Aqui apresentamos um protocolo de dissecação que preserva a glândula pineal, a qual é frequentemente perdida quando o cérebro é removido da cavidade craniana. Este protocolo garante a retenção da glândula pineal em preparações de cérebro de camundongos embrionários e pós-natais iniciais para aplicações posteriores, incluindo imunohistoquímica, hibridização in situ e transcriptômica espacial.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Preservação da Glândula Pineal em Preparações de Cérebro de Camundongo Perinatais
Neste artigo
Resumo
Resumo
A glândula pineal, uma estrutura neuroendócrina que secreta melatonina, forma-se a partir de uma anlage na linha média dorsal do prosencéfalo embrionário. No dia embrionário (E) 14,5 no camundongo, observa-se um divertículo pineal protrudindo do teto do diencéfalo entre as vesículas telencefálicas pareadas. Este divertículo está em estreito contato com o tecido cartilaginoso, meníngeo e vascular subjacente. É facilmente perdido quando a abóbada craniana é aberta para extrair o cérebro em estágios embrionários tardios ou pós-natais iniciais. Apesar do seu importante papel neuroendócrino, o desenvolvimento inicial da glândula pineal e os mecanismos de sinalização que regulam esse processo permanecem pouco compreendidos, em parte devido à dificuldade de preservar esta estrutura intacta durante as fases embrionárias do desenvolvimento cerebral do camundongo.
Este artigo apresenta um procedimento inovador de dissecção que preserva a glândula pineal mantendo sua integridade estrutural e sua ligação com o teto do diencéfalo durante o isolamento do cérebro desde estágios embrionários até o dia pós-natal (P) 7. O procedimento é demonstrado utilizando um cérebro de camundongo E18,5 e, portanto, é adequado para aplicações posteriores que exigem a preservação da arquitetura tecidual, incluindo hibridização in situ, imunohistoquímica e transcriptômica espacial. O protocolo também pode ser usado para isolar a glândula pineal em desenvolvimento, melhorando assim a representação específica da pineal em análises transcriptômicas e proteômicas, o que seria desafiador devido ao seu pequeno tamanho.
Introdução
A glândula pineal é uma pequena estrutura neuroendócrina localizada na linha média dorsal do cérebro dos vertebrados e desempenha um papel central na regulação da fisiologia circadiana por meio da secreção rítmica de melatonina1,2. Durante a embriogênese de mamíferos, a glândula pineal origina-se da linha média dorsal do prosencéfalo em desenvolvimento. Em camundongos, o desenvolvimento da glândula pineal começa quando uma região especializada do neuroepitélio diencefálico dorsal forma o anlage pineal/recesso pineal, que posteriormente evagina para formar o divertículo pineal no dia embrionário (E) 14,53,4,5. Este divertículo está ligado ao teto do diencefalo e é visível entre as vesículas telencefálicas pareadas. À medida que o desenvolvimento progride, esse divertículo associa-se estreitamente com estruturas sobrejacentes na linha média dorsal do cérebro, em particular com o seio sagital superior (SSS) e o seio transverso (TS), canais venosos que percorrem a superfície dorsal do prosencéfalo6. A glândula pineal em desenvolvimento situa-se imediatamente abaixo da intersecção do SSS e do TS, e sua delicada ligação com o diencefalo dorsal é particularmente vulnerável quando as estruturas vasculomeningeais sobrejacentes são removidas para extrair o cérebro da cavidade craniana7. Isso torna a glândula pineal especialmente suscetível a danos, podendo ser arrancada quando a cavidade craniana é aberta para a extração do cérebro. Como resultado, a glândula pineal é frequentemente perdida durante dissecações rotineiras, o que limita a análise de sua estrutura e composição molecular em preparações intactas.
Aqui, descrevemos um protocolo passo a passo para dissecar o cérebro de camundongo preservando a glândula pineal e sua fixação ao teto do diencéfalo. O método é aplicável a estágios embrionários a partir de E16.5 até os estágios pós-natais iniciais (P7) e é adequado para estudos do desenvolvimento da glândula pineal utilizando hibridização in situ, imunohistoquímica e transcriptômica espacial. Como demonstração de aplicações posteriores, são apresentadas a hibridização in situ e a imunohistoquímica para o marcador enriquecido na pineal CRX.
A inovação principal deste método é que o estresse sobre as estruturas da linha média é minimizado ao remover cuidadosamente as ligações físicas que, de outra forma, causariam o desprendimento da glândula pineal quando o cérebro é retirado da cavidade craniana. Esta é uma melhoria em relação ao procedimento padrão.
Este método de dissecção é limitado a estágios até P7 porque a ossificação progressiva da abóbada craniana durante o desenvolvimento pós-natal inicial aumenta a rigidez do crânio e fortalece sua associação com estruturas meníngeas e vasculares. Embora diversos estudos tenham descrito procedimentos de dissecção da glândula pineal em roedores adultos8, pouquíssimos se concentraram em preservar a glândula pineal durante estágios embrionários e pós-natais iniciais, quando a glândula é particularmente frágil e suscetível a danos durante o isolamento cerebral.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos são aprovados e conduzidos de acordo com o Comitê de Ética em Experimentação Animal da Instituição do Instituto de Pesquisa Fundamental Tata.
1. Preparação do material
- Assegure-se de que todos os instrumentos necessários para microdissecção (consulte a Tabela de Materiais) estejam preparados antes do procedimento. Esterilize todos os instrumentos utilizando etanol 70%. Para coletar preparações destinadas a aplicações posteriores, como transcriptômica espacial/hibridização in situ, limpe os instrumentos com solução de descontaminação de RNase.
- Limpe a platina do microscópio de dissecação com solução de descontaminação de RNase e mantenha um frasco de PBS 1× gelado próximo à bancada de dissecação.
- Mantenha os seguintes instrumentos e material plástico prontos antes deste procedimento:
- Para a preparação do animal, mantenha os seguintes itens prontos: 2 pares de pinças rombas, 1 par de tesouras cirúrgicas, 2 placas de Petri (10 cm), várias placas de Petri (6 cm; conforme necessário, uma para cada cabeça).
- Para o isolamento do cérebro, mantenha os seguintes itens prontos: 1 par de pinças #5, 1 par de pinças #55, 1 par de tesouras de microdissecção e tubos/placas de coleta adequados para a aplicação posterior.
- NOTA: Se a aplicação posterior envolver hibridização in situ ou transcriptômica espacial, limpe os instrumentos de dissecação com solução de descontaminação de RNase antes do uso.
2. Preparação dos animais
- Siga os passos (2.1.1–2.1.6) para animais E14.5–P0
- Eutanizie a fêmea prenhe de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Experimentação Animal da instituição. No exemplo apresentado, a fêmea foi eutanizada por dislocação cervical.
- Realize uma incisão mediana na cavidade abdominal da fêmea prenhe para expor o útero. Usando pinças rombas, retire suavemente os cornos uterinos e coloque-os em uma placa estéril de 10 cm contendo PBS 1× gelado.
- Isole cuidadosamente os fetos individuais separando-os do saco amniótico e da placenta circundantes.
- Transfira os fetos para uma placa de Petri de 10 cm nova contendo PBS 1× gelado e mantenha-os no gelo até que cada um seja utilizado para o isolamento do cérebro. Transfira um único feto para uma placa de Petri de 6 cm contendo PBS gelado.
- Para estágios pós-natais até P7, eutanizie o filhote de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Experimentação Animal da instituição. Em seguida, prossiga a partir do passo 2.1.6.
- Usando um par de tesouras cirúrgicas, separe a cabeça do corpo de forma que o cérebro posterior permaneça incluído na cabeça, protegendo assim o cérebro anterior de danos acidentais.
- Lave a cabeça com PBS frio para remover o sangue. Transfira para uma placa de Petri de 6 cm nova contendo PBS 1× gelado. Mantenha a cabeça submersa no PBS para permitir que o sangue e detritos sejam removidos durante os passos subsequentes de dissecação.
3. Procedimento de dissecção para isolar o cérebro com a glândula pineal intacta
OBSERVAÇÃO: Todos os passos abaixo devem ser realizados utilizando um microscópio de dissecação. Ajuste a ampliação para pelo menos 2× (ou conforme necessário) para visualizar com clareza o cérebro e as estruturas circundantes durante toda a dissecação. Todo o processo de dissecação deve ser conduzido em PBS gelado para minimizar a degradação de RNA e proteínas. Para os passos 3.1–3.10, utilize a mão não dominante para segurar firmemente a cabeça e estabilizá-la durante todo o procedimento, conforme as instruções do passo 3.1. Os passos 3.2–3.9 devem ser realizados com a cabeça estabilizada pela mão não dominante e a mão dominante executando as habilidades motoras finas, iniciando com uma pinça #5 e, em seguida, alternando para pinça #55 ou tesoura de microdissecação conforme especificado em cada passo.
- Use uma pinça #5 na mão não dominante. Insira as duas pontas nas órbitas oculares com um movimento firme para baixo. Mantenha a pressão para baixo para fixar o cérebro no fundo da placa de Petri até a conclusão do passo 3.9.
NOTA: O cérebro situa-se acima das órbitas oculares e não é afetado pela inserção da pinça nas órbitas. Manter uma pressão constante para baixo estabiliza o cérebro durante toda a dissecação. - Com a mão dominante, pince e remova a pele que recobre a cabeça usando uma pinça #5.
NOTA: Nesta fase, observa-se o condrocrânio liso cobrindo o cérebro. - Remova a porção do condrocrânio que recobre o mesencéfalo e o rombencéfalo da seguinte maneira:
- Use a pinça #5 para fazer dois cortes penetrantes no condrocrânio em ambos os lados do mesencéfalo, exatamente onde este se encontra com o telencéfalo.
- Deslize uma ponta da pinça #5 tangencialmente sob o condrocrânio ao longo da linha tangencial imaginária que separa o telencéfalo do mesencéfalo. Segure firmemente e rasgue o condrocrânio.
- Continue removendo o condrocrânio até que o mesencéfalo e o rombencéfalo fiquem expostos.
- Substitua pela pinça #55. Insira uma ponta logo abaixo da borda caudal do condrocrânio que recobre o telencéfalo. Separe suavemente o condrocrânio, destacando quaisquer conexões com os tecidos vasculares e meníngeos.
- Usando uma tesoura de microdissecação, corte ao longo da linha média dorsal do telencéfalo em direção ao bulbo olfatório. Usando uma pinça #55 fechada, remova suavemente quaisquer aderências do condrocrânio ao cérebro. Separe as duas metades do condrocrânio que cobrem os hemisférios telencefálicos usando a pinça #5.
NOTA: Nesta fase, a SS é vista como uma veia vermelho-escura ao longo da margem superior do condrocrânio no cérebro, e o TS é visto ortogonalmente à SS. - A glândula pineal está logo abaixo da SS. Faça um corte na extremidade rostral da SS usando uma tesoura de microdissecação.
- Usando uma pinça #55, remova completamente a porção dorsal do condrocrânio de cada lado para expor melhor a pineal, a SS e o TS.
- Faça dois cortes no TS em ambos os lados da pineal, usando uma tesoura de microdissecação. Usando uma pinça #55, solte as aderências laterais do TS.
- Usando uma pinça #5 fechada, desprenda suavemente a porção rostral do cérebro da base do crânio ventral. Deslize a pinça fechada sob a face ventral do cérebro, soltando-o completamente.
- Armazene o cérebro com a glândula pineal intacta, conforme apropriado para aplicações posteriores.
4. Passos críticos no protocolo
OBSERVAÇÃO: O sucesso deste protocolo de dissecção depende do manuseio cuidadoso dos anexos vasculares que envolvem a glândula pineal. Os seguintes pontos são fundamentais para manter a glândula pineal intacta durante todo o procedimento de dissecção:
- Estabilize a cabeça inserindo as pontas de uma pinça #5 em ambas as órbitas oculares e mantenha uma pressão firme para baixo durante todas as etapas 3.1–3.9. Isso fornece suporte estável, evitando pressão direta sobre o cérebro.
- Durante a remoção do condrocrânio (etapa 3.3), evite puxar ou descascar em excesso, pois isso pode resultar na separação da glândula pineal do diencéfalo dorsal.
- Durante a remoção das aderências meníngeas e vasculares (etapa 3.4) e ao abrir o condrocrânio telencefálico dorsal (etapa 3.5), utilize apenas as pontas da pinça #55. A penetração profunda da pinça pode danificar a glândula pineal, que se encontra imediatamente abaixo do teto telencefálico caudal.
- Complete a secção do seio sagital superior (etapa 3.6) e a secção bilateral do seio transverso (etapa 3.8) antes de extrair o cérebro. Esses cortes aliviam a tensão na rede venosa dorsal e evitam o cisalhamento da glândula pineal durante a remoção do cérebro.
- No passo 3.9, solte suavemente o cérebro usando a pinça fechada, sem perturbar a linha média dorsal. O cérebro deve se separar livremente da cavidade craniana assim que todas as aderências meníngeas e vasculares tiverem sido liberadas.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este protocolo de dissecção permite o isolamento consistente de cérebros de camundongos embriônicos e pós-natais precoces de E16,5 a P7, com a glândula pineal preservada em sua posição anatômica nativa (Figura 1).
A remoção escalonada do condrocrânio, combinada com a limpeza cuidadosa das inserções meníngeas e vasculares, evita tensões de cisalhamento acidentais na glândula pineal. Além disso, o corte controlado do seio sagital superior (SSS) em sua extremidade ro...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Métodos padronizados de dissecção da glândula pineal foram desenvolvidos para o cérebro fetal/infantil humano, auxiliando patologistas forenses na compreensão da causa da síndrome da morte súbita infantil11. Protocolos anteriores demonstraram a remoção da glândula pineal juntamente com a vasculatura superficial, as meninges e o plexo coroide12; no entanto, métodos para reter de forma confiável uma glândula pineal intacta, anexada ao teto do diencéfalo durante as fases inici...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Todos os autores declaram não haver conflitos de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Shital Suryavanshi e à equipe do biotério do Instituto Tata de Pesquisa Fundamental pelo excelente apoio. Agradecemos ao Dr. Sundar Naganathan por gentilmente permitir o uso do microscópio estereoscópico macro zoom Olympus MVX10 em seu laboratório para a gravação do vídeo do procedimento. Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Departamento de Energia Atômica (DAE), Governo da Índia, número de identificação do projeto RTI4003 e RTI4015 (ST); bolsa ICMR-DHR SUG, GAP00303, bolsa ANRF PMECRG GAP00313 (AP).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio de campo claro | Olympus | IX73 | Qualquer microscópio de campo claro com câmera colorida é adequado. |
| Microscópio confocal | Olympus | FV3000 | Qualquer microscópio confocal ou microscópio de epifluorescência é adequado, dependendo da resolução necessária |
| Anticorpo CRX | Invitrogen | PA5-32182 | Protocolo de imunomarcação descrito em Parichha et al.9. |
| Probe CRX | Produzido sob encomenda | Produzido sob encomenda | Protocolo de hibridização in situ de Parichha et al.10. |
| Pinceta fina # 5 | F.S.T | 11251-23 | Pode ser substituída por ferramentas semelhantes de qualquer empresa. |
| Pinceta fina # 55 | F.S.T | 11255-20 | Pode ser substituída por ferramentas semelhantes de qualquer empresa. |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010023 | Pode ser substituído por itens semelhantes de qualquer empresa. |
| Placa de Petri | Corning | CLS351029 | Pode ser substituída por itens semelhantes de qualquer empresa. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9782 | A solução de descontaminação RNaseZap é uma solução para descontaminação de superfícies que destrói as RNases ao entrar em contato |
| Tesoura de mola (tesoura para microdissecção) | F.S.T | 15020-15 | Pode ser substituída por ferramentas semelhantes de qualquer empresa. |
| Microscópio estereoscópico com zoom | Nikon | SMZ745 | Qualquer microscópio de dissecação é adequado |
Referências
- Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.
- Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.
- Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.
- Rath MF, Rohde K, Klein DC, Møller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.
- Estivill-Torrús G, Vitalis T, Fernández-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.
- Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.
- Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice's pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.
- Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.
- Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.
- Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by β-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.
- Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.
- Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.
- Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
