insira 2 para Casas decimais (0-9). Clique em OK.
      4. Analise os Resultados de Reconhecimento: Analisar → Medir. Salve os Resultados: Na caixa de diálogo de resultados pop-up, Arquivo → Salvar Como e selecione o local de salvamento.
  7. Exportação de imagem
    1. Selecione um campo de visão de poço positivo de alta qualidade como padrão de referência.
      NOTA: Os requisitos básicos de qualidade são autenticidade, foco preciso, exposição adequada (16 bits) e contraste apropriado (uma relação sinal-ruído mais alta é melhor). Os requisitos de alta qualidade incluem características distintas, contraste, praticidade, mudanças morfológicas intuitivas e pontos principais destacados.
    2. Em Executar Análise, selecione ExportPro na seção Análise e inicie Configuração de Execução para Análise. Em Selecionar opções de saída, escolha Canal individual, Sobreposição de cores, reduzir imagem (opcional) e Barra de escala (opcional) com base nos requisitos da imagem.
    3. Selecione as imagens dos canais fluorescentes a serem exportadas para cada campo de visão. Em Canal Individual, selecione uma cor para cada canal, como Azul para o canal DAPI e Monocromático para o canal TL.
    4. Em Sobreposição de cores, selecione os canais correspondentes a BRIGHTFIELD, VERMELHO, AZUL e VERDE em ordem (selecione o comprimento de onda da cor para sobreposição de cores). Defina o Número para 100; observe a imagem de visualização e aceite o resultado de visualização.
    5. Em saída, selecione a pasta onde as imagens exportadas serão armazenadas em Exportar para pasta. Inicie a execução.
      NOTA: Imagens do mesmo lote não devem ser exportadas separadamente; um lote de imagens refere-se a um conjunto de imagens de quatro amostras principais: controle negativo, controle positivo, grupo controle básico e grupo experimental alvo, todas obtidas sob condições experimentais completamente consistentes.
  8. Comparação dos métodos de processamento de imagem
    1. Selecione 9 campos de visão e compare a contagem manual tradicional de células mortas e vivas com os métodos Pontuação Celular Multicomprimento de Onda, Viva-Morta, CME e ImageJ para contagem de células vivas, células mortas e a razão entre mortas e vivas. Use o GraphPad Prism versão 10.1 para realizar uma ANOVA unifatorial, acompanhada do teste de comparações múltiplas de Tukey, para analisar as diferenças.
    2. Selecione 81 campos de visão e compare as diferenças na contagem celular, área e intensidade entre os métodos Pontuação Celular Multicomprimento de Onda, Viva-Morta, CME e ImageJ. Use o GraphPad Prism versão 10.1 para realizar uma ANOVA unifatorial, acompanhada do teste de comparações múltiplas de Tukey, para analisar as diferenças.
      NOTA: Os experimentos de cultura celular e coloração devem ser realizados dentro de uma cabine de segurança biológica. Descarte líquidos residuais, ponteiras e outros resíduos experimentais de acordo com as regulamentações do laboratório. Garanta proteção total durante todo o experimento.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Impacto da preparação padronizada na qualidade da imagem

Os parâmetros da placa foram configurados para garantir que o instrumento pudesse localizar com confiança a camada de imagem das células. Amostras preparadas como uma única camada de células com confluência moderada facilitaram o foco da imagem em diferentes aumentos do objetivo e melhoraram o reconhecimento da imagem e a análise quantitativa. O preparo padronizado das amostras e os parâmetros otimizados da placa minimizaram efetivamente os efeitos de borda, a sobreposição de células e outros fatores que contribuem para imagens de baixa qualidade (Figura 1).

Comparação das funções dos métodos de cálculo de imagem

O método de dupla coloração com PI/Hoechst 33342 foi utilizado para distinguir células vivas e mortas. Os métodos Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead e CME processaram com sucesso essas imagens identificando objetos com base na intensidade de fluorescência e no tamanho dos objetos, enquanto o ImageJ identificou objetos com base nos valores de escala de cinza. Os resultados de marcação obtidos com esses métodos foram geralmente comparáveis (Figura 3A–E).

O método de Pontuação Celular Multicomprimento de Onda exigiu coloração nuclear para identificar todas as células (Figura 4A). Ele pode processar até 7 canais de imagem e calcular parâmetros como contagem celular, área e densidade óptica.

O método Live-Dead foi mais flexível do que o método de Pontuação Celular Multicomprimento de Onda. Ambos os canais fornecem módulos para coloração nuclear, coloração citoplasmática ou coloração combinada nuclear-citoplasmática para identificar todas as células, células vivas ou células mortas. A função de divisão de objetos sobrepostos separa objetos sobrepostos, permitindo o cálculo do número de células, área e densidade óptica. No entanto, como processava apenas dados de dois canais, era particularmente adequado para ensaios de viabilidade celular com dupla coloração por PI/Hoechst 33342 (Figura 4B).

O método CME dependia da lógica definida pelo usuário para o processamento de imagens. O número de canais processados correspondia ao número de canais adquiridos. Os resultados de reconhecimento foram refinados utilizando funções como Preencher Buracos, Inverter Objetos, Expandir Objetos, Encolher Objetos, Operações Lógicas, Remover Objetos de Borda, Manter Objetos Marcados, Expandir Objetos sem Tocar, Marcar Centros de Objetos, Watershed, Remover Objetos Marcados e Filtrar Máscara para eliminar impurezas e outras fontes de interferência. Este método também permitiu o cálculo de múltiplos parâmetros de objetos para análise multidimensional.

O ImageJ não processava múltiplos canais simultaneamente. Para lotes de imagens com variação substancial de fundo, era necessário o processamento manual e o ajuste de limiar, o que aumentava a subjetividade e reduzia a reprodutibilidade.

Análise das diferenças nos resultados do processamento

Uma análise comparativa dos métodos de processamento de imagem não revelou diferenças significativas nas contagens totais de células, nas contagens de células mortas ou na razão entre células mortas e células totais entre os métodos de Pontuação Celular Multicomprimento de Onda, Vivas-Mortas, CME, ImageJ e contagem manual tradicional em 9 campos de visão (Figura 5A–C, Arquivo Suplementar 1).

Da mesma forma, nenhuma diferença significativa foi observada na proporção entre a área de células mortas e a área celular total entre os métodos de Pontuação Celular Multicomprimento de Onda, Vivas-Mortas, CME e ImageJ. No entanto, uma diferença significativa foi observada na proporção da intensidade média de fluorescência das células mortas em relação à de todas as células entre os métodos de Pontuação Celular Multicomprimento de Onda, Vivas-Mortas e CME, com base em dados obtidos de 81 campos de visão (Figura 5D–F).

Com base nesses resultados, foi estabelecido um fluxo de trabalho padronizado para o Sistema de Imagem de Alto Conteúdo (Figura 6).

figure-results-1
Figura 1: Resultados de imagem de baixa qualidade. (A) O campo de visão está próximo à borda do poço, revelando sombras provenientes da borda do poço (células BV2 neste caso). (B) As setas a e b indicam a sobreposição de células no canal DAPI e no canal TL, com confluência celular excessiva, e até mesmo uma segunda camada ou algumas células flutuantes. (C) O campo de visão não possui células; os parâmetros da placa estão incorretos; o foco não está na camada celular, ou as células não foram coradas, resultando em nenhuma imagem neste campo de visão. Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Configurações dos parâmetros de imagem. (A) A seta a indica o ícone de profundidade de bits. (B) A seta b indica a posição da Correção de Sombreamento. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Resultados do mesmo campo de visão identificados por diversos métodos. (A) Resultados da máscara de pontuação celular multicomprimento de onda: as áreas cinza e vermelha representam todos os núcleos celulares identificados no canal DAPI, sendo a área vermelha correspondente aos núcleos de células mortas identificados no canal Cy3. (B) Resultados da máscara Viva-Morta: as áreas verde e vermelha representam todos os núcleos celulares identificados no canal DAPI, sendo a área vermelha correspondente aos núcleos de células mortas identificados no canal Cy3. (C) Resultado da máscara CME: as áreas amarela e azul representam todos os núcleos celulares identificados no canal DAPI, sendo a área azul correspondente aos núcleos de células mortas identificados no canal Cy3. (D) Resultado da máscara ImageJ no canal DAPI. (E) Resultado da máscara ImageJ no canal Cy3. Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Páginas parciais de configuração de parâmetros. (A) O local indicado por a mostra que o primeiro canal da Pontuação Celular Multicomprimento de Onda só pode selecionar o núcleo; (B) b e c indicam que o ensaio de Células Vivas-Mortas pode processar apenas dois canais, permitindo a dupla marcação com PI/Hoechst 33342 para células mortas e vivas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Diferenças nos resultados do processamento de imagens de fluorescência. (A) Diferenças no número total de células entre os cinco métodos de processamento. (B) Diferenças no número de células mortas entre os cinco métodos de processamento. (C) Diferenças na proporção de células mortas em relação ao total de células entre os cinco métodos de processamento. (D) Diferenças na proporção de células mortas em relação ao total de células entre os quatro métodos de processamento. (E) Diferenças na proporção da área de células mortas em relação à área total de células entre os quatro métodos de processamento. (F) Diferenças na proporção da intensidade média de fluorescência de células mortas em relação à de todas as células entre os quatro métodos de processamento. Todas as barras de erro nos gráficos representam desvios-padrão. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Processo operacional padronizado. Fluxograma resumindo o procedimento padronizado para preparação da amostra, coloração por fluorescência, aquisição de imagens de alto conteúdo, processamento de imagens, exportação de imagens e análise de dados. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1. Dados brutos da análise de contagem celular, área e intensidade de fluorescência apresentados na Figura 5. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizando o método de dupla coloração com PI e Hoechst para determinar a viabilidade celular, por exemplo, o instrumento de alto conteúdo pode calcular rapidamente e de maneira de alto rendimento a viabilidade celular dentro do mesmo lote, usando módulos de algoritmos embutidos. Este método apresenta várias vantagens, incluindo baixo volume de amostra, baixo custo, dano celular mínimo, baixa fotodegradação da fluorescência, resistência ao apagamento e capacidade de capturar múltiplas imagens. Além disso, o tempo de aquisição de imagens para uma placa de 96 poços geralmente é de apenas 30–45 min20.

No protocolo experimental, para garantir a qualidade da imagem, concentre-se nos seguintes passos: Primeiro, assegure uma densidade adequada da placa para evitar densidade celular excessiva, o que pode preencher a imagem com células, ou densidade insuficiente, o que pode levar ao arraste das células durante a coloração e as lavagens. Segundo, lave completamente o corante para impedir que o corante residual afete a aquisição de imagens. Para células com baixa adesão, manipule cuidadosamente a adição e remoção de líquido de forma suave e lenta antes e depois da coloração, evitando adições verticais. Utilize adição pela parede lateral para evitar a perda de células no centro do campo de visão, prestando especial atenção ao desprendimento de células mortas durante ensaios de viabilidade. Considere centrifugar a placa de amostras para reduzir erros experimentais, se necessário. Terceiro, escolha um tempo de exposição apropriado. Uma exposição muito longa aumentará o tempo total de aquisição de imagens e pode perder a janela de detecção, potencialmente levando à superexposição de algumas células ou ao reconhecimento do fundo. Uma exposição muito curta pode resultar em informações de imagem incompletas, com perda de alguns detalhes característicos.

Se uma imagem nítida não puder ser obtida durante a aquisição de imagem, identifique a causa verificando a condição das células, resíduos do corante, configurações de parâmetros e outros fatores. Durante o experimento, se não houver células no fundo do poço, nenhuma imagem será encontrada no campo de visão. Se duas ou mais camadas irregulares de células se formarem no fundo do poço, o foco torna-se difícil, resultando em uma imagem desfocada. Resíduos excessivos de corante podem gerar um fundo intenso, tornando a imagem-alvo menos nítida. Grandes áreas de resíduo podem encobrir células no campo de visão, enquanto partículas pequenas de resíduo, semelhantes em tamanho às células, podem interferir no reconhecimento e na segmentação da imagem subsequente. Se a altura da placa e a profundidade do poço não forem ajustadas de acordo com as especificações do fabricante para a placa de 96 poços, nenhuma imagem será encontrada no campo de visão, ou a posição da amostra pode se deslocar, potencialmente danificando a lente objetiva.

Considerando a flexibilidade e simplicidade de operação, bem como os bons resultados de processamento de dados, o módulo de processamento de imagem ideal para o método de dupla coloração com PI e Hoechst é o Live-Dead. Este programa é especificamente otimizado para os corantes PI e Hoechst e, em comparação com outros métodos e softwares, é simples de operar, realiza cálculos rapidamente e permite o carregamento fácil de imagens em lote no banco de dados com configurações de parâmetros consistentes. Os resultados são mais comparáveis do que aqueles obtidos com o software atualmente comum, o ImageJ. Diferentes modos experimentais podem utilizar métodos proprietários correspondentes ou o modo geral de cálculo Multi-Wavelength Cell Scoring; os métodos proprietários são mais convenientes, enquanto o modo de cálculo geral apresenta menos restrições quanto aos métodos de coloração. Diferentes protocolos de coloração exigem diferentes módulos ótimos de processamento de imagem. Desenvolva métodos computacionais adaptados aos objetivos experimentais. O método ExportPro para exportação de imagens é simples e fácil de aprender, permitindo a visualização de objetos de referência. É amigável para iniciantes, com uma interface gráfica que explica claramente o significado dos parâmetros e simplifica as medições, reduzindo as barreiras à análise com múltiplos softwares e economizando tempo no aprendizado das ferramentas.

Este estudo validou apenas um protocolo básico de coloração. Como referência, outros protocolos experimentais que diferem significativamente deste ainda precisam ser validados em relação ao novo padrão.

O Sistema de Imagem de Alto Conteúdo atua como uma plataforma tecnológica central que integra imagem de alta resolução, detecção sincronizada multiparamétrica, análise quantitativa automatizada e triagem de alto rendimento21,22,23. O design integrado das capacidades de imagem e cálculo do dispositivo deverá permitir o desenvolvimento e estabelecimento de protocolos experimentais e modelos computacionais correspondentes para um número maior de experimentos de imagem já existentes7,24, melhorando, em última instância, a consistência e comparabilidade dos dados obtidos por diferentes operadores, em momentos distintos e entre diferentes lotes.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os autores declaram que não há conflito de interesse. Durante a tradução do manuscrito, a Zhipu AI foi utilizada exclusivamente para tradução e não para gerar dados de pesquisa, resultados experimentais ou conteúdo acadêmico principal. Os autores assumem total responsabilidade pelo conteúdo do manuscrito.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem o apoio fornecido pela Fundação da Escola da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu. Os autores agradecem o apoio concedido pela bolsa MPRC2022034. Esses recursos são utilizados para desenvolver um método de imagem dinâmica tridimensional para bactérias intestinais na Decocção Erchen no tratamento de camundongos obesos simples.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo Centrífugo de 1,5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
Pontas de Pipeta de 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
Tubo Centrífugo de 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
Pontas de Pipeta de 2,5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
Pontas de Pipeta de 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
Tubo Centrífugo de 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
Placa de Cultivo Celular de 96 PoçosCorning Incorporated3599
Pipeta de Canal Único Ajustável, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Pipeta de Canal Único Ajustável, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Pipeta de Canal Único Ajustável, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Pipeta de Canal Único Ajustável, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
Placa de Cultivo CelularCorning Incorporated430167
Frascos CriogênicosLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Dissulfóxido de dimetila (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Life Technologies Limited11966-025Neste estudo, o DMEM completo foi preparado utilizando 10% de SBF, 1% de Solução de Penicilina-Estretomicina e 89% de DMEM.
Incubadora CO2 ESCO CelCultureEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Soro Bovino Fetal (SBF, Superfine)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.164210-50
Cores Fluorescentes Hoechst 33342Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
Célula HT22Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthO ImageJ é um dos softwares de processamento de imagens utilizados no manuscrito.
Sistema de Imagem de Alta Capacidade com Microscopia Confocal ImageXpress MicroMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalNo manuscrito, utilize "Sistema de Imagem de Alta Capacidade" como substituto do nome do instrumento.
Centrífuga de congelamento de baixa velocidadeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
Software de Aquisição e Análise de Imagem de Alta Capacidade MetaXpressMolecular Devices, LLCO software é um complemento ao Sistema de Imagem de Alta Capacidade com Microscopia Confocal ImageXpress®. No manuscrito, "O software de análise fornecido com o equipamento" refere-se a este software.
Capa de Fluxo Laminar Vertical OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Solução de Penicilina-EstretomicinaProcell Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
Solução de Iodeto de Propídio (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Solução de Tripsina-EDTABasalMedia Technology Co., Ltd.S310KJ

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dariolli R, Nir R, Mushlam T, Souza GR, Farmer SR, Batista ML. Optimized scaffold-free human 3D adipose tissue organoid culture for obesity and disease modeling. SLAS Discovery. 2025;31:100218.
  2. Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
  3. Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
  4. Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
  5. Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
  6. Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
  7. Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
  8. Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
  9. Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
  10. Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
  11. Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
  12. Zhang W, Sun H, Zhao W, Li J, Meng H. Suppression of JNK pathway protects neurons from oxidative injury via attenuating parthanatos in glutamate-treated HT22 neurons. Sci Rep. 2024;14(1):25793.
  13. Thoudam T, Chanda D, Lee JY, et al. Enhanced Ca2+-channeling complex formation at the ER-mitochondria interface underlies the pathogenesis of alcohol-associated liver disease. Nat Commun. 2023;14(1):1703.
  14. Huang Z, Zhang Q, Wang Y, et al. Inhibition of caspase-3-mediated GSDME-derived pyroptosis aids in noncancerous tissue protection of squamous cell carcinoma patients during cisplatin-based chemotherapy. Am J Cancer Res. 2020;10(12):4287-4307.
  15. Andreyev AY, Yang H, Doulias PT, et al. Metabolic bypass rescues aberrant S-nitrosylation-induced TCA cycle inhibition and synapse loss in Alzheimer’s disease human neurons. Adv Sci. 2024;11(12):2306469.
  16. Backström A, Kugel L, Gnann C, et al. A sample preparation protocol for high throughput immunofluorescence of suspension cells on an adherent surface. J Histochem Cytochem. 2020;68(7):473-489.
  17. Hongxing Tang et al. Protective effects of hinokitiol on neuronal ferroptosis by activating the Keap1/Nrf2/HO-1 pathway in traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2024;41(5-6):734-750.
  18. Teerawonganan P, Hasriadi, Dasuni Wasana PW, et al. Synthesis, cytotoxicity, and mechanistic evaluation of tetrahydrocurcumin-amino acid conjugates as LAT1-targeting anticancer agents in C6 glioma cells. Int J Mol Sci. 2024;25(20):11266.
  19. Shihan MH, Novo SG, Le Marchand SJ, Wang Y, Duncan MK. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 2021;25:100916.
  20. Gomez-Dopazo G, Nieves RJA, Rivera RLA, et al. Cellulose acetate microwell plates for high-throughput colorimetric assays. RSC Adv. 2024;14(22):15319-15327.
  21. DuBreuil DM, Chiang BM, Zhu K, et al. A high-content platform for physiological profiling and unbiased classification of individual neurons. Cell Rep Methods. 2021;1(1).
  22. Ronzetti M, Simeonov A. A comprehensive update on the application of high-throughput fluorescence imaging for novel drug discovery. Expert Opin Drug Discovery. 2025;20(6):785-797.
  23. Jiang X, Li M, Wang Y, et al. 1,2,4,5-tetrazine-tethered probes for fluorogenically imaging superoxide in live cells with ultrahigh specificity. Nat Commun. 2023;14(1):1401.
  24. Yu Y, Chen J, Zhang X, et al. Identification of anti-inflammatory compounds from zhongjing formulae by knowledge mining and high-content screening in a zebrafish model of inflammatory bowel diseases. Chin Med. 2021;16(1):42.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Fluxo de Trabalho de ImagemViabilidade CelularColora o com PI e HoechstC lulas HT22M todos de Processamento de ImagemPontua o Celular de Comprimentos de Onda M ltiplosEnsaio Live DeadCompara o com ImageJ
Vídeo em breve

Artigos relacionados