Um ensaio de complementação com lúciferase dividida para medição temporalmente resolvida da depuração de tau na microglia

Resumo

Descrevemos uma plataforma quantitativa sensível e resolvida no tempo para medir a eliminação da tau extracelular em microglia derivada de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC), utilizando um sistema de luminescência baseado em microplacas. Essa abordagem permite a detecção sensível da cinética de degradação de tau em formato micropoço, possibilitando interrogações de alta taxa do manuseio de tau sob várias condições experimentais.

Resumo

Como células imunes residentes do sistema nervoso central, a microglia é reguladora central da homeostase cerebral e mediadora-chave das doenças neurodegenerativas. Essas células monitoram continuamente o ambiente neural e desempenham um papel fundamental no reconhecimento, internalização e degradação de substratos extracelulares, incluindo proteínas mal dobradas e agregadas, como a tau patológica. Apesar das crescentes evidências que implicam a microglia na eliminação de tau, as abordagens existentes para medir a absorção e degradação de tau carecem da resolução temporal e sensibilidade necessárias para capturar plenamente esses processos dinâmicos. Aqui, desenvolvemos um ensaio baseado em luminescência para monitorar quantitativamente a eliminação de tau em microglias derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC). Essa plataforma utiliza um sistema de complementação baseado em luciferase dividida para permitir a detecção altamente sensível e em tempo real de tau em células vivas, possibilitando o rastreamento preciso de seu processamento intracelular. Este ensaio é escalável e adaptável a múltiplos tipos celulares, fornecendo uma ferramenta versátil para investigar vias endolisossômicas e mecanismos celulares que regem o manuseio de tau em doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer.

Introdução

Tauopatias, incluindo a Doença de Alzheimer (DA), são caracterizadas pela agregação e disseminação da proteína tau associada a microtúbulos através dos circuitos^{neurais 1,2}. As gliais têm se tornado cada vez mais apreciadas como reguladoras da dinâmica da doença tau, incluindo absorção, degradação e^{disseminação} 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Compreender como a glia contribui para as tauopatias é uma preocupação urgente para resolver dinâmicas importantes da doença, incluindo neuroinflamação e disseminação da tau. Entre as populações gliais, a microglia – os fagocitos residentes no cérebro – está posicionada de forma única para mediar a limpeza dos tau.

Apesar da necessidade urgente de elucidar os mecanismos de manuseio de tau em microglia, o campo permanece limitado na resolução e taxa de processamento dos ensaios disponíveis. Questões-chave sobre internalização de tau, tráfico intracelular e depuração celular permanecem sem solução. Cada uma dessas etapas representa um processo mecanicamente distinto: captação refere-se à internalização de tau extracelular na membrana plasmática; O tráfico abrange a separação e o transporte de tau internalizados através de compartimentos endossomais, lisossomiais e outros compartimentos intracelulares; e degradação denota a degradação proteolítica da tau, principalmente por via de vias lisossômicas e proteassômicas. Embora esses passos sejam sequenciais para o processamento extracelular de tau, já que tau internalizada deve transitar compartimentos intracelulares antes de alcançar a maquinaria degradativa, eles são regulados de forma independente e uma dada perturbação experimental pode afetar uma etapa sem alterar outras. Por exemplo, uma redução no sinal tau intracelular pode refletir captação comprometida, desvio incorreto para longe dos compartimentos degradativos ou degradação aumentada. Resolver esses processos exige novas plataformas de ensaio que possam detectar a presença de proteínas e serem acopladas a medidas existentes para determinar o destino da proteína ao longo do tempo.

Os métodos atuais para resolver a internalização e degradação de tau dependem de imunocitoquímica, citometria de fluxo, western blot e abordagens de marcagem fluorescente para quantificar a captação, localização subcelular e processamento intracelular das espécies^tau 13,14,15,16,17,18 . No entanto, cada uma dessas abordagens apresenta limitações fundamentais quando aplicada ao estudo da dinâmica de eliminação de proteínas. Imunocitoquímica e western blot não têm sensibilidade para detectar espécies tau de baixa abundância e são trabalhosas e são laboriosas. Citometria de fluxo e ensaios baseados em fluorescência não relatam fielmente a eliminação de proteínas porque os fluoróforos podem persistir após a proteína conjugada ter sido^{degradada 19}, desacoplando assim o sinal fluorescente do destino real da proteína em questão. Juntas, essas restrições deixam uma lacuna crítica, sem que nenhum método existente forneça simultaneamente a sensibilidade, resolução temporal e escalabilidade necessárias para acompanhar quantitativamente a dinâmica de limpeza de tau. Portanto, um grande obstáculo para o progresso na compreensão da dinâmica de manuseio de tau na microglia tem sido a falta de ensaios quantitativos, com resolução temporal e alto rendimento para medir a depuração de tau em células vivas.

Para suprir a falta de uma plataforma quantitativa para monitorar a dinâmica de tau vivo, desenvolvemos um ensaio sensível baseado em luminescência que pode ser usado para detectar a dinâmica intracelular da proteína tau. Essa abordagem emprega um sistema de complementação baseado em split-luciferase, no qual uma pequena etiqueta peptídica (High Affinity Binary Technology ou HiBiT) é fundida à tau, permitindo medições cinéticas em células vivas. Ao interagir com seu parceiro de ligação complementar (Grande Tecnologia Binária ou LgBiT), a proteína marcada reconstitui uma enzima luciferase ativa, gerando um sinal bioluminescente^quantitativo 20,21,22. Esse sinal luminescente fornece uma leitura direta e sensível da abundância de proteínas, permitindo o acompanhamento dinâmico das mudanças nos níveis intracelulares ao longo do tempo. Como resultado, a luminescência pode ser usada como um relator robusto da presença ou perda de proteínas, como no caso da degradação intracelular. Juntas, essa plataforma permite uma medição precisa e temporalmente resolvida do manuseio de tau e oferece uma estratégia amplamente aplicável para estudar a renovação proteica.

Protocolo

Todos os experimentos celulares foram realizados em um laboratório apropriado de Biossegurança Nível 2, aprovado pelos Serviços Ambientais e de Saúde da Universidade de Massachusetts Amherst.

1. Expressão, purificação e remoção de endotoxinas da proteína Tau-SLP

1. Anexe o peptídeo de luciferase dividida ou a etiqueta SLP (VSGWRLFKKIS) a uma construção Tau para criar uma construção marcada (Tau-SLP) usando métodos padrão de clonagem, como a montagem^{Gibson 23}.
   NOTA: A complementaridade da etiqueta peptídica de split-luciferase gera um sinal robusto quando colocada no C-terminal, N-terminal ou nos domínios internos de 2N4R^{Tau 24}.
2. Exprima e purifique a Tau-SLP usando os métodos^{já descritos 25,26} e garanta pureza usando SDS-PAGE e imunoblotagem.
3. Para uso com células microgliais, siga protocolos publicados para remover endotoxinas bacterianas após a purificação com Tau-SLP, a fim de limitar a reatividade de^{confusão 27}.
4. Quantifique a concentração de proteína Tau-SLP usando um ensaio padrão de ácido bicincônico (BCA) ou ensaio^{de Bradford 28,29}.
5. Se desejado, agregue a Tau-SLP seguindo os protocolos²⁴ descritos anteriormente.
6. Valide a luminescência funcional da Tau-SLP gerando uma curva padrão usando um substrato de luciferase comercialmente disponível e reagente de complementação, seguindo as instruções do fabricante (veja Tabela de Materiais).

2. Cultura de microglia derivada de iPSC (iTF-Microglia)

1. Cultive células microgliais em 5% de_CO2 a 37 °C no meio de cultivo apropriado.
2. Diferenciar uma linha de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) que abriga seis fatores de transcrição induzíveis por doxiciclina para produzir uma célula semelhante a microglia (microglia-Like ou iTF-Microglia induzido por fator de transcrição) usando um protocolo^{validado 30} (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Este ensaio não se limita à iTF-Microglia e pode ser usado com qualquer linhagem celular aderente. Otimização dos tempos de depuração pode ser necessária ao trabalhar com outras linhagens celulares.

3. Ensaio de Eliminação de Tau

1. Em uma placa de 24 poços, as células da placa com densidade de 1 x 10,⁵ células por poço, em triplicado por condição, com meio de cultivo (250 μL) e incubam durante a noite a 37 °C e 5% de_CO2 (Figura 1A).
2. Remova o meio de cultura, lave as células uma vez com PBS (250 μL) e substitua por meio de cultura de 250 μL.
3. Para medir temporalmente a depuração da Tau-SLP, expõe as células à Tau-SLP de forma escalonada, de modo que todos os poços sejam colhidos simultaneamente, enquanto diferem apenas no tempo de limpeza. Por exemplo, para grupos de liberação de 0 h, 2 h e 4 h, adicione 100 nM com meio contendo Tau-SLP primeiro no grupo de 4 h, depois 1 h depois no grupo de 2 h e, finalmente, 1 h depois no grupo de 0 h (veja a Figura 1B para recomendações de temporização). Uma vez concluído o período final de internalização, todos os poços terão passado pelo mesmo período de exposição Tau-SLP, mas só diferirão na duração de limpeza (Figura 1B).
4. Inclua poços que não recebam tratamento Tau-SLP para subtração de fundo (Figura 1C).
5. Ao final do período de internalização, remova o meio contendo Tau-SLP. Lave as células três vezes com PBS para remover a Tau-SLP extracelular e substitua por meio de cultura livre de Tau-SLP.
6. Incube as células durante o período de liberação designado (Figura 1A). O grupo de depuração de 0 h, colhido imediatamente após o período de internalização, representa a quantidade total de Tau-SLP internalizada no início da fase de eliminação.
7. Seguindo todos os pontos de tempo de liberação, remova o meio dos poços e lave com PBS de 250μL.
8. Trate cada poço com 250 μL de Tripsina-EDTA 0,25% por 5 minutos a 37 °C. Essa etapa remove tau ligada à superfície para garantir que a luminescência refleta a Tau-SLP internalizada. Neutralize cada poço com 250 μL inibidor de tripsina (5 mg/mL).
9. Colete cada poço em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL devidamente rotulado e faça pellets por centrifugação (500 x g, 5 min).
10. Prepare uma quantidade apropriada de tampão de lise contendo substrato de luciferase e componentes de complementação (veja Tabela de Materiais; 50 μL x # de poços + 10%).
11. Remover cada sobrenadante com uma pipeta aspiradora e ressuspender o pellet celular em 50 μL de tampão de lise contendo substrato de luciferase e componentes de complementação. Isso produzirá um complexo de complementação de lúferise dividida e gerará luminescência (Figura 1D).
12. Transfira células lisadas para uma placa branca de meio volume com 96 poços.
13. Leia a luminescência em um leitor de microplacas com tremores orbitais por 10 segundos à temperatura ambiente (~23 °C) antes da leitura para garantir a lise completa dos pellets celulares.
14. Determine a abundância normalizada de Tau-SLP subtraindo primeiro o valor médio de luminescência obtido de poços não expostos à Tau-SLP. Normalize cada valor para o sinal médio subtraído pelo fundo do grupo de liberação 0 h.
15. O gráfico normalizou a abundância de Tau-SLP em função do tempo de limpeza. Uma redução progressiva na luminescência indica uma diminuição na abundância intracelular de Tau-SLP e é interpretada como clearance Tau-SLP, enquanto valores de luminescência estáveis indicam clearance prejudicada ou retardada. Calcule a porcentagem de depuração como: % de depuração = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

Resultados

Usando esse ensaio sensível baseado em luminescência, a abundância intracelular de Tau-SLP pôde ser monitorada ao longo do tempo após um período sincronizado de absorção em microglias humanas derivadas de iPSC. Após o lavado da Tau-SLP, a luminescência diminuiu gradualmente, consistente com a eliminação intracelular da Tau-SLP. Essa plataforma era suficientemente sensível para detectar diferenças no manuseio de espécies monoméricas e fibrilares de Tau-SLP por microglia. A Tau-SLP monomérica foi completamente eliminada na iTF-Microglia em 60 minutos, enquanto a Tau-SLP fibrilar persistiu por mais de 240 minutos (Figura 2A). Além disso, realizamos o ensaio com tau mutante (por exemplo, N279K) para avaliar a cinética de depuração e descobrimos que o TauN279K-SLP apresenta cinética de depuração significativamente reduzida em apenas pontos curtos de tempo de apuração (15 min) (Figura 2B). Esses resultados sugerem que a degradação observada pode ser aparente apenas devido à alta sensibilidade desse ensaio. Realizamos o experimento de degradação Tau-SLP usando a pequena molécula L-Leucil-L-Leucina metiléster (LLOMe) para confirmar o envolvimento lisossomo. LLOMe é um substrato de catepsina C que permeabiliza as membranas lisossômicas, interrompendo a atividade^{lisossômica 31}. Com o tratamento com LLOMe, observamos níveis significativamente aumentados de Tau-SLP em regime estacionário a t=0 (Figura 3A) e uma taxa significativamente reduzida de degradação (Figura 3B), com um aumento de 4 vezes da Tau-SLP remanescente após um tempo de eliminação de 60 minutos. Por fim, realizamos o ensaio de eliminação Tau-SLP em neurônios derivados de iPSC para confirmar a compatibilidade do ensaio entre tipos celulares. Aqui, descobrimos que neurônios derivados de iPSC apresentam cinética de depuração reduzida tanto para as formas monoméricas (Figura 4A) quanto para as fibrilas (Figura 4B) da Tau-SLP. Mais notavelmente, os níveis de fibrila da Tau-SLP permanecem estáveis em ~100% durante uma eliminação de 240 minutos, enquanto no mesmo período os níveis de fibrila da Tau-SLP caíram abaixo de 50% na iTF-Microglia. Esses resultados demonstram que nossa plataforma de complementação baseada em luciferase dividida oferece uma detecção robusta e confiável da depuração endolisossômica intracelular da Tau-SLP e demonstra um design de ensaio altamente adaptável que pode ser aplicado a inúmeras outras proteínas ou tipos celulares.

Figura 1: Desenho experimental representativo do ensaio de eliminação Tau-SLP. (A) Imagem representativa em campo claro da iTF-Microglia utilizada para este ensaio (barra de escala = 100μm) (B) Microglia humana (iTF-Microglia) é exposta a 2N4R-SLP recombinante de forma escalonada, permitindo detecção robusta baseada em luminescência. Após uma incubação de 1 hora, o tau extracelular é removido por troca de meios e as células são lavadas com PBS. As células são mantidas em meio basal durante seu respectivo período de eliminação (0 h, 2 h, 4 h) antes da colheita. No ponto final, as células são lisadas e a luminescência é medida. (C) Projeto de placa proposto para medir a folga Tau-SLP comparando a degradação monomérica com a fibrilar. (D) A proteína Tau-SLP é internalizada nas células e encaminhada para a degradação lisossômica. A adição de LgBiT fornece uma leitura quantitativa da quantidade de Tau-SLP restante na célula por meio da complementação e produção de luminescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: iTF-Microglia Tau-SLP extracelular limpa. (A) A iTF-Microglia foi exposta à Tau-SLP monomérica (100nM) ou Tau-SLP fibrilar (50nM), amostras foram normalizadas para a respectiva captação inicial (t = 0; 100%) e para células que não foram expostas à Tau-SLP (0%) (média ± DS; n = 9 a partir de três diferenciações independentes). (B) a iTF-Microglia foi incubada com Tau-SLP monomérica ou TauN279K-SLP (100nM), e as amostras foram normalizadas para a respectiva captação inicial (t = 0; 100%) e células que não foram expostas à Tau-SLP (0%) (média ± SD; n ≥ 7 a partir de três diferenciações independentes; ∗ p < 0,05 usando o teste t de Welch não emparelhado). Dados reimpressos de Shultz et al., 2025²⁴, e usados sob uma licença Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: A inibição lisossômica prejudica a delimitação da Tau-SLP. (A) O tratamento com 1mM inibidor lisossômico L-Leucil-L-Leucina (LLOMe) por 24 horas aumentou a captação inicial de Tau-SLP (t = 0) em células de neuroglioma H4 (média ± DS; n = 9 culturas independentes; ∗ p < 0,05 usando teste t de Welch não pareado). (B) O tratamento com LLOMe (1mM) por 24 horas aumentou a % de normalização da RLU Tau-SLP após um tempo de liberação de 60 minutos (t = 60 min) em comparação com o veículo (DMSO). O sinal luminescente é normalizado aos respectivos níveis iniciais de absorção (100%) e às células que não foram expostas à Tau-SLP (0%) (média ± SD; n = 9 culturas independentes; ∗∗∗∗ p < 0,0001, ∗ p < 0,05 usando o teste t de Welch desparelado). Dados reimpressos de Shultz et al., 2025²⁴, e usados sob uma licença Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: iTF-Microglia e iNeurônios apresentam diferenças na depuração da Tau-SLP. (A) iTF-Microglia ou iNeurônios foram incubados com Tau-SLP monomérico (100nM), amostras foram normalizadas para a respectiva captação inicial (t=0; 100%) e células que não foram expostas à Tau-SLP (0%) (média±SD; n ≥ 6 de duas ou três diferenciações independentes; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 usando uma ANOVA bidirecional; tempo: F(1, 28) = 7,489, p = 0,0107; tipo celular: F(1, 28) = 46,61, p < 0,0001; interação: F(1, 28) = 3,229, p = 0,0831; Teste de comparações múltiplas de Sidak, valores p indicados na figura, valores t=0 são mostrados para referência, mas foram excluídos da análise estatística. (B) iTF-Microglia ou iNeurônios foram incubados com Tau-SLP fibrilar (50nM), amostras normalizadas para a captação inicial respectiva (t=0; 100%) e células que não foram expostas à Tau-SLP (0%) (média±SD; n ≥ 6 de duas a três diferenciações independentes; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 usando uma ANOVA bidirecional; tempo: F(1, 26) = 0,3888, p = 0,5384; Tipo de célula: F(1, 26) = 43,09, p < 0,0001; interação: F(1, 26) = 1,209, p = 0,2816; Teste de comparações múltiplas de Sidak, valores p indicados na figura, valores t=0 são mostrados para referência, mas foram excluídos da análise estatística. Dados reimpressos de Shultz et al., 2025²⁴, e usados sob uma licença Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Este ensaio fornece uma plataforma escalável e quantitativa para medir a depuração extracelular da Tau-SLP pela microglia com alta sensibilidade e resolução temporal. Em contraste com as abordagens tradicionais baseadas em imagem, que frequentemente exigem processamento laborioso de amostras e são limitadas em taxa de transferência e amostragem temporal, esse sistema baseado em luminescência permite a quantificação direta, em nível populacional, do manuseio de tau em formato de microplaca. A leitura resultante fornece uma medição quantitativa da depuração da Tau-SLP após exposição à tau extracelular. Como as medições podem ser obtidas repetidamente em múltiplos pontos de tempo e com períodos de incubação mais longos, o ensaio permite uma análise de alta produtividade e cinéticamente resolvida da dinâmica da captação e depuração de tau. Além disso, mudanças na luminescência ao longo do tempo são consistentes com alterações na abundância intracelular de Tau-SLP, mas não distinguem entre tráfego, degradação ou secreção sem abordagens complementares. Embora a marcação Tau-SLP não tenha alterado significativamente a captação ou agregação de tau em nosso estudo^{companheiro 24}, etiquetas exógenas podem influenciar o comportamento de outras proteínas. Portanto, os achados do ensaio devem ser complementados usando abordagens ortogonais e comparados com preparações tau não marcadas sempre que possível. Uma limitação adicional é que este ensaio utiliza espécies recombinantes Tau-SLP em vez de tau endógeno ou agregados patológicos de tau derivados do paciente. Embora a tau recombinante 2N4R forneça um substrato experimental reprodutível, ela não recapitula totalmente a heterogeneidade endógena (ou seja, modificações pós-traducionais) das espécies tau isoladas de cérebros humanos de pacientes. Existem muitos protocolos para a fosforilação in vitro da proteína tau recombinante e poderiam ser facilmente incorporados a esse fluxo de trabalho. Essa plataforma também poderia ser adaptada para estudar tau endógeno; isso exigiria o uso de engenharia genética para incorporar uma sequência de marcador SLP no locus tau (MAPT).

Importante, a interpretação da redução do sinal como degradação depende da remoção efetiva de tau extracelular e ligado à superfície, por exemplo, por meio da tripsinização ou etapas equivalentes de desmantelamento. Falsos negativos podem ocorrer se a remoção eficaz não for alcançada. Uma perda aparente de sinal que seria interpretada como um falso positivo de degradação tau também é possível. Isso pode ocorrer do descolamento ou morte celular, secreção de Tau-SLP ou clivagem proteolítico que separa a SLP da tau sem degradar a proteína. Assim, as diminuições na luminescência devem ser interpretadas como reduções na abundância intracelular de Tau-SLP, em vez de medições diretas da degradação lisossòmica. Para atribuir de forma mais definitiva as mudanças de sinal à degradação lisossômica, recomendam-se estratégias de validação ortogonal. Estes podem incluir perturbação farmacológica da função lisossômica, como tratamento com bafilomicina A1 ou LLOMe (Figura 3), bem como desenhos experimentais de pulso e perseguição para resolver a cinética de absorção versus degradação.

A flexibilidade desse ensaio o torna bem adequado para interrogar mecanismos que governam a captação de tau, o tráfico intracelular e a degradação, bem como para triagem de moduladores farmacológicos ou genéticos da eliminação de tau em sistemas celulares humanos. Embora demonstrada aqui em microglias derivadas de iPSC, a plataforma é facilmente adaptável a outros tipos celulares (Figura 4), permitindo ampla aplicação em modelos de biologia tau e doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e outras tauopatias primárias e secundárias. Como este ensaio depende da exposição extracelular de Tau-SLP e detecção baseada em luminescência, ele deve ser facilmente adaptável a astrócitos, oligodendrócitos ou linhagens celulares comumente usadas, embora a otimização das condições de absorção possa ser necessária. Coletivamente, essa abordagem fornece uma ferramenta poderosa para dissecar vias celulares envolvidas na proteostase e avançar a compreensão mecanicista dos processos de doenças neurodegenerativas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Doxycycline	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Graphing Software	GraphPad Prism (ou similar)	n/a
Human GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Luminescent Plate Reader	SpectraMax i3x (ou similar) - Molecular Devices	n/a
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, White	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
Recombinant Human IL-34	Thermo Scientific	200-34
Recombinant Human M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Recombinant Human TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012927
Tau-HiBiT protein	In house	n/a	Proteína Tau com um tag peptídeo VSGWRLFKKIS
Trypsin Inhibitor	Sigma Aldrich	T9128
Trypsin-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochloride	Bio-techne	1254