Enriquecimento de Tirotropos da Hipófise de Camundongos de Camundongos Hipotireoides Usando Classificação Celular Ativada por Fluorescência à Base de CD90

Resumo

Este protocolo descreve o enriquecimento de tireotrópicos de glândulas pituitárias adultas de camundongos hipotireoidistas usando dissociação enzimática e separação celular ativada por fluorescência baseada em CD90, possibilitando análises moleculares posteriores e cultura primária de curto prazo de uma população celular enriquecida com tirórope.

Resumo

Os tireotropes são células endócrinas especializadas na glândula pituitária anterior que secretam o hormônio estimulante da tireoide (TSH) e regulam a atividade tireoide. A secreção de TSH é positivamente regulada pelo hormônio liberador de tirotropina hipotalâmico e regulada negativamente pelos hormônios da tireoide circulantes. Os tirotropos constituem apenas uma pequena fração das células pituitárias (~5%), o que complica os esforços para isolar e estudar sua fisiologia. Aqui, descrevemos uma abordagem aprimorada para isolar tirótropos de camundongos adultos hipotireoidianos. O hipotireoidismo foi induzido para expandir a população de tireotropos antes da dissociação enzimática da glândula pituitária anterior e da separação celular ativada por fluorescência usando o antígeno de superfície CD90.2. O processamento das glândulas pituitárias anteriores de doze camundongos resultou em aproximadamente 1,5 × 10 células⁶ CD90,2 positivas enriquecidas para expressão de RNA mensageiro Tshb . As células CD90.2-positivas representavam aproximadamente 25% das células da hipófise anterior e apresentavam uma expressão de Tshb aproximadamente cinco vezes maior em comparação com as CD90.2-negativas, indicando um enriquecimento substancial de tireotrope. Células isoladas permaneceram viáveis em cultura de curto prazo e mantiveram a resposta ao tratamento com triiodotironina. Esse protocolo permite o enriquecimento e a cultura de tirotropos de camundongos para análises moleculares, transcriptômicas, epigenômicas e fisiológicas a jusante.

Introdução

A glândula pituitária é um órgão endócrino localizado na base do cérebro que exerce controle hierárquico sobre a homeostase hormonal. Sua atividade é regulada por sinais hipotalâmicos que estimulam ou inibem a produção de hormônios pituitários, que por sua vez governam a função dos órgãos endócrinos periféricos. A glândula contém uma população heterogênea e dinâmica de células, incluindo células-tronco/progenitoras e células diferenciadas produtoras de^{hormônios 1}. Em resposta ao estresse fisiológico ou lesão, as células-tronco/progenitoras da hipófise podem ativar, se auto-renovar e se diferenciar em múltiplas linhagens secretoras^{de hormônios 2,3}. Estruturalmente, a hipófise é organizada em dois lobos principais: o lobo posterior (PL), composto por pitujitas e terminais neurosecretórios que liberam ocitocina e vasopressina, e o lobo anterior (AL), que contém tipos celulares endócrinos especializados secretando hormônio do crescimento, prolactina, hormônio estimulante da tireoide (TSH), hormônio adrenocorticotrópico e o hormônio folículo-estimulante das gonadotropinas (FSH) e hormônio luteinizante (LH). A hipófise anterior também abriga tipos celulares não hormonais, como células folliculoseteladas S100B-positivas, células endoteliais e perícitos, que apoiam a função^{endócrina 4,5,6}. Roedores também contêm melanótrofos no lobo intermediário da glândula^{pituitária 7,8}.

O interesse pela função, diferenciação e desenvolvimento da hipófise impulsionou o desenvolvimento de múltiplos protocolos voltados para isolar células-tronco e progenitoras hipofisárias adultas em modelos de roedores. Ratos são frequentemente usados em pesquisas em fisiologia hipofisária porque suas glândulas pituitárias maiores produzem maior número celular e melhoram a recuperação durante o processamento dos^{tecidos 4,9}. Em contraste, isolar células pituitárias de camundongos continua sendo tecnicamente desafiador, e protocolos padronizados são limitados. Protocolos recentes que utilizam agregados de células-tronco/progenitoras da hipófise adulta fornecem ferramentas úteis para modelar o desenvolvimento e a função da^{hipófise 10}; no entanto, esses sistemas ainda não permitem o isolamento direto de populações celulares endócrinas específicas. Entre os tipos celulares produtores de hormônios da hipófise anterior, os tireotropos são os principais reguladores do eixo hipotálmico–hipófise–tireoide (THP), controlando a síntese e secreção do hormônio tireoidiano (TH) em mamíferos. O TSH produzido pelos tirotropos é uma glicoproteína heterodimérica composta por uma subunidade α comum (codificada pela Cga e compartilhada com FSH e LH) e uma subunidade β (codificada pela Tshb), que confere especificidade receptora. Essas células são altamente sensíveis aos níveis circulantes de triiodotironina (T3) e tireoxina (T4). A população de tireotropos se expande quando os níveis de T3 e T4 são baixos durante o hipotireoidismo e contrai durante o hipertireoidismo por meio de um mecanismo clássico de retroalimentação^negativa 11,12,13.

Apesar de seu papel fisiológico essencial, os tireotropos continuam difíceis de estudar porque constituem apenas uma pequena fração das células hipofisárias anteriores (aproximadamente 5%) e compartilham características fenotípicas com outras populações endócrinas. Essa escassez, juntamente com a ausência de modelos robustos in vitro, limitou as investigações mecanicistas sobre regulação tirotrópica e controle do eixo HPT. A linhagem celular tumoral TαT1 representa um modelo¹⁴ semelhante ao tirórope, mas não reflete totalmente as respostas fisiológicas; em particular, a repressão dependente de T3 do Tshb é frequentemente difícil de avaliar devido ao seu nível basal^{de transcrição muito baixo 15}. Consequentemente, muitos estudos têm se baseado em linhas celulares não tireotrópicas, como HEK293, COS, CV1, GH3 ou JEG3, que expressam diferentes construtos de Tshb ¹⁵. No entanto, esses são sistemas heterólogos que podem introduzir artefatos reguladores não fisiológicos, incluindo efeitos impulsionados por espinhas dorsuais plasmídicas em vez de mecanismos transcricionais endógenos.

Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para isolar tireótropos da glândula pituitária adulta de camundongo, adaptado de um método previamente estabelecido em^{ratos 9}, e otimizado para o menor tamanho e menor teor de tireótropos na hipófise do camundongo. Várias modificações importantes foram introduzidas para aumentar o rendimento das células que expressam Tshb e garantir análises confiáveis a jusante. O protocolo aproveita a expressão do antígeno de superfície CD90, um marcador de superfície enriquecido em tireótropos. CD90 (também conhecido como THY1) é uma proteína de membrana^16,17 ancorada no glicosilfosfatidilinositol ^{que media} a sinalização justtacrina por meio de interações heterotípicas com o ligante integrina β2 (ITGB2). Embora CD90 seja comumente associado a populações de células imunes e neurais, estudos transcriptômicos anteriores identificaram o enriquecimento de Thy1 em tirotropos. A sinalização de contato dependente de THY1 ocorre em diversos tipos celulares, incluindo células hematopoiéticas, células T, fibroblastos, células endoteliais e neurônios, onde regula adesão, migração, apoptose, supressão tumoral e^fibrose 18,19,20.

Importante destacar que o perfil transcriptômico de célula única da hipófise anterior do rato identificou o Thy1 como um dos genes relacionados à adesão mais expressos nos^{tirótropos 5}, sugerindo que o THY1 é um marcador superficial enriquecido em tirotropos. Além disso, conjuntos de dados públicos de sequenciamento de ácido ribonucleico (RNA) de células unicelulares em hipófise em camundongos indicam que a expressão de Thy1/CD90 é enriquecida nos^{tirotropos 22,23}. No entanto, sua expressão não se restringe inteiramente a essa linhagem, com expressão detectável em subconjuntos de células da linhagem PIT1, incluindo somatotropos e lactotropos, bem como em populações semelhantes a progenitores. Estudos transcriptômicos de célula única demonstraram sobreposição transcricional substancial entre células hipofisárias da linhagem PIT1, incluindo a identificação de uma população progenitor comum de PIT1 capaz de gerar somatotrópos, lactotópios e^{tireotrópios 24}. Da mesma forma, Thy1/CD90 não identifica exclusivamente a população de tireótropos, mas pode ser usado para enriquecer tirótropos de camundongos. Com base nesses achados, o uso de anticorpos direcionados a THY1 em nossa estratégia de isolamento oferece um método eficaz para enriquecer tireotrópicos após a expansão induzida pelo hipotireoidismo e possibilita estudos funcionais, incluindo avaliação das respostas hormonais ao T3.

O protocolo começa alimentando camundongos selvagens do tipo C57BL/6 com uma dieta baixa em iodo e inibindo a função tireoide com metimazol (MMI) e perclorato de potássio (_{KClO 4}) na água^{potável 25}. Esse tratamento induz hipotireoidismo significativo em uma semana e expande a população de tireotropos que expressam Tshb na hipófise anterior. Células produtoras de TSH sob condições hipotireoidianas passam por adaptações fisiológicas e morfológicas substanciais, incluindo hiperplasia, hipertrofia, citoplasma vacuolado abundante, processos citoplasmáticos proeminentes e lisossomos aumentados, refletindo adaptação à ausência de retroalimentação TH 26,27,28. Assim, a indução do hipotireoidismo pode ser usada como estratégia para expandir a população de tireotropos.

Após a indução do hipotireoidismo, camundongos são anestesiados com isoflurano e submetidos a perfusão cardíaca com solução salina tamponada com HEPES livre de Ca²⁺/^Mg 2+-free para maximizar a viabilidade celular durante a dissociação tecidual. Após a colheita, a glândula pituitária anterior passa por uma digestão enzimática suave para gerar uma suspensão unicelular que é incubada com um anticorpo anti-CD90.2 conjugado ficoeritrina-cianina 7 para enriquecer os tirotropos por meio da separação celular ativada por fluorescência (FACS). As células marcadas são posteriormente coletadas em meio de crescimento para cultura de curto prazo ou em TRIzol para extração de RNA. Para validar a estratégia de enriquecimento, a expressão de RNA mensageiro Tshb foi medida em populações classificadas e encontrada altamente enriquecida em células CD90-positivas. Esse método apoia uma ampla gama de aplicações posteriores em camundongos, incluindo perfilamento de expressão gênica, análises transcriptômicas e epigenômicas, ensaios de alta capacidade e cultura celular primária, e oferece uma plataforma valiosa para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à função dos tirotropos e à regulação do eixo HPT.

Protocolo

Este protocolo descreve o isolamento dos tireotropes da AL de glândulas pituitárias recém-dissecadas, obtidas de camundongos adultos após pelo menos 1 semana de indução do hipotireoidismo. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e do Instituto Nacional de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório. O Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Seção Médica da Universidade do Texas aprovou todos os procedimentos com animais.

Ratos machos e fêmeas foram agrupados durante os experimentos porque não foram observadas diferenças dependentes do sexo no rendimento de tireotropos ou nas análises a jusante. Aproximadamente 12 camundongos foram usados por experimento, embora coortes maiores de até 20 animais possam ser processados escalando proporcionalmente todos os volumes de reagentes.

O isolamento bem-sucedido depende de perfusão rápida e consistente, tempo mínimo de dissecação, remoção completa da PL e placagem de alta densidade das células primárias. O tempo máximo recomendado de processamento entre eutanásia, perfusão, dissecção da hipófise e início da digestão enzimática foi de 6 horas. As células foram placadas com uma densidade de 2,0–2,5 × 10,5 células por 0,7 cm^{de poço 2} (a área de superfície de um poço de uma lâmina de vidro de 8 poços). Uma viabilidade mínima de 95% era necessária para apoiar a cultura de tirotropos de curto prazo.

Todos os reagentes usados para geração de suspensão de célula única foram preparados em condições estéreis. As superfícies de trabalho foram esterilizadas com 70% de etanol, os instrumentos de dissecação foram autoclavados antes do uso, e todas as etapas de preparação da cultura celular foram realizadas em um gabinete de biossegurança usando técnica asséptica. Esse protocolo foi padronizado para 12 animais. Escale todos os volumes de reagentes proporcionalmente ao usar um número diferente de camundongos. Consulte a Tabela de Materiais para todos os reagentes, consumíveis e equipamentos.

Durante a indução do hipotireoidismo, os camundongos foram alojados sob condições específicas livres de patógenos a 20°C–24°C e umidade relativa de 40%–60%, com ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridade e acesso ad libitum a comida e água. Os animais eram alojados em grupos (até três camundongos por gaiola) em gaiolas ventiladas individualmente, contendo cama padrão e enriquecimento ambiental, incluindo material de nidificação e abrigo. A indução bem-sucedida do hipotireoidismo foi confirmada pela medição da expressão hepática de iodotironina deiodinase (Dio1). Uma redução de pelo menos 50% na expressão do RNA mensageiro Dio1 (mRNA) em relação a camundongos controle eutireoides foi considerada indicativa de indução bem-sucedida do hipotireoidismo.

1. Indução de hipotireoidismo em camundongos C57BL/6

NOTA: Realize este procedimento ao longo de 7 a 10 dias para induzir hipotireoidismo in vivo por meio de uma dieta deficiente em iodo e inibição química da função tireoide. Veja a Figura 1A para o desenho experimental e a Figura 1B para validação da indução do hipotireoidismo.

Figura 1. Indução de hipotireoidismo em camundongos C57BL/6. (A) Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental usado para induzir hipotireoidismo em camundongos adultos C57BL/6. Os camundongos receberam 0,05% de metimazol (MMI) e 0,1% de perclorato de potássio (KClO₄) em água potável, juntamente com uma dieta deficiente em iodo por 7 dias antes do isolamento da hipófise anterior. (B) Análise da reação quantitativa em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-qPCR) da expressão hepática de ácido ribonucleico mensageiro Dio1 (mRNA) em camundongos eutireoides e hipotireoides. A ciclofilina A (CyA) foi usada como gene de referência. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DE) (n = 6 por grupo). A significância estatística foi determinada usando o teste t de Student. **P < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

1. Prepare água potável MMI/KClO₄
   1. Dissolva 1 g de MMI e 2 g de KClO₄ em 2 L de água filtrada.
   2. Mexa a solução em temperatura ambiente (20°C–25°C) por 1 h até a dissolução completa.
      ATENÇÃO: MMI e KClO₄ são produtos químicos perigosos. Use luvas, jaleco e proteção ocular durante a preparação e o manuseio.
      NOTA: A MMI inibe a organização do iodeto, enquanto o KClO₄ bloqueia a absorção de iodeto através do simportador de sódio–^{iodeto 25}. Substitua a solução para beber a cada 2 dias para manter a dosagem correta e minimizar a contaminação por roupas de cama, resíduos alimentares e crescimento microbiano. Se não for usada imediatamente, armazene a solução em um recipiente resistente à luz bem fechado a 4°C por até 14 dias.
2. Induzir hipotireoidismo
   1. Camundongos machos ou fêmeas de 8 semanas C57BL/6 em grupos de até três animais por gaiola, sob condições de habitação livres de iodo.
      NOTA: Camundongos domésticos sob condições específicas livres de patógenos entre 20°C–24°C e umidade relativa de 40%–60%, com ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridade e acesso ad libitum a comida e água. Mantenha os animais em gaiolas ventiladas individualmente, contendo cama padrão e enriquecimento ambiental, incluindo material de nidificação e abrigo. Aclimate os animais por 3 dias antes de iniciar o tratamento. Ratos machos e fêmeas da casa separadamente. Para os experimentos descritos aqui, o grupo eutireoide consistia em seis machos e seis fêmeas alojados em gaiolas separadas, e o grupo hipotireoide consistia em seis machos e seis fêmeas alojados em gaiolas separadas. As AL em pool de camundongos machos e fêmeas dentro do mesmo grupo de tratamento durante a preparação celular porque não foram observadas diferenças dependentes do sexo no rendimento de tireotropos ou análises a jusante.
   2. Alimente os camundongos com uma dieta deficiente em iodo ad libitum por 7 a 10 dias.
      NOTA: Inicie simultaneamente a dieta deficiente em iodo e o tratamento com MMI/KClO₄.
   3. Forneça água potável contendo 0,05% de MMI e 0,1% de KClO₄ ad libitum durante todo o período de tratamento.
      NOTA: Mantenha o tratamento até a eutanásia. Monitore diariamente o peso corporal, a ingestão de alimentos, a ingestão de água e os sintomas clínicos durante a indução do hipotireoidismo. A indução bem-sucedida do hipotireoidismo está tipicamente associada a redução do ganho de peso corporal e a sinais clínicos como diminuição da atividade ou pelo opaco em comparação com os controles eureoidianos. Períodos de indução de sete e dez dias produzem eficiência de enriquecimento tireotrópico comparável.

2. Perfusão cardíaca e dissecção da AL

NOTA: Realize este procedimento em aproximadamente 15 minutos por camundongo para maximizar a viabilidade do tecido e preservar a integridade celular durante o isolamento da hipófise.

1. Preparar soluções de perfusão e coleta
   1. Prepare solução salina tamponada com HEPES (HBSS) sem Ca²⁺ e Mg²⁺
      1. Combine 667 mL de 0,9% de NaCl, 20 mL de 1 M HEPES e 313 mL de água duplamente destilada (ddH₂O) para preparar 1 L de HBSS preparado sob medida sem Ca²⁺ e Mg²⁺.
      2. Autoclave a solução e armazene-a a 4°C até o uso.
   2. Prepare HBSS heparinizado sem Ca²⁺ e Mg²⁺
      1. Adicione 27 μL de enoxaparina sódica (solução de estoque de 100 mg/mL) a 50 mL de HBSS preparado sob medida sem Ca²⁺ e Mg²⁺.
   3. Preparar o meio de coleta (CM)
      1. Combine 440 mL de médio Eagle modificado de Dulbecco, 50 mL de soro fetal bovino (FBS) inativado por calor, 4 mM de L-glutamina e 10 mL de 1 M HEPES para um volume final de 500 mL.
      2. Esterilize a solução com filtro usando um filtro de 0,22 μm e armazene a 4°C por até 1 mês.
         NOTA: Prepare 50 mL de alíquotas sob um armário de biossegurança antes do armazenamento para minimizar a contaminação.
      3. Aqueça o CM a 20°C–25°C antes do uso.
   4. Esterilizar instrumentos de dissecação
      1. Esterilize tesouras, pinças, pinças, suportes de agulha, pinças de íris, colheres cirúrgicas e sondas sem embutido com etanol a 75% antes do uso.
         NOTA: Deixe os instrumentos secarem completamente ao ar após a esterilização com etanol antes do contato com o tecido.
2. Realizar perfusão cardíaca
   1. Anestesie profundamente o camundongo usando isoflurano administrado em 100% de oxigênio. Induzir anestesia em uma câmara a 5% de isoflurano e manter anestesia por um cone nasal a 3% de isoflurano com monitoramento contínuo e recaptação de gases residuais.
      ATENÇÃO: Realize procedimentos de anestesia com isoflurano de acordo com as diretrizes institucionais de segurança e utilize sistemas adequados de limpeza para minimizar a exposição à inalação.
   2. Confirme anestesia completa verificando a ausência do reflexo de retirada do pedal usando um beliscão no dedo do pé.
   3. Borrife o animal com etanol 75% e coloque-o na etapa de perfusão dentro da bandeja de coleta.
   4. Prenda os membros para expor a região peritoneal.
   5. Abra cuidadosamente a cavidade torácica evitando danos aos órgãos principais e vasos sanguíneos.
   6. Corte ao longo das costelas para criar uma aba no peito, dobre a aba sobre a cabeça e prenda-a com um hemostato.
   7. Estabilize o coração usando uma pinça e insira uma agulha calibre 23 no ápice do ventrículo esquerdo.
   8. Conecte a agulha a uma bomba peristáltica usando tubos de silicone.
   9. Comece a perfusão com HBSS heparinizado sem Ca²⁺ e Mg²⁺ mantidos em temperatura ambiente.
   10. Incisa o átrio direito imediatamente após a perfusão começar para permitir a drenagem.
   11. Perfunde o animal por 5 minutos com uma vazão de 3 mL/min.
       NOTA: Confirme a perfusão bem-sucedida observando o palidão visível do fígado.
3. Isolar o AL
   1. Decapite o camundongo imediatamente após a perfusão.
   2. Remova o couro cabeludo e os ossos cranianos usando tesouras finas de dissecação e pinças para expor o cérebro.
   3. Insira uma colher cirúrgica entre o cérebro e o crânio.
   4. Levante o cérebro suavemente e corte o quiasma óptico.
   5. Remova a fina membrana meníngea (dura-mater) que cobre a glândula pituitária sob um estereomicroscópio usando pinças finas.
   6. Dissecar e descartar cuidadosamente a PL como mostrado na Figura 2A.
      NOTA: Identifique a AL como o maior tecido rosa localizado rostralmente. Identifique o PL como o tecido branco-translúcido menor localizado dorsalmente.
   7. Corte o tecido conjuntivo ao redor e as membranas meníngeas residuais com uma sonda romba para melhorar o acesso à AL.
   8. Segure o AL com uma pinça romba e transfira-o para um tubo de polipropileno de 15 mL contendo 1,8 mL CM.
      NOTA: Agrupe ALs de 12 animais no mesmo tubo de coleta.
   9. Mantenha a amostra em temperatura ambiente até que todas as dissecações estejam concluídas.
      NOTA: Não exceda 3 horas entre a coleta do tecido e o início da digestão enzimática para minimizar a perda de viabilidade celular.
4. Confirmar indução de hipotireoidismo
   1. Pegue uma pequena amostra de fígado (aproximadamente 50 mg) de cada camundongo.
   2. Quantifique a expressão hepática de Dio1 mRNA por reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa em tempo real e compare com controles eureoidianos não tratados (Figura 1B).
      NOTA: Defina indução bem-sucedida do hipotireoidismo como uma redução de pelo menos 50% na expressão hepática de Dio1 em relação aos controles eutireoides. A expressão de Dio1 se correlaciona positivamente com os níveis circulantes^{de TH 29}; portanto, a redução da expressão de Dio1 confirma indução bem-sucedida do hipotireoidismo.
5. Coleta repetida de tecido
   1. Repita os passos 2.2–2.4. até que ALs de 12 camundongos tenham sido coletados.
   2. Prossiga imediatamente para o Passo 3.

Figura 2. Preparação de uma suspensão unicelular da hipófise anterior do camundongo. (A) Fluxo de trabalho ilustrando a dissecção do lobo anterior (AL), dissociação enzimática e preparação de uma suspensão unicelular para separação celular ativada por fluorescência (FACS). O fluxo de trabalho inclui remoção do lobo posterior, digestão de colaganose, digestão de ácido tripsina–etilenediamina tetraacético (EDTA) e filtração antes da análise FACS. (B) Imagens representativas da coloração de corante viável e contagem automática de células dissociadas da hipófise anterior de camundongos eutireoides e hipotireoides. O rendimento total da célula e a concentração de células viáveis são indicados. Barra de escamas = 200 μm. (C) Distribuição dos diâmetros das células da hipófise anterior após dissociação do tecido e preparação para análise FACS a jusante. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura. 

3. Preparação de uma suspensão de célula única a partir de AL do camundongo

NOTA: Realize este procedimento em aproximadamente 60 minutos para gerar uma suspensão unicelular a partir do tecido hipofisário anterior.

1. Prepare soluções enzimáticas para digestão
   1. Prepare solução de colagenose a 2%
      1. Dissolva 100 mg de colagênase de Clostridium histolyticum (>125 unidades de digestão de colagênase/mg sólido) em 4,9 mL ddH₂O.
      2. Adicione 100 μL de 1 M HEPES para obter um volume final de 5 mL.
      3. Esterilize a solução usando um filtro de 0,22 μm.
      4. Aliquota a solução em volumes de 200 μL e armazene a −30°C por até 2 meses.
         NOTA: Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Não reutilize alíquotas de colagênase descongeladas.
   2. Prepare 0,25% de tripsina–etilenodiamina, ácido tetraacético (EDTA)
      1. Misture 1 mL de tripsina–EDTA 0,5% com 1 mL de HBSS sem Ca²⁺ e Mg²⁺.
      2. Armazene a solução a 4°C até o uso.
         NOTA: Use a solução diluída de tripsina–EDTA no dia da preparação. Não armazene nem reutilize tripsina–EDTA diluída.
2. Realize digestão de colagênase
   1. Adicione 200 μL de solução de colagênase a 2% aos tecidos de AL coletados.
   2. Misture o tecido suavemente pipeteando com uma micropipeta P1000 equipada com pontas de baixa retenção.
   3. Incube a suspensão em banho-maria a 37°C por 15 minutos.
      NOTA: Mantenha a tampa do tubo fechada durante a incubação para minimizar a contaminação.
   4. Bata suavemente no tubo a cada 5 minutos durante a incubação.
3. Realizar a digestão com desoxirribonuclease I (DNase I)
   1. Adicione 5 μL de DNase I (1 U/μL) diretamente à suspensão sem remover o sobrenadante.
   2. Bata suavemente no tubo 10 vezes para misturar a solução.
   3. Incube a suspensão a 37°C por 5 minutos.
4. Aplicar o tecido em pellets
   1. Centrifuge a suspensão a 100 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
   2. Remova o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta de 1 mL.
      NOTA: Deixe aproximadamente 50 μL de líquido residual acima do pellet durante a remoção do sobrenadante para minimizar a perda celular.
5. Realize a digestão de tripsina
   1. Adicione 2 mL de 0,25% de tripsina–EDTA ao pellet.
   2. Incube a suspensão a 37°C por 10–15 minutos até que não restem fragmentos de tecido visíveis e intactos.
      NOTA: Não exceda 15 minutos para evitar digestão excessiva de tecidos e redução da viabilidade celular.
6. Parar a digestão enzimática e dissociar o tecido
   1. Adicione 2 mL de MC para parar a tripsinização.
   2. Pipete a suspensão suavemente para cima e para baixo de 10 a 20 vezes usando uma micropipeta ajustada a 1 mL até que não restem fragmentos de tecido visíveis.
      NOTA: Use pontas de pipeta de baixa retenção durante a dissociação mecânica. Uma suspensão aceitável de célula única é uma suspensão uniforme de baixa viscosidade contendo predominantemente células individuais com agregados ou detritos visíveis mínimos (≤5%–10% aglomerados por inspeção microscópica usando exclusão do Azul de Tripán).
7. Colete a suspensão de célula única
   1. Centrifuge a suspensão a 100 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
   2. Remova o sobrenadante com cuidado.
   3. Prossiga imediatamente para o Passo 4.
      NOTA: Comece a tingir dentro de 15 minutos após a preparação da suspensão de célula única e complete a separação celular em 1 hora sempre que possível. Mantenha as células no gelo durante esse intervalo para minimizar a perda de viabilidade.

4. Coloração para separação celular ativada por fluorescência

NOTA: Realize este procedimento em aproximadamente 60 minutos para colorir as células anterohipófises dissociadas em busca de FACS das células CD90-positivas.

1. Prepare a suspensão da célula
   1. Adicione um tampão de coloração de 350 μL composto por soro salino tamponado com fosfato (PBS, 1×) contendo 2% de FBS e 0,09% de azida de sódio ao pellet celular.
   2. Resuspenda o pellet suavemente, pipeteando para cima e para baixo 10 vezes usando uma micropipeta P1000 equipada com pontas de baixa retenção para obter uma suspensão de célula única.
   3. Transfira a suspensão para um tubo microcentrífuga de baixa ligação de 1,5 mL.
2. Determinar a concentração e viabilidade celular
   1. Remova uma alíquota de 5 μL da suspensão para contagem de células.
   2. Misture a aliquota com um corante de viabilidade de 5 μL.
   3. Carregue 10 μL da mistura em um contador automático de células.
      NOTA: Prossiga para o FACS quando a viabilidade celular for ≥85%, conforme determinado pela exclusão de corante de viabilidade, e quando forem observados detritos mínimos e agregados celulares.
   4. Confirme que a concentração total de células é aproximadamente 1 × 10⁷ células/mL para amostras de eutireoide e 2 × 10⁷ células/mL para amostras de hipotireoide (Figura 2B). A distribuição do tamanho das células após a dissociação é mostrada na Figura 2C.
3. Preparar controles de compensação
   1. Transfira 50 μL da suspensão da célula para um tampão de coloração de 300 μL.
   2. Divida a suspensão em três alíquotas de 100 μL em tubos separados de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Prepare os seguintes controles: (i) controle não corado, (ii) controle apenas iodeto de propidio (PI) e (iii) controle apenas de ficoeritrina-cianina 7 (PE-Cy7) CD90.2.
4. Tinga as células
   1. Adicione 3 μL de anticorpo anti-CD90.2 conjugado com PE-Cy7 à suspensão celular de 300 μL.
      NOTA: A concentração de anticorpos foi determinada por experimentos de titulação anteriores. Uma diluição final de 1:100 proporcionou separação ótima entre populações positivas e negativas, minimizando a coloração de fundo.
   2. Adicione 1 μL de anticorpo ao controle de compensação CD90.2 para obter uma diluição final de 1:100.
   3. Incube todas as amostras no gelo no escuro por 30 minutos.
      NOTA: Misture as amostras suavemente a cada 10 minutos durante a incubação para manter uma coloração homogênea.
5. Lave as células manchadas
   1. Adicione 1 mL de tampão de mancha fria em cada tubo.
   2. Centrifuge as amostras a 210 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
      NOTA: Se disponível, desative o freio da centrífuga para minimizar a perturbação do pellet da célula durante a desaceleração.
   3. Remova e descarte o sobrenadante com cuidado.
6. Ressuspenda as células coradas
   1. Resuspenda a suspensão da célula principal em um tampão de coloração de 300 μL.
      NOTA: Adicione PI imediatamente antes de separar para uma concentração final de 1 μg/mL.
   2. Resuspenda cada controle de compensação em um tampão de coloração de 100 μL.
7. Filtrar a suspensão da célula
   1. Filtre a suspensão celular por um tubo de citometria de fluxo equipado com um filtro de células de 35 μm imediatamente antes da separação.
8. Prossiga para a separação celular ativada por fluorescência
   1. Prossiga imediatamente para a Etapa 5 e separe as células coradas usando um classificador de células ativado por fluorescência.

5. Estratégia de bloqueio e triagem do FACS

NOTA: Realize este procedimento em aproximadamente 60 minutos para isolar tirotropos viáveis CD90.2-positivos por FACS.

1. Configure o classificador de células
   1. Instale um bico de 100 μm no separador de células.
   2. Ajuste a pressão da bainha para 20 psi.
      NOTA: Use fluido de bainha estéril à base de PBS mantido em temperatura ambiente.
2. Realizar o controle de qualidade do instrumento
   1. Execute procedimentos de controle de qualidade do instrumento de acordo com as instruções do fabricante antes da aquisição da amostra.
      NOTA: Fluxos de trabalho equivalentes recomendados pelo fabricante podem ser usados em classificadores de células alternativos.
   2. Verifique o atraso de queda e a estabilidade do fluxo usando esferas de calibração.
3. Realize compensação de fluorescência
   1. Adquira controles de compensação de cor única.
   2. Realize compensação de fluorescência antes de fazer a seleção e o gate.
      NOTA: Calcule a compensação usando controles sem coragem e com uma única coloração. Verifique e ajuste manualmente as matrizes de compensação antes de separar, quando necessário.
4. Defina a estratégia de gate
   1. Exclua detritos usando parâmetros de dispersão frontal e lateral (Figuras 3A,B).
   2. Gate células individuais usando altura de espalhamento direto versus área de dispersão direta e altura de dispersão lateral versus área de dispersão lateral (Figura 3A,B).
   3. Exclua células mortas por meio de bloco de células PI-negativas.
   4. Células positivas para CD90.2 para enriquecimento tirotrope.
      NOTA: Defina células CD90.2-positivas como eventos que exibem intensidade de fluorescência maior que 10³ no canal de detecção CD90 (Figura 3C–F).
5. Preparar tubos de coleta
   1. Prepare tubos de coleta de acordo com a aplicação a jusante pretendida.
      NOTA: Preencha os tubos de coleta de baixa retenção com reagente de lise QIAzol de 1 mL para isolamento de RNA ou Medium 199 suplementado com soro fetal bovino despojado de carvão vegetal a 10% para aplicações em cultura celular.
6. Ordenar tirotropos CD90.2-positivos
   1. Separe células individuais CD90.2-positivas em tubos coletores.
   2. Coletar células para análise de RNA
      1. Colete as células diretamente em um reagente de lise de 1 mL.
      2. Faça vórtice nos tubos por 1 minuto para lisar as células.
      3. Congele as amostras imediatamente em gelo seco.
      4. Armazene as amostras a −80°C até a extração de RNA.
   3. Coletar células para cultura primária
      1. Colete as células em meio de cultura suplementado com soro fetal bovino despojado de carvão e 1% de penicilina-estreptomicina.
      2. Semeie as células em lâminas de câmara de vidro de 8 poços com uma densidade de pelo menos 2 × 10⁵ células/poço em um volume final de 200 μL.
      3. Cultive as células por até 72 horas a 37°C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂.
         NOTA: O desempenho aceitável da cultura é indicado pela fixação celular visível dentro de 24 horas, eficiência de fixação de aproximadamente 60%–80% e viabilidade ≥70%–80% após 72 horas.
      4. Adicione 100 nM T3 ao meio de cultura quando necessário.
         NOTA: Inicie o tratamento T3 após a fixação da célula, tipicamente 24 horas após o placagem, e mantenha o tratamento até a coleta da amostra às 72 horas. Prepare a solução de T3 em 40 mM de NaOH e inclua controles tratados com veículo na mesma concentração final de solvente.
         NOTA: O soro despojado com carvão mantém um ambiente de cultura pobre em TH e melhora a detecção da supressão dependente de T3 induzida experimentalmente da expressão de Tshb .

Figura 3. Estratégia de bloqueio FACS e validação do enriquecimento de tirotropos. (A,B) Estratégia de gate sequencial usada para isolar células viáveis da hipófise anterior única. Os portões incluem exclusão de detritos usando área de espalhamento frontal (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A), discriminação de singlets usando altura de dispersão frontal (FSC-H) versus FSC-A e altura de dispersão lateral (SSC-H) versus SSC-A, e exclusão de células mortas positivas para iodeto propidiano (PI). (C–F) Gráficos representativos do FACS mostrando identificação e enriquecimento de populações celulares CD90.2-positivas e CD90.2-negativas usando um anticorpo anti-CD90.2 conjugado com ficoeritrina-cianina 7 (PE-Cy7). (G–I) Validação da reação em cadeia quantitativa da polimerase por transcrição reversa (RT-qPCR) do enriquecimento de tirotropos em populações celulares ordenadas. Abreviações: FSC-A, área de espalhamento frontal; SSC-A, área de espalhamento lateral; FSC-H, altura de espalhamento frontal; SSC-H, altura de espalhamento lateral; PI, iodeto de propídio; PE-Cy7, ficoeritrina–cianina 7; NT, sem tratamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Análise da expressão gênica do mRNA Tshb em células CD90-positivas versus CD90-negativas por reação em cadeia da polimerase em tempo real

NOTA: Realize este procedimento em aproximadamente 5 horas para quantificar a expressão do mRNA do Tshb em populações celulares ordenadas.

1. Coletar células separadas para extração de RNA
   1. Colete o mesmo número de células CD90-positivas e CD90-negativas (2,5 × 10⁵ células) em tubos separados de 1,5 mL contendo reagente de lise de 1 mL.
2. Lisar as células
   1. Faça vórtice vigorosamente nas amostras por 1 minuto para lisar completamente as células e coloque as amostras no gelo.
      NOTA: Armazene amostras lisadas a −80°C antes da extração de RNA, se necessário.
3. Extrair RNA total
   1. Extraia o RNA total conforme as instruções do fabricante fornecidas com o kit de extração de RNA.
      NOTA: Realize a digestão de DNase durante a purificação usando DNase I livre de RNase, conforme as instruções do fabricante para remover o ácido desoxirribonucleico genômico residual (DNA) antes da elução.
   2. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro.
      NOTA: Use amostras com razão A260/A280 de aproximadamente 1,8–2,1 e razão A260/A230 maior que 1,8 para síntese complementar de DNA (cDNA).
4. Sintetizar cDNA
   1. Sintetize cDNA a partir de 100 ng de RNA total conforme as instruções do fabricante fornecidas com o kit de síntese de cDNA de primeira fita.
      NOTA: Use primers oligo(dT) durante a síntese de cDNA.
   2. Prepare a mistura de molde e primer conforme a Tabela 1.
   3. Misture os reagentes delicadamente e centrifuge brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo.
   4. Desnature a mistura de molde e primer a 65°C por 10 minutos.
   5. Resfrie as amostras imediatamente no gelo.
   6. Prepare a mistura de reação de transcrição reversa de acordo com a Tabela 2 para obter um volume final de 20 μL.
      NOTA: Prepare uma mistura master multiplicando os volumes de reagentes listados na Tabela 2 pelo número total de amostras e adicionando 10% de volume extra adicional para considerar a variabilidade da pipeteação.
   7. Misture a reação suavemente sem vórtice e centrifuge brevemente.
   8. Incube a reação a 50°C por 60 minutos.
   9. Iative a reação a 85°C por 5 minutos.
   10. Resfrie as amostras no gelo.
   11. Proceda diretamente à reação em cadeia quantitativa da polimerase por transcrição reversa (RT-qPCR) ou armazene o cDNA a −30°C até o uso.
       NOTA: o cDNA pode ser armazenado a −30°C por até 6 meses em condições livres de nuclease. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
       NOTA: Realize etapas de síntese de cDNA em um termociclador equipado com tampa aquecida para minimizar a evaporação.
5. Prepare a mistura de reação RT-qPCR
   1. Prepare a mistura de reação RT-qPCR de acordo com a Tabela 3.
6. Carregue a placa RT-qPCR
   1. Adicione 9 μL de mistura de reação RT-qPCR a cada poço de uma placa de 96 poços.
   2. Adicione um molde de cDNA de 1 μL correspondente ao produto transcrito reverso gerado a partir de 5 ng de RNA total de entrada.
   3. Misture as amostras suavemente e centrifuge brevemente.
7. Executar RT-qPCR
   1. Realize a RT-qPCR conforme as instruções do fabricante fornecidas com a mistura master SYBR Green.
      NOTA: Use uma etapa inicial de desnaturação de 95°C por 2 minutos, seguida por 40 ciclos de 95°C por 5 s e 60°C por 30 s. Adquira fluorescência ao final de cada etapa de extensão. Realize análise da curva de fusão de 65°C a 95°C em incrementos de 0,5°C para verificar a amplificação de produto único.
8. Normalizar a expressão do Tshb
   1. Normalize a expressão de Tshb para a expressão de Ciclofilina A (CyA) usando o método ΔCt.
      NOTA: Valide a estabilidade do CyA antes da análise, confirmando a mínima variação de Ct entre os grupos experimentais.
9. Calcular a expressão gênica relativa
   1. Calcule a expressão relativa de Tshb em células CD90-positivas em relação às CD90-negativas usando o método 2^−ΔΔCt .
      NOTA: Realize a análise RT-qPCR usando oito amostras biológicas, cada uma analisada em reações técnicas duplicadas (Figura 3G–I).

Reagente	Volume	Quantidade/concentração final
Total RNA	Variável	100 ng
Primer de oligo(dT)18 ancorado (50 pmol/μL)	1 μL	2,5 μM
Água de grau PCR	Variável	Ajuste para 13 μL de volume total
Total	13 μL	—

Tabela 1: Preparação da mistura molde–primer para síntese complementar de ácidos desoxirribonucleicos. Reagentes, volumes e quantidades finais usados para preparar a mistura molde-primer para síntese complementar de ácido desoxirribonucleico (cDNA). Cada reação continha 100 ng de ácido ribonucleico total (RNA), um primer, um oligo(dT)18 ancorado e água de grau de reação em cadeia da polimerase (PCR) ajustada a um volume final de 13 μL. A concentração relatada de 2,5 μM refere-se à concentração de primer na mistura de 13 μL molde–primer antes da adição dos componentes da reação de transcrição reversa.

Reagente	Volume	Quantidade/concentração final
Buffer de Reação Transcriptora Reversa (5×)	4 μL	1×
Inibidor de RNase Protetor (40 U/μL)	0,5 μL	20 U
Mistura de desoxinucleotídeos (10 mM cada)	2 μL	1 mM cada
Transcriptase Reversa do Transcriptor (20 U/μL)	0,5 μL	10 U
Mistura de molde e primer (Tabela 1)	13 μL	—
Total	20 μL	—

Tabela 2: Mistura de reação de transcrição reversa para síntese complementar de ácido desoxirribonucleico. Reagentes, volumes e concentrações finais usados para a síntese de ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) de primeira fita. O volume final de reação foi de 20 μL. As concentrações reportadas de trifosfato desoxinucleotídico (1 mM cada) referem-se às concentrações finais na mistura completa da reação.

Reagente	Volume	Quantidade/concentração final
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 μL	1×
Primers de oligonucleotídeos TSHB direto e reverso (veja Tabela de Materiais)	0,5 μL	400 nM
Água de grau PCR	3,5 μL	Ajuste para 9 μL de volume de reação
Volume subtotal de reação	9 μL	—
Modelo de cDNA	1 μL	5 ng
Volume final de reação	10 μL	—

Tabela 3: Preparação da mistura de reação quantitativa da polimerase em cadeia por transcrição reversa. Reagentes, volumes e concentrações finais usados para a amplificação da reação em cadeia quantitativa da polimerase (RT-qPCR) por transcrição reversa do ácido ribonucleico mensageiro Tshb (mRNA). O volume da mistura de reação antes da adição do molde foi de 9 μL. Adicione 1 μL de molde complementar de ácido desoxirribonucleico (cDNA) imediatamente antes da amplificação para obter um volume final de reação de 10 μL.

Resultados

Doze camundongos C57BL/6 de 8 semanas (6 machos e 6 fêmeas) foram tratados com MMI e KClO₄ em água potável, juntamente com uma dieta deficiente em iodo por 1 semana, induzindo hipotireoidismo (Figura 1A). A expressão do mRNA hepático tipo 1 Dio1 foi quantificada em camundongos eutireoides e hipotireoides para confirmar a indução bem-sucedida do hipotireoidismo²⁹. Camundongos hipotireoides apresentaram uma redução de aproximad...

Discussão

O protocolo FACS baseado em CD90 descrito aqui fornece um método reprodutível para enriquecer tireotropes primários de tecido hipofisário adulto de camundongo, preservando a resposta hormonal. Este método aborda uma limitação técnica de longa data no estudo da biologia dos tireótropos e da regulação do eixo HPT. Historicamente, as investigações sobre regulação dos tireótropos dependeram fortemente da linha celular TαT1; no entanto, as células TαT1 apresentam expressão basal muito bai...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 µm filtro	Corning	430769	Para esterilização do meio de coleta
Filtro de seringa de 0,22 µm	Pall Life Sciences	PN4602	Para esterilização de colagenase
0,5% de tripsina e EDTA	Gibco	15400-054	Para dissociação celular
Tubo de microcentrífuga de ligação baixa de 1,5 mL	Invitrogen	AM12450	Para coloração FACS
Tubos de polipropileno de 15 mL	Falcon	352097	Para coleta do lobo anterior e dissociação celular
Agulha de 23 calibres	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Para perfusão cardíaca
Slide de câmara de vidro de 8 poços	Millipore	PEZGS0816	Para cultura pós-FACS
Esferas Accudrop	BD Biosciences	345249	Para calibração de atraso de gota durante FACS
Anticorpo anti-CD90.2 anti-mouse PE-Cy7	Invitrogen	25-0902-82	Para coloração FACS
Contador de células automatizado	DeNovix	s-10700	Para contagem de células
Soro fetal bovino estriado com carvão	Gibco	12676029	Para cultura de tirotropo pós-FACS
Colagenase de Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Para dissociação celular
Bandeja de perfusão cardíaca	Bandeja de disseção laboratorial padrão	N/A	Para perfusão cardíaca
Solução salina tamponada com HEPES preparada personalizada (HBSS) sem Ca2+ e Mg2+	N/A	N/A	Para perfusão e dissociação celular
Prímeros oligonucleotídeos de ciclofilina A (CyA) diretos	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	Para RT-qPCR
Prímeros oligonucleotídeos de ciclofilina A (CyA) reversos	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	Para RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Para meio de coleta
Solução de DNAse I	Promega	M6101	Para dissociação celular
Injeção de enoxaparina sódica	Sandoz	0781-3119-64	Para perfusão
Soro fetal bovino (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Para meio de coleta
Buffer de coloração para citometria de fluxo	Invitrogen	00-4222-26	Para coloração FACS
Hemostato	Fine Science Tools	13008-12	Para estabilização da cavidade torácica
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Para meio de coleta
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	Para preparação de HBSS
Dieta deficiente em iodo	Envigo	TD.95007	Para indução de hipotireoidismo in vivo
Pinça de íris	Fine Science Tools	11065-07	Para dissecação da pituitária
Isoflurano	Piramal Critical Care	66794-017-25	Para anestesia
L-glutamina	Gibco	35050-061	Para meio de coleta
Meio 199	Gibco	11150-059	Para cultura pós-FACS
Metimazol (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Para indução de hipotireoidismo in vivo
Placa de reação de 96 poços rápidos MicroAmp	Applied Biosystems	4346907	Para RT-qPCR
Penicilina e estreptomicina	Gibco	15140122	Para cultura pós-FACS
Bomba peristáltica	Fisher Scientific	GP1000	Para perfusão cardíaca
Perclorato de potássio (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Para indução de hipotireoidismo in vivo
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Para RT-qPCR
Iodeto de propídio	eBioscience	00-6990-50	Para coloração de viabilidade durante FACS
Reagente de lise QIAzol	Qiagen	79306	Para extração de RNA
Tubulação de silicone	Cole-Parmer	EW-96410-13	Para perfusão cardíaca
Estereomicroscópio	Nikon	SMZ-745T	Para dissecação do lobo anterior
Sistema StepOnePlus Real-Time PCR	Applied Biosystems	4376600	Para RT-qPCR
Chopstick cirúrgico	Fine Science Tools	10090-13	Para elevação do cérebro durante exposição da pituitária
Kit de síntese de cDNA de primeira fita Transcriptor	Roche	4379012001	Para preparação de cDNA
Azul de Tripano	Thermo Fisher Scientific	T10282	Para contagem de células
Prímeros oligonucleotídeos de Tshb diretos	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	Para RT-qPCR
Prímeros oligonucleotídeos de Tshb reversos	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	Para RT-qPCR
Banho d'água	Fisher Scientific Isotemp Water Bath	15-462-5Q	Para digestão enzimática