Um protocolo eficiente de criação e microinjeção para modificação genética da mosca estável, Stomoxys calcitrans

Summary

Este protocolo descreve um método confiável de microinjeção embrionária para integrar material genético estranho ao genoma da mosca estável, um sistema de triagem fluorescente para monitoramento do desenvolvimento embrionário pós-injeção e um substrato de criação larval composto por ágar de gema de ovo suplementado com carvão ativado, inoculado com Escherichia coli , que apoia o desenvolvimento do ovo ao adulto.

Abstract

Moscas dos estábulos são pragas sanguinárias de gado, animais de companhia e humanos, e são encontradas em todos os continentes, exceto na Antártica. As mordidas dolorosas tanto de adultos machos quanto femininos induzem comportamentos relacionados ao estresse no gado, resultando em perda de peso e perdas econômicas substanciais para os produtores. Tanto machos quanto fêmeas moscas dos estábulos são obrigatórios a se alimentar de sangue, o que representa um desafio para a técnica de insetos estéreis e outras estratégias de manejo de pragas que exigem a liberação em massa dos machos. As estratégias atuais de manejo estável de pragas de moscas frequentemente falham em controlar adequadamente as populações de moscas. Embora inúmeros métodos de manipulação genética para introduzir material genético exógeno ou induzir knockouts gênicos tenham sido desenvolvidos para mosquitos, Drosophila e outros grupos modelo de insetos, os métodos para a transformação genética de moscas estáveis continuam limitados. Este protocolo descreve uma abordagem confiável e aprimorada para introduzir material genético estranho em moscas estáveis, utilizando uma variante hiperativa da piggyBac transposase e um novo meio sólido de criação larval que apoia a recuperação larval, eclosão, alimentação e triagem fluorescente após microinjeção embrionária.

Introduction

Moscas dos estábulos (Stomoxys calcitrans L., 1758) são pragas economicamente importantes e vetores de doenças do^{gado 1,2,3} e possuem uma distribuição cosmopolita globalmente. As estratégias de manejo integrado de pragas (GIP) frequentemente falham em controlar adequadamente populações estáveis de^{moscas 2,3}, resultando em perdas anuais estimadas em mais de US$ 2 bilhões de dólares somente nos^{Estados Unidos.} Além disso, a resistência a inseticidas foi documentada em populações estáveis de moscas na Europa ^4,5 e também foi relatada nos Estados^Unidos6. Consequentemente, abordagens de controle genético como a técnica de insetos estéreis (SIT) e sistemas de gene drive representam adições desejáveis aos programas tradicionais de IPM.

Esforços anteriores para desenvolver métodos de controle genético em moscas estáveis, incluindo a geração de cepas genéticas de sexagem para SIT, baseavam-se em seleção e translocação induzida^{por radiação 7,8}. Essas abordagens são laboriosas e limitadas a modificações não transgênicas. Posteriormente, O'Brochta et al.⁹ demonstrou que o uso do sistema transposase de Hermes foi capaz de integrar transgenes em S. calcitrans; no entanto, o protocolo gerou baixa eficiência de transformação, com aproximadamente 0,11% dos embriões injetados produzindo descendentes transgênicos, e produziu uma expressão fraca do marcador da proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) sob o controle de um promotor^{exógeno 9}.

Outras abordagens de manipulação genética, incluindo sistemas CRISPR-Cas, ainda não foram amplamente aplicadas em moscas estáveis, em parte devido à dificuldade de penetrar o corion resiliente de embriões de moscas estáveis. O corion externo duro é comparável ao de outras moscas^{musculosas 10,11}. Tentativas de injetar através do córion usando agulhas de quartzo ou de remover o corion com fita adesiva dupla face foram malsucedidas, exigindo tratamento com uma solução oxidante (hipoclorito de sódio a 3%, NaOCl), que reduz as taxas de eclosão dos ovos.

Moscas estáveis podem ser mantidas a longo prazo em condições laboratoriais, e estágios imaturos são tipicamente criados em substratos celulósicos fermentados, como lascas de madeira, farelo de trigo ou palha suplementadas com fontes de nitrogênio, incluindo suplementos de proteína de bezerro ou lascas de^{peixe 12}. No entanto, esses substratos apresentam várias desvantagens quando usados para criação de embriões microinjetados. Sua opacidade e alta autofluorescência dificultam a identificação de larvas positivas para GFP após a eclosão e a escavação no substrato. Além disso, embora alguma presença bacteriana seja necessária para a sobrevivência^{larval 13}, o meio fermentado introduz comunidades bacterianas e fúngicas imprevisíveis que podem danificar ou consumir embriões antes da eclosão. Essas limitações impediram a recuperação de larvas transformadas usando métodos de injeção e criação já^{descritos 9}, destacando a necessidade de um protocolo de injeção mais confiável que também permita a triagem fluorescente durante todo o desenvolvimento.

Aqui é apresentado um protocolo de microinjeção reprodutível que incorpora melhorias na seleção de transposase, metodologia de injeção e meios de triagem e criação. Essas modificações facilitam o desenvolvimento de moscas estáveis geneticamente modificadas para aplicações que incluem cepas de sexagem genética para SIT, gene drives e knockouts genéticos mediados por CRISPR-Cas. As principais melhorias incluem o uso da piggyBac transposase¹⁴ hiperativa sob controle do promotor estável da proteína de choque térmico (hsp)83, dessecação embrionária para minimizar a perda de ooplasma após a injeção e a eliminação de fita adesiva e óleo de halocarbonetos durante a injeção do embrião.

A recuperação dos embriões injetados foi ainda melhorada pela substituição do meio de criação em massa por placas de ágar nutritiva planas e pigmentadas, inoculadas com um gramado de Escherichia coli. Essa formulação de ágar oferece duas grandes vantagens. Primeiro, fornece uma fonte de alimento bacteriano monogênico previsível para o desenvolvimento larvar. Segundo, fornece um fundo de alto contraste e baixa autofluorescência que facilita a observação da morfologia, desenvolvimento e expressão de GFP em larvas de primeira geração (G0). Moscas domésticas e moscas dos estábulos se desenvolvem e pupam normalmente em placas de ágar à base de gema de ovo inoculadas com E. ^{coli 13,15}. A formulação descrita aqui incorpora pó de carvão ativado como um aditivo não reativo e seguro para alimentos para reduzir ainda mais a fluorescência de fundo.

Protocol

Todos os experimentos e operações foram realizados com aprovação do Comitê Institucional de Biossegurança da Texas A&M (protocolo IBC2019-081). Os reagentes, produtos químicos e ferramentas usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Criação de moscas para produção de ovos

1. Preparando gaiolas para adultos
   1. Ajuste o termostato da câmara incubadora para 28°C e misture 3 kg de cloreto de sódio com ~5 L de água da torneira em uma panela de 10 L, dissolvendo ~50% do sal.
   2. Coloque essa bandeja de salmoura destapada no fundo da câmara incubadora para manter uma umidade em torno de 80% de UM. Mantenha um ciclo 16:8 dia-noite na câmara ou ambiente.
   3. Forre a base das gaiolas para insetos (gaiolas de aço inox/alumínio de 30 x 30 cm com rede de malha) com duas camadas de papel toalha e coloque um copo descartável de 45 mL cheio de açúcar granulado sobre a camada de papel toalha (Figura 1A).
      NOTA: As toalhas de papel ajudam a absorver as moscas, e o açúcar fornece uma fonte de alimento antes da alimentação sanguínea.
   4. Encha um béquer Griffin de 250 mL com aproximadamente 100 mL de água da torneira em temperatura ambiente e coloque um quadrado de tecido preto de algodão de 20 cm x 20 cm (cortado de fronha ou lençóis pretos simples) na água até que o tecido fique umedecido. Ajuste o tecido preto para que suas bordas se estendam 1-2 cm além da borda do béquer (Figura 1B).
      NOTA: Esse pano úmido fornece tanto água líquida quanto uma superfície de oviposição para moscas adultas. A morte pode ocorrer rapidamente se os adultos não tiverem acesso a uma fonte de umidade.
   5. Transfira de 500 a 1.500 pupas de moscas estáveis para um pequeno recipiente ou béquer e coloque-as na gaiola dos insetos. Coloque a gaiola de adulto na câmara de criação úmida (passo 1.1.1) e monitore diariamente a eclosão. Após a emergência dos adultos, inicie a alimentação diária com sangue bovino citado (seção 1.2).
2. Alimentando moscas adultas
   1. Prepare sangue bovino citado adicionando uma concentração final de 10,9 mM de diidrato de citrato trissódico ao sangue bovino recém-coletado.
   2. Brevemente, suspenda ~12,8 gramas de sal de citrato em um volume mínimo de água desionizada e adicione aos 4 litros de sangue coletados no matadouro local.
      NOTA: Recipientes de sangue devem ter tampas rosqueadas (por exemplo, garrafas quadradas, de boca larga, grip de 4L) e devem ser limpos cuidadosamente com água e sabão morno antes do uso. No matadouro, evite coletar o primeiro ~1 litro de sangue bovino de um animal abatido para minimizar a contaminação com pelos, suor, sujeira e outros coagulantes.
   3. Congele sangue bovino citado em 200 mL de alíquotas e descongele conforme necessário, mantendo as alíquotas descongeladas refrigeradas a 4°C por até uma semana.
   4. Forneça ~40 mL de sangue em temperatura ambiente por 600 moscas para cada gaiola adulta.
   5. O sangue pode ser oferecido em um recipiente de condimentos ou béquer, e uma esponja de algodão dobrada e não estéril deve ser inserida no vaso para absorver o sangue. Agite o pavio até que o algodão fique totalmente saturado e insira-o na gaiola.
      NOTA: O sangue deve ser trocado diariamente a partir de 24 horas após a eclosão.
3. Coleta de ovos
   1. Uma vez que os ovos estiverem observados no tecido preto de algodão, retire o pano do béquer e lave os ovos em um recipiente plástico raso separado de ~700 mL usando uma garrafa de lavar (Figura 2A). A oviposição normalmente ocorre quando as moscas têm entre 7 e 10 dias de idade.
      NOTA: Verifique os copos de sangue para ovos também e colete quaisquer ovos que possam estar depositados lá.
   2. Colete os ovos em papel filtro por meio de filtragem a vácuo. Isso é feito colocando um papel filtro preto em um funil Buchner, aplicando um vácuo e depois despejando os ovos do passo 1.3.1. sobre a montagem.
   3. Depois, transfira os ovos para um cilindro graduado ou tubo microcentrífuga graduado de 1,7 mL usando um frasco de lavagem e registre o volume de ovos coletados (Figura 2B).
      NOTA: Evite imersão prolongada dos ovos na água, pois a mortalidade começa a aumentar ~10 minutos após a imersão.
4. Preparação de meios larvais a granel
   1. Colete materiais para mídia larvaria a granel (Figura 3A), conforme descrito na Tabela 1.
   2. Em um béquer de 1000 mL, adicione o suplemento de proteína da bezerro e toda a água da torneira. Deixe reidratar durante a noite em temperatura ambiente.
   3. Adicione o farelo de trigo e a vermiculita em um recipiente separado e maior.
   4. Após a reidratação durante a noite, mexa bem o suplemento de bezerro reidratado para quebrar os tufos, depois despeje a mistura no recipiente com farelo de trigo e vermiculita. Misture bem até que fique homogêneo e todo o farelo de trigo tenha sido coberto com a pasta do suplemento para bezerros.
   5. Transfira o meio a granel para um recipiente de armazenamento de alimentos de polipropileno em uma camada de ~8 cm de profundidade cobrindo todo o fundo do recipiente (Figura 3B).
   6. Adicione ~1.000 embriões (aproximadamente 0,2 mL de óvulos por 2,2 L de meio a granel) coletando embriões via .filtragem a vácuo em um papel filtro circular de 90 mm de diâmetro e então colocando o papel com ovos virados para baixo no centro da caixa de mídia (Figuras 3B, C).
   7. Cubra o papel de filtro com ~1 cm de meio para reter a umidade (Figura 3C) e cubra o recipiente com um retângulo grande de tecido preto de algodão, com 5 cm de tecido de algodão saliente se estendendo além da borda do recipiente.
   8. Corte um grande buraco (~12 cm de diâmetro) na tampa do recipiente de alimentos para permitir a troca de gases e encaixe a tampa no recipiente de mídia enquanto prende o pano de algodão preto entre o recipiente e a tampa (Figura 3D).
      NOTA: Isso serve como uma junta, evitando que a abertura entre a tampa e o recipiente prenda larvas de^1º ínstar em gotículas de condensação.
   9. Coloque o recipiente de mídia finalizado na câmara de criação dos adultos até a pupação e monitore o desenvolvimento larval (Figura 4) (a pupação ocorre em ~10 dias, dependendo da temperatura do meio e densidade larval).
      NOTA: A cobertura de tecido deve ser fina o suficiente para impedir a passagem das larvas do primeiro estádio, mas permeável o bastante para evitar a formação de condensação nas paredes internas dos compartimentos de mídia, que pode prender e afogar as larvas.
5. Separação das pupas
   1. Remova o pano das caixas de pupas e recolha as pupas com uma colher ou conherente.
      NOTA: Pupas de moscas estáveis aparecem como cilindros vermelho-marrom não móveis, de 4 a 7 mm de comprimento, em contraste com as larvas móveis amarelo-esbranquiçadas. As pupas normalmente se acumulam no perímetro externo das paredes do recipiente ou em posições úmidas e elevadas dentro do compartimento de mídia, à medida que as moscas começam a metamorfose, de larvas para pupas e depois adultas.
   2. Coloque de 500 a 1.500 pupas com ~1 cm de profundidade em um recipiente e coloque em uma nova gaiola limpa, conforme descrito na seção 1.1, para propagar a próxima geração.

Figura 1: Materiais de criação de moscas adultas. (A) Gaula de criação de moscas adultas mostrando a taça de sacarose (S) e a taça de oviposição (O). (B) Copo de oviposição preparado com pano de algodão preto saturado em água, que se estende um pouco além da borda do béquer. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Coleta de ovos. (A) Coleta de ovos do pano de oviposição usando uma garrafa de lavagem. (B) Recuperação dos ovos por filtração a vácuo em papel filtro de alto contraste. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Materiais para Material Larval a Granel
Reagente	Missa (g)
Água	900
Farelo de trigo	230
Suplemento para panturrilhas	100
Vermiculita (grosso A4)	70
Materiais para Soluções de Descorionização
Solução	Composição
Banho oxidante	Hipoclorito de sódio a 3% em água desionizada
Banho de lavagem	Solução de 0,02% do Triton X-100 em água desionizada
Enxágue	Água desionizada
Materiais para Placas de Criagem e Criação de Ágar Preto
Reagente	Missa (g)
Água	500
Gemas de ovo em pó	18
Carvão ativado	4
Cloreto de sódio	1

Tabela 1: Reagentes para substratos larvais a granel, soluções de decorionização e placas de ágar preto. Reagentes usados para a preparação de meio larval a granel para manutenção da colônia, bem como para a composição de soluções usadas para enfraquecer e remover o corion de embriões de moscas estáveis, e materiais necessários para preparar 500 mL de meio de triagem e criação de ágar preto.

Figura 3: Preparação de meio larvario a granel. (A) Materiais usados para preparação de meio larval a granel: suplemento de proteína de bezerro (CM), farelo de trigo (WB), vermiculita (VM), recipiente de armazenamento (SC), tampa (L) e junta de tecido (FG). (B) Mistura completa dos componentes da mídia. (C) Colocação do papel filtro coberto com ovo (EP) virado para baixo na superfície do meio e cobertura adicional para evitar a dessecação. (D) Instalação da junta de algodão entre o recipiente e a tampa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Desenvolvimento larval em meio a granel. Recipientes transparentes permitem monitoramento do desenvolvimento larvar e da condição do meio. Larvas (L) são visíveis nas paredes do recipiente, na tampa e dentro do meio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Preparação para injeção: descoriação e dessecação

1. Coloque um pano de algodão preto umedecido em um béquer, conforme descrito no passo 1.1.4, e transfira-o para uma gaiola de adulto por 25 minutos para coletar ovos. Enxágue os ovos em uma peneira de aço inoxidável de 106 μm usando um frasco de lavagem.
   NOTA: Um período de coleta de 25 minutos normalmente resulta em aproximadamente 400 ovos.
2. Deixe os embriões descansarem tranquilos na peneira por mais 30 minutos.
3. Enquanto os embriões envelhecem, prepare 150 mL de cada uma das soluções oxidantes, lavadoras e de enxágue descritas na seção "Materiais para Soluções de Descorionização" da Tabela 1 (Figura 5). Use volume suficiente para cobrir os embriões com aproximadamente 1 cm de solução.
4. Imerga a peneira contendo embriões no banho oxidante por 2 minutos e agite suavemente os embriões usando uma pipeta Pasteur (Figura 6A).
   NOTA: A aspiração repetida e a dispensação de solução para criar um vórtice circular ajudam a concentrar os embriões no centro da peneira e impedem que embriões recém-descorionados aderam às paredes da peneira.
5. Remova a peneira do banho oxidante e tire a solução em excesso. Transfira a peneira para a solução de lavagem e agite por aspiração e dispensa por 2 minutos.
6. Transfira a peneira contendo embriões para a solução de enxágue e agite conforme descrito no passo 2.4. por 2 minutos. Retire a peneira da solução de enxágue e tire o excesso de água.
7. Coloque uma cobertura de vidro estéril sobre a peneira e, sob um microscópio de dissecação, use um pincel de nylon de ponta fina para transferir embriões (Figura 6B) da peneira para a borda da tampona. Posicione os embriões próximos uns dos outros sem permitir que se toquem, com o polo posterior mais largo voltado para a borda do coverslip. Evite dobrar, distorcer ou rasgar embriões durante a transferência.
8. Prepare uma câmara de dessecação cobrindo o fundo de um frasco de 1 L com 100 mL de dessecante de sulfato de cálcio e selando o frasco com uma rolha de borracha.
   NOTA: Após 24 horas de equilíbrio, a câmara de dessecação normalmente atinge uma umidade relativa de <5% a 23 °C.
9. Remova o excesso de água do manta e coloque o revestimento contendo embriões decorionados sobre o dessecante. Feche novamente o cantil com uma rolha de borracha e desidrate os embriões por 8 minutos.
10. Remova o coverslip da câmara de dessecação e coloque-o no palco do microscópio sob uma meta de 20× para microinjeção.

Figura 5: Soluções de decorionação. Da esquerda para a direita: peneira de aço inoxidável, solução oxidante, solução de lavagem e solução de enxágue usada para descorionação embrionária. O hipoclorito de sódio é mantido como uma solução original de 6% protegida da luz, e o Triton X-100 é mantido como solução original de 10× e diluído até uma concentração final de 0,02% antes do uso. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Decorionização embrionária. (A) A aspiração suave e a dispensação da solução geram um vórtice que concentra os embriões no centro da peneira e reduz a adesão às paredes do crivo. (B) Embrião descoriionado emergindo do córion translúcido após o enxágue. O polo anterior (extremidade mais estreita) normalmente emerge antes do polo posterior. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Microinjeção

1. Retire agulhas de microinjeção de quartzo de capilares de vidro filamentados de 100 mm (DI. 0,7 mm, O.D. 1,0 mm) usando os parâmetros listados na Tabela 2. Guarde as agulhas em um local sem poeira até o uso.
   NOTA: Agulhas de borosilicato com geometria semelhante também podem ser usadas.
2. Prepare o tampão de injeção (0,1% w/v de fenol vermelho em soro salino tamponado com fosfato (PBS), pH 7,4) e filtre esterilize através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
3. Prepare 20 μL de mistura de injeção combinando 10 μg de cada plasmídeo auxiliar piggyBac e plasmídeo doador, que contém a carga genética entre as repetições terminais invertidas esquerda e direita do piggyBac, com 4 μL de buffer de injeção. Dilua até uma concentração final de 500 ng/μL usando água livre de nuclease.
   NOTA: O plasmídeo auxiliar compreende a sequência promotora hsp83 de 3,1 kb a montante do códon inicial hsp83 . e a sequência codificante da transposase piggyBac hiperativa.
4. Transfira a mistura de injeção para um filtro de seringa PTFE de baixo volume de 0,20 μm e coloque o filtro na abertura de um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL (Figura 7A). Centrifuge a ≥11.000 x g por 10 minutos ou até que toda a mistura de injeção passe pelo filtro. Armazene a mistura de injeção não utilizada a -20 °C.
5. Preencha uma agulha de microinjeção de quartzo com aproximadamente 2 μL de mistura de injeção usando uma ponta de micro-gel de pipeta (Figura 7B). Evite introduzir bolhas de ar durante o carregamento.
   NOTA: Oriente a agulha de microinjeção paralela ao eixo longo do embrião e mantenha o deslocamento angular horizontal e vertical zero para minimizar rasgões e cisalhamentos.
6. Bata suavemente a ponta da agulha contra a borda de uma lâmina de vidro até que a mistura de injeção flua pela ponta da agulha (Figura 7C).
   NOTA: Quebre a ponta da agulha gradualmente para criar a menor e mais nítida abertura que ainda permita o fluxo de injeção e mistura.
7. Injete o embrião pelo polo posterior imediatamente após a dessecação, utilizando aproximadamente 700 hPa de pressão de injeção e 300 hPa de contrapressão.
8. Perfure suavemente o embrião e injete aproximadamente um décimo do volume embrionário com a mistura de injeção (Figura 7D–F).
   NOTA: Minimize a penetração da agulha para diminuir a perturbação da membrana vitelina e evitar a perda de ooplasma durante a retirada da agulha.
9. Transfira o revestimento para uma placa de Petri revestida com um papel filtro preto estéril e umedecido de 90 mm imediatamente após a injeção e incube em temperatura ambiente por 48 horas.
   NOTA: Conclua todas as injeções dentro de 2 horas após a oviposição para atingir embriões antes do estágio sincicial.
10. Examine embriões para eclosão a cada 12–16 horas. Transfira as larvas recém-eclodentes e o revestimento de vidro para uma placa de ágar inoculada e condicionada preparada conforme descrito na seção 4.

Parâmetro	Calor	Fil	Vel	Del	Puxe
Valor	825	5	60	150	175

Tabela 2: Parâmetros de Puxada da Agulha. Parâmetros usados para gerar agulhas de microinjeção de quartzo.

Figura 7: Microinjeção de embriões. (A) Filtragem da mistura de injeção usando um filtro de seringa aninhado em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL. (B) Carregamento da mistura filtrada de injeção em uma agulha de microinjeção usando uma ponta de pipeta com carregamento de gel. (C) Geometria terminal de uma agulha de microinjeção de quartzo. (D) Alinhamento da agulha com o polo posterior do embrião. (E) Penetração da superfície do embrião minimizando a perturbação da membrana vitelina. (F) Injeção de aproximadamente um décimo do volume do embrião seguida de retirada da agulha. Maior transparência indica deslocamento do ooplasma pela mistura de injeção. Barra da escala = 400 μm (D–F) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Preparação de placas tratadas

1. Formulação do meio de ágar
   1. Prepare o meio descrito na seção "Materiais para Placas de Criagem e Criação de Ágar Preto" da Tabela 1 e o autoclave por 15 minutos a 121 °C. Despeje o ágar a 40 °C ou armazene-o em temperatura ambiente antes de reaquecê-lo e dispensá-lo em placas de Petri de 90 mm.
      NOTA: Gire vigorosamente antes de despejar para ressuspender partículas sólidas.
2. Inoculação de placas
   1. Dilua uma cultura de 24 h de K12 Escherichia coli. para OD600 = 0,200 no caldo Luria-Bertani e dispense 200 μL em uma placa de ágar resfriada e solidificada. Espalhe a cultura uniformemente usando esferas de vidro estéreis ou um espalhador de vidro e permita que a placa absorva o excesso de umidade (Figuras 8A, B).
      NOTA: Use placas de ágar dentro de 1 mês após o despejo ou descarte-as para garantir um crescimento confiável de bactérias e larvas.
3. Condicionamento de placas
   1. Dobre 6 × 6 cm de papel filtro preto para criar 6 a 10 saliências onduladas e esterilize assando ou autoclavando. Coloque um papel filtro corrugado estéril assépticamente sobre a placa de Petri inoculada e umedeça com várias gotas de água estéril (Figura 8C).
   2. Esterilize em superfície larvas de primeiro estádio do tipo selvagem (WT) não tratadas e não injetadas e transfira 10 larvas para o papel filtrante umedecido.
      NOTA: Esterilize os embriões de WT mergulhando-os em água sanitária a 10% (0,6% NaOCl) por 1 minuto, seguido de enxágue em água desionizada estéril por 2 minutos.
   3. Coloque um papel de filtro de 90 mm entre a tampa e o corpo da placa de Petri para atuar como uma junta.
   4. Permita que as larvas de WT condicionem as placas por 24 horas antes de adicionar embriões injetados em coberturas de vidro (Figura 8C). Remova as larvas de WT após a eclosão dos primeiros embriões injetados.

Figura 8: Preparação da placa de ágar e recuperação pós-injeção. (A) Inoculação de placas de ágar com um OD600 = 0,2 cultura de Escherichia coli usando esferas de vidro estéreis. (B) Absorção do excesso de umidade superficial antes da transferência do embrião. (C) Colocação de uma junta de papel filtro de 90 mm entre a tampa e o corpo da placa de Petri. (D) Triagem de larvas para marcadores fluorescentes em placas de ágar condicionadas. Embriões injetados são recuperados em um papel filtro de 90 mm saturado em água desionizada, colocado na tampa de uma placa de Petri invertida e incubados por 48 horas antes de serem transferidos para placas de triagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Results

Usando esse protocolo, 431 embriões de moscas estáveis foram decorionizados e injetados com plasmídeo doador piggyBac-Hsp83 e plasmídeo auxiliar Hsp83 a uma concentração final de 500 ng/μL. Dos 431 embriões injetados, 18 larvas ZsGreen-positivas (4,2%) e 8 ZsGreen-negativas (1,9%) eclodiram 48-76 horas após a injeção quando crivadas em placas de ágar de carbono preto (Tabela 3). No total, 26 dos 431 embriões injetados eclodiram (6,0%) e 16 das 26 larvas ecloderam até a idade adulta (61,5%).

Espécies	Tipo de injeção	Construto	# injetado	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Pupas	ZsGreen(-) Pupas	ZsGreen(+) Adultos	ZsGreen(-) Adultos	# Adultos produzindo descendentes ZsGreen(+)
Stomoxys calcitrans	Inserção de transposase	Hsp83:hy-pBac (ajudante, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (doador, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Inserção de transposase	Hsp83:hy-pBac (ajudante, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (doador, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabela 3: Estatísticas de Injeção. Taxas de sobrevivência, transformação e recuperação após microinjeção embrionária.

Das 18 larvas G0 ZsGreen-positivas, 12 sobreviveram até a pupação (66,7%) e 10 eclosionaram como adultas. Seis adultos ZsGreen-positivos (1,4% dos embriões injetados, 60% dos sobreviventes férteis de G0) produziram descendentes ZsGreen-positivos. Esses descendentes (Figura 9A–E) foram autocruzados e mantiveram fluorescência por seis gerações até o momento da redação.

Entre as oito larvas ZsGreen-negativas, seis sobreviveram até a idade adulta (75%). Nenhum dos adultos não fluorescentes produziu descendentes fluorescentes.

Figura 9: Triagem fluorescente de moscas transgênicas. (A) Comparação entre larvas de F1 que expressam ZsGreen e larvas de WT. (B) Fluorescência visível através da cutícula pupal, permitindo triagem transgênica no estágio pupal. (C,D) Comparação de três larvas e pupas que expressam ZsGreen (à esquerda) com três larvas e pupas WT (à direita) sob iluminação de luz branca (C) e fluorescência (D). (E) Mosca transgênica adulta F1 expressando ZsGreen (esquerda) em comparação com uma mosca adulta WT (direita). Barras de escala = 1 mm (A), 2 mm (B,E) e 3 mm (C,D). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussion

A transformação genética de espécies de insetos não modelo continua sendo um grande gargalo no desenvolvimento e avaliação de estratégias de controle genético para pragas e vetores de artrópodes.

Para moscas estáveis, o protocolo descrito aqui reduz o tempo, os recursos, o trabalho e a variabilidade associados à injeção e criação de moscas G0 após a microinjeção embrionária. Além disso, o uso de placas de triagem de ágar preto permite a observação direta do desenvolvimento ao longo do ciclo de vida, facilitando a identificação e correção de problemas que surgem durante a injeção, recuperação e criação larval. Utilizando os construtos plasmídicos avaliados neste estudo, o protocolo gerou linhas de moscas estáveis transgênicas com menos embriões injetados do que os métodos previamente^{relatados 9}. Embora esteja fora do escopo deste artigo sobre métodos, a confirmação e localização dos sítios de inserção de transgenes podem ser realizadas usando abordagens estabelecidas, como PCR inversa e PCR por splinkerette.

Um protocolo eficiente de injeção também facilita estudos futuros em genômica funcional, incluindo caracterização de promotores usando repórteres fluorescentes; competência vetorial, por meio de análises genéticas reversas de genes associados à transmissão de patógenos; caracterização de nuclease, incluindo avaliação de CRISPR-Cas9 e outras nucleases programáveis em moscas estáveis; pesquisa sobre resistência a inseticidas por meio da modificação de alelos candidatos à resistência; e investigações de biologia básica, incluindo genes envolvidos na alimentação sanguínea, acasalamento e desenvolvimento. Nosso protocolo também elimina a necessidade de injeções embrionárias imersas em óleo e câmaras de umidade oxigenadas para recuperação pós-injeção, conforme documentado em literatura anterior sobre transformação doméstica Musca e Lucilia cuprina ^{piggyBac 16,17}.

Vários parâmetros são críticos para o sucesso da transgênese. A dessecação embrionária e o momento da injeção são particularmente importantes porque o DNA plasmídico deve ser introduzido antes da celularização para garantir a incorporação às células precursoras da linhagem germinativa. No entanto, o momento exato da formação do sincitício em embriões de moscas estáveis permanece desconhecido. Além disso, a taxa de desenvolvimento embrionário é influenciada pela temperatura, e o cronograma de desenvolvimento de embriões de moscas estáveis sob diferentes condições ambientais ainda não foi totalmente caracterizado. Pesquisas futuras sobre as taxas de desenvolvimento e embriogênese de cepas de laboratório de moscas estáveis podem fornecer insights para otimizar protocolos de microinjeção e transformação, aumentando assim ainda mais a eficiência e a reprodutibilidade do protocolo. No entanto, até lá, determinar a janela ideal de injeção permanece uma limitação metodológica que pode afetar a eficiência da transformação. Quando as taxas de sobrevivência são baixas, a solução de problemas pode ser realizada comparando as taxas de eclosão e de sobrevivência adulta entre embriões não tratados, embriões descorionados, embriões injetados com PBS esterilizado por filtro e embriões WT criados em placas de ágar. A literatura anterior descrevendo a transformação da musca doméstica resultou em 14 eventos de integração de 1.668 injeções (0,84% das injetadas⁾¹⁶, e a transformação da praga ovina Lucilia cuprina estabeleceu 3 linhagens transgênicas a partir de aproximadamente 900 injeções embrionárias (0,33% das injetadas⁾¹⁷, sugerindo que o protocolo de transformação de moscas estáveis descrito neste protocolo (6 eventos de integração em 431 injeções, 1,4% dos injetados) oferecem uma melhora na eficiência da injeção em comparação com outras espécies de dípteros pragas na literatura.

O promotor constitutivo da mosca estável hsp83 forneceu expressão robusta de ZsGreen durante todo o desenvolvimento e apoiou a expressão da transposase piggyBac hiperativa durante o início da embriogênese, melhorando assim a visibilidade dos marcadores fluorescentes e a eficiência da transformação em comparação com um protocolo de transformação de moscas^{estáveis previamente relatado 9}. O plasmídeo auxiliar utilizado neste estudo foi gerado subclonando 3,1 kb de DNA genômico imediatamente a montante do códon inicial hsp83 em um vetor plasmídico mínimo a montante da sequência codificante da transposase piggyBac hiperativa. A proporção entre ajudante e plasmídeo de carga foi estabelecida empiricamente em 1:1 em massa e foi usada durante todo o estudo. Embora razões de plasmídeos adicionais não tenham sido avaliadas, razões alternativas também podem se mostrar eficazes.

As melhorias descritas aqui podem ser aplicáveis a protocolos de transgênese para outros artrópodes. Além disso, o sistema de triagem e criação baseado em ágar está sendo atualmente aplicado à injeção e triagem de embriões de mosca-soldado preta (Hermetia illucens). O protocolo pode ser particularmente útil para esforços de transgênese em outras moscas muscidas, incluindo Musca domestica e Haematobia irritans, devido à sua ecologia larval semelhante e desenvolvimento em substratos fibrosos em decomposição. O uso de placas de ágar inoculadas com Escherichia coli pode fornecer uma abordagem prática para o monitoramento pós-injeção, permitindo que os pesquisadores avaliem o desenvolvimento embrionário, morfologia larval, expressão de marcadores, taxas de eclosão e recuperação geral. Adaptar o componente bacteriano do meio à biologia da espécie-alvo pode aumentar ainda mais a utilidade dessa abordagem para desenvolver e otimizar protocolos de transgênese.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Dessication chamber
Bacto Agar	Difco	281230	Agar para placas de ágar preto
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Tecido de algodão preto para copos de coleta de ovos e junta de tecido para caixas de criação larval
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Dessicante para câmara de dessecação
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Meio larval a granel
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Microscópio de injeção
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Fonte de nutrientes para placas de ágar preto
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bactéria usada em placas de ágar preto
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Fornecimento de pressão de microinjeção
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Transferência de embriões
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Capilares para puxar agulhas
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Manuseio de amostras
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Mantém os embriões durante a decorioonação
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Solução de água sanitária para remover o corion
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Recipiente de meio larval a granel
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Coleta de embriões
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	LB broth para cultura de E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Microscópio para movimentar e alinhar embriões
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Usado para carregar a mistura de injeção nas agulhas
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Micromanipulador para injeção
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Usado para filtrar a mistura de injeção
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Buffer de injeção
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigmento para placas de ágar preto
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Dispositivo para puxar agulhas de capilares
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Buffer de injeção
Petri plates	VWR	391-0609	Placas petri para placas de ágar preto
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Corante para injeção
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Plug da câmara de dessecação
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Meio larval a granel
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Lâminas de vidro para microinjeção
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Lâmpada fluorescente e filtros para triagem de larvas
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Espalhar bactérias nas placas
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Lavar embriões durante a decorioonação
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Dechorioonando embriões
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Lavar embriões das superfícies