Um modelo tridimensional de angiogênese baseado em microesferas usando células endoteliais em veias umbilicais humanas

Resumo

Este protocolo descreve um modelo tridimensional de angiogênese baseado em microesferas de transportadores, utilizando células endoteliais da veia umbilicais humana. O ensaio permite a visualização direta do brotamento endotelial e da formação de estruturas semelhantes a lúmenes, podendo ser aplicado a estudos de mecanismos angiogênicos e intervenções terapêuticas.

Resumo

A angiogênese é um processo biológico em múltiplas etapas envolvendo ativação, migração, elongamento, formação do lúmen, ramificação e anastomose das células endoteliais. Sistemas convencionais de cultura bidimensional são úteis para a avaliação preliminar de medicamentos, genes ou condições de cultura, mas não recapitulam adequadamente a organização espacial da morfogênese endotelial dentro de uma matriz extracelular tridimensional. O presente protocolo descreve um ensaio tridimensional de angiogênese baseado em microesferas de transportadores, utilizando células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os HUVECs são inicialmente semeados em esferas microtransportadoras contendo colágeno suíno tipo I desnaturado por ácido quimicamente acoplado e depois incorporados em uma matriz de membrana basal. Fibroblastos mucosos orais são posteriormente semeados sobre o gel para fornecer suporte paracrino ao brotamento endotelial e à formação de estruturas semelhantes a vasculares. O meio de cultivo é substituído a cada 2 dias, e o comportamento de germinação e os fenótipos angiogênicos são monitorados por microscopia invertida. Sob condições apropriadas de cultura, brotos endoteliais emergem em poucos dias, seguidos pela formação de estruturas semelhantes a lúmen e conexões entre brotos. Esse método oferece uma plataforma conveniente e reprodutível para estudos in vitro de morfogênese endotelial e pode ser aplicado ainda em investigações de manipulação gênica, intervenção farmacológica e modelagem de doenças.

Introdução

O brotamento endotelial é um evento chave na angiogênese e envolve a emergência, migração, proliferação e alinhamento de células endoteliais a partir de estruturas vasculares pré-existentes, seguida pela formação do lúmen e o estabelecimento de redes vasculares^{interconectadas 1,2}. Embora sistemas convencionais de cultura bidimensional e ensaios de formação de tubos baseados em gel sejam tecnicamente simples, eles são limitados em sua capacidade de recapitular a remodelação espacial de células endoteliais em um microambiente^{tridimensional 3,4}. O ensaio clássico de germinação tridimensional baseado em microesferas de transportadores reproduz vários estágios de angiogênese in vitro, incluindo germinação endotelial, alongamento, formação de lúmen e montagem de rede, tornando-se assim um método amplamente utilizado para pesquisas em angiogênese.

No protocolo atual, foi estabelecido um modelo tridimensional de germinação baseado em microesferas de transportadores, utilizando células endoteliais normais de veias umbilicais humanas. Com base em ensaios de germinação de microesferas endoteliais^{de microtransportadores anteriormente relatados 5,6,7}, esse método preserva a estrutura básica do revestimento celular endotelial sobre microesferas de transportadores, incorporando em uma matriz tridimensional e a cultura de fibroblastos, enquanto substitui o gel convencional de fibrina por uma matriz de membrana basal para simplificar o procedimento e facilitar a obtenção rotineira de imagens. A matriz de membrana basal foi selecionada neste protocolo modificado por várias razões práticas e biológicas. Experimentalmente, fornece uma matriz tridimensional pronta a usar que permite a rápida formação de gel, embedding simples de esferas e observação microscópica rotineira conveniente, sem as etapas adicionais de polimerização exigidas para a preparação do gel de fibrina. Biologicamente, a matriz da membrana basal contém componentes da matriz extracelular que apoiam a adesão das células endoteliais, migração, extensão dos brotos e formação de estruturas semelhantes a lúmenes. Portanto, essa modificação é adequada para estudos que exigem visualização direta do comportamento de germinação endotelial, comparação de fenótipos angiogênicos e avaliação de intervenções farmacológicas ou genéticas em um ambiente de cultura tridimensional. No entanto, como a matriz da membrana basal difere do gel de fibrina em composição da matriz, propriedades mecânicas, degradabilidade e sinais bioativos, o presente ensaio deve ser interpretado como um modelo de germinação baseado em microesferas de transportadores modificado, e não como uma substituição direta do ensaio clássico baseado em fibrina. Essas diferenças relacionadas à matriz podem influenciar a cinética do brotamento, a estabilidade do lúmen e a morfologia da rede, e devem ser consideradas ao comparar resultados entre diferentes sistemas tridimensionais de angiogênese. Esse modelo é adequado para observar o comportamento de germinação endotelial em três dimensões e pode ser aplicado posteriormente a estudos de intervenção farmacológica, manipulação gênica e mecanismos angiogênicos.

Protocolo

As células endoteliais da veia umbilical humana usadas neste protocolo foram isoladas e cultivadas a partir de tecidos do cordão umbilical humano coletados no Departamento de Obstetrícia do Primeiro Hospital Popular da Província de Yunnan. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os doadores antes da coleta da amostra. Todos os procedimentos envolvendo materiais de origem humana foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica do Primeiro Hospital Popular da Província de Yunnan (aprovação nº KHLL2023-KY198). Fibroblastos mucosos orais humanos (HOMFs) foram gentilmente fornecidos pelo grupo de pesquisa da Dra. Jiemei Zhai no Hospital Estomatológico Afiliado da Universidade Médica de Kunming. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da célula

1. Cultive células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) em meio de crescimento de células endoteliais, suplementado com soro fetal bovino adicional (FBS), até uma concentração final de 10% a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. As células usadas para o ensaio devem estar livres de contaminação, apresentar crescimento estável e estar na fase de crescimento logarítmico. Use as células nas passagens 4–6.
2. Cultive fibroblastos mucosos orais humanos (HOMFs) em meio basal de alta glicemia, suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10% a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. Use as células nas passagens 4–6.
3. Antes do revestimento com microesferas de transportadores, confirme que ambos os tipos celulares estão em uma confluência apropriada. Evite culturas excessivamente confluentes ou digestão enzimática excessiva, pois podem afetar negativamente a germinação subsequente.

2. Preparação de contas microtransportadoras

1. Hidrate 0,5 g de microesferas secas em 50 mL de PBS por pelo menos 3 horas. Após a lavagem, ressuspenda as esferas em 50 mL de PBS para obter uma suspensão microtransportadora de 10 mg/mL, correspondendo a aproximadamente 3 × 10⁴ esferas/mL.
2. Transfira a suspensão para um frasco de vidro siliconado, esterilize-a autoclavando a 115 °C por 15 minutos e armazene a 4 °C até o uso.
3. Antes do revestimento das células endoteliais, remova a solução de armazenamento e lave as esferas com PBS estéril. Equilibre as esferas no meio de crescimento das células endoteliais a 37 °C por pelo menos 30 minutos.
4. Suspenda suavemente as esferas equilibradas imediatamente antes do uso para evitar sedimentação e agregação de contas.
5. Antes do revestimento celular, examine uma pequena alíquota da suspensão da esfera sob um microscópio invertido. Proceda somente quando as esferas estiverem totalmente hidratadas, suspensas uniformemente e livres de agregados visíveis ou partículas fragmentadas.

3. Revestir células endoteliais em esferas microtransportadoras

1. Descolhe os HUVECs usando tripsina e resuspenda as células em um meio de crescimento endotelial.
2. Revestir as microesferas transportadoras com uma densidade de 1.500 células por conta. Misture 3 ×^{10 6} HUVECs com 2.000 microesferas de transportadores em 1,5 mL de meio de crescimento endotelial de células.
3. Transfira a mistura celular-esferas para um tubo de microcentrífuga e incube por 12 horas em uma incubadora de cultura celular. Durante todo o período de incubação de 12 horas, inverta suavemente o tubo a cada 20 minutos para manter contato adequado entre as células e as esferas e promover a fixação uniforme das células endoteliais.
4. Após 12 horas, transfira as esferas revestidas para um frasco^{de 2} culturas de 2 células de 25 cm contendo 4 mL de meio de crescimento endotelial e continue a incubação durante a noite para permitir a fixação firme das células endoteliais à superfície da microesfera transportadora.
5. Antes de embebedar, examine esferas representativas revestidas sob um microscópio invertido. Prossiga para a imersão da matriz apenas quando mais de 80% das esferas examinadas apresentarem uma camada celular endotelial contínua e relativamente uniforme na superfície da esfera, com células flutuantes mínimas, sem aglomerações celulares evidentes e sem agregação severa das contas. Esferas com revestimento irregular, grandes agrupamentos celulares ou agregação extensa não devem ser usadas para embedding.
6. Se as contas aderirem ao fundo do cantil, agite suavemente o frasco para liberá-las. Evite pipeteamento vigoroso, que pode causar agregação de esferas ou descolamento celular.

4. Incorporar as contas revestidas em uma matriz tridimensional

1. Transfira as esferas microtransportadoras revestidas por células endoteliais para um tubo centrífuga de 15 mL e permita que as esferas se assentem por gravidade. Remova o excesso de meio e adicione um volume apropriado de meio fresco.
2. Misture a suspensão das esferas microtransportadoras com a matriz de membrana basal pré-fria em uma proporção 1:1 (v/v) para obter uma concentração final de 500 esferas/mL.
3. Adicione 100 μL da suspensão matricial ao centro de cada poço de uma placa de 24 poços, permitindo que a mistura forme uma única gota de gel em forma de cúpula sem tocar a parede do poço. Misture delicadamente a suspensão imediatamente antes de dispensar e evite introduzir bolhas de ar.
4. Deixe a placa de 24 poços em temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a gelificação inicial e estabilização da gota de gel. Depois, incube a placa em pé a 37 °C em 5% de CO₂ por 15 minutos, seguida de mais 15 minutos de incubação na posição invertida para garantir a gelificação completa e a formação adequada do gel.
5. Depois que o gel estiver totalmente solidificado, proceda imediatamente à cultura de sobreposição de fibroblastos.

5. Cultura de sobreposição de fibroblastos

1. Resuspenda 3 × 10⁴ fibroblastos mucosos orais humanos (HOMFs) em 1 mL de meio de crescimento de células endoteliais e adicione suavemente a suspensão celular ao longo da parede de cada poço, permitindo que as células se distribuam pela superfície do gel sem prejudicar diretamente a cúpula do gel.
2. Continue a incubação em meio de crescimento celular endotelial a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. Fibroblastos mucosos orais humanos são usados como células de suporte porque fornecem sinais paracrinos derivados do estroma que promovem a extensão dos brotos endoteliais, a estabilização e a remodelação vascular no sistema de cultura tridimensional.

6. Manutenção da cultura e observação microscópica

1. Troque o substrato de cultura a cada 2 dias. Durante as trocas de meio, aspire lentamente o meio gasto e adicione meio de cultivo fresco ao longo da parede do poço para evitar perturbar o gel.
2. Observe as culturas diariamente ou dia sim, dia não, sob um microscópio invertido, usando o modo campo claro ou contraste de fase. Para análise quantitativa longitudinal, selecione múltiplos campos de visão em cada poço no dia 7 e fotografe os mesmos campos predefinidos nos dias 9 e 11.
3. Em condições ideais de cultura, o brotamento endotelial evidente é tipicamente observado nos dias 4–6, estruturas semelhantes a lúmen aparecem nos dias 5–7, e redes microvasculares interconectadas se formam gradualmente após o dia 7.
4. Defina germinação bem-sucedida como a presença de múltiplas extensões endoteliais crescendo radialmente da superfície da esfera para a matriz tridimensional ao redor. Um broto deve ser contado apenas quando ele claramente se estende além da superfície da esfera e permanece conectado à camada celular endotelial associada à esfera.
5. Defina formação de estruturas semelhantes a lúmen como a aparência de estruturas endoteliais alongadas com um espaço central visível e claro ou morfologia em forma de tubo. Conexões entre brotos são definidas como contatos diretos ou estruturas contínuas formadas entre brotos adjacentes.
6. Culturas com morte celular extensiva, agregação severa de esferas, estrutura gelada desorganizada, bolhas abundantes, colapso da matriz ou apenas protuberâncias celulares curtas e irregulares devem ser consideradas subótimas e excluídas da análise quantitativa.

7. Aquisição de imagens e análise quantitativa

1. Selecione múltiplos campos de visão em cada poço no dia 7 e adquira imagens dos mesmos campos predefinidos nos dias 9 e 11. As imagens devem ser coletadas usando ampliação, configurações de exposição e condições de imagem idênticas em todos os momentos de tempo.
2. Quantifique o número de brotos por microesfera transportadora e a área vascularizada.
   1. Para medição de área vascularizada, utilize software de análise de imagens de código aberto. Abra a imagem adquirida e delinee manualmente o limite da região vascularizada de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção de polígonos ou à mão livre. Adicione o ROI selecionado ao gerenciador de ROI.
   2. Para visualização, use um plugin de visualização por região de interesse para exibir o ROI delineado. Permitir a medição de área nas configurações de medição e medir o ROI selecionado para obter a área vascularizada. Aplique as mesmas configurações de análise a todas as imagens.
   3. Para a análise da taxa angiogênica, use a área vascularizada no dia 7 como linha de base e calcule a mudança relativa na área vascularizada nos dias 9 e 11.
3. Conte o número de brotos individuais independentemente por três observadores e use o valor médio para análise.

Resultados

Angiogênese no modelo tridimensional HUVEC

Em culturas estabelecidas com sucesso, as células endoteliais estão distribuídas uniformemente na superfície das microesferas transportadoras, e nenhuma agregação óbvia de esferas é observada. Observações dinâmicas mostraram crescimento progressivo do endotelial e formação de redes microvasculares nos dias 7, 9 e 11 (Figura 1A). A análise quantitativa confirmou ainda a re...

Discussão

O protocolo atual descreve um modelo modificado de germinação endotelial tridimensional baseado em microesferas transportadoras. A Figura 3 apresenta uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho experimental. O protocolo foi adaptado do ensaio clássico de angiogênese relatado por Nakatsu e Hughes e otimizado para atender aos objetivos do presente estudo ^8,9. No sistema clássico, as célula...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Claro, livre de nuclease
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Fundo cônico, estéril, embalado em saco
24-well cell culture plate	Haier	612003	Fundo plano, tratado para cultura de tecido, individualmente embalado, para cultura de células aderentes
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Slide descartável para contador de células automatizado, 50 slides/caixa
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Usado para cultura de células a 37 °C com 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Pó seco; contas de microcarregador de dextrano revestidas com colágeno
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Plugin de visualização de região de interesse usado para exibir áreas vascularizadas delineadas
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM básico (1×), contendo 4,5 g/L de D-glicose, L-glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Meio de cultura de células endoteliais suplementado com FBS adicional para uma concentração final de 10% antes do uso
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualificado, formato de uso único, origem Austrália, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Fibroblastos primários isolados da mucosa oral humana; gentilmente fornecidos por outro laboratório
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Células endoteliais primárias isoladas de veias umbilicais humanas; sem número de catálogo
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Software de código aberto; versão 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Para imagem de campo brilhante, contraste de fase e fluorescência
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Para imagem confocal; modelo não especificado
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Alta concentração (HC), sem fenol vermelho, livre de LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Solução de penicilina-estreptomicina para cultura celular, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, estéril, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, tampa ventilada, tratada para cultura de tecido, para cultura de células aderentes
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Solução de 0,25% de tripsina-EDTA, 100 mL