Significância Clínica, Panorama de Infiltração Imune e Análise de Rede Funcional do miR-192-5p no Câncer Colorretal

Wei Zhang; Xin Yang; Zhui Ke; Shouhua Wang; Li Feng

doi:10.3791/71908

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Artigo de investigação

Significância Clínica, Panorama de Infiltração Imune e Análise de Rede Funcional do miR-192-5p no Câncer Colorretal

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DOI:

10.3791/71908

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1 de setembro de 2026

Wei Zhang^*¹ , Xin Yang^*² , Zhui Ke¹ , Shouhua Wang¹ , Li Feng³

¹XiangShui County People's Hospital, ²Inner Mongolia International Hospital of Mongolian Medicine, ³Affiliated Tumor Hospital of Inner Mongolia Medical University

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo integra conjuntos de dados públicos, validação em tecidos pareados, ensaios de migração celular, predição de redes alvo e análise de assinaturas imunes para avaliar o miR-192-5p no câncer colorretal. Os resultados destacam uma discordância entre os dados de expressão do TCGA/GDC e os resultados locais de qRT-PCR e alertam contra a superinterpretação de seu significado diagnóstico, prognóstico, funcional e relacionado ao sistema imunológico.

Resumo

O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia heterogênea na qual microRNAs podem contribuir para a progressão tumoral e para a descoberta de biomarcadores. Este estudo avaliou a significância clínica, as associações imunes e a rede funcional do miR-192-5p no CCR por meio da integração de análises bioinformáticas do TCGA/GDC e do GEO, validação por qRT-PCR em tecidos pareados, predição de alvos, análise de assinatura imune e experimentos de cicatrização de ferida em HT29. A reanálise dos dados de sequenciamento de miRNA do TCGA/GDC incluiu 616 amostras tumorais e 11 amostras normais de COADREAD e mostrou um sinal mais alto do hsa-mir-192 em nível de banco de dados nas amostras tumorais em comparação com as normais (Mann-Whitney p = 9,96 x 10^-8). A mesma tendência foi observada em 11 casos pareados do TCGA (diferença mediana tumor-normal = 3,13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0,0029), enquanto a qRT-PCR local em tecidos clínicos pareados apoiou uma expressão mais baixa do miR-192-5p maduro nos tecidos de CCR. A análise ROC baseada no TCGA mostrou uma forte separação entre tumor e tecido normal, mas análises de reamostragem balanceada e leave-one-normal-out confirmaram que esse resultado deve ser interpretado com cautela devido ao número limitado de amostras normais. A análise clinicopatológica sugeriu associações com o estadiamento N e a idade na coorte do TCGA, enquanto o estadiamento T e o estadiamento M não foram significativos na tabela resumida, e a análise de sobrevida global não mostrou associação prognóstica significativa. Análises exploratórias de genes centrais candidatos usando RNA-seq do TCGA forneceram evidências de expressão, correlação e sobrevida, mas não estabeleceram o direcionamento direto do miR-192-5p. A análise de assinatura imune mostrou correlações heterogêneas, principalmente fracas. Funcionalmente, a transfeção com mimetizador do miR-192-5p reduziu o fechamento da ferida em HT29. Esses achados indicam que o miR-192-5p é biologicamente relevante para o CCR, mas sua direção de expressão e interpretação clínica dependem da plataforma utilizada e requerem validação experimental adicional.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais comuns em todo o mundo e continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer¹^,². Embora a colonoscopia, o teste imunocromatográfico fecal, o teste de metilação de SEPT9, marcadores tumorais circulantes e o perfil molecular tenham melhorado a detecção e o manejo clínico do CCR³^,⁴, ainda persiste uma heterogeneidade significativa na biologia tumoral, na resposta ao tratamento e nos desfechos dos pacientes⁵^,⁶^,⁷. Biomarcadores que ajudem a caracterizar a biologia do CCR podem, portanto, contribuir para a estratificação de risco e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais individualizadas⁸.

MicroRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos não codificantes, com aproximadamente 19–24 nucleotídeos de comprimento, que regulam a expressão gênica principalmente por meio de mecanismos pós-transcricionais⁹. A expressão desregulada de miRNAs pode influenciar a proliferação, migração, invasão, apoptose, interações imunes e resposta ao tratamento de células cancerígenas¹⁰. Relatou-se que o miR-192-5p atua de maneira dependente do contexto em diferentes doenças e cânceres, apresentando associações oncogênicas ou supressoras de tumor, dependendo do tipo de tecido, do contexto molecular e do sistema experimental¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. No CCR, estudos anteriores relataram perfis alterados de miRNAs em espécimes clínicos e regulação funcional de fenótipos malignos em células de câncer de cólon¹²^,¹⁴^,¹⁵. No entanto, análises de bancos de dados públicos nem sempre podem mostrar a mesma direção de expressão, e a significância clínica, a rede de alvos e as associações imunes do miR-192-5p no CCR exigem avaliação cuidadosa.

O presente estudo avaliou o miR-192-5p no CCR por meio da integração de análises bioinformáticas do TCGA/GDC e do GEO, validação por qRT-PCR em tecidos clínicos pareados, ensaios de migração in vitro, predição de genes-alvo candidatos, enriquecimento de vias e análise de correlação com assinatura imune. O estudo baseou-se na hipótese de que o miR-192-5p maduro pode estar subregulado em tecidos de CCR e exercer um efeito supressor de tumor. Como o sinal de sequenciamento de miRNA do TCGA/GDC, reanalisado, mostrou direção oposta de expressão, os resultados são interpretados como exploratórios e dependentes da plataforma, e não como um único padrão definitivo de expressão.

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Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética da Universidade Médica da Mongólia Interior em 21 de outubro de 2021. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.

Coleta de espécimes clínicos

Tecidos de CCR pareados e tecidos não cancerosos adjacentes foram coletados de 45 pacientes submetidos à ressecção radical entre dezembro de 2017 e fevereiro de 2020. Nenhum dos pacientes recebeu radioterapia ou quimioterapia pré-operatória, e pacientes com outras neoplasias foram excluídos. O tecido não canceroso adjacente foi coletado a pelo menos 5 cm da margem tumoral. As amostras foram congeladas imediatamente após a remoção cirúrgica e armazenadas em nitrogênio líquido até a extração de RNA. A coorte incluiu 27 pacientes do sexo masculino e 18 do sexo feminino; 13 pacientes tinham menos de 60 anos, e 32 tinham 60 anos ou mais. As variáveis clínico-patológicas incluíram diâmetro do tumor, estágio TNM, grau de diferenciação, trombo tumoral vascular, metástase linfonodal e nível pré-operatório de CEA.

Aquisição e pré-processamento de dados públicos

Dados de miRNA-seq, RNA-seq e dados clínicos de acesso aberto para TCGA-COAD e TCGA-READ foram obtidos no portal Genomic Data Commons. Tumores primários e amostras de tecido sólido normal foram identificados de acordo com o tipo de amostra do GDC. Amostras de tumores metastáticos e recorrentes foram excluídas da análise de expressão diferencial entre tumor e tecido normal. Para os arquivos de miRNA-seq do TCGA, a entrada ao nível da base de dados detectada nesta análise foi hsa-mir-192; os valores de expressão foram analisados como log2(RPM + 1), em que RPM indica leituras por milhão de leituras de miRNA mapeadas. Foram realizadas análises não pareadas e pareadas entre tumor e tecido normal quando amostras emparelhadas estavam disponíveis. Os conjuntos de dados GEO GSE89076 e GSE156355 foram utilizados para triagem de genes-alvo candidatos. Genes diferencialmente expressos provenientes do GEO foram triados utilizando valores ajustados p < 0,05 e mudança absoluta no log2 de pelo menos 2. Os nomes dos conjuntos de dados foram verificados quanto à consistência ao longo do manuscrito.

Análises diagnósticas, clínico-patológicas e de sobrevida

A análise da curva ROC (característica operacional do receptor) foi utilizada para avaliar a separação exploratória entre tumor e tecido normal nos conjuntos de dados TCGA-COAD, TCGA-READ e no coorte combinado COADREAD. Como o número de amostras normais era pequeno, foram realizadas análises de sensibilidade adicionais, incluindo reamostragem balanceada entre tumor e tecido normal com 5.000 iterações e análise leave-one-normal-out. Para as análises de associação clinicopatológica, as amostras de tumor primário foram divididas em grupos de alta e baixa expressão com base no nível mediano de expressão da miR-192 no TCGA. As análises foram repetidas para o coorte combinado COADREAD e separadamente para COAD e READ, sempre que o tamanho da amostra permitiu. A sobrevida global foi avaliada por meio da análise de Kaplan-Meier com o teste log-rank e regressão de Cox univariável. As análises diagnósticas, clinicopatológicas e de sobrevida foram relatadas separadamente para evitar a superestimação de conclusões prognósticas.

Análises de genes-alvo candidatos e genes centrais

Genes-alvo candidatos foram identificados integrando a predição do miRWalk com genes diferencialmente expressos de GSE89076 e GSE156355. A interseção entre essas três fontes foi mantida para análises exploratórias subsequentes. Uma rede de interação proteína-proteína foi construída utilizando o STRING, e os genes centrais foram selecionados com base no grau do nó e na conectividade do módulo por meio das análises cytoHubba e MCODE baseadas no Cytoscape. Os genes centrais mantidos (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C) foram avaliados posteriormente utilizando dados de RNA-seq do TCGA. As diferenças de expressão entre tumor e tecido normal, as correlações de Spearman com a expressão do miR-192 do TCGA e as associações com sobrevida geral foram resumidas como análises exploratórias suplementares. Esses genes foram considerados apenas como alvos candidatos; nenhuma ligação direta, efeito de resgate ou regulação em nível proteico downstream foi inferida a partir dos dados bioinformáticos.

Análise de enriquecimento de GO e KEGG

Foram realizadas análises de enriquecimento de Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) para o conjunto de genes candidatos e os módulos significativos da rede. Os termos de GO foram agrupados em categorias de processo biológico, componente celular e função molecular. Resultados de enriquecimento com p < 0,05 foram considerados estatisticamente relevantes e foram interpretados como sinais de vias geradores de hipóteses, e não como mecanismos validados experimentalmente.

Extração de RNA e análise de qRT-PCR

O RNA total foi extraído de 45 amostras pareadas de tecido de CCR e tecido não canceroso adjacente utilizando o reagente TRIzol, conforme o protocolo do fabricante. A pureza e a concentração do RNA foram avaliadas espectrofotometricamente, e amostras com valores de A₂₆₀/A₂₈₀ entre 1,8 e 2,1 foram utilizadas para a transcrição reversa. A qRT-PCR foi realizada utilizando um sistema de transcrição reversa para miRNA e reagentes de qPCR para miRNA baseados em SYBR Green da TransGen Biotech. A transcrição reversa e a amplificação por qPCR foram realizadas conforme as instruções do fabricante dos reagentes. Cada reação de qRT-PCR foi executada em triplicata técnica. O RNU6B foi utilizado como referência interna. Os primers para miR-192-5p foram 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (sentido) e 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (anti-sentido). Os primers para RNU6B foram 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (sentido) e 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (anti-sentido). A análise da curva de dissociação foi utilizada para avaliar a especificidade da amplificação, quando suportada pela plataforma de qPCR. A expressão relativa foi calculada utilizando o método 2^-ΔΔCt. Os resultados de tecidos tumorais pareados e tecidos adjacentes foram analisados como medições clínicas pareadas.

Cultura celular e transfeção

A linhagem celular de CCR humano HT29 foi obtida do estoque celular do laboratório dos autores e havia sido autenticada e confirmada como livre de contaminação por micoplasma. As células HT29 foram cultivadas em meio McCoy's 5A suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina a 37 ^oC em atmosfera com 5% de CO₂. As células foram repicadas quando atingiram cerca de 80% de confluência. Os miméticos de miR-192-5p e o oligonucleotídeo controle negativo con238 foram adquiridos da Sangon Biotech (Xangai, China) e utilizados para transfeção transitória. Células HT29 foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas quando a densidade celular atingiu aproximadamente 20–30%, utilizando uma concentração final de oligonucleotídeo de 50 nM e um protocolo de transfeção baseado em lipídeos, conforme as instruções do fabricante do reagente. A proporção exata entre reagente e oligonucleotídeo, bem como a quantidade de reagente, seguiu o protocolo recomendado pelo fabricante, conforme registrado nos arquivos do laboratório dos autores. As células foram incubadas com os complexos de transfeção em condições padrão de cultivo, e análises downstream de imagem da transfeção e ensaios de cicatrização (wound-healing) foram realizados após a transfeção, de acordo com o cronograma experimental. Apenas os dados obtidos com células HT29 foram incluídos no presente estudo.

Ensaio de cicatrização de ferida

Células HT29 transfectadas foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até a formação de uma monocamada confluente. Um arranhão linear foi criado utilizando uma ponteira estéril de 200 µL, e as células destacadas foram removidas por lavagem com PBS. O meio foi então substituído por meio sem soro para reduzir os efeitos relacionados à proliferação durante a avaliação da migração. Imagens da ferida foram capturadas em 0 h, 24 h e 48 h. O ensaio de cicatrização da ferida foi realizado em três réplicas biológicas independentes, e múltiplos campos microscópicos foram medidos para cada grupo e ponto temporal. A largura da ferida foi quantificada a partir das imagens de microscopia utilizando software de análise de imagem; a versão exata do software utilizada nas medições originais não estava disponível nos registros fonte. A taxa de cicatrização da ferida foi calculada como [(largura da ferida em 0 h – largura da ferida no ponto temporal indicado) / largura da ferida em 0 h] × 100%. Como os dados disponíveis do manuscrito não incluem um experimento controle de proliferação separado, os resultados do ensaio de cicatrização da ferida foram interpretados como relacionados à migração, mas sem exclusão completa dos efeitos de proliferação.

Análise de correlação de assinatura imune

A associação entre a expressão de miR-192 do TCGA e assinaturas relacionadas ao sistema imunológico foi reavaliada utilizando dados de RNA-seq de tumores primários. Um total de 425 amostras tumorais com dados pareados de miRNA e RNA-seq foi incluído na análise de correlação de escores de assinatura. A expressão de miR-192 mostrou correlações negativas estatisticamente significativas, mas fracas, com várias assinaturas imunes após correção da taxa de falsa descoberta, incluindo células Tfh (rho = -0.205, FDR = 0.00049), células dendríticas ativadas (rho = -0.186, FDR = 0.00098), células Treg (rho = -0.185, FDR = 0.00098), células dendríticas plasmocitoides (rho = -0.169, FDR = 0.0027) e macrófagos (rho = -0.149, FDR = 0.0092). Correlações positivas foram observadas principalmente para assinaturas de eosinófilos (rho = 0.139, FDR = 0.0155) e de células Th17 (rho = 0.121, FDR = 0.0296). Esses achados indicam associações imunes heterogêneas e geralmente fracas, ao invés de um padrão uniforme de infiltração imune positiva.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 e software R 3.6.3. As variáveis contínuas foram resumidas como média ± desvio padrão ou mediana com intervalo interquartílico, conforme apropriado. Comparações pareadas de tecidos foram analisadas usando testes pareados quando as amostras de tumor e tecido adjacente eram emparelhadas. Testes não paramétricos foram utilizados quando as suposições de normalidade não foram atendidas. Curvas ROC, reamostragem balanceada e análise leave-one-normal-out foram utilizadas para discriminação diagnóstica exploratória; testes qui-quadrado foram utilizados para associações clínico-patológicas categóricas; modelos log-rank e de Cox foram utilizados para análises de sobrevida; e a correlação de Spearman foi utilizada para análises imunes e de genes centrais. Valores de p bilaterais < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos, com correção da taxa de falsas descobertas relatada para correlações de assinaturas imunes.

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Resultados

Análise de expressão em conjuntos de dados públicos e tecidos clínicos pareados

O padrão de expressão de miR-192 foi reavaliado utilizando dados de sequenciamento de miRNA do TCGA-COAD e TCGA-READ provenientes do GDC (Figura 1). Nessas bases de dados, a entrada no nível do banco de dados foi anotada como hsa-mir-192, em vez de diretamente como a espécie madura hsa-miR-192-5p; portanto, esse resultado proveniente de base de dados pública foi interp...

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Discussão

Este estudo avaliou a relevância clínica e biológica do miR-192-5p no CCR combinando análise de conjuntos de dados públicos, validação em tecidos locais, predição de rede alvo, análise de assinatura imune e experimentos in vitro de migração. As análises utilizaram definições verificadas de amostras do TCGA, separaram COAD e READ sempre que possível, empregaram valores de miARN em log2(RPM + 1), distinguiram comparações pareadas de não pareadas, testaram a robustez da ROC e incluíram análises de sensibilidade de RNA-seq p...

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Divulgações

Os autores não têm conflito de interesse a declarar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Laboratório de Diagnóstico Molecular de Tumores da Universidade Médica da Mongólia Interior pelo apoio técnico. Este trabalho foi financiado pelo Projeto de Pesquisa Científica da Comissão de Saúde do Município de Yancheng (Grant No. YK2023101), que também custeou a taxa de processamento do artigo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
tripsina-EDTA 0,25%+2:60	Biological Industries	03-054-1	digestão/passagem celular
persulfato de amônio 10%	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	A8090	reagente para SDS-PAGE
lauril sulfato de sódio 10%	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	SIS1070	reagente para SDS-PAGE
tampão de carregamento de proteína 4x	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1016	preparação de amostra proteica
congelador ultracongelador a -80 °C	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	armazenamento de amostras
reagente de remoção de micoplasma Anti-Myc	Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	P-CMR-001	descontaminação de micoplasma
conjuntos de iniciadores ARL2, BATF2, MEN1 e beta-actina	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	sintetizado sob encomenda	iniciadores para qPCR de mRNA
leitor automático de microplacas	PerkinElmer, USA	VICTOR Nivo	medição de absorbância
Kit BCA para Dosagem de Proteína	Thermo Fisher Scientific	23225	quantificação proteica
cabine de segurança biológica / bancada limpa	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	cultivo celular asséptico
câmara de contagem celular / hemocitômetro	Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd.	http://www.shqiujing.net/	contagem celular
Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8)	Biosharp	BS350B	ensaio de proliferação celular/citotoxicidade
frascos de cultura celular, placas de cultura, tubos de centrífuga e ponteiras de pipeta	Corning	https://www.corning.com/in/en.html	consumíveis gerais para cultura celular
Kit de Detecção de Ciclo Celular e Apoptose	Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China	https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm	análise citométrica de ciclo celular/apoptose
incubadora de células com CO2	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	cultivo celular
oligonucleotídeo controle negativo con238	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	sintetizado sob encomenda	controle de transfeção
software Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	visualização de módulos de rede e genes centrais
agitador magnético termostático digital	Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory	https://czxtyq.en.alibaba.com/	preparação de solução
estufa elétrica termostática com circulação de ar	Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd.	https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/	apoio à secagem/esterilização
sistema de eletroforese	Bio-Rad Laboratories	Mini-PROTEAN 3 Cell	eletroforese em gel
sistema de eletrotransferência	Hoefer	TE77XP	transferência proteica
soro bovino fetal	Biological Industries	04-001-1ACS	suplemento para cultura celular
citômetro de fluxo	ACEA Biosciences	NovoCyte	citometria de fluxo
microscópio invertido com fluorescência	Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd.	https://www.sunny-instrument.com/en	imagem celular e de feridas
portal GDC/TCGA	National Cancer Institute	banco de dados de acesso aberto	dados públicos de miRNA-seq, RNA-seq e clínicos
banco de dados GEO	National Center for Biotechnology Information	GSE89076 e GSE156355	conjuntos de dados públicos de expressão gênica
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versão 9	análise estatística e geração de gráficos
centrífuga refrigerada de alta velocidade	Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd.	https://www.bioridgecentrifuge.com/	preparação de amostras
células HT29	estoque celular do laboratório dos autores	não aplicável	linha celular de câncer colorretal humano
software de análise de imagem	ImageJ	não aplicável	quantificação da largura da ferida
sistema de imagem	Tanon Science & Technology Co., Ltd.	Tanon-5200	imagem de gel/blot
sistema de observação dinâmica de células e análise funcional IncuCyte S3	Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd.	IncuCyte S3	imagem de células vivas/análise funcional
banho-maria termostático inteligente	Leica	HI1210	incubação com controle de temperatura
lentivírus e reagente de infecção	Shanghai GeneChem Co., Ltd.	https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4	transdução celular estável
pipetas manuais	Gilson	PIPETMAN P	manipulação de líquidos
meio basal McCoy's 5A	Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	PM150710	meio de cultura para células HT29
centrífuga médica	fabricante de Zhuhai não especificado	3200	preparação de amostras
geladeira/congelador médico	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	https://www.haiermedical.com/	armazenamento de reagentes/amostras
substrato quimioluminescente ECL supersensível Meilunbio Fixer	Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China	MA0186	detecção em imunoblot
centrífuga mini	Beijing DLAB Scientific Co., Ltd.	https://www.dlabsci.com/	preparação de amostras
conjuntos de iniciadores miR-192-5p e U6	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	sintetizado sob encomenda	iniciadores para qPCR de miRNA
mimético de miR-192-5p	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	sintetizado sob encomenda	oligonucleotídeo para transfeção transitória
Kit miRcute Enhanced miRNA First-Strand cDNA Synthesis	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	KR211	transcrição reversa de miRNA
Kit miRcute Enhanced miRNA Fluorescence Quantitation (SYBR Green FP)	TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China	FP411	qPCR de miRNA
miRWalk	banco de dados público	banco de dados web	banco de dados de predição de alvos de miRNA
membrana de nitrocelulose	Millipore	HATF00010	membrana para transferência proteica
leite em pó desnatado	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	D8340	reagente bloqueador para imunoblot
tecidos pareados de câncer colorretal e tecidos não cancerosos adjacentes	instituição dos autores	não aplicável	espécimes clínicos
tubos para PCR	Corning	PCR-02-C	montagem de PCR/qRT-PCR
solução de penicilina-estreptomicina	Biological Industries	03-031-1B	antibiótico para cultura celular
Kit PerfectStart Uni RT&qPCR	TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China	AUQ-01	transcrição reversa de mRNA e qPCR
solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Biological Industries	02-023-1A	tampão para lavagem celular
marcador proteico pré-estainado	Fermentas	26619	marcador de peso molecular proteico
sistema de preparação de água pura	China Moer	não disponível	preparação de água pura
puromicina	Phygene	PH1143	seleção de células transduzidas
software R	R Foundation for Statistical Computing	Versão 3.6.3	análise estatística e bioinformática
tampão de transferência rápida	Crisbio	não aplicável	eletrotransferência proteica
sistema de PCR quantitativo em tempo real com fluorescência	Applied Biosystems (ABI), USA	não disponível	detecção de qRT-PCR
tampão de lise RIPA	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	R0020	extração proteica
tubos microcentrífuga livres de RNase	Corning	3208	manipulação de RNA
meio de criopreservação celular sem soro	New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd.	C40100	criopreservação celular
SPSS Statistics	IBM	Versão 25	análise estatística
diluente estabilizado para anticorpos	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	não aplicável	diluição de anticorpos primários/secundários
ponteiros de pipeta estéreis	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	TP-10-C	ferramenta para risco de cicatrização de feridas
banco de dados STRING	STRING Consortium	banco de dados web	análise de rede de interação proteica
TEMED	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8090	reagente para SDS-PAGE
TransZol Up	TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China	ET111-01	extração de RNA
tampão Tris-HCl, pH 6,8	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1020	tampão para gel de empilhamento em SDS-PAGE
tampão Tris-HCl, pH 8,8	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1010	tampão para gel de separação em SDS-PAGE
Tween-20	Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8220	reagente de lavagem para imunoblot
esterilizador vertical por vapor sob pressão	Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp.	BXM-30R	esterilização

Referências

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