Este estudo integra conjuntos de dados públicos, validação em tecidos pareados, ensaios de migração celular, predição de redes alvo e análise de assinaturas imunes para avaliar o miR-192-5p no câncer colorretal. Os resultados destacam uma discordância entre os dados de expressão do TCGA/GDC e os resultados locais de qRT-PCR e alertam contra a superinterpretação de seu significado diagnóstico, prognóstico, funcional e relacionado ao sistema imunológico.
Artigo de investigação
Significância Clínica, Panorama de Infiltração Imune e Análise de Rede Funcional do miR-192-5p no Câncer Colorretal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia heterogênea na qual microRNAs podem contribuir para a progressão tumoral e para a descoberta de biomarcadores. Este estudo avaliou a significância clínica, as associações imunes e a rede funcional do miR-192-5p no CCR por meio da integração de análises bioinformáticas do TCGA/GDC e do GEO, validação por qRT-PCR em tecidos pareados, predição de alvos, análise de assinatura imune e experimentos de cicatrização de ferida em HT29. A reanálise dos dados de sequenciamento de miRNA do TCGA/GDC incluiu 616 amostras tumorais e 11 amostras normais de COADREAD e mostrou um sinal mais alto do hsa-mir-192 em nível de banco de dados nas amostras tumorais em comparação com as normais (Mann-Whitney p = 9,96 x 10-8). A mesma tendência foi observada em 11 casos pareados do TCGA (diferença mediana tumor-normal = 3,13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0,0029), enquanto a qRT-PCR local em tecidos clínicos pareados apoiou uma expressão mais baixa do miR-192-5p maduro nos tecidos de CCR. A análise ROC baseada no TCGA mostrou uma forte separação entre tumor e tecido normal, mas análises de reamostragem balanceada e leave-one-normal-out confirmaram que esse resultado deve ser interpretado com cautela devido ao número limitado de amostras normais. A análise clinicopatológica sugeriu associações com o estadiamento N e a idade na coorte do TCGA, enquanto o estadiamento T e o estadiamento M não foram significativos na tabela resumida, e a análise de sobrevida global não mostrou associação prognóstica significativa. Análises exploratórias de genes centrais candidatos usando RNA-seq do TCGA forneceram evidências de expressão, correlação e sobrevida, mas não estabeleceram o direcionamento direto do miR-192-5p. A análise de assinatura imune mostrou correlações heterogêneas, principalmente fracas. Funcionalmente, a transfeção com mimetizador do miR-192-5p reduziu o fechamento da ferida em HT29. Esses achados indicam que o miR-192-5p é biologicamente relevante para o CCR, mas sua direção de expressão e interpretação clínica dependem da plataforma utilizada e requerem validação experimental adicional.
Introdução
O câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais comuns em todo o mundo e continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer1,2. Embora a colonoscopia, o teste imunocromatográfico fecal, o teste de metilação de SEPT9, marcadores tumorais circulantes e o perfil molecular tenham melhorado a detecção e o manejo clínico do CCR3,4, ainda persiste uma heterogeneidade significativa na biologia tumoral, na resposta ao tratamento e nos desfechos dos pacientes5,6,7. Biomarcadores que ajudem a caracterizar a biologia do CCR podem, portanto, contribuir para a estratificação de risco e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais individualizadas8.
MicroRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos não codificantes, com aproximadamente 19–24 nucleotídeos de comprimento, que regulam a expressão gênica principalmente por meio de mecanismos pós-transcricionais9. A expressão desregulada de miRNAs pode influenciar a proliferação, migração, invasão, apoptose, interações imunes e resposta ao tratamento de células cancerígenas10. Relatou-se que o miR-192-5p atua de maneira dependente do contexto em diferentes doenças e cânceres, apresentando associações oncogênicas ou supressoras de tumor, dependendo do tipo de tecido, do contexto molecular e do sistema experimental11,12,13,14,15,16. No CCR, estudos anteriores relataram perfis alterados de miRNAs em espécimes clínicos e regulação funcional de fenótipos malignos em células de câncer de cólon12,14,15. No entanto, análises de bancos de dados públicos nem sempre podem mostrar a mesma direção de expressão, e a significância clínica, a rede de alvos e as associações imunes do miR-192-5p no CCR exigem avaliação cuidadosa.
O presente estudo avaliou o miR-192-5p no CCR por meio da integração de análises bioinformáticas do TCGA/GDC e do GEO, validação por qRT-PCR em tecidos clínicos pareados, ensaios de migração in vitro, predição de genes-alvo candidatos, enriquecimento de vias e análise de correlação com assinatura imune. O estudo baseou-se na hipótese de que o miR-192-5p maduro pode estar subregulado em tecidos de CCR e exercer um efeito supressor de tumor. Como o sinal de sequenciamento de miRNA do TCGA/GDC, reanalisado, mostrou direção oposta de expressão, os resultados são interpretados como exploratórios e dependentes da plataforma, e não como um único padrão definitivo de expressão.
Protocolo
Este estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque. A aprovação foi concedida pelo Comitê de Ética da Universidade Médica da Mongólia Interior em 21 de outubro de 2021. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo.
Coleta de espécimes clínicos
Tecidos de CCR pareados e tecidos não cancerosos adjacentes foram coletados de 45 pacientes submetidos à ressecção radical entre dezembro de 2017 e fevereiro de 2020. Nenhum dos pacientes recebeu radioterapia ou quimioterapia pré-operatória, e pacientes com outras neoplasias foram excluídos. O tecido não canceroso adjacente foi coletado a pelo menos 5 cm da margem tumoral. As amostras foram congeladas imediatamente após a remoção cirúrgica e armazenadas em nitrogênio líquido até a extração de RNA. A coorte incluiu 27 pacientes do sexo masculino e 18 do sexo feminino; 13 pacientes tinham menos de 60 anos, e 32 tinham 60 anos ou mais. As variáveis clínico-patológicas incluíram diâmetro do tumor, estágio TNM, grau de diferenciação, trombo tumoral vascular, metástase linfonodal e nível pré-operatório de CEA.
Aquisição e pré-processamento de dados públicos
Dados de miRNA-seq, RNA-seq e dados clínicos de acesso aberto para TCGA-COAD e TCGA-READ foram obtidos no portal Genomic Data Commons. Tumores primários e amostras de tecido sólido normal foram identificados de acordo com o tipo de amostra do GDC. Amostras de tumores metastáticos e recorrentes foram excluídas da análise de expressão diferencial entre tumor e tecido normal. Para os arquivos de miRNA-seq do TCGA, a entrada ao nível da base de dados detectada nesta análise foi hsa-mir-192; os valores de expressão foram analisados como log2(RPM + 1), em que RPM indica leituras por milhão de leituras de miRNA mapeadas. Foram realizadas análises não pareadas e pareadas entre tumor e tecido normal quando amostras emparelhadas estavam disponíveis. Os conjuntos de dados GEO GSE89076 e GSE156355 foram utilizados para triagem de genes-alvo candidatos. Genes diferencialmente expressos provenientes do GEO foram triados utilizando valores ajustados p < 0,05 e mudança absoluta no log2 de pelo menos 2. Os nomes dos conjuntos de dados foram verificados quanto à consistência ao longo do manuscrito.
Análises diagnósticas, clínico-patológicas e de sobrevida
A análise da curva ROC (característica operacional do receptor) foi utilizada para avaliar a separação exploratória entre tumor e tecido normal nos conjuntos de dados TCGA-COAD, TCGA-READ e no coorte combinado COADREAD. Como o número de amostras normais era pequeno, foram realizadas análises de sensibilidade adicionais, incluindo reamostragem balanceada entre tumor e tecido normal com 5.000 iterações e análise leave-one-normal-out. Para as análises de associação clinicopatológica, as amostras de tumor primário foram divididas em grupos de alta e baixa expressão com base no nível mediano de expressão da miR-192 no TCGA. As análises foram repetidas para o coorte combinado COADREAD e separadamente para COAD e READ, sempre que o tamanho da amostra permitiu. A sobrevida global foi avaliada por meio da análise de Kaplan-Meier com o teste log-rank e regressão de Cox univariável. As análises diagnósticas, clinicopatológicas e de sobrevida foram relatadas separadamente para evitar a superestimação de conclusões prognósticas.
Análises de genes-alvo candidatos e genes centrais
Genes-alvo candidatos foram identificados integrando a predição do miRWalk com genes diferencialmente expressos de GSE89076 e GSE156355. A interseção entre essas três fontes foi mantida para análises exploratórias subsequentes. Uma rede de interação proteína-proteína foi construída utilizando o STRING, e os genes centrais foram selecionados com base no grau do nó e na conectividade do módulo por meio das análises cytoHubba e MCODE baseadas no Cytoscape. Os genes centrais mantidos (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C) foram avaliados posteriormente utilizando dados de RNA-seq do TCGA. As diferenças de expressão entre tumor e tecido normal, as correlações de Spearman com a expressão do miR-192 do TCGA e as associações com sobrevida geral foram resumidas como análises exploratórias suplementares. Esses genes foram considerados apenas como alvos candidatos; nenhuma ligação direta, efeito de resgate ou regulação em nível proteico downstream foi inferida a partir dos dados bioinformáticos.
Análise de enriquecimento de GO e KEGG
Foram realizadas análises de enriquecimento de Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) para o conjunto de genes candidatos e os módulos significativos da rede. Os termos de GO foram agrupados em categorias de processo biológico, componente celular e função molecular. Resultados de enriquecimento com p < 0,05 foram considerados estatisticamente relevantes e foram interpretados como sinais de vias geradores de hipóteses, e não como mecanismos validados experimentalmente.
Extração de RNA e análise de qRT-PCR
O RNA total foi extraído de 45 amostras pareadas de tecido de CCR e tecido não canceroso adjacente utilizando o reagente TRIzol, conforme o protocolo do fabricante. A pureza e a concentração do RNA foram avaliadas espectrofotometricamente, e amostras com valores de A260/A280 entre 1,8 e 2,1 foram utilizadas para a transcrição reversa. A qRT-PCR foi realizada utilizando um sistema de transcrição reversa para miRNA e reagentes de qPCR para miRNA baseados em SYBR Green da TransGen Biotech. A transcrição reversa e a amplificação por qPCR foram realizadas conforme as instruções do fabricante dos reagentes. Cada reação de qRT-PCR foi executada em triplicata técnica. O RNU6B foi utilizado como referência interna. Os primers para miR-192-5p foram 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (sentido) e 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (anti-sentido). Os primers para RNU6B foram 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (sentido) e 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (anti-sentido). A análise da curva de dissociação foi utilizada para avaliar a especificidade da amplificação, quando suportada pela plataforma de qPCR. A expressão relativa foi calculada utilizando o método 2-ΔΔCt. Os resultados de tecidos tumorais pareados e tecidos adjacentes foram analisados como medições clínicas pareadas.
Cultura celular e transfeção
A linhagem celular de CCR humano HT29 foi obtida do estoque celular do laboratório dos autores e havia sido autenticada e confirmada como livre de contaminação por micoplasma. As células HT29 foram cultivadas em meio McCoy's 5A suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina a 37 oC em atmosfera com 5% de CO2. As células foram repicadas quando atingiram cerca de 80% de confluência. Os miméticos de miR-192-5p e o oligonucleotídeo controle negativo con238 foram adquiridos da Sangon Biotech (Xangai, China) e utilizados para transfeção transitória. Células HT29 foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas quando a densidade celular atingiu aproximadamente 20–30%, utilizando uma concentração final de oligonucleotídeo de 50 nM e um protocolo de transfeção baseado em lipídeos, conforme as instruções do fabricante do reagente. A proporção exata entre reagente e oligonucleotídeo, bem como a quantidade de reagente, seguiu o protocolo recomendado pelo fabricante, conforme registrado nos arquivos do laboratório dos autores. As células foram incubadas com os complexos de transfeção em condições padrão de cultivo, e análises downstream de imagem da transfeção e ensaios de cicatrização (wound-healing) foram realizados após a transfeção, de acordo com o cronograma experimental. Apenas os dados obtidos com células HT29 foram incluídos no presente estudo.
Ensaio de cicatrização de ferida
Células HT29 transfectadas foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até a formação de uma monocamada confluente. Um arranhão linear foi criado utilizando uma ponteira estéril de 200 µL, e as células destacadas foram removidas por lavagem com PBS. O meio foi então substituído por meio sem soro para reduzir os efeitos relacionados à proliferação durante a avaliação da migração. Imagens da ferida foram capturadas em 0 h, 24 h e 48 h. O ensaio de cicatrização da ferida foi realizado em três réplicas biológicas independentes, e múltiplos campos microscópicos foram medidos para cada grupo e ponto temporal. A largura da ferida foi quantificada a partir das imagens de microscopia utilizando software de análise de imagem; a versão exata do software utilizada nas medições originais não estava disponível nos registros fonte. A taxa de cicatrização da ferida foi calculada como [(largura da ferida em 0 h – largura da ferida no ponto temporal indicado) / largura da ferida em 0 h] × 100%. Como os dados disponíveis do manuscrito não incluem um experimento controle de proliferação separado, os resultados do ensaio de cicatrização da ferida foram interpretados como relacionados à migração, mas sem exclusão completa dos efeitos de proliferação.
Análise de correlação de assinatura imune
A associação entre a expressão de miR-192 do TCGA e assinaturas relacionadas ao sistema imunológico foi reavaliada utilizando dados de RNA-seq de tumores primários. Um total de 425 amostras tumorais com dados pareados de miRNA e RNA-seq foi incluído na análise de correlação de escores de assinatura. A expressão de miR-192 mostrou correlações negativas estatisticamente significativas, mas fracas, com várias assinaturas imunes após correção da taxa de falsa descoberta, incluindo células Tfh (rho = -0.205, FDR = 0.00049), células dendríticas ativadas (rho = -0.186, FDR = 0.00098), células Treg (rho = -0.185, FDR = 0.00098), células dendríticas plasmocitoides (rho = -0.169, FDR = 0.0027) e macrófagos (rho = -0.149, FDR = 0.0092). Correlações positivas foram observadas principalmente para assinaturas de eosinófilos (rho = 0.139, FDR = 0.0155) e de células Th17 (rho = 0.121, FDR = 0.0296). Esses achados indicam associações imunes heterogêneas e geralmente fracas, ao invés de um padrão uniforme de infiltração imune positiva.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 e software R 3.6.3. As variáveis contínuas foram resumidas como média ± desvio padrão ou mediana com intervalo interquartílico, conforme apropriado. Comparações pareadas de tecidos foram analisadas usando testes pareados quando as amostras de tumor e tecido adjacente eram emparelhadas. Testes não paramétricos foram utilizados quando as suposições de normalidade não foram atendidas. Curvas ROC, reamostragem balanceada e análise leave-one-normal-out foram utilizadas para discriminação diagnóstica exploratória; testes qui-quadrado foram utilizados para associações clínico-patológicas categóricas; modelos log-rank e de Cox foram utilizados para análises de sobrevida; e a correlação de Spearman foi utilizada para análises imunes e de genes centrais. Valores de p bilaterais < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos, com correção da taxa de falsas descobertas relatada para correlações de assinaturas imunes.
Resultados
Análise de expressão em conjuntos de dados públicos e tecidos clínicos pareados
O padrão de expressão de miR-192 foi reavaliado utilizando dados de sequenciamento de miRNA provenientes do GDC, do TCGA-COAD e do TCGA-READ (Figura 1). Nessas bases de dados, a entrada no nível do banco de dados foi anotada como hsa-mir-192, em vez da espécie madura hsa-miR-192-5p; portanto, esse resultado proveniente de base de dados pública foi interpretado como um sinal de miR-192 do TCGA. No coorte combinado COADREAD, foram analisados 616 tumores primários e 11 amostras normais de tecido sólido. As amostras tumorais apresentaram expressão maior de miR-192 do que as amostras normais (mediana de 16,05 versus 13,46 log2[RPM + 1], Mann-Whitney p = 9,96 x 10-8). A mesma tendência de expressão mais elevada no tumor foi observada no COAD isolado (455 tumores e 8 amostras normais, p = 9,89 x 10-8) e no READ isolado (161 tumores e 3 amostras normais, p = 1,94 x 10-5). A análise pareada do TCGA também mostrou expressão tumoral mais elevada em 11 casos pareados (diferença mediana tumor-normal = 3,13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0,0029). Esses resultados permaneceram discordantes com o resultado local de qRT-PCR pareado, que indicou redução da expressão da miR-192-5p madura em tecidos de CCR (Figura 2).
Desempenho diagnóstico e associações clinicopatológicas
A análise ROC baseada no TCGA foi repetida utilizando a definição de discriminação entre amostras tumorais e normais descrita acima (Figura 3). A AUC foi de 0,968 para o conjunto combinado COADREAD, 0,947 para COAD isoladamente e 0,994 para READ isoladamente. A reamostragem balanceada adicional gerou AUCs medianas de 0,983 para COADREAD, 0,984 para COAD e 1,000 para READ; no entanto, os intervalos de confiança de 95% foram amplos para COADREAD (0,868–1,000) e COAD (0,781–1,000), e READ incluiu apenas três amostras normais. A análise leave-one-out normal também mostrou que a estimativa ROC era sensível ao pequeno grupo normal. Portanto, o resultado ROC foi mantido apenas como evidência exploratória de separação entre tumor e tecido normal, não como evidência suficiente para um biomarcador diagnóstico clínico. A análise de associação clinicopatológica baseada na expressão mediana de miR-192 do TCGA mostrou associações significativas com o estadiamento N (p = 0,019) e idade (p = 0,004), enquanto o estadiamento T (p = 0,110) e o estadiamento M (p = 0,932) não foram significativos (Tabela 1).
Análise de sobrevida
A análise de sobrevida global não apoiou uma associação prognóstica significativa para a expressão de miR-192 do TCGA em CCR (Figura 3). No coorte combinado de COADREAD, a comparação de Kaplan-Meier com corte na mediana não foi significativa (log-rank p = 0,857), e a regressão de Cox univariável também não mostrou associação significativa (HR = 0,934 por unidade de expressão log2, p = 0,374). A mesma conclusão foi observada em COAD (log-rank p = 0,889; Cox p = 0,493) e em READ (log-rank p = 0,807; Cox p = 0,716). Assim, os dados não apoiam uma alegação robusta de biomarcador prognóstico para miR-192 em CCR.
Genes alvo candidatos e enriquecimento funcional
A análise de genes-alvo candidatos foi realizada integrando a predição do miRWalk com genes diferencialmente expressos dos conjuntos de dados GEO GSE89076 e GSE156355. Esta triagem identificou 93 genes candidatos para análises de rede e enriquecimento posteriores (Figura 4). A análise de interação proteica manteve KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C como genes centrais exploratórios (Figura 5). A análise de sensibilidade de RNA-seq do TCGA mostrou que KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1 e CDK1 apresentavam níveis mais altos no tecido tumoral do que no tecido normal, enquanto PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C apresentavam níveis mais baixos no tecido tumoral. A análise de correlação com a expressão de miR-192 do TCGA foi variada: CDCA5, CCNB1 e CDK1 mostraram correlações positivas, enquanto PLP1, NRXN1 e KIF5C mostraram correlações negativas. A análise de enriquecimento destacou termos representativos relacionados ao metabolismo de fármacos pelo citocromo P450, metabolismo de xenobióticos pelo citocromo P450, metabolismo do retinol, termos relacionados à sinapse glutamatérgica e à organização do pré-sináptico (Figura 6). Esses achados sustentam a relevância biológica da rede de genes centrais, mas não estabelecem o direcionamento direto pelo miR-192-5p.
Ensaio de migração celular
Células HT29 foram transfectadas com mimetizadores de miR-192 para avaliar os efeitos funcionais da superexpressão de miR-192. A microscopia de fluorescência confirmou a transfeção bem-sucedida nos grupos transfectados com o mimetizador de miR-192-5p e no grupo controle negativo (Figura 7). No ensaio de cicatrização, a taxa de migração das células HT29 transfectadas com miR-192 foi menor do que a das células HT29 não transfectadas e das células transfectadas com controle negativo, tanto em 24 h quanto em 48 h (Figura 8). Em 24 h, a taxa de migração foi de 9,75 +/- 2,43% no grupo transfectado com miR-192, comparada a 15,69 +/- 3,47% no grupo não transfectado e 15,45 +/- 3,92% no grupo controle negativo (P = 0,010). Em 48 h, a taxa de migração foi de 20,04 +/- 2,54% no grupo transfectado com miR-192, comparada a 26,84 +/- 7,65% e 27,98 +/- 6,78% nos dois grupos controle, respectivamente (P = 0,021). Esses resultados sugerem que a superexpressão de miR-192 suprime a migração de células HT29 in vitro.
Análise de correlação de assinatura imune
A associação entre a expressão de miR-192 do TCGA e assinaturas relacionadas ao sistema imunológico foi reavaliada utilizando dados de RNA-seq de tumores primários (Figura 9). Um total de 425 amostras tumorais com dados pareados de miRNA e RNA-seq foi incluído na análise de correlação dos escores das assinaturas. A expressão de miR-192 apresentou correlações negativas fracas com múltiplas assinaturas de células imunes, incluindo células Tfh (rho = -0.205, p = 2,15e-05), células dendríticas ativadas (rho = -0.186, p = 0,00011), células Treg (rho = -0.185, p = 0,00013), células dendríticas plasmocitoides (rho = -0.169, p = 0,00046), macrófagos (rho = -0.149, p = 0,0020), células Tcm (rho = -0.136, p = 0,0050), células NK CD56bright (rho = -0.132, p = 0,0065) e células Tem (rho = -0.129, p = 0,0078). Correlações positivas fracas foram observadas para assinaturas de eosinófilos (rho = 0,139, p = 0,0040) e de células Th17 (rho = 0,121, p = 0,0129). Assim, a associação imune da miR-192 no CCR parece heterogênea e não deve ser descrita como uniformemente positiva entre os infiltrados imunes.
Disponibilidade de Dados
Os conjuntos de dados públicos analisados neste estudo estão disponíveis no portal GDC/TCGA e no banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) sob os números de acesso GSE89076 e GSE156355. As análises in silico e a reanálise geradas durante este estudo são fornecidas na Tabela Suplementar 1. Os dados experimentais subjacentes que sustentam as análises de qRT-PCR e de cicatrização de ferimento, incluindo os valores brutos de Ct da qRT-PCR, as medidas de largura da ferida, as imagens microscópicas originais e os dados experimentais relacionados, estão disponíveis na Pasta Suplementar 1.
Figura 1: Visão geral da expressão pan-câncer do miR-192 no TCGA. O eixo x mostra as abreviações dos tumores, e o eixo y mostra a expressão relativa do miR-192. O azul indica tecido normal, e o vermelho indica tecido tumoral. A significância estatística é indicada da seguinte forma: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001; NS = não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de miR-192/miR-192-5p em conjuntos de dados de CCR e tecidos pareados. (A) Análise de sequenciamento de miRNA do TCGA/GDC mostrando sinal mais alto do hsa-mir-192 em nível de banco de dados em amostras tumorais de CCR do que em amostras normais. (B) Análise por qRT-PCR de amostras pareadas de tecido local mostrando expressão reduzida do miR-192-5p maduro em tecidos de CCR em comparação com tecidos não cancerosos adjacentes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análises diagnósticas exploratórias e de sobrevida baseadas na expressão de hsa-mir-192 do TCGA. (A–C) Curvas de sobrevida de Kaplan-Meier. A análise de sobrevida não apoiou uma associação prognóstica significativa. (D) Curva ROC para discriminação entre tumor e tecido normal na coorte do TCGA. A AUC deve ser interpretada com cautela devido ao pequeno número de amostras normais. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Triagem de genes-alvo candidatos e análise de interação proteica. (A) Diagrama de Venn mostrando a sobreposição entre a predição de alvos de miRNA e genes diferencialmente expressos de GSE89076 e GSE156355. (B) Rede de interação proteína-proteína dos 93 genes candidatos. Os nós representam genes e as arestas representam associações gênicas preditas ou curadas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Triagem de genes centrais a partir da rede de alvos candidatos. (A,B) Módulos da rede identificados pela triagem de módulos. (C) Classificação dos genes centrais com base na conectividade da rede. (D) Alvos centrais candidatos são mantidos após a integração da triagem baseada em módulos e grau. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6: Termos selecionados de enriquecimento GO e KEGG para genes candidatos e módulos de rede significativos. O gráfico de bolhas resume as funções biológicas e vias metabólicas enriquecidas representativas. Os resultados de enriquecimento são exploratórios e requerem validação experimental. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagens de transfeção de células HT29. (A) Células HT29 representativas. (B) Imagem de fluorescência de células HT29 transfectadas com o mimetizador de miR-192-5p. (C) Imagem de fluorescência de células HT29 transfectadas com o controle negativo con238. Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 8: Ensaio de cicatrização em células HT29. (A) Imagens representativas da ferida aos 0 h, 24 h e 48 h em células HT29 não transfectadas, células HT29 transfectadas com o mimetizador de miR-192-5p e células HT29 transfectadas com con238. (B) Quantificação das taxas de cicatrização aos 24 h e 48 h, apresentadas como porcentagens. Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 9: Correlação entre a expressão de miR-192 no TCGA e escores de assinaturas relacionadas ao sistema imunológico em amostras tumorais de CCR. A análise mostrou associações imunes heterogêneas, com diversas correlações negativas fracas e, principalmente para as assinaturas de eosinófilos e células Th17, correlações positivas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Características | Baixa expressão de TCGA miR-192 | Alta expressão de TCGA miR-192 | valor p | Método |
| n | 308 | 308 | ||
| Estágio T, n (%) | 0,11 | Chisq.test | ||
| T1 | 9 (1,5%) | 11 (1,8%) | ||
| T2 | 44 (7,2%) | 59 (9,6%) | ||
| T3 | 209 (34,1%) | 211 (34,4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4,4%) | ||
| Estágio N, n (%) | 0,019 | Chisq.test | ||
| N0 | 156 (25,5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14,4%) | 63 (10,3%) | ||
| N2 | 61 (10%) | 54 (8,8%) | ||
| Estágio M, n (%) | 0,932 | Chisq.test | ||
| M0 | 214 (39,9%) | 234 (43,7%) | ||
| M1 | 41 (7,6%) | 47 (8,8%) | ||
| Idade, mediana (IQR) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0,004 | Wilcoxon |
Tabela 1: Associação entre os grupos de expressão de miR-192 do TCGA e as características clínico-patológicas no CCR. Os grupos de alta e baixa expressão foram definidos pelo nível mediano de expressão de miR-192 do TCGA. Na tabela resumida, o estágio N e a idade foram significativos, enquanto os estágios T e M não foram significativos.
Tabela Suplementar 1: Resultados da reanálise in silico gerados para este estudo. A pasta de trabalho inclui comparações de expressão do TCGA/GDC, análises de sensibilidade ROC balanceadas, análises leave-one-normal-out, análises de associação clinicopatológica, análises de sobrevida, resumos da expressão e correlação de genes centrais e resultados de correlação de assinaturas imunes.Clique aqui para baixar este arquivo.
Pasta Suplementar 1: Dados experimentais brutos que apoiam os experimentos de qRT-PCR, transfeção celular e cicatrização de ferimento. Esses arquivos incluem os valores Ct originais de qRT-PCR, dados de citometria de fluxo/transfeção, medidas de largura do ferimento e imagens representativas de microscopia utilizadas nas análises apresentadas no manuscrito.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este estudo avaliou a relevância clínica e biológica do miR-192-5p no CCR combinando análise de conjuntos de dados públicos, validação em tecidos locais, predição de rede alvo, análise de assinatura imune e experimentos in vitro de migração. As análises utilizaram definições verificadas de amostras do TCGA, separaram COAD e READ sempre que possível, empregaram valores de miARN em log2(RPM + 1), distinguiram comparações pareadas de não pareadas, testaram a robustez da ROC e incluíram análises de sensibilidade de RNA-seq para genes centrais. A descoberta principal é que o sinal do miR-192 do TCGA/GDC público e o resultado local de qRT-PCR para o miR-192-5p maduro indicam direções opostas de expressão, enfatizando a necessidade de distinguir anotações de precursores em nível de banco de dados de medições de miARN maduro9,11.
Essa discordância não deve ser explicada apenas por tamanhos desiguais de amostras. O grupo normal do TCGA era pequeno, mas análises não pareadas, pareadas, somente COAD e somente READ mostraram todas a mesma direção de maior tumor no TCGA/GDC. Vários fatores podem contribuir, incluindo diferenças na origem das amostras, plataformas de sequenciamento versus qRT-PCR, anotação no nível do banco de dados do hsa-mir-192 versus medição da forma madura do hsa-miR-192-5p, processamento do RNA, pureza do tumor, definição do tecido adjacente e características da população. Preocupações semelhantes sobre a interpretação de biomarcadores e heterogeneidade tumoral foram enfatizadas em estudos de CCR5,6,7,8. Portanto, os achados apoiam uma interpretação do miR-192-5p no CCR dependente do contexto e da plataforma, em vez de uma única direção universal de expressão.
A análise diagnóstica também deve ser interpretada com cautela. Embora a análise ROC baseada no TCGA tenha produzido um AUC elevado, a comparação incluiu muito mais amostras tumorais do que amostras normais, com apenas 11 amostras normais no cohort combinado COADREAD. A reamostragem balanceada ainda mostrou valores medianos altos de AUC, mas os intervalos foram amplos porque cada comparação balanceada foi limitada pelo pequeno grupo normal. Assim, o resultado da ROC apoia a separação exploratória entre tumor e tecido normal dentro do TCGA/GDC, mas é insuficiente para estabelecer o miR-192-5p como biomarcador diagnóstico clínico. Essa interpretação é consistente com a distinção geral entre sinais exploratórios de biomarcadores e biomarcadores diagnósticos ou prognósticos clinicamente validados4,8.
A análise de sobrevida não mostrou uma associação significativa entre a expressão de miR-192 e a sobrevida geral em COADREAD, COAD ou READ. Na análise atual, miR-192 pode estar associado a variáveis clinicopatológicas selecionadas, mas os dados disponíveis não sustentam uma conclusão robusta sobre seu papel como biomarcador prognóstico. Essa distinção é importante porque biomarcadores prognósticos exigem evidência de que o status do marcador esteja associado ao desfecho de forma independente e reprodutível em contextos clinicamente relevantes8.
O ensaio de cicatrização de ferida in vitro fornece evidência funcional de que a superexpressão de miR-192 pode reduzir a migração de células HT29. Esse resultado é consistente com uma possível função supressora de tumor em células de CCR e com a direção local do qRT-PCR. Trabalhos anteriores também apoiaram papéis para miRNAs, incluindo vias relacionadas ao miR-192, na regulação da transição epitélio-mesênquima, do destino celular e de fenótipos relacionados à migração15,16,17. No entanto, os dados funcionais ainda são incompletos. Seria necessária uma validação adicional em laboratório para apoiar um modelo mecanicista de supressor de tumor, incluindo transfeções repetidas em pelo menos uma linha celular adicional de CCR, controles de proliferação para ensaios de cicatrização de ferida, ensaios de migração/invasão em Transwell, validação com duplo luciferase de alvos selecionados, medidas de mRNA e proteína dos alvos e experimentos de resgate.
A análise de genes centrais deve ser considerada geradora de hipóteses. A suplementação com RNA-seq do TCGA mostrou fortes diferenças de expressão entre tumor e tecido normal para os genes centrais mantidos, mas suas correlações com o miR-192 foram variadas. Vários genes do ciclo celular, incluindo CDCA5, CCNB1 e CDK1, apresentaram correlação positiva, e não negativa, com o miR-192, o que não se encaixa em um modelo simples de repressão direta entre miRNA e seu alvo. Em contraste, PLP1, NRXN1 e KIF5C mostraram correlações negativas. Esses resultados sustentam a relevância biológica da rede, mas indicam que não se pode concluir o direcionamento direto sem validação por ensaio de luciferase, em nível proteico e por experimentos de resgate. Essa interpretação cautelosa é consistente com o caráter exploratório das análises in silico de redes de alvos10,11.
A análise imunológica apoia ainda mais uma interpretação cautelosa. Os escores de assinaturas imunes obtidos a partir de dados de RNA-seq de tumor mostraram que a expressão de miR-192 foi negativamente correlacionada com diversas assinaturas imunes e positivamente correlacionada principalmente com as assinaturas de eosinófilos e de células Th17. A maioria das correlações foi fraca, mesmo após a correção para a taxa de falsa descoberta. Como os métodos de assinatura imune inferem o enriquecimento de vias ou estados celulares a partir de dados de expressão em massa, esses achados devem ser considerados exploratórios e exigem validação por meio de abordagens ortogonais de perfilagem imune13.
Este estudo possui várias limitações. Primeiramente, a coorte de validação local foi relativamente pequena e proveniente de um único centro. Em segundo lugar, a análise de conjuntos de dados públicos e a validação local por qRT-PCR utilizaram plataformas e níveis de medição diferentes. Terceiro, as amostras de sequenciamento de miRNA normais do TCGA foram escassas, limitando a inferência diagnóstica. Quarto, as análises de genes centrais e imunes foram computacionais e requerem validação experimental. Quinto, os experimentos funcionais disponíveis limitaram-se aos dados de cicatrização de ferida em HT29. Essas limitações justificam apresentar o estudo como uma análise exploratória integrada, e não como evidência definitiva de que o miR-192-5p é um biomarcador diagnóstico, prognóstico ou mecanicista validado no CCR6,8.
Em resumo, o miR-192-5p parece ser biologicamente relevante para o CCR, mas seu padrão de expressão e interpretação clínica são complexos. A análise do TCGA/GDC mostrou um sinal mais alto de miR-192 em amostras tumorais de CCR, enquanto a qRT-PCR em uma coorte local de tecidos pareados mostrou expressão reduzida do miR-192-5p maduro. A análise ROC indicou separação exploratória entre tumor e tecido normal, mas foi limitada pelo pequeno grupo de amostras normais do TCGA. Nenhuma associação significativa com sobrevida global foi observada. As análises de genes centrais e imunes fornecem evidências com potencial hipotético, e os dados de cicatrização de ferimento em HT29 sugerem que a superexpressão do miR-192-5p pode reduzir a migração celular. São necessárias outras coortes independentes e experimentos laboratoriais direcionados antes que o miR-192-5p possa ser considerado um biomarcador validado para diagnóstico, prognóstico ou mecanismo no CCR.
Divulgações
Os autores não têm conflito de interesse a declarar.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Laboratório de Diagnóstico Molecular de Tumores da Universidade Médica da Mongólia Interior pelo apoio técnico. Este trabalho foi financiado pelo Projeto de Pesquisa Científica da Comissão de Saúde do Município de Yancheng (Grant No. YK2023101), que também custeou a taxa de processamento do artigo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| tripsina-EDTA 0,25%+2:60 | Biological Industries | 03-054-1 | digestão/passagem celular |
| persulfato de amônio 10% | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8090 | reagente para SDS-PAGE |
| lauril sulfato de sódio 10% | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SIS1070 | reagente para SDS-PAGE |
| tampão de carregamento de proteína 4x | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1016 | preparação de amostra proteica |
| congelador ultracongelador a -80 °C | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | armazenamento de amostras |
| reagente de remoção de micoplasma Anti-Myc | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | P-CMR-001 | descontaminação de micoplasma |
| conjuntos de iniciadores ARL2, BATF2, MEN1 e beta-actina | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | sintetizado sob encomenda | iniciadores para qPCR de mRNA |
| leitor automático de microplacas | PerkinElmer, USA | VICTOR Nivo | medição de absorbância |
| Kit BCA para Dosagem de Proteína | Thermo Fisher Scientific | 23225 | quantificação proteica |
| cabine de segurança biológica / bancada limpa | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | cultivo celular asséptico |
| câmara de contagem celular / hemocitômetro | Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd. | http://www.shqiujing.net/ | contagem celular |
| Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8) | Biosharp | BS350B | ensaio de proliferação celular/citotoxicidade |
| frascos de cultura celular, placas de cultura, tubos de centrífuga e ponteiras de pipeta | Corning | https://www.corning.com/in/en.html | consumíveis gerais para cultura celular |
| Kit de Detecção de Ciclo Celular e Apoptose | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm | análise citométrica de ciclo celular/apoptose |
| incubadora de células com CO2 | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | cultivo celular |
| oligonucleotídeo controle negativo con238 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | sintetizado sob encomenda | controle de transfeção |
| software Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | visualização de módulos de rede e genes centrais |
| agitador magnético termostático digital | Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory | https://czxtyq.en.alibaba.com/ | preparação de solução |
| estufa elétrica termostática com circulação de ar | Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd. | https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/ | apoio à secagem/esterilização |
| sistema de eletroforese | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN 3 Cell | eletroforese em gel |
| sistema de eletrotransferência | Hoefer | TE77XP | transferência proteica |
| soro bovino fetal | Biological Industries | 04-001-1ACS | suplemento para cultura celular |
| citômetro de fluxo | ACEA Biosciences | NovoCyte | citometria de fluxo |
| microscópio invertido com fluorescência | Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd. | https://www.sunny-instrument.com/en | imagem celular e de feridas |
| portal GDC/TCGA | National Cancer Institute | banco de dados de acesso aberto | dados públicos de miRNA-seq, RNA-seq e clínicos |
| banco de dados GEO | National Center for Biotechnology Information | GSE89076 e GSE156355 | conjuntos de dados públicos de expressão gênica |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versão 9 | análise estatística e geração de gráficos |
| centrífuga refrigerada de alta velocidade | Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | https://www.bioridgecentrifuge.com/ | preparação de amostras |
| células HT29 | estoque celular do laboratório dos autores | não aplicável | linha celular de câncer colorretal humano |
| software de análise de imagem | ImageJ | não aplicável | quantificação da largura da ferida |
| sistema de imagem | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | Tanon-5200 | imagem de gel/blot |
| sistema de observação dinâmica de células e análise funcional IncuCyte S3 | Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd. | IncuCyte S3 | imagem de células vivas/análise funcional |
| banho-maria termostático inteligente | Leica | HI1210 | incubação com controle de temperatura |
| lentivírus e reagente de infecção | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4 | transdução celular estável |
| pipetas manuais | Gilson | PIPETMAN P | manipulação de líquidos |
| meio basal McCoy's 5A | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | PM150710 | meio de cultura para células HT29 |
| centrífuga médica | fabricante de Zhuhai não especificado | 3200 | preparação de amostras |
| geladeira/congelador médico | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | armazenamento de reagentes/amostras |
| substrato quimioluminescente ECL supersensível Meilunbio Fixer | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | MA0186 | detecção em imunoblot |
| centrífuga mini | Beijing DLAB Scientific Co., Ltd. | https://www.dlabsci.com/ | preparação de amostras |
| conjuntos de iniciadores miR-192-5p e U6 | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | sintetizado sob encomenda | iniciadores para qPCR de miRNA |
| mimético de miR-192-5p | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | sintetizado sob encomenda | oligonucleotídeo para transfeção transitória |
| Kit miRcute Enhanced miRNA First-Strand cDNA Synthesis | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | KR211 | transcrição reversa de miRNA |
| Kit miRcute Enhanced miRNA Fluorescence Quantitation (SYBR Green FP) | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | FP411 | qPCR de miRNA |
| miRWalk | banco de dados público | banco de dados web | banco de dados de predição de alvos de miRNA |
| membrana de nitrocelulose | Millipore | HATF00010 | membrana para transferência proteica |
| leite em pó desnatado | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8340 | reagente bloqueador para imunoblot |
| tecidos pareados de câncer colorretal e tecidos não cancerosos adjacentes | instituição dos autores | não aplicável | espécimes clínicos |
| tubos para PCR | Corning | PCR-02-C | montagem de PCR/qRT-PCR |
| solução de penicilina-estreptomicina | Biological Industries | 03-031-1B | antibiótico para cultura celular |
| Kit PerfectStart Uni RT&qPCR | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | AUQ-01 | transcrição reversa de mRNA e qPCR |
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | tampão para lavagem celular |
| marcador proteico pré-estainado | Fermentas | 26619 | marcador de peso molecular proteico |
| sistema de preparação de água pura | China Moer | não disponível | preparação de água pura |
| puromicina | Phygene | PH1143 | seleção de células transduzidas |
| software R | R Foundation for Statistical Computing | Versão 3.6.3 | análise estatística e bioinformática |
| tampão de transferência rápida | Crisbio | não aplicável | eletrotransferência proteica |
| sistema de PCR quantitativo em tempo real com fluorescência | Applied Biosystems (ABI), USA | não disponível | detecção de qRT-PCR |
| tampão de lise RIPA | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0020 | extração proteica |
| tubos microcentrífuga livres de RNase | Corning | 3208 | manipulação de RNA |
| meio de criopreservação celular sem soro | New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd. | C40100 | criopreservação celular |
| SPSS Statistics | IBM | Versão 25 | análise estatística |
| diluente estabilizado para anticorpos | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | não aplicável | diluição de anticorpos primários/secundários |
| ponteiros de pipeta estéreis | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | TP-10-C | ferramenta para risco de cicatrização de feridas |
| banco de dados STRING | STRING Consortium | banco de dados web | análise de rede de interação proteica |
| TEMED | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8090 | reagente para SDS-PAGE |
| TransZol Up | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | ET111-01 | extração de RNA |
| tampão Tris-HCl, pH 6,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1020 | tampão para gel de empilhamento em SDS-PAGE |
| tampão Tris-HCl, pH 8,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1010 | tampão para gel de separação em SDS-PAGE |
| Tween-20 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8220 | reagente de lavagem para imunoblot |
| esterilizador vertical por vapor sob pressão | Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp. | BXM-30R | esterilização |
Referências
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