Medindo os Efeitos de Compostos Farmacológicos na Morfologia Mitocondrial em Modelos de Envelhecimento de Camundongos

Resumo

Este protocolo descreve métodos para medir os efeitos de medicamentos administrados por meio de minibombas osmóticas implantáveis na morfologia mitocondrial em modelos de camundongos envelhecidos. É realizada uma imagem confocal tridimensional (3D) de super-resolução dos fígados de camundongo, e é desenvolvido um pipeline para segmentação imparcial, classificação e análise quantitativa das estruturas mitocondriais.

Resumo

O acúmulo de danos moleculares relacionados ao envelhecimento pode contribuir para mudanças na morfologia mitocondrial e na disfunção metabólica, especialmente em tecidos com alto gasto energético. Compostos farmacológicos que melhoram a disfunção metabólica e restauram morfologias mitocondriais saudáveis e 'novas' podem, assim, representar modalidades eficazes para estender a vida útil (ou seja, a parte da vida livre do peso de doenças crônicas relacionadas ao envelhecimento) em mamíferos. Aqui, são descritos métodos para realizar implantações de bombas osmóticas subcutâneas em camundongos idosos para a entrega estável de compostos farmacofóbicos hidrofóbicos. Em seguida, os tecidos são fixados, criossecados, corados e imaginados usando microscopia confocal de super-resolução. Por fim, é apresentado um pipeline automatizado para segmentação tridimensional, classificação e medição quantitativa de estruturas mitocondriais. Assim, esses métodos podem ser úteis para avaliar quantitativamente mudanças na estrutura tridimensional mitocondrial em diferentes tecidos ao longo da vida do camundongo. Além disso, essas técnicas podem auxiliar na identificação reprodutível de medicamentos de pequenas moléculas que mitigam a disfunção metabólica relacionada ao envelhecimento.

Introdução

Mitocôndrias são organelas duplas de membrana, organizadas espaço-temporalmente para atender às demandas metabólicas atuais de sua célula hospedeira e^{do tecido 1}. Invaginações na membrana interna, chamadas cristas, são formadas e organizadas por meio de uma coordenação dinâmica entre fosfolipídios da membrana interna não bilayer, como cardiolipina e fosfatidiletanolamina, fileiras de dímeros de ATP sintase nas pontas das cristas, oligômeros ligadores à cardiolipina da GTPase Óptica Atrófia 1 (OPA1) semelhante a dinamina no topo das cristas, e complexos Mitocondrial Contact Site e Sistema Organizador de Cristae (MICOS) nas junções^{das cristas 1}. Essas estruturas de membrana interna subcompartimentalizam as mitocôndrias em unidades funcionais^{individuais 2} e fornecem maior área de superfície sobre a qual os complexos respiratórios produtores de potencial transmembranar mitocondrial podem^{se formar 1}. Como organelos dinâmicos com funções celulares secundárias relacionadas à sinalização^{apoptótica 3}, Ca²+ e homeostase de espécies reativas^{de oxigênio 3}, e biossíntese^{lipídica 4}, as estruturas morfológicas mitocondriais são altamente sensíveis a mudanças ambientais, como diminuição da disponibilidade^{de oxigênio 5} e aumento da liberação de Ca²⁺ pelo retículo endoplasmático ^6,7.

O acúmulo de danos moleculares contribui para mudanças na estrutura e função mitocondrial durante o^{envelhecimento de 8} anos. Estudos pioneiros de criotomografia eletrônica (crio-ET) conduzidos pelo grupo de Kühlbrandt em vários organismos modelo demonstraram uma clara correlação entre densidade de cristas e capacidade respiratória, bem como uma diminuição dependente da idade na densidade de cristas e a perda associada de dímeros de ATP^{sintase 9,10}. Além disso, alterações no volume mitocondrial podem resultar de fissão mitocondrial comprometida e dinâmica^{de fusão 11}, aumento do acúmulo^{lipídico 12} e aumento do inchaço¹³. No músculo esquelético, VO₂ max, que é um forte preditor da expectativa de vida^14,15, pode ser previsto com precisão com base no grau de fragmentação mitocondrial intermiofibrilar e na densidade das^{cristas 16}.

Não surpreendentemente, mudanças estruturais e funcionais relacionadas ao envelhecimento nas mitocôndrias podem contribuir para a patogênese de várias doenças^crônicas 17,18,19,20. O aumento da fragmentação mitocondrial e alterações na biogênese e morfologia mitocondrial estão associados tanto à doença de Alzheimer quanto à doença de Parkinson²⁰. Essas mudanças resultam em perturbações nos complexos de fosforilação oxidativa, prejudicando a geração da força motriz do próton e levando à produção excessiva de espécies reativas de^oxigênio 20,21,22. Em disfunção cardíaca relacionada ao envelhecimento e insuficiência cardíaca, o aumento da fragmentação mitocondrial, inchaço, vacuolização e perda de densidade das cristas contribui para a diminuição da produção de^{ATP 23,24}. Essas alterações estruturais podem estar em parte relacionadas ao manuseio alterado do Ca²+ mitocondrial e ao aumento da atividade do poro de transição da permeabilidade^mitocondrial 6,7,13,25. Como um possível regulador da mitofagia, a abertura excessiva do poro de transição de permeabilidade durante o envelhecimento pode, em vez disso, ser destrutiva e levar à morte celular descontrolada¹³. Por fim, sabe-se que déficits relacionados ao envelhecimento no metabolismo lipídico mitocondrial e na mitofagia também podem contribuir para o desenvolvimento da doença hepática gordurosa^{não alcoólica 26}. Em particular, a esteatose hepática tem demonstrado ser acompanhada por aumento do estresse oxidativo e maior formação de estruturas mitocondriais semelhantes a^{donuts 3,27}.

Consequentemente, há considerável interesse em desenvolver terapias que visem as quedas relacionadas ao envelhecimento na função mitocondrial para melhorar a qualidade de vida de indivíduos que sofrem de certas doenças crônicas. A Forzinity (elamipretida), um peptídeo interativo lipídico que atenua o potencial superficial da membrana^{interna 28} e aumenta a geração^29,30 de ATP mitocondrial, tornou-se recentemente o primeiro medicamento aprovado pela FDA para o tratamento da síndrome de Barth. A síndrome de Barth é um distúrbio ligado ao cromosoma X no qual defeitos na remodelação da cardiolipina contribuem para cardiomiopatia, fraqueza dos músculos esqueléticos e mortalidade^{prematura 31}. Embora o tratamento de curto prazo não tenha produzido mudanças detectáveis na idade biológica muscular em camundongos^{idosos 32}, o tratamento com elamipretida mostrou melhorias repetidas nos parâmetros funcionais do envelhecimento, como fração de ejeção cardíaca e tensão longitudinal^{global 32,33}, fadiga muscular e geração^{de força} 33,34,35 e ^{fragilidade 32}. A urolitina A, uma ellagitanina derivada do intestino que induz^{mitofagia 36}, também apresentou melhorias clínicas na resistência e força muscular^{aeróbica 37,38}, além de efeitos positivos sobre disfunção cardíaca em camundongos idosos e modelos de insuficiência cardíaca induzida em^{ratos 39}. A metformina, um medicamento antidiabético que foi comprovado interagir com o Complexo I⁴⁰, também foi sugerido atuar como um mimético parcial da restrição calórica^41,42. No entanto, embora o tratamento com metformina tenha sido associado a redução do risco de câncer e declínio cognitivo atrasado em dados epidemiológicos^{anteriores 43,44}, seus efeitos sobre a saúde e a vida em pacientes não diabéticos ainda são uma questão em^{aberto 45}. Por fim, o tratamento com ribosídeo de nicotinamida, um precursor de NAD+, pode aumentar a biogênese mitocondrial e a resposta proteica desdobrada mitocondrial para melhorar a geração^{de energia 46,47,48,49}, mas seu tratamento a longo prazo em camundongos UM-HET3 não teve efeito significativo na mediana do camundongo ou na expectativa de vida do percentil^{90 50}.

Aqui, são descritos métodos para preparar tecidos de camundongos envelhecidos tratados com compostos farmacológicos para imagem confocal de superresolução da morfologia mitocondrial. A implantação bem-sucedida de minibombas osmóticas para entrega sustentada de medicamentos em camundongos é demonstrada, e os fígados são analisados quanto aos efeitos do tratamento na estrutura da membrana externa. Por fim, é apresentado um pipeline de análise para medição quantitativa imparcial e reprodutível do volume mitocondrial, área superficial e esfericidade, bem como classificação das mitocôndrias em diferentes estruturas. Assim, esses métodos são aplicáveis tanto para estudar mudanças na morfologia mitocondrial ao longo da vida dos mamíferos quanto para identificar compostos farmacológicos que possam mitigar os declínios metabólicos relacionados ao envelhecimento.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais de pesquisa foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais para o uso de animais de laboratório e aprovados pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional de Animais do Brigham and Women's Hospital e da Harvard Medical School sob o Protocolo nº 2016N000368. Pesquisadores interessados em aplicar esse protocolo em outros países devem consultar seus órgãos institucionais e reguladores locais para garantir o cumprimento das regulamentações de bem-estar animal aplicáveis.

1. Implantação da bomba osmótica subcutânea

NOTA: Cirurgias em animais devem ser realizadas apenas por profissionais experientes e treinados, e um cuidado extremo deve ser tomado para minimizar o estresse e/ou sofrimento animal. Realize procedimentos envolvendo animais de pesquisa apenas conforme exatamente descrito nos protocolos aprovados para animais. Todas as pesquisas envolvendo o uso de animais devem seguir rigorosamente os 3Rs – Substituição, Redução e Refinamento. Este protocolo detalha o implante da bomba osmótica subcutânea, que é classificada como um procedimento cirúrgico menor. Implantações intraperitoneais com bomba osmótica também podem ser realizadas, mas este é um procedimento mais complexo classificado como um procedimento cirúrgico de grande porte. Portanto, recomenda-se que o procedimento subcutâneo seja realizado, a menos que haja forte justificativa científica favorável à implantação intraperitoneal.

1. Enchimento de bombas osmóticas
   NOTA: A preparação de soluções medicamentosas e o enchimento das bombas osmóticas devem ser realizados em um gabinete de biossegurança usando técnica estéril. Os modelos de bombas devem ser escolhidos com base no volume desejado do reservatório e na duração da entrega do tratamento. Para este estudo, foi utilizado o modelo 2004 (~200 μL de volume do reservatório, entrega de tratamento por 4 semanas).
   1. Prepare a solução medicamentosa em um solvente compatível com as bombas osmóticas. Consulte https://alzet.com/formulating-the-solution/. Use a taxa de fluxo (μL/h) indicada no lote das bombas osmóticas ordenadas para determinar a concentração do medicamento necessária para atingir a dosagem diária alvo.
      NOTA: Uma solução de 50% de DMSO v/v e 50% v/v_{PEG 300} solubiliza de forma estável compostos hidrofóbicos e é compatível com as bombas osmóticas. Todo(s) composto(s) e solvente(s) devem ser de grau farmacêutico sempre que possível.
   2. Filtre, esterilize a solução medicamentosa através de um filtro de seringa de 0,22 μm e mantenha em temperatura ambiente.
   3. Coloque um moderador de fluxo em uma bomba e pressione até que ele encaixe em um tubo microfuge. Não pressione o moderador de fluxo até o fim.
   4. Faça um balanço analítico em um tubo de microfuga vazio e então registre o peso da bomba osmótica.
   5. Conecte o tubo de enchimento a uma seringa de 1 mL e retire pelo menos 1,5 vezes o volume do reservatório da bomba. Remova as bolhas de ar puxando o êmbolo para baixo, estalando a seringa e empurrando-a para cima até que um líquido se forme no topo do tubo de preenchimento.
   6. Remova o moderador de fluxo enquanto segura a bomba na vertical.
   7. Insira o tubo de enchimento pela abertura no topo da bomba até que ele não possa ir mais longe.
   8. Empurre lentamente o êmbolo para baixo enquanto segura a bomba na vertical. Continue preenchendo até a solução aparecer na tomada. Depois, remova o tubo de preenchimento e limpe o excesso com um lenço delicado.
   9. Insira o moderador de fluxo até que a tampa fique nivelada com o topo da bomba.
   10. Coloque a bomba cheia de volta em um tubo microfuge e pese. Determine o peso da solução e verifique se o volume de enchimento é pelo menos 90% do volume do reservatório (diferença de peso em miligramas ≈ volume em microlitros).
   11. Encha um tubo cônico de 15 mL com 5 mL de soro fisiológico estéril 1× fosfatado tamponado (PBS) e adicione a bomba pré-preenchida. Sele com filme de parafina e prepare a(s) bomba(s) incubando(s) a 37 °C pelo tempo necessário pelo modelo de bombas osmóticas. Para o modelo 2004, isso é 40 horas.
2. Preparação de meloxicam
   NOTA: Isso deve ser realizado em um gabinete de biossegurança usando técnica estéril. Meloxicam, um anti-inflamatório não esteroide (AINE), não é uma substância controlada, mas pode exigir licença para ser adquirido.
   1. Usando uma agulha de 27 g e uma seringa Luer-lok de 3 mL, dilua a coronha de meloxicam de 5 mg/mL para 1 mg/mL usando PBS estéril em um frasco de vidro estéril de 5 mL. Prepare no dia e armazene em temperatura ambiente.
3. Preparação do local da cirurgia
   NOTA: Não é necessário realizar a implantação da bomba osmótica dentro de um gabinete de biossegurança, nem é possível manter a esterilidade durante procedimentos cirúrgicos. No entanto, o local da cirurgia deve seguir padrões rigorosos de limpeza e práticas assépticas. O local da cirurgia deve estar limpo, livre de bagunça e ter pouco fluxo de pessoas. Idealmente, há tanto um local de preparação (ou seja, para raspar e esfregar) quanto um local de cirurgia (ou seja, para realizar a implantação da bomba).
   1. Desinfete completamente a área da cirurgia com etanol 70% e sece com papel toalha.
   2. Ligue o esterilizador de esferas de vidro e ajuste para 250 °C. Deixe aquecer por 15–30 minutos.
   3. Ligue o vaporizador e ajuste a almofada térmica para 65%. Defina o peso corporal do animal e ajuste o percentual de isoflurano em 3,2%.
   4. Prenda uma das sondas de temperatura na superfície da almofada térmica. Deixe a almofada térmica aquecer até 35–37 °C.
   5. Remova a seringa do vaporizador. Coloque a aba verde até o fundo e encha com isoflurano conectando a um frasco de isoflurano e puxando o êmbolo.
   6. Reconecte a seringa ao vaporizador e prepare a seringa.
   7. Coloque uma segunda almofada térmica sob uma gaiola limpa para a recuperação. Coloque a gaiola meio colocada, meio fora do almofada térmica.
4. Implantação da bomba
   NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser limpos e autoclavados com antecedência. Para esterilizar ferramentas cirúrgicas entre animais, pode-se usar um esterilizador de contas de vidro. Isso só pode ser usado para lotes de até 5 animais. Certifique-se de incluir uma tira indicadora de autoclave para verificar se os parâmetros de esterilização foram cumpridos. O equipamento de proteção individual (EPI) adequado inclui jaleco limpo, máscara cirúrgica, luvas cirúrgicas estéreis e cobertura capilar. Animais que passam por cirurgia não devem estar na visão de outros animais.
   1. Pegue o rato pela base da cauda e coloque-o na câmara de anestesia. Desencaixe os tubos e ligue o fluxo de isoflurano (3,2%) para a câmara. Coloque duas folhas esterilizadas sobre a bolsa térmica.
   2. Espere o rato virar de lado e monitore sua respiração. Quando a respiração desacelera e relaxa, interrompa o fluxo de isoflurano para a câmara. Prenda os tubos à câmara e desencaixe os tubos do nariz para ser usado. Inicie o fluxo de isoflurano (2%) para o nariz.
   3. Retire o rato da câmara e coloque o nariz dele no cone do almofada térmica. Adicione pomada oftálmica em ambos os olhos.
   4. Pese o rato na balança e depois volte para o nariz. Determine o volume de 1 mg/mL de meloxicam a ser administrado. Para uma dosagem de 5 mg/kg, multiplique o peso do camundongo em gramas por 5 para obter os microlitros de meloxicam a serem administrados.
   5. Borrife a tampa do frasco com 1 mg/mL de meloxicam com 70% de etanol e sece com um lenço suave. Depois, usando uma seringa de insulina de 0,3 mL, prepare o volume correto de meloxicam. Remova todas as bolhas de ar da seringa.
   6. Prenda o rato com uma mão, com a cabeça inclinada para baixo. Insira a agulha em um ângulo de 30°–45° no quadrante inferior direito do abdômen, com o chanfro voltado para cima. Aspire para confirmar a colocação correta da agulha.
   7. Se não houver aspirado, pressione suavemente o êmbolo e injete meloxicam intraperitonealmente.
   8. Coloque o mouse de volta no conone do nariz e na almofada térmica. Raspe completamente 150% da área ao redor do local de implantação (meio a parte superior das costas) com aparadores cirúrgicos. Quando terminar, aspire/escove suavemente o pelo do animal e descarte a primeira folha de cabeceira.
      NOTA: Uma limpeza limpa é necessária para realizar a cirurgia asséptica. No mínimo, qualquer incisão deve estar completamente livre de pelos de animais.
   9. Posicione o rato de forma que a cabeça dele fique voltada para o cirurgião. Realize uma esfoliação alternada com povidona-iodo e 70% de etanol, utilizando aplicadores com ponta de algodão, totalizando 3 aplicações. Certifique-se de começar no meio da incisão planejada e espiralar para fora com os aplicadores com ponta de algodão.
   10. Cubra o animal com drapeados cirúrgicos estéreis com fenestras e utilize a técnica asséptica adequada para colocar as luvas cirúrgicas.
   11. Antes de fazer qualquer incisão, certifique-se de verificar cuidadosamente os reflexos dos pedais, beliscando firmemente ambos os pés com pinças de tecido. Não prossiga até depois de várias pressões, não há movimento. Isso confirma um plano cirúrgico de anestesia.
   12. Feche a pele da escápula média com pinças de tecido e faça uma incisão de 1 cm perpendicular à coluna com uma pequena tesoura cirúrgica de íris. Para fazer um corte reto, corte com a tesoura cirúrgica Iris em um ângulo de 90° em relação ao mouse.
   13. Use pequenas pinças hemostáticas dentro da incisão para espalhar o tecido subcutâneo e criar uma bolsa para a bomba. Certifique-se de que o bolso da bomba fique afastado da frente do animal e posicionado levemente para um lado dele. Use as pinças hemostáticas para soltar a pele em todos os lados da incisão.
   14. Abra a incisão com a pinça de tecido e insira a bomba usando a pinça hemostática. Insira a bomba com o moderador de fluxo entrando primeiro.
       ATENÇÃO: A bomba deve ser inserida de forma que fique suficientemente afastada da incisão, ou seja, para que a pele ao redor da incisão não fique sob tensão. Se não for posicionado corretamente, isso pode levar à deiscência da ferida. A bomba também pode mudar de posição durante a recuperação do animal.
   15. Usando a pinça de tecido, aperte suavemente a pele e puxe ambos os lados da incisão de forma uniforme. Começando por uma extremidade da incisão, use o aplicador de clipe para posicionar clipes de ferida de 7 mm ao longo de toda a incisão (podem ser necessários 2–4 clipes).
   16. Para quaisquer espaços na incisão que sejam pequenos demais para serem acomodados por outro clipe de ferida, aplique uma pequena quantidade de adesivo de tecido usando o aplicador estéril. Aperte com a pinça de tecido.
   17. Puxe e estique suavemente a pele ao redor da incisão para confirmar que a ferida está fechada. Depois, desligue o fluxo de isoflurano para o nariz e corte os tubos relevantes. Coloque os ratos na gaiola de recuperação, sobre a almofada térmica.
   18. Monitore completamente o rato até que ele acorde e fique andando. Monitore os animais frequentemente em busca de sinais de sofrimento ou dor e mantenha-os isolados de outros camundongos até que se recuperem.
   19. Após 24 horas, readministrar 5 mg/kg de meloxicam por injeção intraperitoneal. (Opcional) Para ajudar na recuperação dos animais, forneça suplementos de Electro-Gel e/ou coloque a comida no chão da gaiola.
   20. Após 10–14 dias, anestesie novamente os animais com isoflurano, aplique pomada oftálmica e retire os clipes com removedor de clipes.
       NOTA: Os clipes precisam ser removidos até esse período para evitar o crescimento dos pelos sobre os grampos da ferida. Além disso, todas as bombas osmóticas têm um período de duração definido. Certifique-se de explantar as bombas ou eutanasiar os animais até o final do período de duração. Para períodos de tratamento mais longos, múltiplas implantações de bombas podem ser realizadas consecutivamente no mesmo animal.

2. Fixação, embedding e separação de tecidos

1. Fixação dos tecidos
   NOTA: Todos os procedimentos com animais devem ser realizados por profissionais experientes para minimizar o estresse e o sofrimento animal. A câmara de eutanásia deve ser limpa e fisicamente despejada entre cada animal para remover qualquer dióxido de carbono residual. Para minimizar o estresse, os animais devem ser eutanasiados em suas gaiolas caseiras sempre que possível. Por fim, animais não devem ser eutanasiados em proximidade espacial ou à vista de outros camundongos. Ferramentas cirúrgicas limpas são necessárias para procedimentos não de sobrevivência, mas não precisam ser estéreis (ou seja, autoclaveadas).
   1. Coloque o mouse na câmara de indução e abra o regulador até que o fluxímetro atinja a vazão pretendida (~40%–70% do volume da câmara por minuto).
   2. Observe o rato durante todo o procedimento, garantindo que não haja sinais de sofrimento como pulos. Monitore a cessação da atividade respiratória e mantenha o fluxo de CO₂ por pelo menos 2 minutos após a cessação da atividade respiratória. Certifique-se de que o tempo total de exposição ao_CO2 seja de pelo menos 5 minutos.
   3. Recolha o camundongo e realize um método secundário de eutanásia, como a luxação cervical.
   4. Prenda os membros do animal a uma placa de espuma de poliestireno coberta com papel alumínio usando agulhas 23-G. Molhar o pelo borrifando com etanol 70%.
   5. Faça uma pequena incisão perto da base do abdômen e corte a pele até o pescoço. Siga essa mesma incisão para abrir a cavidade corporal e corte cuidadosamente a caixa torácica.
   6. Faça incisões em forma de U começando na base do abdômen e prenda a pele com agulhas de 23-G.
   7. Dissecar o(s) órgão(s) relevante(s) e coloque-lo em um tubo cônico de 15 mL pré-preenchido com 5 mL de paraformaldeído (PFA) a 4%. Fixe para 24 horas a 4 °C em um rotisserie.
      ATENÇÃO: A solução PFA é perigosa. Evite contato com a pele. O EPI adequado durante o manuseio inclui jaleco, luvas de nitrilo e óculos de proteção.
      NOTA: Se precisar ser perfundido sangue dos tecidos e/ou se se desejarem fixações por perfusão, realize a perfusão cardíaca conforme descrito^{anteriormente 51}. Na fixação por imersão, como realizada aqui, pode levar tempo para que o fixativo se difunda pelo tecido, especialmente em pedaços maiores de tecido. Isso pode alterar a morfologia mitocondrial; além disso, a fixação com PFA também pode fazer os tecidos^{encolherem 52}.
   8. Após 24 horas, remova a solução de paraformaldeído e enxágue os tecidos em 10 mL de 1× PBS. Realize um total de 3 vezes por 10 minutos cada em temperatura ambiente em um espetador.
   9. Remova o PBS e submerga os tecidos em 10 mL de sacarose a 30% por 48 horas a 4 °C em um rotisserie. A infiltração da sacarose é completa quando o(s) tecido(s) afundam.
      NOTA: Para verificar se o solvente foi entregue ao animal, meça a quantidade restante na bomba.
2. Incorporação de tecidos
   NOTA: Certifique-se de acompanhar a localização e orientação do tecido nos moldes.
   1. Encha um recipiente de espuma de poliestireno com gelo seco e coloque uma chapa de metal plana por cima.
   2. Coloque os moldes sobre a chapa de metal e encha de 2/3 a 3/4 até cima com composto de temperatura de corte ideal (OCT) (meio de injeção de tecido). Leve qualquer bolha de ar para a superfície ou para os cantos com um par de pinças finas. Para acelerar a taxa de congelamento, coloque alguns pellets de gelo seco diretamente sobre os moldes.
   3. Coloque um meio de injeção de tecido em um barco de pesagem e misture os tecidos nele. Tente evitar carregar qualquer solução de sacarose.
   4. Uma vez que o meio de imersão tenha congelado completamente no fundo do molde (deve ser totalmente opaco), submerga o tecido dentro do molde de modo que ele não toque nenhum lado do molde ou a superfície. Coloque no local e orientação desejados.
   5. Espere o meio de infiltração do tecido congelar completamente antes de transferir os moldes para um freezer a -80 °C.
      NOTA: (Ponto de pausa) Os tecidos embutidos podem ser armazenados por pelo menos 3 meses.
3. Separação dos tecidos
   NOTA: Para reduzir a variação da espessura da seção de lote para lote, todos os tecidos a serem analisados juntos devem ser seccionados em uma única sessão.
   1. Pegue os lenços embutidos do freezer a -80 °C e coloque-os em um recipiente de espuma de poliestireno cheio de gelo seco.
   2. Pré-resfrie a temperatura da câmara do crióstato e o suporte da amostra para -24 °C e -25 °C, respectivamente.
   3. Coloque uma lâmina microtómica nova no suporte da lâmina e insira a placa anti-rolamento. Para facilitar a limpeza, forre a câmara do criostato com papel toalha.
   4. Retire o mandil da amostra da câmara do criostato e aqueça até a temperatura ambiente.
   5. Use uma lâmina de barbear para cortar cuidadosamente cada canto do mofo. Desligue suavemente para remover o bloco de tecido que embute o meio de impressão.
   6. Pressione firmemente o bloco de tecido contra o mandril da amostra enquanto gira para frente e para trás. Uma vez firmemente aderido, coloque o chuck da amostra na câmara do crióstato por alguns minutos para congelar.
      NOTA: Certifique-se de posicionar o bloco de tecido no mandril na orientação correta, de modo que o tecido seja seccionado na orientação desejada.
   7. Quando o bloco de tecido estiver totalmente congelado ao mandril da amostra, coloque o mandril no suporte do mandril e aperte no lugar. Mova a lâmina do criostato para que fique logo na frente do bloco de tecido, sem tocá-lo.
   8. Ajuste a configuração de corte para 50 μm e comece a aparar o bloco até que uma seção transversal completa do tecido fique exposta.
   9. Desmarque a configuração de corte e defina a espessura da seção para 20 μm. Corte algumas fatias nessa espessura antes de abaixar a placa anti-rolamento. Corte devagar e suavemente por ~80%–90% da seção antes de parar.
   10. Levante a placa anti-rolagem. Retire uma lâmina de vidro carregada e pressione o lado carregado sobre a seção de tecido na posição desejada.
       NOTA: Se a seção de tecido enrolar após levantar a placa anti-rolagem, use as escovas finas para desenrolá-la.
   11. Remova o mandril do suporte do mandril. Retire o mandril do crióstato e aqueça até a temperatura ambiente. Retire o bloco de papel do mandril e coloque de volta no molde.
   12. Envolva em papel alumínio para evitar que o bloco de tecido saia do mofo e volte ao freezer a -80 °C.
   13. Coloque as seções de tecido montadas a -20 °C.
       NOTA: (Ponto de pausa) As seções de tecido podem ser armazenadas com segurança a -20 °C indefinidamente.

3. Coloração por imunofluorescência

1. Recupere as criosseções e deixe-as secar por 10 minutos a 37 °C em uma incubadora.
2. Lave as lâminas para remover o excesso de tecido para o meio de impressão.
   1. Prepare 1 L de 1× PBS contendo 0,1% v/v Triton X-100 (PBS-T)
   2. Encha 3 potes de coloração com PBS-T.
   3. Coloque os slides no suporte do slide. Submerga os slides no pote de colorimento por 10 minutos. Repita por um total de 3 vezes.
3. Bloqueie o tecido para tingir.
   1. Toque suavemente cada lâmina em um lenço lenço para secar. Deite os slides suspensos em uma caixa de slides com o tecido voltado para cima.
   2. Prepare uma solução bloqueadora de 20 mL de 1× PBS, 0,3% v/v Triton X-100 e 5% v/v de albumina sérica bovina (BSA).
   3. Pipete 1 mL de solução bloqueante em cada lâmina, garantindo que os tecidos estejam totalmente cobertos.
   4. Incube em temperatura ambiente por 1 hora.
4. Incube os tecidos com o anticorpo primário.
   1. Toque suavemente cada lâmina em um lenço lenço para secar. Use outro lenço delicado para absorver suavemente o líquido restante entre as partes do tecido.
   2. Prepare uma diluição 1:200 do anticorpo Tom20 coelho α-camundongo em solução bloqueante (200 μL por lâmina)
   3. No fundo da caixa do slide, coloque papel toalha e umedeça completamente com água.
   4. Deite os slides suspensos na caixa do slide com o tecido voltado para cima. Pipete 200 μL de anticorpo primário diluído em cada lâmina, garantindo que os tecidos estejam totalmente cobertos.
   5. Cortei pedaços de filme de parafina aproximadamente do tamanho dos deslizes de cobertura a serem usados. Corte 1 pedaço de filme de parafina para cada slide.
   6. Coloque cada pedaço de filme de parafina em cada lâmina para espalhar a diluição de anticorpos pelas seções do tecido. Feche a caixa do lâmina e incube a 4 °C durante a noite.
5. Lave as lâminas após a incubação com o anticorpo primário.
   1. Encha 3 potes de coloração com PBS-T. Recupere os slides e remova pedaços de filme de parafina.
   2. Coloque os slides no suporte do slide. Submerga os slides no pote de colorimento por 10 minutos. Repita por um total de 3 vezes.
6. Incube as lâminas no anticorpo secundário.
   NOTA: Para confirmar a marcação específica das mitocôndrias, prepare pelo menos uma lâmina de cada grupo colorida apenas com o anticorpo secundário.
   1. Toque suavemente cada lâmina em um lenço lenço para secar. Use outro lenço delicado para absorver suavemente o líquido restante entre as partes do tecido.
   2. Prepare uma diluição de 1:200 do anticorpo Alexa Fluor 568 de α-coelho de cabra e 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em solução bloqueante (200 μL por lâmina).
   3. Deite os slides suspensos na caixa do slide com o tecido voltado para cima. Pipete 200 μL de anticorpo secundário diluído em cada lâmina, garantindo que os tecidos estejam totalmente cobertos.
   4. Cortei pedaços de filme de parafina aproximadamente do tamanho dos deslizes de cobertura a serem usados. Corte 1 pedaço de filme de parafina para cada slide.
   5. Coloque um pedaço de parafilme em cada lâmina para espalhar a diluição de anticorpos pelas seções do tecido. Feche a caixa do lâmino e incube em temperatura ambiente por 4 horas, ou a 4 °C durante a noite.
7. Lave as coberturas.
   NOTA: Use pinças plásticas para pegar e manusear as capas
   1. Coloque as coberturas uma de cada vez em um béquer cheio de água quente da torneira e um detergente para vidros, como o Contrad 70. Cubra com um pedaço de filme de parafina.
   2. Sonice por 30 minutos em um sonicador de banho.
   3. Enxágue várias vezes com água quente da torneira. Depois enxágue várias vezes em água duplamente destilada. Sonice por 15 minutos no enxágue final com água dupla destilada.
   4. Coloque as coberturas em 70% de etanol e armazene. Quando estiver pronto para montar os coverslips, remova-os do etanol de 70% e deixe-os secar ao ar em uma exaustão de fumo.
8. Lave as lâminas após a incubação com o anticorpo secundário.
   1. Encha 3 potes de coloração com PBS-T. Recupere os slides e remova pedaços de filme de parafina.
   2. Coloque os slides no suporte do slide. Submerga os slides no pote de colorimento por 10 minutos. Repita por um total de 3 vezes.
   3. Toque suavemente cada lâmina em um lenço lenço para secar. Use outro lenço delicado para absorver suavemente o líquido restante entre as partes do tecido.
9. Monte nos cobertores.
   1. Adicione 2–3 gotas distribuídas uniformemente de antidesvanecedor em um slide.
   2. Para evitar bolhas de ar, pegue um coverslip #1.5 limpo e segure-o em um ângulo de 45° em relação ao ferrolho ao longo do eixo longo. Incline suavemente e devagar a capa sobre o escorregador. Repita para todos os slides.
   3. Deixe as lâminas curarem por 18–60 horas em temperatura ambiente, protegidas da luz.
   4. Armazene os slides a 4 °C protegidos da luz.
      NOTA: (Ponto de pausa) As lâminas podem ser visualizadas imediatamente após o período de cura, ou até 1 mês quando armazenadas a 4 °C. Não há necessidade de vedar as bordas. Certifique-se de usar coberturas #1.5 ou #1.5H, pois outras espessuras podem introduzir aberração esférica e reduzir a qualidade da imagem. Não use mídia de montagem com DAPI, pois o DAPI possui amplos espectros de excitação e emissão. O tempo de cura depende da espessura da amostra; aqui, 48 horas.

4. Imagem de superresolução

NOTA: Este protocolo utiliza um confocal LSM 980 de varredura pontual ZEISS Airyscan2 construído em torno de um ZEISS Axio Observer Z1 e equipado com dois tubos fotomultiplicadores multi-alcalinos (PMTs) e um detector espectral GaASP de 32 canais, um gabinete ambiental e um objetivo de contraste de interferência diferencial de óleo (DIC) III Plan Apo 63×/1.4.

1. Organize a aquisição.
   1. Adicione uma única faixa Airyscan SR e selecione o fluoróforo apropriado.
   2. Selecione a placa de 10" e os filtros passa-banda de emissão apropriados.
      NOTA: A placa de 10" é específica para este microscópio, pois também está equipada com detectores infravermelhos (IR).
   3. Selecione o(s) laser(s) apropriado(s). Defina os critérios de amostragem de Nyquist para 2 clicando em SR (o tamanho do pixel deve ser ajustado para 0,05 μm).
   4. Clique em ativar e alinhar o detector Airyscan (selecione a função de alinhamento em tempo real). Clique em parar assim que a intensidade estiver localizada no centro do ícone do detector e quando o detector estiver verde.
      NOTA: Se tudo estiver configurado corretamente, uma mensagem no lado esquerdo do software dizendo "Configurações Airyscan otimizadas com sucesso" deve aparecer.
   5. Faça o live novamente e ajuste a intensidade do laser para que haja um sinal decente, mas sem pixels saturados (clique no indicador de alcance). Clique em parar quando estiver otimizado.
      1. (Opcional) Para aumentar o sinal sem ajustar a potência do laser, aumente o ganho.
2. Realize a aquisição de dados.
   1. Clique em z-stack e verifique se o tamanho do passo está definido para 0,1 μm (ajuste se não estiver).
   2. Clique em live e defina os limites inferior e superior da pilha z.
   3. Clique em iniciar experimento.
   4. Depois que a pilha z for coletada, vá até a aba Airyscan abaixo da imagem e clique em processar 3D. Mantenha os parâmetros do filtro de Weiner de desruído usados aqui consistentes entre diferentes réplicas e grupos de tratamento.
   5. Salve a pilha z-stack processada do Airysscan.
      NOTA: Se duas trilhas Airyscan SR estiverem sendo usadas, certifique-se de que o microscópio troque as trilhas a cada quadro.

5. Criação de um pipeline automatizado para quantificar a morfologia mitocondrial

NOTA: Este protocolo descreve o desenvolvimento de um pipeline automatizado de análise de imagens para quantificação 3D da morfologia mitocondrial usando o software ZEISS arivis Pro 4.1.2.

1. Converta arquivos .czi processados pelo Airyscan para o formato .sis usando a ferramenta de conversão arivis.
   NOTA: Se a imagem completa for grande e o tempo de processamento for muito longo durante a otimização de parâmetros, corte uma pequena sub-região representativa da imagem para usar como referência de trabalho e otimizar as configurações. Essa imagem recortada deve incluir tanto mitocôndrias bem isoladas quanto regiões de maior densidade, para representar com precisão todo o campo da imagem. Uma vez alcançada a segmentação satisfatória na imagem recortada, o pipeline otimizado pode ser aplicado ao conjunto completo de imagens. Essa abordagem economizará significativamente tempo e facilitará o ajuste de todos os parâmetros sem comprometer a qualidade do pipeline.
2. Configure e otimize o pipeline.
   1. Abra uma imagem representativa (por exemplo, do grupo de controle) no software.
   2. Selecione o canal de imunofluorescência Tom20 como entrada para análise.
   3. Aplique uma etapa de redução de ruído antes da segmentação. Aqui, foi utilizado o algoritmo de aprimoramento de partículas, com diâmetro de 5,42 e força de 0,5.
      NOTA: O filtro de aprimoramento de partículas é um algoritmo de redução de ruído que preserva a estrutura, projetado para amplificar objetos compactos, aproximadamente esféricos ou alongados, enquanto suprime ruído de fundo. Ele funciona aumentando a intensidade local em uma escala espacial (diâmetro) especificada, tornando-a particularmente adequada para mitocôndrias, que aparecem como partículas ou túbulos brilhantes e isolados contra um fundo escuro. Se o valor do parâmetro de diâmetro for ajustado muito pequeno, isso aumentará o ruído, enquanto um valor muito grande desfocará objetos adjacentes. O parâmetro de força controla o grau de realço, no qual valores altos aumentam a amplificação do sinal, mas podem introduzir artefatos se ajustados muito altos. Comece pelos valores padrão e ajuste enquanto inspeciona visualmente a saída em uma região representativa de interesse. Vários métodos de redução de ruído estão disponíveis no arivis Pro. O suavizamento gaussiano é uma opção simples e rápida que reduz o ruído de alta frequência de forma uniforme, mas pode borrar detalhes estruturais finos. A filtragem mediana é melhor para preservar bordas afiadas enquanto remove o ruído de sal e pimenta. O aprimoramento de partículas (usado aqui) é preferido quando o objetivo é detectar objetos fluorescentes discretos, pois amplifica seletivamente o sinal de estruturas que correspondem à faixa de tamanho especificada. Para imagens com baixa relação sinal-ruído ou heterogeneidade significativa de fundo, pode ser necessária uma passagem de redução de ruído mais forte. Recomenda-se testar dois ou três métodos na mesma imagem representativa e comparar a qualidade da segmentação a jusante.
   4. Segmente mitocôndrias individuais usando o algoritmo Blob Finder, que detecta objetos no espaço 3D.
   5. Ajuste os parâmetros de segmentação, incluindo tamanho do objeto e limiar de sensibilidade, e inspecione visualmente a sobreposição entre os objetos detectados e a imagem com desruído para garantir uma segmentação precisa. Aqui, foram usados os seguintes parâmetros: diâmetro de 0,244 μm, limiar de probabilidade de 25% e sensibilidade dividida de 22,22%, com normalização definida para o primeiro ponto inicial.
      NOTA: Os parâmetros de segmentação dependem da resolução da imagem e do tamanho do voxel. Neste estudo, as dimensões da imagem foram de 1354 × 1354 pixels, com tamanho de pixel XY de 0,049 μm e tamanho de voxel de 0,049 × 0,049 × 0,100^{μm 3}.
3. Realize extração de recursos e controle de qualidade.
   1. Extraia parâmetros morfológicos para cada objeto detectado, incluindo volume (μm³), área superficial (μm²) e esfericidade (área superficial de uma esfera com o mesmo volume/área superficial das mitocôndrias).
   2. Exporte objetos segmentados como arquivos TIFF para validação visual.
   3. Abra arquivos exportados em FIJI ou arivis e sobreponha-os com a imagem original para inspeção visual da precisão da segmentação.
   4. Exporte medições quantitativas como arquivos individuais de planilha para cada amostra.
4. Aplique o pipeline.
   1. Salve o pipeline otimizado. Um exemplo de pipeline pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 1.
   2. Aplique o pipeline a imagens adicionais de todos os grupos experimentais do estudo.
   3. Refinar iterativamente os parâmetros de segmentação, se necessário, para garantir desempenho consistente entre todos os grupos experimentais.
   4. Uma vez finalizado, aplique o pipeline em modo batch a todas as imagens do estudo.
5. Realizar análise de dados
   1. Importe os dados exportados para o RStudio (versão 4.3.2) para análise estatística.
   2. Se não estiver instalado, instale os pacotes: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers e tidyverse.
   3. Faça upload do script (Arquivo Suplementar 2) para unir todos os conjuntos de dados, filtrar os dados (veja abaixo), plotar os valores de volume, área de superfície e esfericidade, e analisar as mitocôndrias segmentadas para proporções por subtipo de amostra.
   4. (Opcional) Filtrar mitocôndrias segmentadas com base no volume para excluir artefatos de segmentação e ruído.
      1. Para determinar os filtros apropriados, inspecione visualmente as distribuições de volume.
         NOTA: Todas as amostras apresentaram um pico pronunciado em volumes muito pequenos (abaixo de 0,0003^{μm 3}), consistente com ruído de segmentação e não com mitocôndrias reais.
      2. Para identificar o limite inferior, avalie a retenção de partículas entre os limiares candidatos (0,0009, 0,003, 0,005, 0,007 e 0,01^{μm 3}). A queda mais acentuada na contagem de partículas ocorreu abaixo de 0,003^{μm 3}, indicando que a maioria das partículas de ruído está nessa faixa. A inspeção visual confirmou que 0,003^{μm 3} correspondia à borda direita do pico de ruído.
      3. Para o limite superior, as distribuições afunilaram naturalmente bem abaixo de 10^{μm 3}; Defina esse limite para excluir grandes objetos artefactuais, como redes mitocondriais sobresegmentadas. A filtragem final reteve partículas com volumes entre 0,003 e 10^{μm 3}.
         NOTA: Este script calcula valores medianos por amostra em todas as mitocôndrias detectadas e usa esses valores como unidade de análise. Essa abordagem explica a não independência de mitocôndrias individuais dentro da mesma amostra biológica.

Resultados

O protocolo descrito acima foi realizado (Figura 1) em camundongos machos UM-HET3 de 20 meses. Os camundongos receberam um coquetel de veículo (Controle) ou um coquetel de reprogramação química (Tratado) usando minibombas osmóticas^{modelo 2004 53}. Os fígados foram então seccionados e imagados em um microscópio confocal Airyscan2 antes de processar os z-stacks usando o pipeline de análise.

As imagens de fluorescência 3D foram processadas e analisadas usando o software ZEISS arivis Pro 4.1.2. Antes da segmentação das mitocôndrias, o algoritmo de aprimoramento de partículas era aplicado para reduzir o ruído das imagens e remover luz de fundo, fora de foco, autofluorescência e/ou fluorescência originada de ligações não específicas. O aprimoramento de partículas amplifica seletivamente o sinal a partir de um dado diâmetro. Após a redução de ruído, mitocôndrias individuais foram segmentadas em 3D usando o algoritmo Blob Finder, que detecta objetos com base em máximos locais de intensidade dentro de uma faixa de tamanho definida. Por fim, a segmentação de objetos reduz cada fatia 2D a uma imagem binária.

Para ilustrar o fluxo de trabalho de segmentação, a Figura 2 apresenta fatias ópticas representativas em cada etapa do pipeline de processamento para amostras de Controle e Tratadas. A imagem de fluorescência bruta mostra o sinal Tom20 não processado, que contém uma mistura de fluorescência mitocondrial específica e fundo indesejado, luz fora de foco e autofluorescência. Após aplicar a redução de ruído por aprimoramento de partículas, o sinal de fundo foi substancialmente reduzido, e a fluorescência restante fica confinada a estruturas discretas e bem definidas (Figura 2). Isso resulta em uma representação mais limpa dos limites mitocondriais, facilitando uma segmentação precisa.

A saída da segmentação do Blob Finder é mostrada em verde. Para confirmar que as pilhas z são segmentadas com precisão, as fatias 2D com desruído e as imagens binárias segmentadas associadas foram sobrepostas (Figura 2). Se o processo de segmentação for suficientemente otimizado, deve ser observada uma colocalização forte e consistente da fluorescência mitocondrial com os objetos binários. Se o processo de segmentação for supersegmentação (ou seja, dividir mitocôndrias individuais em múltiplos objetos) ou subsegmentar (ou seja, combinar múltiplas mitocôndrias em uma só), ajuste os parâmetros de segmentação. A inspeção visual dos insets confirma segmentação de alta qualidade: objetos detectados co-localizam precisamente com o sinal de fluorescência Tom20 sem ruído, sem evidências de supersegmentação, superdimensionamento de objetos, fusão inadequada de mitocôndrias espacialmente adjacentes em objetos únicos ou geração de objetos espúrios em regiões sem qualquer sinal Tom20. Esse nível de fidelidade de segmentação foi consistentemente alcançado tanto em amostras de Controle quanto Tratadas, demonstrando que os parâmetros do pipeline otimizados no software ZEISS arivis são robustos e generalizáveis entre os grupos experimentais. Juntos, esses resultados validam a abordagem de segmentação e apoiam a confiabilidade das medições morfológicas derivadas dela.

Os objetos segmentados podem ser medidos para parâmetros mitocondriais, como volume, esfericidade e área superficial (Figura 3). Para considerar o grande número de mitocôndrias detectadas por amostra biológica e a independência de organelos individuais dentro de uma célula, valores medianos por amostra foram calculados e usados como unidade de comparação estatística. As diferenças entre grupos foram avaliadas usando o teste de Wilcoxon. Amostras tratadas apresentaram volume e área de superfície mitocondrial significativamente maiores em comparação aos controles, indicando que a reprogramação química induz uma remodelação substancial da morfologia mitocondrial.

Por fim, as mitocôndrias segmentadas podem ser classificadas em diferentes subtipos ^54,55 (Figura 4). O método do^{cotovelo 56} foi usado para determinar o número ótimo de agrupamentos para agrupamento k-means ^57,58 (Figura 4A). Depois, usando k = 4 agrupamentos, subamostras aleatórias de mitocôndrias para grupos Controle e Tratado foram plotadas por meio de aproximação e projeção de variedade uniforme (UMAP) redução de dimensionalidade (Figura 4B), coloridas tanto pelo subtipo mitocondrial (à esquerda) quanto pelo grupo de tratamento (à direita). Por fim, as proporções de cada subtipo mitocondrial (Figura 4C) para os grupos Controle e Tratado foram plotadas. No grupo de tratamento, houve menos mitocôndrias fragmentadas, mas nenhuma mudança significativa na proporção de mitocôndrias em rede ou alongadas.

Figura 1: Visão geral do protocolo. Os camundongos são tratados com medicamentos ou veículo por até 6 semanas utilizando implantação subcutânea de minibomba osmótica (1). Após o tratamento, os tecidos do camundongo são fixados, infiltrados com sacarose, incorporados em composto OCT e criossecados (2). As seções do tecido são então coradas com anticorpos contra Tom20 e anticorpos secundários marcados com Alexa Fluor 568 (3). Os pilhões z de superresolução são coletados em um microscópio confocal de varredura pontual Airyscan2 (4), e os pilhões z processados sem ruído são segmentados em arivis para quantificar a morfologia mitocondrial (5). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Pipeline automatizado para segmentação mitocondrial e análise morfologica.
Fatias ópticas únicas representativas de amostras de Controle (painéis superiores) e Tratadas (painéis inferiores). O sinal de imunofluorescência Tom20 é mostrado em cinza (à esquerda). A mesma imagem após a redução de ruído é exibida em cinza, seguida pelo resultado de segmentação que destaca objetos mitocondriais detectados em verde. A imagem fundida mostra a sobreposição entre o sinal com desrudo e objetos segmentados. Os insertos mostram vistas de maior ampliação das regiões indicadas, ilustrando os efeitos da redução de ruído e a precisão da segmentação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Morfologia mitocondrial nos grupos Controle e Tratado. Gráficos de caixa mostram a faixa mediana ± interquartil dos valores medianos por amostra (n = 10 por grupo). Cada ponto representa uma amostra biológica, resumida como a mediana de todas as mitocôndrias detectadas dentro dessa amostra. Volume e área de superfície são exibidos em uma escala_{logarítmica 10} . Os grupos foram comparados usando testes de soma de ranks de Wilcoxon. Níveis de significância: ns p ≥ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Classificação morfométrica não supervisionada de subtipos mitocondriais. (A) Gráfico do cotovelo mostrando a soma total de quadrados dentro do aglomerado (WSS) em função do número de aglomerados (k), calculado em uma subamostra aleatória de 10.000 mitocôndrias. O ponto de inflexão em k = 4 foi selecionado como o número ótimo de clusters para análise a jusante. (B) (Esquerda) Redução da dimensionalidade UMAP das características morfométricas mitocondriais (n = 20.000 mitocôndrias amostradas aleatoriamente), colorida por subtipo atribuído. Quatro subtipos morfologicamente distintos foram identificados: fragmentados (pequenos, alta esfericidade), alongados (longos, baixa esfericidade), em rede (grandes, irregulares) e intermediários. (Direita) Projeção UMAP colorida por grupo experimental (Controle vs. Tratado) mostrando a distribuição de cada grupo ao longo do espaço morfológico. (C) Proporções por amostra de cada subtipo mitocondrial em cada grupo experimental. Cada ponto de dados representa uma amostra biológica (n = 10 por grupo). Gráficos de caixa mostram a faixa e mediana interquartil, com bigodes se estendendo até 1,5 vezes a faixa interquartil. Proporções de subtipos foram comparadas entre grupos usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon, e os valores p foram corrigidos para comparações múltiplas usando o método de Benjamini-Hochberg. NSP ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Exemplo de pipeline arivis. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Script R para quantificar a morfologia mitocondrial e populações subtipos.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

As duas etapas mais críticas para executar com sucesso esse protocolo são (i) o fechamento da incisão durante a implantação da bomba osmótica e (ii) segmentação precisa. Para o primeiro, tenha cuidado especial para criar uma bolsa subcutânea grande o suficiente para a bomba, mas não grande demais para que a bomba escorra pelo flanco do animal. Quando a incisão está fechada, a bomba deve ser colocada suficientemente longe para não induzir qualquer tensão na pele ao redor, o que pode levar à deiscência. Certifique-se de puxar a pele ao redor da incisão fechada em todas as direções para verificar se a ferida está suficientemente fechada antes de iniciar a recuperação do animal. Clipes de ferida são vantajosos porque são rápidos de aplicar e remover. No entanto, se surgirem problemas por não conseguir fechar corretamente as incisões, podem ser usados pontos interrompidos. Para o segundo, a segmentação precisa exige que você compare constantemente os resultados da segmentação com as imagens reduzidas ao ruído até que haja similaridade suficiente na imagem. As pilhas Z de animais Controle e Tratados devem ser coletadas usando os mesmos parâmetros de coleta e, preferencialmente, durante a mesma sessão de imagem. Da mesma forma, todas as etapas de processamento devem ser aplicadas a todas as imagens usando exatamente os mesmos parâmetros. O parâmetro de segmentação de diâmetro define o tamanho esperado dos objetos a serem detectados. Um bom ponto de partida é a largura média mitocondrial medida a partir de alguns objetos inspecionados manualmente usando um corte óptico. O limiar de probabilidade controla a confiança mínima de detecção necessária para que um objeto seja aceito. Valores mais baixos aumentam a sensibilidade e detectam mais objetos, mas alguns desses objetos podem ser falsos. Por outro lado, valores mais altos melhoram a especificidade, mas podem causar a perda de objetos com sinal mais baixo. Um intervalo inicial recomendado é de 25% a 30%. Por fim, a sensibilidade dividida determina o quão agressivamente objetos que tocam ou sobrepõem são separados em objetos individuais. Uma baixa sensibilidade dividida deixará as mitocôndrias agrupadas como objetos fundidos isolados. Por outro lado, uma alta sensibilidade à divisão pode resultar na super-divisão de mitocôndrias alongadas ou ramificadas em fragmentos. Valores entre 15% e 30% são razoáveis para estudos morfológicos mitocondriais típicos. Se a segmentação precisa ainda for desafiadora, a segmentação pode ser realizada usando o Mitochondria^{Analyzer 59} no FIJI⁶⁰. Um pipeline semi-automatizado para a quantificação de morfologias mitocondriais em células e tecidos usando o software Huygens Professional e um script personalizado em Python também foi recentemente^{descrito 61}.

Uma limitação é o limite de resolução do microscópio confocal Airyscan2, que é de ~150 nm em XY e ~350 nm no plano Z. Isso impede imagens de alta resolução das cristas mitocondriais, já que as distâncias entre cristas individuais são encontradas em ~40–120^nm 62,63,64. Em contraste, a depleção de emissão estimulada (STED) pode atingir limites de resolução de ~20–50 nm lateralmente e distinguir claramente cristas mitocondriais^individuais 62,63,64. Vários corantes STED foram recentemente desenvolvidos que permitem a coloração e a imagem eficazes da membrana interna mitocondrial tanto em células vivas quanto^fixas 63,64,65. Considerando que a análise das morfologias das cristas pode fornecer insights sobre a saúde bioenergética mitocondrial¹⁰, tais dados são, portanto, desejáveis. No entanto, a morfologia mitocondrial difere fortemente entre tecidos de mamíferos e cultura celular (discutida em detalhes abaixo), e atualmente não existe metodologia para colorir a membrana interna dos tecidos para imagens STED e análise de estruturas das cristas.

Quantificar a morfologia mitocondrial em tecido intacto apresenta desafios únicos em comparação com sistemas de cultura celular. Em células cultivadas, as mitocôndrias são tipicamente distribuídas por todo o citoplasma em redes bem separadas, com sobreposição mínima entre as células. Em seções de tecido ou preparações de montagem inteira, entretanto, as células são densamente compactadas e seus limites não são bem definidos. Se for necessária análise em nível celular, deve ser incorporado um marcador fluorescente adicional direcionado à membrana plasmática ou um marcador específico do tipo celular, juntamente com uma etapa correspondente de segmentação na pipeline de análise de imagens para definir limites individuais das células antes da quantificação da morfologia mitocondrial. Uma segunda diferença importante é que, em células cultivadas, as mitocôndrias frequentemente formam redes reticulares contínuas e interconectadas, fáceis de visualizar e interpretar. Em tecidos, esse padrão é raramente observado. Por exemplo, mitocôndrias de seções hepáticas apresentam um padrão de pontuados, bastonetes e feixes que ocupa todo o^{citosol 66}. No entanto, hepatócitos em cultura apresentam morfologias tubulares com formações claras de redes⁶⁶. De forma semelhante, ao comparar mitocôndrias de tecido liso com as de células musculares lisas em cultura, são observadas diferenças distintas em suas morfologias e padrões de^{rede 67}. A arquitetura tridimensional, combinada com diferenças específicas de tipo celular na distribuição mitocondrial, faz com que as mitocôndrias desses tecidos apareçam como pontos discretos e densamente compactos ou pequenos fragmentos, em vez de redes alongadas. Portanto, é necessária uma interpretação cautelosa dos dados ao comparar características morfológicas entre tecidos e cultura celular, já que as diferenças entre as duas podem ser parcialmente atribuídas ao contexto de imagem e não à verdadeira variação biológica.

Um destaque desse protocolo é a capacidade de medir quantitativamente estruturas mitocondriais em tecidos usando microscopia óptica. Embora existam outros métodos para quantificar a morfologia mitocondrial a partir de imagens de microscopia óptica de super-resolução, muitos deles são adequados apenas para células em cultura. Além disso, em contraste com outros métodos de análise, o pipeline apresentado aqui é totalmente automatizado, quantifica tanto as dimensões mitocondriais quanto as proporções dos subtipos, e requer pouca experiência em codificação para ser executado com sucesso. Microscopia eletrônica de varredura/transmissão (SEM/TEM) e crio-ET já foram usados anteriormente para imagens de estruturas mitocondriais em tecidos em 2D e 3D^{10, 68, 69}. No entanto, para o primeiro, há preocupações sobre a preservação de estruturas nativas após fixação da amostra, desidratação e incorporação ^70,71. Além disso, a medição manual dos parâmetros mitocondriais no FIJI⁶⁰ às vezes é o método de análise preferido para imagens^{TEM 72}, o que exige trabalho significativo e pode levar a viés da amostra. Métodos de aprendizado profundo para quantificação automatizada de morfologias mitocondriais a partir de imagens TEM, no entanto, foram recentemente^{descritos 73,74}. Uma vantagem da abordagem apresentada é que, uma vez estabelecido o pipeline de análise, ele pode processar imagens em lote com pouca ou nenhuma entrada do usuário. Para o segundo, o congelamento em alta pressão pode preservar estruturas tecituais em condições próximas às^{nativas 75}. No entanto, o congelamento de amostras crio-ET, seccionamento, fresagem, coleta de dados e processamento de dados exigem treinamento extensivo e equipamentos altamente avançados. Em contraste, a microscopia confocal de superresolução é relativamente mais acessível e requer menos treinamento e recursos para ser executada com sucesso.

Implantações de bombas osmóticas podem ser realizadas com segurança em camundongos idosos para avaliar os efeitos de diferentes compostos farmacológicos sobre o declínio da função fisiológica relacionado ao envelhecimento. Além disso, os métodos descritos aqui são generalizáveis para muitos órgãos diferentes. É bem caracterizado que declínios relacionados ao envelhecimento na função metabólica contribuem para doenças e surgem da disfunção mitocondrial, uma das marcas coloquiais do^{envelhecimento aos 76} anos. Além disso, entende-se que as estruturas mitocondriais informam a capacidade bioenergética e o estado metabólico^{mitocondrial 77,78}. Assim, avaliar quantitativamente os compostos quanto a seus efeitos na estrutura mitocondrial durante o envelhecimento dos camundongos, utilizando os métodos descritos aqui, pode ajudar na identificação de terapêuticas que possam prolongar a saúde humana.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Airyscan2 point scanning confocal microscope	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm.
Folha de alumínio	Essendant	BWK7112
Balança analítica	Mettler Toledo	MR204
Placa de vidro anti-rolamento	Gel Company	LGI70
Software Arivis Pro	ZEISS	Versão 4.1.2
Sonicador de banho	Branson Ultrasonics	71020-MT
Álbumina sérica bovina	Research Products International	A30075
Tubo de centrífuga, 15 mL	CELLTREAT	229411
Lâminas de microscópio carregadas	Globe Scientific	1358W
Removedor de clipe	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Aplicadores de algodão	Puritan Medical	25-8061WC
Criostato	Leica Biosystems	CM3050 S
Lâminas de criostato	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Prepare para 5 mg/mL em ddH2O, alíquotas e armazene a -20 °C protegido da luz
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Sistema de coloração de lâminas EasyDip	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Moldes de incorporação, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mm	Polysciences	18646A-1
Etanol, 200 prova	Decon Labs	V1001
Folhas de drapê estéril fenestrada	Dukal	20001
Pinças finas	Fine Science Tools	11445-12
Esterilizador de contas de vidro	VWR	75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Almofada de aquecimento	CVS	215313
Pinças hemostáticas	World Precision Instruments	501705
Óleo de imersão Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Câmara de indução	World Precision Instruments	EZ178
Seringas de insulina, 0,3 mL	BD	328431
Tesouras cirúrgicas Iris	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Isoflurano	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Seringas Luer-Lok 1 mL	BD	309628
Seringas Luer-Lok 3 mL	BD	309657
Seringas Luer-Lok 50 mL	BD	309653
Meloxivet (meloxicam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Tubo de microcentrífuga, 1,5 mL	CELLTREAT	229443
Caixa de lâminas de microscópio	Heathrow Scientific	15994E
Vidro de cobertura de lâminas de microscópio, #1.5, 22 mm ´ 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
Incubadora não-CO2	Benchmark Scientific	H2200-H
Folhas de drapê estéril não fenestradas	Dukal	20-002
Composto OCT	Sakura Finetek USA Inc	4583
Pomada oftálmica	Patterson Veterinary	07-888-2572
Minibombas osmóticas	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldeído, 4% p/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1´	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
Filtros de seringa PES, 0,22 µm	CELLTREAT	229747
Barra de iodo de povidona 10% USP	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Anticorpo anti-Tom20 de coelho	Novus Biologicals	NBP2-67501
Lâminas de barbear, 0,22 mm	VWR	55411-050
Rotator/rotisserie	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	versão 4.3.2
Balança	Fisher Scientific	S72422
Sistema de anestesia de baixo fluxo SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01
Fitas indicadoras de esterilização a vapor	Crosstex	SIS-250
Vials de vidro estéril, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Agulhas estéreis, 0,5", 23 G	BD	305145
Agulhas estéreis, 0,5", 27 G	BD	305109
Bolsas de esterilização	Cardinal Health	92510
Sacarose	Sigma-Aldrich	S9378	Prepare uma solução de 30% p/v em 1´ PBS
Tesouras cirúr