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Artigo de investigação
Este estudo retrospectivo caso-controle avaliou o miR-146a sérico, miR-642a, miR-2861 e marcadores metabólicos em mulheres com síndrome dos ovários policísticos. Foram observadas alterações coordenadas nos miRNAs, adipocinas, resistência à insulina, inflamação e testosterona, enquanto um modelo combinado de biomarcadores apresentou desempenho discriminatório superior ao dos marcadores individuais.
A síndrome dos ovários policísticos (SOP) é um distúrbio endócrino e metabólico comum em mulheres na idade reprodutiva, mas as relações entre microRNAs (miRNAs) circulantes e proteínas relacionadas à nutrição permanecem parcialmente compreendidas. Este estudo investigou as associações entre o miR-146a, miR-642a e miR-2861 séricos e marcadores metabólicos e inflamatórios na SOP. O estudo incluiu 62 mulheres com SOP e 71 controles saudáveis. Os níveis séricos de miR-146a, miR-642a e miR-2861 foram medidos por PCR quantitativa em tempo real, enquanto adiponectina (ADPN), leptina (LEP), proteína transportadora de retinol 4 (RBP4), avaliação do modelo de homeostase da resistência à insulina (HOMA-IR), interleucina-6 (IL-6) e testosterona (T) também foram avaliados. A validação metodológica avaliou as condições de processamento das amostras, a precisão do ensaio e a concordância entre métodos analíticos. Em comparação com os controles, as mulheres com SOP apresentaram expressão aumentada de miR-146a e expressão reduzida de miR-642a e miR-2861. Os níveis de ADPN foram reduzidos, enquanto os níveis de LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 e T foram elevados. O miR-146a apresentou correlação negativa com ADPN e correlação positiva com LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 e T. O miR-642a apresentou correlação negativa com RBP4, HOMA-IR e IL-6, enquanto o miR-2861 apresentou correlação positiva com ADPN. A validação metodológica mostrou estabilidade, precisão e concordância entre métodos aceitáveis. O modelo combinando os três miRNAs com ADPN, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 e T alcançou uma área sob a curva de 0,929, com sensibilidade de 82,26% e especificidade de 94,37%. Esses achados demonstram alterações coordenadas nos miRNAs circulantes e nos marcadores metabólicos na SOP e apoiam a avaliação adicional do potencial diagnóstico combinado desses marcadores.
A SOP é o distúrbio endócrino e metabólico mais comum em mulheres na idade reprodutiva. Estima-se que sua prevalência global varie de 6% a 20%. Aproximadamente 70% das mulheres afetadas apresentam resistência à insulina, e mais da metade está acima do peso ou obesa1. A SOP pode levar a disfunção ovulatória, infertilidade, diabetes tipo 2, doenças cardiovasculares e outras complicações de longo prazo, afetando seriamente a saúde reprodutiva e a qualidade de vida2. Embora sua patogênese ainda não tenha sido totalmente elucidada, considera-se geralmente que a SOP envolve múltiplos fatores, incluindo suscetibilidade genética, inflamação crônica de baixo grau, anormalidades nas vias de sinalização da insulina e desregulação do microambiente ovariano local. Nesse contexto, a identificação de marcadores moleculares específicos que reflitam a progressão da doença tem valor evidente para o diagnóstico precoce e intervenção precisa na SOP3,4.
Os miARNs são uma classe de ARNs não codificantes com aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento. Essas moléculas regulam a expressão gênica pós-transcricional ao promover a degradação do ARNm ou inibir a tradução. Portanto, essas moléculas são cruciais para diversos processos celulares, incluindo crescimento celular, diferenciação, respostas à inflamação e regulação metabólica5,6. Estudos anteriores demonstraram uma desregulação característica dos miARNs-146a, miARN-642a e miARN-2861 no soro de pacientes com SOP. A superexpressão do miARN-146a pode mediar respostas inflamatórias crônicas por meio da regulação direcionada da via TLR4/NF-κB7, enquanto a redução da expressão dos miARNs-642a e miARN-2861 tem sido fortemente associada à resistência à insulina e à disfunção das células da granulosa ovarianas8,9. A ADPN, a LEP e a RBP4, que são proteínas relacionadas à nutrição, desempenham um papel fundamental na regulação do equilíbrio metabólico. Alterações em seus níveis podem afetar diretamente o metabolismo dos lipídios, a sensibilidade à insulina e o estado inflamatório. Isso é considerado uma parte chave da base molecular dos distúrbios metabólicos observados no SOP10,11. No entanto, a maioria dos estudos publicados examinou separadamente os miARNs ou as proteínas relacionadas à nutrição em relação ao SOP12,13, e a relação molecular entre ambos ainda não foi esclarecida de maneira sistemática.
Neste estudo, medimos os níveis de expressão de três miRNAs e seis biomarcadores centrais em pacientes com SOP, analisamos as correlações entre esses marcadores e suas associações com índices bioquímicos clínicos, e investigamos ainda se os miRNAs podem participar do processo patológico da SOP por meio de associações com proteínas relacionadas à nutrição. Os resultados deste estudo podem enriquecer o entendimento atual da base molecular da SOP, fornecer alvos potenciais para terapias direcionadas à regulação nutricional e metabólica, e oferecer evidências laboratoriais para triagem precoce, monitoramento da eficácia e manejo individualizado da SOP.
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Declaração de ética
O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Ganzhou (número de aprovação: GZSZYYKYLL20240092, Data: 2024-12-20).
Todos os materiais, reagentes, kits de ensaio e equipamentos utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
Desenho do estudo
Este estudo retrospectivo caso-controle incluiu 62 pacientes com SOP diagnosticadas na clínica ambulatorial de ginecologia do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Ganzhou entre junho de 2024 e agosto de 2025 e 71 mulheres saudáveis em idade reprodutiva avaliadas no centro de gestão da saúde do hospital no mesmo período. Os controles foram selecionados para alcançar comparabilidade entre os grupos quanto à idade; o IMC não foi utilizado como variável de pareamento e foi avaliado como uma característica basal.
Participantes do estudo
Critérios de inclusão: Os critérios de inclusão para o grupo com SOP foram os seguintes: (1) idade >18 anos; (2) diagnóstico de SOP de acordo com os critérios de Rotterdam modificados, conforme recomendado pela Diretriz Internacional Baseada em Evidências de 2023, exigindo pelo menos duas das três características a seguir após exclusão de distúrbios relacionados: oligo-ovulação ou anovulação, definida como ciclos menstruais superiores a 35 dias ou menos de oito ciclos por ano; hiperandrogenismo clínico e/ou hiperandrogenismo bioquímico, sendo o hiperandrogenismo bioquímico definido como concentração sérica de testosterona total acima do limite superior de referência específico do ensaio; e morfologia ovariana policística, definida como pelo menos 20 folículos em um ovário ou volume ovariano de pelo menos 10 mL quando a contagem completa de folículos não era viável14; (3) prontuários médicos eletrônicos completos; (4) ausência de terapia de reposição hormonal, agentes hipoglicemiantes ou imunossupressores nos últimos 3 meses; e (5) disponibilidade de uma amostra sérica de jejum coletada no momento da inscrição e armazenada no biobanco institucional.
Os critérios de inclusão para o grupo controle foram os seguintes: (1) comparecimento a um exame de saúde durante o mesmo período; (2) ciclos menstruais regulares; (3) morfologia ovariana normal na ultrassonografia transvaginal; (4) ausência de histórico de distúrbios endócrinos, doenças ginecológicas, infertilidade ou disfunção hepática ou renal clinicamente significativa; e (5) disponibilidade de uma amostra de soro coletada em jejum no dia do exame e armazenada no biobanco institucional.
Os critérios de exclusão foram os seguintes: (1) endometriose, miomas uterinos, tumores ovarianos, doença inflamatória pélvica ou outras desordens ginecológicas; (2) disfunção tireoidiana, síndrome de Cushing, hiperprolactinemia, hiperplasia adrenal congênita, ou outra desordem endócrina que pudesse explicar disfunção ovulatória ou hiperandrogenismo; (3) disfunção cardíaca, hepática, renal ou pulmonar grave, tumores malignos, doenças autoimunes ou distúrbios hematológicos; (4) gravidez, parto ou aborto nos últimos 6 meses; (5) uso de glicocorticoides, contraceptivos orais ou outros medicamentos que afetem o metabolismo da glicose ou dos lipídios nos últimos 3 meses; (6) transtornos psiquiátricos ou comprometimento cognitivo; (7) ausência de informações clínicas essenciais; e (8) hemólise sérica grave, definida como concentração de hemoglobina >2,0 g/L, lipemia, icterícia, mais de um ciclo de congelamento-descongelamento ou armazenamento de amostra interrompido. A disfunção tireoidiana, a hiperprolactinemia e a hiperplasia adrenal congênita não clássica foram excluídas mediante medições de hormônio estimulante da tireoide, prolactina sérica e 17-hidroxiprogesterona, respectivamente; o hormônio folículo-estimulante foi avaliado quando apropriado, enquanto a síndrome de Cushing ou um tumor adrenal foi investigado quando clinicamente indicado. O mesmo procedimento pré-analítico foi aplicado a todas as amostras clínicas, e nenhuma amostra incluída na análise primária passou por mais de um ciclo de congelamento-descongelamento.
Coleta e armazenamento de amostras de soro
Sangue venoso em jejum (10 mL) foi coletado pela manhã em tubos sem anticoagulante, deixado coagular à temperatura ambiente por 30 min e centrifugado a 1.505 x g durante 15 min a 4 °C. O soro foi dividido em alíquotas de 200 µL e armazenado a −80 °C até a análise. O mesmo procedimento pré-analítico foi aplicado a todas as amostras clínicas, e nenhuma amostra incluída na análise primária sofreu mais de um ciclo de congelamento–descongelamento.
Preparação das amostras para validação metodológica
Dez amostras de soro pool provenientes de voluntários saudáveis foram utilizadas para avaliar os efeitos da velocidade de centrifugação (1.505, 3.000 e 4.000 x g por 15 min), frequência de congelamento-descongelamento (0, 1, 3 e 5 ciclos), temperatura de armazenamento (4 °C, −20 °C e −80 °C por 7 dias), duração do armazenamento (1, 3, 6 e 12 meses a −80 °C) e hemólise (<0,1, 0,1–0,5 e 0,5–2,0 g/L de hemoglobina).
Testes laboratoriais
Todos os ensaios laboratoriais foram realizados pelo mesmo técnico treinado, sob condições ambientais padronizadas e de acordo com procedimentos operacionais previamente especificados. Os miRNAs séricos foram quantificados por qRT-PCR; ADPN, LEP e RBP4 foram medidos por ELISA sandwich; T e IL-6 foram medidos por ensaios imunométricos baseados em quimioluminescência; e as variáveis metabólicas da glicose foram obtidas utilizando métodos laboratoriais automatizados de rotina.
Quantificação de miARN sérico por qRT-PCR
O RNA total foi extraído de 200 µL de soro utilizando o reagente TRIzol. Os dados de concentração de RNA e pureza A260/A280 obtidos por espectrofotometria não estavam disponíveis para as preparações de RNA de soro arquivadas. A aceitabilidade do ensaio de qRT-PCR foi, portanto, avaliada pela presença de um único pico específico na curva de dissociação e pela concordância entre três réplicas técnicas. Após a separação de fases com clorofórmio, precipitação com isopropanol e duas lavagens com etanol 75%, o pellet de RNA foi dissolvido em água livre de enzimas. O sistema de reação de 20 µL continha 4 µL de tampão 5x, 1 µL de transcriptase reversa, 1 µL de iniciador em alça (stem-loop) 10 µM e 5 µL de molde de RNA. As condições de reação foram 16 °C por 30 min, 42 °C por 30 min e 85 °C por 5 s. Os produtos da transcrição reversa foram armazenados a −20 °C. A PCR quantitativa foi realizada utilizando o kit TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II. Cada reação de 20 µL continha 10 µL da mistura SYBR 2×, 0,8 µL de cada iniciador (sentido e antissentido) a 10 µM e 2 µL de molde de cDNA. A amplificação foi realizada em um sistema de PCR em tempo real Applied Biosystems 7500 nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s; 40 ciclos de 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s; em seguida, foi realizada a análise da curva de dissociação para confirmar a especificidade da amplificação. O snRNA U6 foi utilizado como gene de referência interno, e os níveis relativos de expressão de miR-146a, miR-642a e miR-2861 foram calculados pelo método 2-ΔΔCt. Cada amostra foi testada em triplicata. As sequências de todos os iniciadores utilizados neste estudo estão listadas na Tabela 1.
Detecção de marcadores proteicos séricos
As concentrações séricas de ADPN, LEP e RBP4 foram medidas por ELISA de duplo anticorpo em sanduíche utilizando o Kit ELISA Quantikine para ADPN Total Humano/Acrp30 (sensibilidade analítica, 0,891 ng/mL; faixa do ensaio, 3,9–250 ng/mL), o Kit ELISA Quantikine para Leptina Humana (sensibilidade analítica, 7,8 pg/mL; faixa do ensaio, 15,6–1.000 pg/mL) e o Kit ELISA Quantikine para RBP4 Humano (sensibilidade analítica, 0,628 ng/mL; faixa do ensaio, 1,56–100 ng/mL), respectivamente. Cada ensaio foi específico para o analito humano correspondente, e as amostras séricas foram diluídas de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância foi medida a 450 nm, e as concentrações foram calculadas utilizando curvas padrão logísticas de quatro parâmetros. Os CVs intra-ensaio ou inter-ensaio foram de 2,5% ou 3,2% para ADPN, 2,7% ou 3,4% para LEP e 2,6% ou 3,3% para RBP4.
Medição de T
O T sérico foi medido por imunoensaio de eletroquimioluminescência utilizando um analisador imunoenzimático automatizado Roche Cobas e601.
Medições metabólicas da glicose e inflamatórias
Os valores de glicose plasmática em jejum, insulina em jejum e HbA1c foram obtidos dos registros clínicos laboratoriais de rotina do mesmo dia, e não dos alíquotas de soro arquivadas utilizadas nos ensaios de miRNA e proteínas metabólicas. A glicose plasmática em jejum foi medida pelo método de glicose oxidase, a insulina em jejum por imunoturbidimetria e a HbA1c por cromatografia líquida de alta eficiência. O HOMA-IR foi calculado como [glicose plasmática em jejum (mmol/L) × insulina em jejum (mIU/L)]/22,5. O IL-6 sérico foi medido por ensaio imunoenzimático quimioluminescente.
Validação metodológica
As comparações com métodos alternativos foram realizadas para determinar se as medições primárias eram robustas em relação à plataforma do ensaio e não foram utilizadas para gerar os principais resultados entre grupos. Os níveis de expressão dos três miRNAs e de cinco marcadores bioquímicos foram medidos sob as diferentes condições de processamento descritas acima, e o coeficiente de variação para cada indicador foi calculado como CV = (desvio padrão/média) x 100%. Um CV <15% foi considerado aceitável para avaliar a estabilidade dos resultados do ensaio sob diferentes condições de processamento e armazenamento das amostras. A precisão intra-dia foi avaliada por meio da medição repetida da mesma amostra de soro pool 10 vezes em um único dia, enquanto a precisão inter-dia foi determinada a partir de medições realizadas uma vez ao dia durante cinco dias consecutivos. Para cada indicador, foram calculados a média, o desvio padrão e o coeficiente de variação (CV) correspondente. Para o teste de concordância analítica, cinco analitos bioquímicos — ADPN, LEP, RBP4, IL-6 e T — foram medidos nas amostras de validação utilizando o ensaio principal e uma plataforma de imunoensaio com quimioluminescência da Roche. A análise de Bland–Altman foi utilizada para calcular os limites de concordância de 95%. O ensaio principal de qRT-PCR foi utilizado para todas as medições clínicas de miRNA, enquanto o miScript SYBR Green PCR Kit foi usado apenas como um método ortogonal no experimento de concordância analítica; os coeficientes de correlação de Pearson foram calculados entre os dois sistemas de qRT-PCR.
Análise estatística
A análise dos dados foi realizada utilizando software estatístico. Todas as variáveis contínuas foram inicialmente testadas quanto à normalidade com o teste de Shapiro-Wilk. Os dados com distribuição normal são expressos como média ± desvio padrão. As comparações entre dois grupos foram feitas com o teste t para amostras independentes, enquanto as comparações entre múltiplos grupos foram realizadas utilizando análise de variância de um fator, seguida pelo teste LSD-t para comparações pareadas. Os dados que não seguiam distribuição normal são apresentados como mediana (intervalo interquartil) [M (P25, P75)]. As comparações entre dois grupos foram então realizadas com o teste U de Mann-Whitney, e as comparações entre múltiplos grupos com o teste H de Kruskal-Wallis. Dados categóricos foram apresentados como frequências e porcentagens. Utilizamos o teste χ2 ou o teste exato de Fisher para comparar os grupos. As correlações entre variáveis foram avaliadas utilizando análise de correlação de Pearson ou análise de correlação de postos de Spearman, conforme a distribuição dos dados. Como análise exploratória, as correlações de Pearson entre cada miRNA e os seis marcadores metabólicos foram repetidas nos subgrupos de PCOS não obeso (IMC <28 kg/m2) e obeso (IMC ≥28 kg/m2). Os coeficientes de correlação foram comparados utilizando a transformação r para z de Fisher, e os valores de p resultantes entre subgrupos foram ajustados utilizando o procedimento de taxa de falsa descoberta de Benjamini–Hochberg. Avaliamos o desempenho diagnóstico utilizando curvas de característica operacional do receptor (ROC) e a área sob a curva (AUC). Além disso, analisamos a detecção combinada utilizando um modelo de regressão logística. Todos os testes foram bicaudais, e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Características basais da população em estudo
Um total de 62 pacientes com SOP e 71 controles saudáveis foram incluídos neste estudo. Os dois grupos foram comparáveis em idade, composição étnica e outras características basais (p > 0,05). Em contraste, os ciclos menstruais foram significativamente mais longos no grupo com SOP do que no grupo controle (p < 0,001), o que é consistente com a apresentação clínica típica da SOP (Tabela 2).
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Utilizando ensaios bioquímicos padronizados de soro e qRT-PCR, este estudo analisou amostras de soro de 62 pacientes com SOP e 71 controles saudáveis. Observamos um padrão característico de expressão disregulada de miRNA e proteínas relacionadas à nutrição na SOP, juntamente com associações pós-transcricionais significativas entre os dois. Todos os experimentos passaram por rigorosa validação metodológica. A precisão, estabilidade e concordância entre métodos do sistema de detecção atenderam aos padrões esperados em um l...
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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Freezer de temperatura ultra-baixa a -80 °C | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | Armazenamento de longo prazo de amostras de soro em baixa temperatura |
| Kit ELISA para adiponectina (ADPN) | R&D Systems (USA) | DY1065 | Detecção quantitativa da concentração sérica de ADPN |
| Analisador bioquímico automático | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | Detecção de glicose em jejum, insulina e hemoglobina glicada |
| Leitor automático de microplacas | Tecan (Suíça) | Infinite M200 Pro | Medição da absorbância a 450 nm em experimentos de ELISA |
| Kit de detecção de glicose sanguínea | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | Detecção da glicose sérica em jejum pelo método da glicose oxidase |
| Analisador de imunoensaio por quimioluminescência Cobas e601 | Roche (Alemanha) | Cobas e601 | Detecção eletroquimioluminescente de testosterona e IL-6 séricas |
| Tubo de criopreservação sem enzimas | Axygen (USA) | MCT-150-C | Fracionamento de amostras de soro, armazenamento em temperatura ultra-baixa a -80 °C |
| Pipeta Eppendorf Research plus | Eppendorf (Alemanha) | Research plus 0,5-1.000 μL | Aspiração de soro, pipetagem de RNA/reagentes, fracionamento de amostras |
| Kit para hemoglobina glicada (HbA1c) | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | Detecção de HbA1c sérica por cromatografia líquida de alta eficiência |
| Kit de detecção de IL-6 | Roche (Alemanha) | 5200057190 | Quantificação da interleucina-6 sérica |
| Kit de detecção de insulina | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | Detecção da insulina sérica em jejum por imunoturbidimetria |
| Kit ELISA para leptina (LEP) | R&D Systems (USA) | DY398 | Detecção quantitativa da concentração sérica de LEP |
| Centrífuga de alta velocidade e baixa temperatura | Xiangyi Instrument (China) | TDZ5-WS | Centrifugação de amostras nas forças centrífugas especificadas |
| Kit miScript SYBR Green PCR | Qiagen (Alemanha) | 218073 | Verificação da consistência metodológica para detecção de miRNA |
| Kit de transcrição reversa PrimeScript RT | TaKaRa (Japão) | RR036A | Transcrição reversa de miRNA para síntese de cDNA |
| Instrumento de PCR quantitativo em tempo real com fluorescência | Applied Biosystems (USA) | 7500 | Amplificação por qRT-PCR de miRNA e detecção de fluorescência |
| Kit ELISA para proteína transportadora de retinol 4 (RBP4) | R&D Systems (USA) | DY6005 | Detecção quantitativa da concentração sérica de RBP4 |
| Software estatístico SPSS | IBM (USA) | 25 | Teste de normalidade dos dados, comparação entre grupos, análise de correlação e análise ROC |
| Kit SYBR Premix Ex Taq II | TaKaRa (Japão) | RR420A | Amplificação por PCR quantitativo com fluorescência de miRNA |
| Kit de detecção de testosterona (T) | Roche (Alemanha) | 5200067190 | Quantificação dos níveis séricos de testosterona |
| Reagente TRIzol para extração de RNA total | Invitrogen (USA) | 15596026 | Extração de RNA total de amostras de soro |
| Tubo de coleta de sangue a vácuo sem anticoagulante | BD Biosciences (USA) | 367812 | Coleta de sangue venoso cubital em jejum para separação de soro |
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