Artigo de método

Eletroacupuntura assistida por isoflurano em um modelo de rato de oligoastenozoospermia

DOI:

10.3791/71878

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16 de junho de 2026

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1Ningxia Medical University School of Traditional Chinese Medicine, 2Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Dryness Syndrome in Chinese Medicine, Ministry of Education, Ningxia Regional Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Regional High Incidence Disease, Ningxia Medical University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo detalha o estabelecimento de um modelo de oligoastenozoospermia induzida por adenina em ratos e a subsequente administração de eletroacupuntura em CV3, CV4, ST36 e SP6 sob anestesia isoflurana. Os desfechos foram verificados por meio de análise de espermatozoides assistida por computador para contagem e motilidade, juntamente com histologia testicular com coloração de hematoxilina e eosina.

Resumo

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A oligoastenozoospermia é uma das formas mais comuns de disfunção reprodutiva masculina. Em estudos com roedores, administrar eletroacupuntura (EA) de forma consistente em sessões repetidas representa um desafio técnico, especialmente ao combinar pontos de acupuntura da linha média abdominal e dos membros posteriores, onde o contato estável com os eletrodos é fundamental. Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) e Sanyinjiao (SP6) foram selecionados porque esses pontos são frequentemente usados em protocolos de acupuntura para infertilidade e anormalidades do sêmen, e a configuração da linha média abdominal mais membro posterior favorece o pareamento padronizado de eletrodos. Este relatório descreve um protocolo prático para estabelecer um modelo de oligoastenozoospermia induzido por adenina em ratos e para administrar EA assistida por isoflurano com estimulação pareada de CV3–CV4 e ST36–SP6. Ratos machos de Sprague-Dawley receberam adenina por gavage diário por 28 dias para induzir comprometimento reprodutivo. Posteriormente, a EA foi administrada diariamente por 28 dias sob anestesia inalação, utilizando isoflurano a 3% para indução e 1,5% para manutenção da máscara, permitindo uma colocação estável da agulha e pareamento de eletrodos (CV3–CV4 e ST36–SP6) com parâmetros de estimulação definidos (2 Hz, 1,5 mA, 30 min). Os efeitos do tratamento foram avaliados por meio de análise de sêmen assistida por computador para contagem e motilidade espermática, complementada por histologia testicular de hematoxilina e eosina (HE). Resultados representativos indicam que a exposição à adenina reduziu a contagem e motilidade dos espermatozoides e perturbou a arquitetura dos túbulos seminíferos, enquanto a EA esteve associada a recuperação parcial tanto nos parâmetros do sêmen quanto na morfologia testicular. Este protocolo oferece uma referência pronta para estudos que exigem entrega consistente de EA e verificação de sêmen/histológica em um modelo de rato de oligoastenozoospermia.

Introdução

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Fatores masculinos contribuem substancialmente para a infertilidade, representando aproximadamente metade de todos os casais inférteis, com anormalidades na contagem e motilidade de espermatozoides entre os achados clínicos maiscomuns 1,2. A oligoastenozoospermia, caracterizada por redução da concentração de espermatozoides e motilidade prejudicada, é uma das formas mais comuns de disfunção reprodutivamasculina 3,4. Apesar da disponibilidade de técnicas de reprodução assistida e terapias médicas empíricas, estratégias eficazes para melhorar a qualidade do sêmen permanecem limitadas, destacando a necessidade de investigações pré-clínicasadicionais 5,6,7. Essas necessidades clínicas e translacionais motivam o desenvolvimento de fluxos de trabalho experimentais reprodutíveis para estudar o comprometimento reprodutivo masculino sob condições controladas.

Intervenções de acupuntura foram investigadas para anomalias sêmenicas e infertilidade masculina tanto em contextos clínicos quantoexperimentais 8. Embora estudos clínicos sugiram benefícios potenciais para certos parâmetros do sêmen, seus desenhos, protocolos de intervenção e medidas de desfecho variamamplamente 9. A eletroacupuntura (EA) é particularmente adequada para pesquisa laboratorial porque oferece parâmetros de estimulação controlados e uma regulação mais uniforme do que a acupuntura manual, o que facilita a avaliação de mudanças relacionadas ao tratamento nos resultados reprodutivosmensuráveis 10,11,12. Essa vantagem procedimental torna a EA bem adequada para fluxos de trabalho pré-clínicos estruturados em pesquisas reprodutivas masculinas.

Modelos animais são centrais para essa avaliação, mas a seleção de modelos continua sendo uma questão metodológica chave na pesquisa em oligoastenozoospermia. Uma revisão sistemática recente observou que métodos de modelagem induzidos por busulfano são controversos e apresentam heterogeneidade substancial nos índices de avaliação, destacando a necessidade de procedimentos mais claros e leituras maisconsistentes 13. Modelos baseados em adenina fornecem uma abordagem experimental prática porque a gavage de adenina pode induzir comprometimento reprodutivo em ratos, incluindo redução dos desfechos relacionados ao esperma e danos histológicos no tecidotesticular 14,15. Em nosso trabalho anterior, um modelo de rato de rato oligoastenozoospermia induzido por adenina foi tratado com EA em um conjunto de pontos de acupuntura cérebro-rim Shu-Mu (Epangsanxian, BL23, GB25 e KI3), juntamente com condições sem pontos de acupuntura e controle positivo de drogas, com medidas de desfecho expandidas que incluíam coeficientes de órgãos e níveis de hormônio sérico quantificados pelo ELISA16. Com base nessa base experimental e reconhecendo a heterogeneidade na seleção de pontos de acupuntura, no desenho do controle, nos parâmetros de estimulação e nas medidas de desfecho entre os estudos existentes de EA, o atual protocolo foi projetado para refinar e estender o fluxo de trabalho metodológico para uma entrega estável da EA.

Assim, o protocolo atual foca na entrega, abordando duas variáveis práticas críticas para sessões repetidas de EA em roedores. Primeiro, para evitar o deslocamento da agulha e o contato intermitente de eletrodos causado pelo movimento dos animais e tração do fio de chumbo, descrevemos um procedimento mantido com isoflurano que estabiliza o posicionamento durante a estimulação e garante contato confiável com eletrodos entre as sessões; Isso é particularmente importante ao combinar pontos da linha média do abdome com pontos dos membros posteriores. Segundo, com base em revisões anteriores e análises de pontos de acupunturae prescrição 9,17, identificando CV4, SP6, ST36 e CV3 como pontos reprodutivos comuns em protocolos de infertilidade e anormalidade de sêmen, selecionamos CV3, CV4, ST36 e SP6 e aplicamos estimulação pareada a CV3-CV4 e ST36-SP6. Essa configuração, que combina os pontos da linha média abdominal e dos membros posteriores, padroniza as conexões dos eletrodos, minimiza a variabilidade causada pela fixação instável do eletrodo e apoia a entrega reprodutível de EA através de sessões repetidas de tratamento. Para manter um escopo orientado a protocolos e evitar duplicar módulos endócrinos, mecanicistas ou de controle positivo previamente relatados, a verificação de resultados é limitada a um conjunto primário de leitura de sêmen e testículo. Esse conjunto compreende análise de espermatozoides assistida por computador e coloração testicular de HE, que são suficientes para confirmar a indução bem-sucedida do fenótipo e as mudanças associadas ao tratamento dentro desse fluxo de trabalho.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Ningxia (aprovação nº IACUC-NYLAC-2021-130). Ratos machos Sprague-Dawley, com 8 semanas de idade e pesando entre 180 e 220 g, foram obtidos do Centro Experimental de Animais da Universidade Médica de Ningxia (licença nº SYXK (Ning) 2020-0001). Os animais foram alojados em condições laboratoriais padrão de 22–24 °C e umidade relativa de 52%–56%, com um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão, e tinham livre acesso a comida e água.

1. Preparação animal, trabalho em grupo e estabelecimento modelo induzido por adenina

  1. Aclimate os ratos por 7 dias antes do experimento e monitore sua condição geral diariamente.
  2. Após a aclimatação, atribua números de identificação únicos a nove ratos e aloque-os aleatoriamente em uma proporção 1:1:1 em três grupos usando uma sequência de randomização gerada por computador: um grupo controle (n = 3), um grupo modelo (n = 3) e um grupo EA (n = 3). Usar cada rato como unidade experimental e incluir todos os animais e amostras na análise final, a menos que critérios de exclusão pré-definidos sejam atendidos.
  3. Mantenha os pesquisadores que realizam análise de sêmen assistida por computador e avaliação histológica cegos para a alocação em grupos.
    NOTA: Os investigadores que entregam a EA não podem ser cegos porque a intervenção envolve procedimentos visíveis específicos de grupo.
  4. Prepare uma suspensão de 20 mg/mL de adenina em soro fisiológico normal contendo 0,5% (p/v) de goma arábica como agente suspensor, e misture cuidadosamente antes e durante a gavage para evitar sedimentação.
  5. Administrar soro fisiológico normal ao grupo controle e suspensão de adenina aos grupos modelo e EA via gavage a 10 mL/kg, equivalente a 1 mL/100 g de peso corporal, uma vez ao dia por 28 dias consecutivos. Use uma dose de adenina de 200 mg/kg/dia.
  6. Registre o peso corporal e a condição geral durante todo o período de modelagem.
    NOTA: A adenina é administrada em suspensão e cuida dos sedimentos durante o manuseio. Mantenha agitação contínua durante o gavage para minimizar a precipitação, que pode causar inconsistência na dosagem e obstrução da agulha do gavage. Se ocorrer entupido, re-suspenda a solução completamente e substitua a agulha de gavage antes de continuar.

2. Anestesia isoflurana para liberação por eletroacupuntura (Figura 1)

  1. Prepare um sistema de anestesia de isoflurano com câmara de indução, máscara nasal e almofada térmica.
  2. Induza anestesia com 3% de isoflurano na câmara de indução até que a atividade espontânea diminua significativamente.
  3. Transfira o rato para a almofada térmica na posição deitada e mantenha anestesia com 1,5% de isoflurano via uma máscara nasal durante todo o EA.
  4. Confirme anestesia adequada reduzindo o movimento espontâneo e perdendo o reflexo de piscar, mantendo a respiração regular.

3. Fidelidade da entrega da estimulação e controle de qualidade

  1. Use uma bolsa térmica para manter a temperatura corporal durante toda a sessão e reduzir a variabilidade fisiológica causada pela hipotermia.
  2. Aplique ajustes de anestesia consistentes em todos os animais e sessões, usando 3% de isoflurano para indução e 1,5% de isoflurano para manutenção. Mantenha a profundidade do anestésico no mínimo necessário para evitar dificuldades enquanto se mantém a respiração regular.
  3. Insira agulhas de acupuntura descartáveis estéreis (0,25 mm × 13 mm) verticalmente nos pontos de acupuntura selecionados. Insira as agulhas a profundidades de aproximadamente 2 mm em CV3 e CV4, 7 mm em ST36 e 5 mm em SP6.
  4. Após a inserção da agulha e a conexão do eletrodo, confirme visualmente que cada agulha permanece estável, sem afrouxamento observável devido à respiração ou ao movimento dos membros. Se ocorrer deslocamento, reinsera a agulha verticalmente até a profundidade original e verifique o contato estável do eletrodo antes de retomar a estimulação.
  5. Prenda os cabos do eletrodo próximos à extremidade proximal do cabo da agulha, depois roteie-os e fixe-os para minimizar a tração, pois o peso do chumbo e a puxada são causas comuns de descolamento.
  6. Confirme a estimulação eficaz observando um leve tremor muscular local no ponto de acupuntura sem movimento corporal grosso. Se não houver tremor, verifique novamente e confirme o contato do eletrodo e a colocação da agulha.
  7. Realize uma única verificação padronizada no meio da sessão, com 15 minutos. Se necessário, reajuste as agulhas e confirme o tremor local leve antes de prosseguir para reduzir a variabilidade na entrega da estimulação entre os animais.
    NOTA: Ao conectar o dispositivo EA, prenda os eletrodos na extremidade proximal do cabo da agulha para reduzir a tração causada pelo peso do cabo. Se necessário, prenda o cabo e/ou a agulha com fita adesiva para evitar descolamento durante a reunião.

4. Tratamento com eletroacupuntura (Figura 2)

  1. Inicie a EA no dia seguinte ao período de 28 dias de gavage de adenina e administre-a uma vez ao dia por 28 dias consecutivos.
  2. Sob anestesia isoflurana, exponha a parte inferior do abdômen e os membros posteriores, e localize Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) e Sanyinjiao (SP6) usando marcos anatômicos da superfície.
  3. Insira agulhas descartáveis estéreis de acupuntura (0,25 mm × 13 mm) verticalmente até profundidades de 2 mm em CV3 e CV4, 7 mm em ST36 e 5 mm em SP6.
  4. Conecte um par de eletrodos ao CV3 e CV4, e conecte o outro par ao ST36 e SP6.
  5. Administre estimulação elétrica a 2 Hz e 1,5 mA por 30 minutos. Use esses parâmetros para corresponder aos usados anteriormente em oligoastenozoospermia induzida poradenina 16.
  6. Aplique as verificações de controle de qualidade descritas na Seção 3, incluindo uma única verificação no meio da sessão a 15 minutos.
    NOTA: Localize pontos de acupuntura de ratos com referência ao livro Experimental Acupuncture and MoxibustionScience 18, Apêndice II de Yong Tang ("Pontos de Acupuntura Comumente Usados em Animais Experimentais"), juntamente com marcos anatômicos comparativos. Como os pontos de acupuntura dos ratos representam regiões anatômicas discretas em vez de pontos geométricos fixos, utilize uma posição corporal consistente, pontos de referência anatômicos fixos e medições de superfície em milímetros entre animais e sessões. Localize Zhongji (CV3) na linha média ventral, aproximadamente 33 mm caudal até o centro do umbigo. Localize o Guanyuan (CV4) na linha média ventral, aproximadamente 25 mm caudal até o centro do umbílico, próximo às artérias superficiais subcutâneas da parede abdominal. Localize Zusanli (ST36) na face posterolateral do joelho, aproximadamente 3 mm distal da cabeça fibular. Localize Sanyinjiao (SP6) na face medial do membro posterior, aproximadamente 10 mm proximal à ponta do maléolo medial. Aplique as mesmas referências de localização, posição corporal, ângulo de inserção e profundidade de inserção de forma consistente em todos os animais e sessões de tratamento.

5. Coleta de amostras

  1. Faça jejum dos ratos por 24 horas após a última sessão EA.
  2. Induzir anestesia profunda por meio de injeção intraperitoneal de 2% de pentobarbital sódico a 2 mL/kg antes da coleta do tecido. Confirme anestesia profunda pela ausência do reflexo de retirada dos pedais e movimento espontâneo.
  3. Eutanasiar o rato por decapitação sob anestesia profunda, seguindo protocolos institucionalmente aprovados.
  4. Expõe imediatamente os órgãos reprodutores assépticamente. Isolar um epidídimo da cauda para análise de espermatozoides e retirar um testículo para exame histológico.
  5. Fixe o testículo em paraformaldeído a 4% por pelo menos 24 horas antes do processamento histológico.

6. Análise de esperma

  1. Remova a gordura ao redor do epidídimo da cauda e imediatamente coloque o tecido em 2 mL de soro fisiológico normal pré-aquecido a 37 °C.
  2. Incube o tecido em banho-maria a 37 °C por 5 minutos, pique com tesoura oftálmica, filtre a suspensão por uma tela de 200 malhas e misture suavemente o filtrado.
  3. Carregue uma alíquota de 10 μL da suspensão espermática em uma câmara de contagem pré-aquecida e analise a contagem e motilidade dos espermatozoides usando um sistema de análise de sêmen assistida por computador (CASA).
  4. Use o mesmo tipo de câmara, condições de aquecimento e configurações de aquisição para todas as amostras dentro de um determinado experimento.

7. Exame histológico do tecido testicular

  1. Fixe o tecido testicular em paraformaldeído a 4% por no mínimo 24 horas. Corte a área alvo e coloque em cassetes rotulados.
  2. Desidrate as amostras através de uma série de etanol graduado, limpe-as em xileno, infiltre com parafina, incorpore-as e secione-as a 4 μm.
  3. Flutue as seções em um banho-maria a 40 °C, monte-as em slides e seque em um forno a 60 °C.
  4. Para a coloração de hematoxilina e eosina, faça um dewax nas seções em xileno, reidrate-as com etanol graduado, tinga-as com hematoxilina por 5–10 minutos e eosina por 1–5 minutos, depois desidrate, limpe e monte.
  5. Examine a organização dos túbulos seminíferos e a disposição das células espermatogênicas sob configurações consistentes de ampliação em todos os grupos.

8. Avaliação do estabelecimento do modelo e mudanças associadas ao tratamento

  1. Confirme o estabelecimento do modelo por meio de uma redução na contagem e motilidade espermática, incluindo uma estrutura desorganizada dos túbulos seminíferos, em relação ao grupo controle.
  2. Confirme as alterações associadas ao tratamento por meio do aumento da contagem e motilidade dos espermatozoides, juntamente com restauração parcial da morfologia dos túbulos seminíferos, no grupo EA em relação ao grupo modelo.
  3. Predefinam amostras tecnicamente comprometidas, como aquelas com processamento de esperma atrasado, falha na carga da câmara ou seções de baixa qualidade não relacionadas à modelagem, como critério de exclusão. Documente quaisquer exclusões durante a análise.

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Resultados

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Análise de esperma (Figura 3)
Suspensões epididimáticas de espermatozoides foram analisadas usando um sistema de análise de sêmen assistido por computador para quantificar a contagem e a motilidade dos espermatozoides. Neste conjunto de dados representativo, a administração de adenina reduziu significativamente ambos os parâmetros em relação ao grupo controle, confirmando o estabelecimento bem-sucedido do modelo. A intervenção em EA posteriormente aumentou a contagem e a motilidade dos espermatozoides...

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Discussão

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Dada a etiologia multifatorial da oligoastenozoospermia e a eficácia limitada dos tratamentos farmacológicos disponíveis, a acupuntura e a AA ganharam atenção como intervenções repetiblas e nãofarmacológicas 19. A literatura clínica e pré-clínica existente sugere vários mecanismos plausíveis pelos quais a acupuntura ou EA pode influenciar a função reprodutiva masculina, incluindo a modulação da regulação neuroendócrina, a melhoria da microcirculação dos órgãos rep...

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Divulgações

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Os autores declaram que não há interesses financeiros ou não financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado pelo Fundo Regional de Ciência da China (82460972) da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China 2024 e pelo Fundo Regional de Ciência da China 2022 (82260967); o Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da Região Autônoma Hui de Ningxia 2022 (2022BEG02040); o Projeto de Construção de Disciplinas de Primeira Classe da Escola de Medicina Tradicional Chinesa, Universidade Médica de Ningxia (ZY0019110305); o Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento do Condado de Yanchi 2023 (2023YCYDCT003); e o Programa Especial de Ciência e Tecnologia em Benefício do Povo da Região Autônoma Hui de Ningxia (2024CMG03054).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AdenineBeijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd.A8330
CASA computer-assisted semen analysis systemNanning Songjing Tianlun Biotechnology Co.,Ltd.VICOS-SPERM
CentrifugeSartoriusA-14C
Differentiation fluidShanghai Biyuntian Biotechnology Co.,LtdC0163M
Disposable sterile acupuncture needlesHanyi brand0,25 mm ´ 13 mm
Drying machineLeicaHI1220
Electrical stimulatorChangzhou Yingdi Electronic Medical Device Co., LtdKWD-808I
Electronic balanceHangzhou Youheng Weighing Equipment Co.,LtdHLD-6002
Eosin Y Stain SolutionLanke BiotechBS248
Hematoxylin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co. LTDBA-4041
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10
MicrotomeLeicaRM2255
Neutral balsamBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,LtdZli-9555
Paraffin embedding machineLeicaHistoCore Arcadia H
SD ratsAnimal Center of Ningxia Medical University8-week-old, Male, 180-220 g
Slide scannerLeicaAperio LV1
Small Animal Anesthesia MachineRWD Life Science Co., Ltd.R500
Vortex oscillatorHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co.,LtdQL-902
Warming padDongguan Hongda Electronics Co., Ltd.45W-80X28CM

Referências

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Oligoasthenozoospermia ModelElectroacupuncture ProtocolIsoflurane AnesthesiaRat Reproductive DysfunctionAdenine Induced ModelSperm MotilitySperm CountAcupuncture AcupointsSemen AnalysisTesticular Histology

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