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Avaliação Multimodal do Tratamento com Eletroacupuntura para Osteoartrite de Joelho em Camundongos

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DOI:

10.3791/71901

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6 de outubro de 2026

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1Department of Acupuncture and Moxibustion, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Science and Technology for Brain-Inspired Intelligence, Fudan University, 4Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo combina técnicas comportamentais e de imagem para avaliação multimodal e longitudinal de camundongos com osteoartrite após eletroacupuntura, incluindo coloração da cartilagem e pontuação pela Sociedade Internacional de Pesquisa em Osteoartrite (OARSI).

Resumo

A osteoartrite é uma doença articular degenerativa crônica que comumente afeta o joelho e provoca dor, inchaço, rigidez e limitação funcional. A inflamação sinovial e alterações nos músculos periarticulares contribuem para o início e progressão da doença. Evidências clínicas sugerem que a eletroacupuntura pode atenuar a inflamação local e modular o metabolismo da cartilagem. Neste estudo, a osteoartrite do joelho foi induzida em camundongos por meio da desestabilização cirúrgica do menisco medial. Os desfechos foram avaliados utilizando um protocolo multimodal composto pelo teste de rotarod, ultrassonografia, termografia por infravermelho, ressonância magnética e coloração histológica. O volume da cavidade articular e a temperatura da pele foram monitorados longitudinalmente, e a ressonância magnética no ponto final e a coloração com Safranina O-Fast Green foram utilizadas para avaliar alterações no sinal muscular periarticular e a patologia da cartilagem. A eletroacupuntura esteve associada a uma melhora no desempenho motor, redução do inchaço articular, maior temperatura local da pele, alterações menos acentuadas no sinal muscular periarticular nas imagens de ressonância magnética e menores escores de degeneração da cartilagem. Esses achados apoiam o uso deste protocolo multimodal para avaliar desfechos associados à eletroacupuntura em um modelo pré-clínico com camundongos.

Introdução

A osteoartrite do joelho (OJ) é a doença osteoarticular mais prevalente no mundo, afetando cerca de 250 milhões de pessoas1. Seus aspectos patológicos característicos incluem degeneração progressiva da cartilagem e proliferação sinovial, e clinicamente se apresenta com dor, inchaço e comprometimento funcional2,3.

A osteoartrite (OA) era historicamente considerada uma desordem articular não inflamatória, mas atualmente reconhece-se que possui um componente inflamatório, com sinovite detectável na maioria dos pacientes. Acredita-se que citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina (IL)-1β e a IL-18, juntamente com espécies reativas de oxigênio e estresse biomecânico, contribuam para o processo patológico4. A inflamação é frequentemente acompanhada por aumento do fluxo sanguíneo local, o que se manifesta clinicamente como vermelhidão, calor e inchaço5. Além de acelerar a degradação da cartilagem e a deterioração funcional, a inflamação pode ser particularmente ativa nas fases iniciais da doença. Assim, monitorar o estado inflamatório ao longo do tempo poderia orientar estratégias terapêuticas direcionadas ao mecanismo subjacente e permitir um manejo adaptado ao estágio da doença6,7. Estudos anteriores que utilizaram ultrassonografia (US) em joelhos de camundongos identificaram uma região triangular entre os côndilos tibial e femoral. A análise histológica confirmou que esta área contém tecidos moles, incluindo a sinóvia, o menisco e o coxim adiposo, bem como espaços preenchidos por líquido sinovial. Essa região detectada por ultrassonografia é definida como o volume interarticular, que abrange as áreas de tecidos moles mencionadas8.

Além disso, a temperatura é um parâmetro físico fundamental que reflete diretamente a progressão da inflamação articular. O aumento da temperatura local é um dos quatro sinais cardinais da inflamação, e a imagem termográfica permite a detecção e quantificação precisas dessas alterações térmicas9. Uma revisão sistemática recente destacou a correlação entre a temperatura da superfície cutânea e doenças articulares inflamatórias e degenerativas10, reforçando ainda mais a utilidade da termografia infravermelha (IRT) na pesquisa e no manejo clínico da artrite11. Além disso, a IRT fornece uma medida indireta associada à perfusão tecidual e à atividade metabólica e pode ser útil para monitorar as respostas terapêuticas.

Neste estudo, combinamos o teste do rotarod, ultrassonografia (US), termografia por infravermelho (IRT) e ressonância magnética (MRI) para avaliar os efeitos da eletroacupuntura (EA) em um modelo murino de OA. Essa abordagem multmodal permitiu a avaliação simultânea do desempenho motor, da morfologia articular, das alterações térmicas e da inflamação dos tecidos moles — parâmetros que não estão disponíveis apenas pela histologia. De forma importante, o conjunto fornece informações complementares em múltiplos níveis biológ游戏副本

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Wuchuang Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (Número de Aprovação Ética: WTPZ20260209001). Todos os animais utilizados neste estudo foram camundongos C57BL/6 com 8 semanas de idade e peso aproximado de 20 g, adquiridos de um fornecedor comercial (consulte a Tabela de Materiais). O experimento incluiu 24 camundongos. Após um período de aclimatação de 1 semana, os animais foram alocados aleatoriamente, com seis camundongos designados para cada uma das quatro condições experimentais. Essas condições compreenderam cirurgia simulada, desestabilização do menisco medial (DMM), acupuntura simulada (SA) e eletroacupuntura (EA). O número de animais utilizados foi determinado sem cálculo prospectivo de tamanho da amostra; ao invés disso, o tamanho dos grupos foi definido com base em estudos prévios de eletroacupuntura que utilizaram modelos e pontos finais comparáveis de osteoartrite e em conformidade com o princípio dos 3Rs.

1. Cuidados pré-operatórios e modelagem

OBSERVAÇÃO: Um técnico cirúrgico experiente realizou todos os procedimentos de modelagem. Devolva os animais às suas gaiolas somente após eles recuperarem a consciência sobre uma placa aquecida.

  1. Adapte os camundongos ao ambiente experimental por pelo menos 7 dias antes do início do experimento.
  2. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Desinfete completamente a área cirúrgica.
  3. Ligue o equipamento de anestesia com gás. Coloque o camundongo na câmara de indução e induza anestesia geral com 2–3% de isoflurano por 5 min.
  4. Após a conclusão da indução anestésica, transfira o camundongo para a mesa cirúrgica. Mantenha a anestesia mediante administração contínua de 1–1,5% de isoflurano por meio de máscara anestésica até o término do procedimento cirúrgico.
  5. Posicione o camundongo em posição supina com a articulação do joelho voltada para cima. Certifique-se de que a posição esteja estável e que o local cirúrgico esteja totalmente exposto. Utilize DMM para criar um modelo na pata traseira direita12. Para o grupo Sham, faça uma incisão no mesmo local e, em seguida, feche-a com sutura.
    1. Procedimento cirúrgico de DMM
      1. Realize uma incisão longitudinal medial parapatelar de 1 cm para expor a articulação do joelho.
      2. Através da incisão medial parapatelar criada no passo 1.5.1.1, faça uma abertura longitudinal na cápsula articular. Use pinça para separar suficientemente a cápsula do tecido circundante. Em seguida, apoie a pata traseira distal na mão esquerda sem aplicar pressão excessiva e use a pinça para mover a patela e o ligamento patelar lateralmente, expondo assim a articulação do joelho. Manipule a pata com cuidado durante todo o procedimento para evitar lesões.
        NOTA: A liberação adequada da cápsula articular permite que a patela seja deslocada com força mínima.
      3. Adicione gotas de solução salina estéril sobre a superfície da cartilagem articular durante a operação para prevenir dessecação.
      4. Localize o menisco medial no espaço entre o côndilo femoral medial e a placa tibial medial. A partir de sua face lateral, siga o ligamento meniscotibial medial até seu ponto de fixação na eminência intercondilar da tíbia. Estabilize suavemente a pata traseira com a mão e seccione o ligamento com uma lâmina cirúrgica nº 10, tomando cuidado para não tocar a cartilagem subjacente ao menisco medial. NOTA: Certifique-se de que a cartilagem articular e outros ligamentos não sejam lesados. Em muitos casos, é necessário retrair, mas não remover, o tecido adiposo sobrejacente para identificar o ligamento.
      5. Aproxime as bordas da cápsula articular do joelho e fixe-as utilizando fio absorvível 6-0.
      6. Feche a pele com sutura de seda 6-012.
  6. Para o cuidado pós-operatório, administre uma gota de bupivacaína a 0,25% no local cirúrgico para analgesia local e mantenha os camundongos com acesso livre a alimento e água.
    NOTA: Durante a anestesia, mantenha a taxa de fluxo de oxigênio na faixa de 0,5–1 NL/min. A anestesia bem-sucedida foi confirmada pela perda do reflexo de endireitamento, ausência de resposta de retirada ao aperto dos dedos dos pés e respiração estável e regular. Durante a cirurgia, utilize solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) como solução de irrigação para manter a hidratação da cartilagem. Os tamanhos e especificações exatos do fio absorvível para fechamento da cápsula articular e do fio de seda para fechamento da pele estão detalhados na Tabela de Materiais.

2. Tratamento com eletroacupuntura

OBSERVAÇÃO: As intervenções nos grupos SA e EA iniciaram 1 semana após o estabelecimento do modelo (Figura 1A). Ambos os grupos receberam tratamento em dias alternados, três vezes por semana, durante 15 minutos por sessão, ao longo de 4 semanas. Os grupos Sham e DMM passaram pelos mesmos procedimentos de anestesia e imobilização, no mesmo cronograma, sem acupuntura ou estimulação elétrica. Todos os operadores receberam treinamento antes do experimento para garantir consistência na seleção dos pontos de acupuntura, ângulo e profundidade de inserção.

  1. Coloque os camundongos na câmara de indução e remova-os após a indução da anestesia com isoflurano.
  2. Mantenha os camundongos em posição supina sob anestesia inalatória contínua com isoflurano (1,5–2,0% em O₂ a 100%) durante toda a sessão de eletroacupuntura para garantir um estado tranquilo e estável.
  3. Localize com precisão os pontos de acupuntura nos camundongos. Insira duas agulhas descartáveis estéreis (0,16 mm × 25 mm) nos pontos de acupuntura ST36 (Zusanli) e SP10 (Xuehai) nos membros inferiores até uma profundidade cutânea de 5 mm13 (Figura 1B).
    ​NOTA: O ponto ST36 localiza-se a 1 mm lateralmente ao tubérculo anterior da tíbia, 3 mm abaixo da cabeça da fíbula e diretamente abaixo da articulação do joelho. O ponto SP10 localiza-se na coxa medial, 3 mm acima da margem superomedial da patela, na saliência medial do músculo quadríceps, quando o joelho está flexionado.
    1. No grupo SA, insira as agulhas superficialmente, até uma profundidade de aproximadamente 1 mm, em áreas adjacentes não acupunturais, ao invés dos pontos ST36 ou SP10, e conecte-as ao dispositivo de EA sem aplicação de corrente14.
      NOTA: Assim, o grupo SA difere do grupo EA quanto ao posicionamento das agulhas, profundidade de inserção e ausência de estimulação elétrica, mas é pareado com relação a todos os demais parâmetros procedimentais. Comparado ao grupo DMM, o grupo SA recebe punção superficial em pontos não acupunturais e conexão ao dispositivo sem corrente, enquanto o grupo DMM recebe apenas anestesia e imobilização.
  4. Conecte a agulha ao dispositivo de eletroacupuntura e aplique a estimulação em 2/100 Hz e 2 mA para produzir tremores musculares leves. Inicie a estimulação com EA por 15 min, 3 vezes por semana, começando 7 dias após a modelagem, e continue por 4 semanas.
  5. Após o tratamento, coloque o camundongo sobre uma placa aquecida e devolva-o à sua gaiola assim que recuperar a consciência.

3. Avaliação dinâmica da eficácia do EA

NOTA: Todas as avaliações (teste de rotarod, US, IRT, RNM e pontuação OARSI) foram realizadas por pesquisadores cegos quanto à alocação dos grupos, com as identidades dos grupos ocultas até que todas as análises de dados fossem concluídas. A aquisição de imagens e a análise de dados foram realizadas por indivíduos distintos, e a avaliação histológica foi realizada independentemente por dois patologistas cegos quanto aos grupos de tratamento. Nenhum dos avaliadores participou da alocação dos animais ou da intervenção com eletroacupuntura.

  1. Teste de fadiga em rotarod
    1. Adiestre previamente os camundongos para familiarizá-los com o aparelho experimental antes do teste formal.
    2. Durante o teste formal, coloque cada camundongo individualmente no rotarod, que acelera a uma taxa de 4 rotações por minuto até que o camundongo caia.
    3. Registre imediatamente o tempo que cada camundongo permanece no bastão. Permita um intervalo de 30 min entre ensaios para cada camundongo e calcule o valor médio a partir de três ensaios repetidos.
      NOTA: Utilize o teste em rotarod para avaliar a coordenação motora antes da criação do modelo de OA e após a conclusão do tratamento com EA. Para minimizar a dor pós-operatória, reduza a coleta de dados no rotarod durante a primeira semana após a cirurgia.
  2. Exame de ultrassom em pequenos animais
    ​NOTA: O procedimento passo a passo para a imagem por ultrassom e delimitação da cavidade articular é mostrado na Figura 2.
    1. Antes da aquisição formal de dados, coloque o camundongo em uma câmara de anestesia até que perca a função motora e, em seguida, use creme depilatório para remover o pelo da articulação do joelho direito. Ao remover o pelo do camundongo, seja o mais gentil possível; limpe suavemente com água morna para minimizar a irritação ao animal.
      NOTA: Mantenha o cegamento durante a análise exibindo apenas os códigos dos animais e os pontos temporais até que todas as medições de volume sejam concluídas e as informações dos grupos sejam reveladas para análise estatística.
    2. Ligue o sistema de ultrassom, instale o transdutor de ultrassom para pequenos animais e configure o protocolo apropriado para exame de camundongo. Simultaneamente, coloque o camundongo em uma gaiola para anestesia contínua.
    3. Após a anestesia estar completa, transfira o camundongo para a plataforma de controle e administre anestesia inalatória com isoflurano por meio de uma máscara nasal. Posicione o camundongo com a cabeça voltada para longe do operador e a cauda voltada para o operador.
    4. Dobre a articulação do joelho, fixe o camundongo e aplique o agente acoplador de ultrassom na pele sobre o ligamento patelar.
    5. Ajuste a sonda e posicione-a de modo que fique paralela à articulação do joelho.
    6. Defina a distância de varredura em 4 mm e o tamanho do passo em 0,04 mm. Localize a cavidade articular na imagem com base em sua posição anatômica. Não mova o animal durante a varredura da sonda.
    7. Adquira as imagens. Identifique a cavidade articular: uma região triangular com limites distintos entre o fêmur, a tíbia e a pele e músculos sobrejacentes.
    8. Dê nome e salve os resultados da varredura, depois exporte-os para o computador de análise mantendo a estrutura original de pastas.
    9. Analise o volume da cavidade articular do joelho usando software. Entre no módulo Estudo e clique na função Importar.
    10. Navegue e selecione a pasta de dados, verifique os arquivos de dados a serem importados e clique duas vezes para abri-los.
    11. No modo exibição, selecione sequencialmente Processamento de Imagem | Carregar em 3D | Visualização por Corte | Medição de Volume | Iniciar.
    12. Use a roda do mouse ou o controle deslizante de cortes para percorrer os cortes do proximal ao distal, localizando o corte em que a cavidade articular aparece pela primeira vez (geralmente como uma região triangular com limites claros entre o fêmur, a tíbia e o tecido muscular e cutâneo sobrejacente).
    13. Inicie o rastreamento no corte em que a cavidade articular aparece pela primeira vez. Clique com o botão esquerdo para começar a desenhar o contorno.
    14. Siga a borda da cavidade articular ponto a ponto para desenhar um contorno fechado até que a cavidade articular desapareça completamente.
    15. Clique em Finalizar; o sistema gerará um volume segmentado em 3D e exibirá os resultados da medição de volume.
    16. Selecione o tipo de arquivo desejado para exportar a imagem como um arquivo de região no formato TIFF (.tif).
  3. Termografia infravermelha em pequenos animais
    ​NOTA: As medições foram realizadas 1 dia antes da cirurgia, 7 dias após a cirurgia e ao final do tratamento em camundongos com OA. Realize a IRT 6 h após o tratamento em uma sala com temperatura controlada (22–24 °C), com os camundongos aclimatizados por 30 min antes da aquisição de imagens.
    1. Coloque o animal em decúbito dorsal com as patas traseiras estendidas e fixe todas as patas na bancada com fita adesiva para garantir exposição consistente do joelho. Coloque o camundongo em uma câmara de indução e administre continuamente isoflurano até que esteja completamente anestesiado.
    2. Fixe o camundongo anestesiado em posição supina na mesa cirúrgica e mantenha uma temperatura ambiente constante.
    3. Segure suavemente a pata traseira do camundongo para estender a articulação do joelho direito e, em seguida, use um termógrafo infravermelho para capturar imagens e medir as temperaturas na área.
    4. Use a emissividade cutânea padrão (0,98). Adquira imagens 3 min após a anestesia profunda. Defina a região de interesse (ROI) do joelho como a linha articular medial na articulação femorotibial e a ROI do tornozelo como a superfície dorsal da articulação tibiotalar. Delimite manualmente todas as ROIs por um único operador treinado com base nesses marcos anatômicos.
    5. Analise as imagens usando o software fornecido com o equipamento para ler os dados de temperatura da articulação do joelho e da pele circundante e defina pontos de controle de medição nas articulações do tornozelo e do joelho onde os gradientes de temperatura diminuem.
  4. RM em pequenos animais
    ​NOTA: Após o tratamento com EA, a RM em pequenos animais foi usada para avaliar a inflamação local nas articulações do joelho dos camundongos em cada grupo.
    1. Coloque o camundongo em uma caixa de anestesia. Após a perda da função motora, aplique creme depilatório em ambas as articulações do joelho.
    2. Após 1 min, remova o creme depilatório com gaze umedecida em água morna para completar a depilação em ambas as articulações do joelho.
      ​NOTA: Certifique-se de remover o máximo possível do pelo do camundongo e realize o procedimento sob anestesia.
    3. Configure o protocolo apropriado usando um gantry de tamanho para camundongo.
      1. Certifique-se de que o dispositivo de posicionamento utilize uma sequência rápida de gradiente eco em três planos (TR/TE = 50/3 ms, campo de visão (FOV) = 30 × 30 mm, espessura de corte de 1 mm) para centralizar a articulação do joelho na imagem; use uma sequência de eco de spin rápido ponderada em T2 (T2WI) para escanear a articulação do joelho do camundongo.
      2. Use os seguintes parâmetros de varredura: tempo de repetição (TR) de 2.500 ms, tempo de eco (TE) de 8 ms, campo de visão (FOV) de 20 × 20 mm, matriz de 256 × 256, espessura de corte de 0,5 mm, sem espaçamento entre cortes e 10 cortes consecutivos cobrindo a região do côndilo femoral até a placa tibial; espera-se que a duração de um único exame seja de aproximadamente 8 min e 20 s.
      3. Examine as imagens ponderadas em T2 obtidas para observar alterações morfológicas na cartilagem do joelho, sinóvia, cavidade articular e tecidos moles circundantes, e avalie efusão articular, espessamento sinovial e inflamação local.
    4. Coloque o camundongo no gantry, induza anestesia inalatória com isoflurano por meio de uma máscara e fixe as patas com fita adesiva médica para garantir posicionamento consistente com os joelhos voltados para cima.
    5. Deslize o gantry para dentro do scanner de RM para aquisição de imagens.
      1. No localizador em três planos, confirme que o espaço articular do joelho esteja paralelo ao plano coronal, que o centro do bloco esteja alinhado com o espaço articular e que alças intestinais ou cavidades de ar sejam excluídas do FOV para evitar artefatos de suscetibilidade; se o posicionamento estiver incorreto, realinhe e reescaneie.
    6. Exporte as imagens ponderadas em T2 com múltiplos ecos adquiridas em formato DICOM ou NIfTI para avaliação qualitativa.
    7. Avalie as imagens de RM examinando visualmente a intensidade do sinal e a distribuição de áreas hiperintensas dentro da articulação do joelho e dos tecidos moles periarticulares e compare os sinais inflamatórios entre os grupos com base nessas imagens exportadas.

4. Observações patológicas e morfológicas

  1. Fixação e corte de joelhos de camundongos
    1. Fixe ambas as amostras de joelho de camundongos em paraformaldeído a 10% por 48 h. Posteriormente, imerja as amostras em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 30 min e enxágue.
    2. Após remover o excesso de umidade com papel absorvente, transfira imediatamente as amostras para uma solução recém-preparada de descalcificação (pH 7,2–7,4) e troque a solução a cada 3 dias;
    3. Continue a descalcificação por 2 semanas, enxágue as amostras sob água corrente e, em seguida, imerja-as em etanol a 75% por 2 h.
    4. Realize a desidratação automatizada em gradiente em um processador de tecidos por 18 h.
    5. Após a desidratação, imerja a amostra em parafina pré-aquecida por 2 h em uma máquina de inclusão em parafina e, em seguida, prossiga com a inclusão;
    6. Durante a inclusão sagital da articulação do joelho, posicione a superfície articular medial voltada para baixo, de modo que essa superfície seja cortada primeiro.
    7. Monte o bloco de tecido no micrótomo e realize cortes contínuos de 4 µm. Após atingir a separação média do menisco, colete 21 cortes consecutivos.
    8. Disperse os cortes em um espalhador de cortes. Use pinça para separar os espécimes na superfície da água e recolha-os com lamínulas, coletando dois espécimes por lamínula;
    9. Coloque as lâminas em posição horizontal em uma estufa de lâminas por mais de 1 h para garantir a completa evaporação da umidade. Coloque as lâminas em uma caixa de espécimes e remova a parafina em uma estufa a 60 °C por 8 h. Reserve para uso posterior.
      ​NOTA: Todo fixador com paraformaldeído, solução de descalcificação e lavagens com etanol devem ser coletados como resíduos perigosos e descartados de acordo com as diretrizes institucionais.
  2. Coloração com Safranina O-Fast Green
    1. Coloque cortes não corados em uma grade de coloração e aqueça-os em uma estufa por 5 min. Durante esse tempo, prepare a solução de coloração em uma cabine de exaustão.
    2. Deixe os cortes retornarem à temperatura ambiente, depois remova a parafina convencionalmente até a água.
    3. Transfira os cortes para uma caixa úmida e cora com solução de Weigert fresca (Parte A + Parte B) por 5 min.
    4. Enxágue com água por 3 x 1 s.
    5. Diferencie com ácido clorídrico a 1% em etanol por 15 s, depois enxágue com água destilada por 10 min.
    6. Colore com solução de Fast Green por 4 min e 55 s.
    7. Lave rapidamente os cortes com solução de ácido acético a 1% por 10-15 s para remover o Fast Green residual e, em seguida, seque ao ar.
    8. Imersão na coloração de Safranina O por 4 min 35 s.
    9. Desidrate rapidamente os cortes com etanol a 95% por 3-5 s, seguido de enxágues com etanol absoluto por 2 x 1 min.
    10. Limpe com xilol, monte com resina neutra e coloque na cabine de exaustão por 4 h para evaporar o xilol.
    11. Visualize e digitalize o corte com um escâner de lâminas inteiras.
      NOTA: Xilol, álcool ácido, ácido acético, paraformaldeído e as soluções de coloração utilizadas neste estudo, incluindo a solução de Weigert, Fast Green e Safranina O, são materiais perigosos. Todas as manipulações devem ser realizadas em uma cabine de exaustão, utilizando equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas de nitrila, jaleco de laboratório e óculos de segurança. Os resíduos perigosos, incluindo reagentes usados e lavagens, devem ser segregados, mantendo-se o resíduo de xilol separado do resíduo aquoso, coletados em recipientes designados e descartados de acordo com as regulamentações institucionais.

5. Análise estatística

  1. Relate dados contínuos como média ± desvio padrão (DP), salvo indicação em contrário; os escores OARSI são relatados como mediana (P25, P75).
  2. Para desfechos relatados como média ± DP, realize comparações entre múltiplos grupos utilizando análise de variância unidirecional (ANOVA), seguida de testes post hoc de Tukey. Os escores OARSI foram analisados utilizando o teste de Kruskal-Wallis, seguido de testes post hoc com o teste de Mann-Whitney unilateral para comparações par a par entre os dois grupos15.
  3. Considere valores de P < 0,05 estatisticamente significativos ("ns" indica ausência de diferença significativa).

Resultados

O teste de rotarod mostrou maior latência para queda no grupo EA em comparação com o grupo DMM (P < 0,05), enquanto o grupo SA não diferiu significativamente do grupo DMM (Figura 1C e Tabela 1). Antes da modelagem, varreduras ultrassonográficas longitudinais da articulação do joelho (distância de varredura, 4 mm; tamanho do passo, 0,04 mm) não mostraram diferenças significativas no volume da cavidade articular entre os grupos (Figura 3A,B e Tabela 2). Uma semana após a modelagem, a reconstrução tridimensional mostrou volume da cavidade articular significativamente maior nos grupos DMM, SA e EA em comparação com o grupo Sham (P < 0,05), sem diferenças significativas entre os grupos DMM, SA e EA (P > 0,05) (Figura 3A,C). Após 4 semanas de tratamento com EA, o volume da cavidade articular foi significativamente menor no grupo EA em comparação com o grupo DMM (P < 0,05) (Figura 3A,D), consistente com a redução do inchaço da cavidade articular.

A TIR é uma técnica utilizada para coletar informações sobre a temperatura no plano focal dentro de um campo de visão e para exibir distribuições de temperatura da superfície em formato pseudocolorido16. Não houve diferenças significativas na temperatura da superfície da pele entre os grupos antes da modelagem ou uma semana após a modelagem (Figura 4A-C e Tabela 3). No entanto, após o tratamento com AE, a temperatura da superfície da pele no grupo DMM foi significativamente menor do que no grupo Sham. Em contraste, a temperatura da superfície da pele no grupo AE foi significativamente maior do que no grupo DMM (Figura 4A,D), demonstrando que a AE esteve associada a uma temperatura local da superfície da pele mais elevada do que o DMM, enquanto a AS não esteve.

As imagens de RNM não mostraram anormalidade visível no sinal muscular periarticular no grupo Sham, alterações de sinal mais acentuadas no grupo DMM, alterações menos acentuadas no grupo EA e alterações semelhantes nos grupos SA e DMM (Figura 5A). Após o tratamento com EA, as articulações do joelho direito foram coletadas, embutidas em parafina e seccionadas em plano sagital com espessura de 4 µm. As seções foram coradas com Safranina O-Fast Green e avaliadas utilizando o sistema histopatológico OARSI. Em comparação com o grupo Sham, o grupo DMM apresentou maior desgaste da cartilagem articular e pontuação OARSI mais elevada. O grupo EA mostrou menor degeneração da cartilagem e pontuação OARSI mais baixa do que o grupo DMM (P < 0,05), enquanto o grupo SA não diferiu significativamente do grupo DMM (Figura 5B,C e Tabela 4).

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Figura 1: Cronograma experimental, diagrama dos pontos de acupuntura e teste de rotarod em camundongos com OA. (A) Cronograma experimental. (B) Diagrama dos pontos de acupuntura. (C) Teste de rotarod. n = 6 por grupo. Cada camundongo realizou três ensaios. Os dados são apresentados como média ± DP. ### Falso vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; ** EA vs DMM, P < 0,01. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Exame ultrassonográfico passo a passo. (A) Coloque o camundongo em uma câmara de indução para anestesia. (B) Aplique creme depilatório na pata traseira. (C) Após aplicar o creme uniformemente, espere 1 min. (D) Remova o excesso de creme depilatório e pelos com gaze. (E) Inspecione a pata traseira depilada. (F) Antes da aquisição de imagens, retorne o camundongo à câmara de indução para anestesia. (G) Aplique agente acoplador de ultrassom na pata traseira e gire a sonda até que fique paralela ao eixo longitudinal da pata traseira. (H) Adquira imagens ultrassonográficas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagens representativas e resultados quantitativos de exames de ultrassom em pequenos animais em camundongos com OA. (A) Reconstruções tridimensionais por ultrassom da articulação do joelho antes da cirurgia, 1 semana após a cirurgia e após o tratamento com EA (distância de varredura, 4 mm; tamanho do passo, 0,04 mm). Barras de escala = 2 mm. (B) Volume da cavidade articular pré-operatório (n = 6 por grupo). (C) Volume da cavidade articular 1 semana após a cirurgia (n = 6 por grupo). (D) Volume da cavidade articular após a intervenção com EA (n = 6 por grupo). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; *** EA vs DMM, P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Termogramas infravermelhos representativos e resultados quantitativos de temperatura da pele em camundongos com OA. (A) Termogramas das extremidades inferiores antes da cirurgia, 1 semana após a cirurgia e após o tratamento com EA. Cada termograma foi exibido utilizando a faixa automática de temperatura do software da câmera infravermelha; portanto, as cores não são diretamente comparáveis entre os painéis. As comparações quantitativas devem ser baseadas nos gráficos de dispersão nos painéis B–D. (B–D) Análise quantitativa da temperatura da pele na região de interesse (ROI) na articulação do joelho, definida como a linha articular medial na articulação femorotibial. (B) Temperatura da pele da extremidade inferior antes da cirurgia (n = 6 por grupo). (C) Temperatura da pele da extremidade inferior 1 semana após a cirurgia (n = 6 por grupo). (D) Temperatura da pele da extremidade inferior após a intervenção com EA (n = 6 por grupo). Os dados são apresentados como média ± DP. ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; ** EA vs DMM, P < 0,01. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Imagens representativas de ressonância magnética de alterações no sinal muscular periarticular, cortes histológicos da articulação do joelho e resultados quantitativos em camundongos com OA. (A) Imagens representativas de ressonância magnética de cada grupo. (B) Cortes representativos do joelho corados com Safranina O-Verde Rápido. Barras de escala = 1 mm. (C) Pontuações da patologia da cartilagem OARSI (n = 6 por grupo). As pontuações OARSI são apresentadas como mediana (P25, P75). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; ** EA vs DMM, P < 0,01. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

GrupoNSemana 5
Sham6101,300 ± 5,416
DMM670,280 ± 3,363###
SA670,060 ± 7,796
EA684,390 ± 9,504**
Nota: ### Sham versus DMM, P < 0,001; ** EA versus DMM, P < 0,01.

Tabela 1: Teste de rotarod (média ± DP; n = 6 por grupo). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ** EA vs DMM, P < 0,01.

GrupoNSemana 0Semana 1Semana 5
Sham62,029 ± 0,0552,056 ± 0,0712,061 ± 0,079
DMM62,058 ± 0,0682,591 ± 0,056###2,926 ± 0,088###
SA62,056 ± 0,0452,592 ± 0,0762,915 ± 0,112
EA62,032 ± 0,0592,548 ± 0,0742,177 ± 0,110***
Nota: ### Sham versus DMM, P < 0,001; *** EA versus DMM, P < 0,001.

Tabela 2: Volume da cavidade articular (média ± DP; n = 6 por grupo). ### Sham versus DMM, P < 0,001; *** EA versus DMM, P < 0,001.

GrupoNSemana 0Semana 1Semana 5
Sham635,517 ± 1,36635,717 ± 0,54635,650 ± 0,701
DMM635,783 ± 1,29235,033 ± 0,78132,967 ± 1,223###
SA635,583 ± 1,78035,283 ± 0,86133,267 ± 0,501
EA635,500 ± 1,51035,417 ± 0,88234,533 ± 0,929**
Nota: ### Sham versus DMM, P < 0,001; ** EA versus DMM, P < 0,01.

Tabela 3: Temperatura da pele (média ± DP; n = 6 por grupo). ### Sham versus DMM, P < 0,001; ** EA versus DMM, P < 0,01.

GrupoNSemana 5Mediana
Sham60,000 (0,000; 0,250)0
DMM64,000 (3,000; 4,250)###4
SA64,000 (3,000; 4,250)4
EA62,500 (1,750; 3,000)**2,5
Nota: ### Sham versus DMM, P < 0,001; ** EA versus DMM, P < 0,01.

Tabela 4: Escore OARSI [mediana (P25, P75); n = 6 por grupo]. ### Sham vs DMM, P < 0,001; ** EA vs DMM, P < 0,01.

Discussão

A osteoartrite do joelho (OJ) é uma doença degenerativa progressiva, e as intervenções terapêuticas atuais oferecem eficácia limitada na interrupção de sua progressão subjacente17. A disfunção muscular e a redução do desempenho físico são preditores clinicamente significativos da gravidade dos sintomas. Consequentemente, o manejo ativo de fatores de risco modificáveis é essencial para retardar a progressão da OJ18. Utilizando um sistema de avaliação multimodal, este estudo demonstrou que a AE esteve associada à melhora do desempenho motor, redução do volume da cavidade articular, aumento da temperatura local da superfície cutânea, alterações de sinal na RM dos músculos periarticulares menos acentuadas e menores escores OARSI em camundongos com OA.

Os achados da TIR reforçam ainda mais essa visão integrada. Uma semana após a cirurgia, as temperaturas cutâneas não diferiram entre os grupos, incluindo o grupo Controle, o que provavelmente reflete uma resposta uniforme ao trauma cirúrgico, caracterizada por vasoconstrição transitória e edema superficial que temporariamente reduziu a emissão de calor da superfície da pele. Em contraste, a divergência térmica significativa observada após o tratamento sugere que as ações anti-inflamatórias e microcirculatórias da AE são cumulativas e não imediatas, tornando-se evidentes apenas após sessões repetidas. Essas medidas de desfecho podem estar inter-relacionadas. O inchaço da cavidade articular geralmente reflete a extensão da inflamação sinovial e da efusão, enquanto o estado microcirculatório local está estreitamente associado às alterações na permeabilidade vascular durante a inflamação19. Em nossos experimentos, a redução no volume articular após a administração de AE coincidiu com um aumento na temperatura local. Embora a TIR não meça diretamente o fluxo sanguíneo, as alterações coincidentes sugerem que o aumento do fluxo sanguíneo local pode facilitar a eliminação de mediadores inflamatórios, reduzindo assim a infiltração inflamatória no interior do revestimento sinovial e nos músculos adjacentes. A melhora subsequente da função motora pode decorrer dos benefícios combinados da diminuição do inchaço e da atenuação da inflamação. De modo geral, as alterações observadas nesses parâmetros parecem ser respostas interconectadas e não eventos isolados. Esse padrão sugere que a AE pode modular múltiplos processos patológicos de maneira integrada, em vez de atuar por meio de um único mecanismo20.

Em comparação com as avaliações histológicas convencionais em ponto final, o sistema de monitoramento dinâmico multimodal empregado neste estudo oferece vantagens práticas distintas. O ultrassom em pequenos animais permite o acompanhamento longitudinal e não invasivo do derrame articular sem exposição à radiação, evitando a variabilidade entre animais inerente à coleta de tecidos em ponto final21. A ressonância magnética em pequenos animais complementa o ultrassom ao fornecer visualização detalhada das alterações de sinal nos músculos periarticulares. Isso permite uma avaliação qualitativa da inflamação muscular que o ultrassom isoladamente pode não captar completamente. Associada à termografia infravermelha para medição em tempo real da temperatura cutânea local, essa abordagem fornece um indicador indireto da resolução da inflamação. A disponibilidade dessas modalidades de imagem torna viável a realização de medições repetidas ao longo do tratamento. Além de cumprir os princípios dos 3R, esse delineamento longitudinal permite observações repetidas em cada animal, o que minimiza a influência da variabilidade interindividual. Tanto quanto sabemos, nenhum estudo prévio em animais que avalie a acupuntura para OA integrou ultrassom, ressonância magnética, termografia, testes comportamentais e histopatologia dentro de um único arcabouço experimental. Essa abordagem multilível fornece dados complementares nos domínios funcional, morfológico e histológico, oferecendo uma avaliação mais abrangente do que qualquer ponto final isolado poderia proporcionar.

Várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, este trabalho baseia-se em dados observacionais de experimentos com animais e carece de evidências mecanicistas provenientes de estudos in vitro. Permanece desconhecido se a AE ativa a via da família de receptores tipo NOD, domínio pirina 3 (NLRP3)/caspase-1/IL-1β. A IL-1β e a IL-18 são mediadores-chave da inflamação sinovial e muscular, e sua maturação requer a ativação do inflamassoma NLRP322. Também não é possível determinar se as melhorias circulatórias observadas se correlacionam com alterações na expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)23. Segundo, aplicamos um único parâmetro de AE (2/100 Hz) em dois pontos de acupuntura (E36 e BP10). Se diferentes configurações ou combinações alternativas de pontos de acupuntura poderiam gerar resultados superiores exige investigação adicional24. Terceiro, um único operador adquiriu todos os dados de imagem. Embora essa abordagem tenha garantido consistência técnica, a confiabilidade entre observadores não foi avaliada, o que potencialmente limita a generalização dos achados de imagem. Quarto, omitimos um grupo controle submetido apenas à contenção, dificultando a separação completa dos efeitos da anestesia, imobilização e manipulação dos efeitos terapêuticos da AE. Quinto, o procedimento de SA foi projetado como um controle mínimo para reduzir os efeitos específicos dos pontos de acupuntura, tecidos profundos e estimulação elétrica. No entanto, a diferença na profundidade da punção entre as intervenções verdadeira e simulada impede o isolamento da contribuição exclusiva da profundidade. Consequentemente, nossos achados devem ser interpretados como uma comparação entre o protocolo completo de AE e um procedimento simulado mínimo, e não como uma avaliação estrita da estimulação elétrica isolada. Sexto, a distância da câmera, o ângulo de imagem e a área absoluta da ROI não foram formalmente documentados, o que constitui uma limitação técnica. Uma última limitação é o uso de ANOVAs separadas por ponto temporal, o que ignora as correlações de medidas repetidas e a interação tempo por grupo, reduzindo assim a sensibilidade às mudanças dinâmicas.

Em resumo, a EA esteve associada a desfechos anti-inflamatórios e funcionais em um modelo murino de OA induzida por DMM. Apesar de limitações, como resolução variável entre as modalidades, dependência do operador na US e na IRT, custos elevados da RNM e estresse potencial decorrente de medições repetidas, o protocolo permanece como uma plataforma viável para avaliação longitudinal multimodal. O sistema integrado fornece uma estrutura para avaliação pré-clínica. Trabalhos futuros devem otimizar os parâmetros elétricos e aproveitar plataformas de organoides, órgãos-em-chip e inteligência artificial para elucidar mecanismos e orientar terapias individualizadas25,26. Controles simulados aprimorados, protocolos padronizados e acompanhamento mais prolongado também são necessários para melhorar a translação clínica.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Plano de Ação para Inovação em Ciência e Tecnologia em Xangai (23YF1447900 para JMC) e pela Fundação Nacional Natural de Ciências da China (U23A20508 para LQY, 82575196 para HSC e U24A6013 para HX).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de ácido acético 1%SolarbioCat# G1371Solução de diferenciação/lavagem para coloração
Ácido clorídrico 1% em etanolSolarbioCat# G1371Solução de diferenciação com álcool ácido
RMN de pequenos animais 7TShanghai Chenguang7T MRI NOVALSistema de imagem por ressonância magnética para pequenos animais
Agulhas de acupuntura (0,16 mm × 25 mm)Wuxi Jiajian Medical Instrument, Wuxi, Chinalote n.º 491226Agulhas de acupuntura estéreis
Lâminas adesivas para microscopiaJiangsu ShitaiMH0662Lâminas para microscopia para seções de tecido
Etanol anidroShanghai Titan Technology Co., Ltd.64-17-5Etanol para desidratação
Camundongos C57BL/6Shanghai Silaike Laboratory Animal Co., Ltd.https://www.slaccas.com/Animais experimentais
Lâminas de coberturaJiangsu ShitaiNão fornecidoColeta e montagem de seções de tecido
Solução de descalcificaçãoSerivebioG1105-500mlReagente para descalcificação de ossos e articulações, pH 7,2–7,4
Dispositivo de eletroterapiaSuzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd.SD-ZEstimulador de eletroacupuntura
Ácido etilenodiaminotetraacéticoShanghai Titan Technology Co., Ltd.60-00-4Reagente quelante
Fiji (ImageJ)National Institutes of Health (NIH)ImageJ com Java 8 de 64 bits.Software de análise de imagem
GazeWeizhe MedicalModelo A1: Compressas de Gaze Padrão (Esterilizadas)Material para remoção de pelos e limpeza
Creme depilatórioVEETNão fornecidoCreme depilatório
Software de análise de imagem infravermelhaFLIRVersão não fornecidaSoftware fornecido com o imageador térmico infravermelho
Imageador térmico infravermelhoFLIR435-0007-03 (Lote Inicial)Sistema de termografia infravermelha
Sistema de anestesia inalatória para pequenos animaisMatrx07149Sistema de anestesia a gás para pequenos animais
Isóflurano (anestésico inalatório)RWD217140901Anestésico inalatório
Fita elástica impermeável médica Naisikang (3,81 cm × 4,57 m)Naisikang™732Material para posicionamento de membros em RMN
Kit de Coloração Modificado com Safranina O e Verde Rápido (para osso)SolarbioCat# G1371Kit de coloração para cartilagem e osso
Porta-agulhasRWDF21001-12Fixação e sutura intraoperatórias
Meio de montagem com resina neutrabiosharp23338664Meio de montagem histológica
OxigênioNão fornecidoNão fornecidoGás de transporte para anestesia inalatória
Máquina de inclusão em parafinaLEICAEG1150CSistema de inclusão em parafina
Microtomo de parafinaLEICARM2235Microtomo rotativo
Cera de parafinaepredia151534Meio de inclusão
ParaformaldeídoSinopharm Reagents Co., Ltd.80096618Fixador de tecidos
PBSServicebioG0002Solução salina tamponada com fosfato
Aparelho rotarodPanlabLE8205Sistema de teste de fadiga rotarod
Plataforma de imagem por ultrassom para pequenos animaisFujiVevo 3100Sistema de ultrassom para pequenos animais
Hidróxido de sódioShanghai Titan Technology Co., Ltd.G19852HReagente de laboratório
Stereo microscópioOlympusSZ61Microscópio de dissecação
Agulhas de sutura com fio (sutura absorvível 6-0 e sutura de seda 6-0)Ningbo Medical Suture Co., Ltd.Agulhas Cosméticas 1/2 4X12 40Sutura pós-operatória
Lâminas cirúrgicas (10#)Hangzhou Nuoyang Biotechnology Co., Ltd.20090120Incisão do ligamento do menisco medial
Desidratador de tecidosLEICATP1020Processador automático de tecidos
Secador de tecidosLEICAHI1220Secador de lâminas
Blocos para inclusão de tecidosJiangsu ShitaiREF31050102WConsumíveis para inclusão
Espalhador de tecidosLEICAHI1210Sistema de espalhamento de seções
Software de análise de ultrassom (Vevo Lab 3.1.0)OpticVersão 3.1.0Software de análise de ultrassom tridimensional
Agente acoplante de ultrassomHu Qingyu TangYY0299-2008Gel acoplante de ultrassom
Scanner de lâminas inteirasOlympusVS200Sistema digital de digitalização de lâminas
XilolSinopharm Reagents Co., Ltd.10023418Reagente de clareamento

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