Este estudo descreve um modelo in vitro. para avaliar os efeitos protetores do Sanqi Baiji San contra lesão das células epiteliais gástricas induzidas por etanol e seu envolvimento na sinalização relacionada a PI3K/AKT.
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Artigo de investigação
Este estudo descreve um modelo in vitro. para avaliar os efeitos protetores do Sanqi Baiji San contra lesão das células epiteliais gástricas induzidas por etanol e seu envolvimento na sinalização relacionada a PI3K/AKT.
Esse trabalho teve como objetivo esclarecer o mecanismo protetor do Sanqi Baiji San (SQBJ) contra lesão das células epiteliais gástricas induzidas pelo etanol e explorar sua potencial relevância para a úlcera gástrica (GU). A farmacologia em rede foi usada para triar os componentes ativos do SQBJ (Banco de Dados e Análise de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa [TCMSP], Biodisponibilidade Oral [OB] ≥ 20%, Semelhança de Medicamentos [DL] ≥ 0,1), mapear seus alvos (Universal Protein Resource [UniProt]), coletar alvos relacionados a GU (GeneCards/OMIM/DrugBank) e analisar alvos sobrepostos via enriquecimento e acoplamento molecular da Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG). Células da Linha Celular Epitelial Gástrica 1 (GES-1) lesionadas com etanol foram tratadas com SQBJ ou o inibidor de PI3K LY294002. CCK-8 foi usado para determinar a concentração ideal de SQBJ. Análises de farmacologia em redes identificaram 126 alvos comuns enriquecidos dentro de cascatas relacionadas a PI3K/AKT/MACK e sugeriram possíveis interações entre os principais constituintes do SQBJ e proteínas relacionadas a PI3K/AKT. Em células com dificuldade com etanol, o SQBJ aliviou a lesão celular ao reduzir a liberação de mediadores inflamatórios e o estresse oxidativo, como evidenciado pela diminuição das espécies reativas intracelulares de oxigênio e pelos níveis de malondialdeído. O SQBJ restaurou o potencial da membrana mitocondrial e o conteúdo de ATP e reduziu as alterações associadas à apoptose nos níveis de linfoma-2 de células B, clivagem de caspase-3 e proteína X associada a Bcl-2. O SQBJ também modulava marcadores de sinalização associados a PI3K/AKT e MAPK. Esses efeitos protetores foram amplamente enfraquecidos pela LY294002, sugerindo que a sinalização relacionada a PI3K/AKT está envolvida na citoproteção mediada por SQBJ. Esses achados fornecem uma base mecanicista in vitro para a possível aplicação do SQBJ em GU, embora seja necessária validação adicional em modelos animais de úlcera gástrica induzida por etanol.
A úlcera gástrica (GU) é um distúrbio gastrointestinal altamente prevalente em todo o mundo, caracterizado por inflamação localizada, erosão e ulceração da mucosa gástrica. De acordo com estimativas da análise Global Burden of Disease (GBD 2021) de 2021, a doença da úlcera péptica (PUD) continua a impor um ônus clínico e econômico substancial a milhões de pacientes globalmente. Embora a prevalência geral da PUD tenha diminuído com a ampla e extensa dependência clínica de regimes anti-infecciosos e inibidores da bomba de prótons (IBPs) supressores de ácido, essa tendência de queda se estabilizou, com uma recuperação observada em algumasregiões 1. Notavelmente, o consumo de álcool (etanol) é um fator patogênico crítico, independente da infecção por Helicobacter pylori (H. pylori) e do uso de anti-inflamatórios não esteroides (AINEs). O consumo excessivo de álcool a longo prazo danifica a barreira mucosa gástrica, acelera o desenvolvimento de úlceras e até aumenta a suscetibilidade a malignidades gástricas — tornando essa condição uma crise crítica internacionalde saúde 2. Em países em desenvolvimento, a incidência de lesão da mucosa gástrica relacionada ao álcool está aumentando devido a múltiplos fatores, incluindo o aumento do consumo de álcool e mudanças no estilo de vida, criando uma necessidade urgente de estratégias eficazes e seguras de prevenção e tratamento.
O mecanismo patológico subjacente à lesão mucosa gástrica induzida pelo etanol é multifatorial e multicamada. Ao contato direto com a mucosa gástrica, o etanol rapidamente rompe a barreira muco-bicarbonato e desencadeia um surto descontrolado de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ROS). Esse surto oxidativo subsequentemente provoca a peroxidação lipídica (marcada por elevação do malondialdeído, MDA), esgota antioxidantes endógenos no revestimento do estômago, incluindo superóxido dismutase (SOD), juntamente com glutationa (GSH), e, por fim, induz disfunçãomitocondrial 3. Evidências acumuladas indicam que a ROS intracelular induzida pelo etanol é derivada principalmente de mitocôndrias e está intimamente ligada ao colapso do potencial da membrana mitocondrial interna (Δψm) e à inibição da síntese de trifosfato deadenosina (ATP) 4. Enquanto isso, o estresse oxidativo ativa ainda mais as cascatas pró-inflamatórias sob o comando do fator nuclear kappa B (NF-κB). Essa ativação promove posteriormente a liberação massiva de mediadores inflamatórios, principalmente fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e proteína C-reativa (CRP), formando assim um ciclo vicioso de "resposta oxidativa de estresse-inflamatória"5. Com base nisso, a cascata apoptótica intrínseca impulsionada pelas mitocôndrias é desencadeada, como evidenciado por uma proporção perturbada de Bcl-2 para Bax junto com a clivagem proteolítica enzimática sequencial da proteinase específica do aspartato de cisteil-aspartato 3 (Caspase-3), que eventualmente leva à morte massiva das células epiteliais da mucosa gástrica e à formaçãode úlceras 6. Assim, o direcionamento simultâneo dos três elos patológicos centrais do estresse oxidativo, resposta inflamatória e apoptose representa uma estratégia fundamental para a intervenção eficaz da lesão mucosa gástrica alcoólica.
A via de sinalização fosfoinositida 3-quinase/proteína quinase B (PI3K/AKT) constitui um eixo regulador central que governa a longevidade celular, a proliferação e a morte programada, desempenhando uma função vital na preservação da homeostase da mucosa gástrica. Após a ativação, a sinalização PI3K/AKT fosforila múltiplos substratos a jusante inibe a atividade do fator pro-apoptótico Bad, impedindo assim a fuga mitocondrial do citocromo c, destrutivo para células, mantendo a homeostase de ΔΨm e promovendo a sobrevivênciacelular 7. Além disso, existe uma complexa intercomunicação antagônica entre a cascata PI3K/AKT e as redes de proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK): a ativação aumentada de PI3K/AKT pode atenuar a transdução do sinal inflamatório e as reações em cascata apoptótica ao inibir a ativação de quinases de estresse, incluindo p38, c-Jun N-terminal quinase (JNK) e quinases proteicas reguladas extracelularmente (ERK)8. Diversos estudos indicaram que a redução da atividade da via PI3K/AKT está intimamente associada ao agravamento da inflamação e ao aumento da apoptose em modelos de lesão da mucosa gástrica, enquanto a restauração da atividade dessa via pode melhorar significativamente a lesãomucosa 9. No entanto, atualmente há falta uma verificação experimental causal sistemática quanto ao mecanismo regulador preciso do PI3K/AKT na lesão mucosa gástrica induzida por etanol, particularmente sua relação sinérgica com a via MAPK.
Em termos de farmacoterapia moderna, os IBPs são a opção de primeira linha para o manejo clínico da GU, mas sua administração a longo prazo tem levantado crescentes preocupações com a segurança. Estudos acumulados associaram o uso crônico de IBP a uma variedade de desfechos adversos, incluindo doença renal, eventos cardiovasculares, fraturas osteoporóticas, deficiências nutricionais (ferro, magnésio e vitamina B12), infecção por Clostridioides difficile. e até um risco elevado de câncergástrico. Além disso, o fenômeno da hipersecreção de ácido gástrico de rebote após a descontinuação de IBP foi confirmado por dados de farmacovigilância em largaescala 11. Esses riscos à segurança levaram tanto as comunidades clínicas quanto as de pesquisa básica a explorar ativamente terapias alternativas com mecanismos de proteção multi-alvo, efeitos colaterais mínimos e adequação para uso a longo prazo. Em particular, preparações de compostos naturais da medicina tradicional chinesa (MTC) atraíram ampla atenção devido ao seu conceito terapêutico holístico de ação "multicomponente, múltiplo alvo e múltiplasvias" 12.
O Pó Sanqi Baiji (SQBJ) é uma fórmula clássica composta da MTC composta por Panax notoginseng e Bletilla striata em uma razão de massa de 1:1. O Panax notoginseng é bem conhecido por seus efeitos de promover a circulação sanguínea e interromper sangramentos, além de aliviar o inchaço doloroso. Seus principais constituintes bioativos, incluindo notoginsenosídeo R1 junto com ginsenósidos (Rg1, Rb1), exercem efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e reparadores da mucosa significativos. Bletilla striata é caracterizada por seus efeitos adstringentes que interrompem o sangramento, reduzem o inchaço e promovem a regeneração dos tecidos danificados. Simultaneamente, o polissacarídeo de Bletilla striata (BSP), que atua como seu principal extrato ativo, documentou eficácia na supressão da cascata MAPK JNK/p38, diminuindo assim a expressão de interleucina-1β (IL-1β), TNF-α e IL-6, além de aumentar a capacidade de defesa antioxidante da mucosagástrica 13. Evidências acumuladas na literatura confirmaram que a coadministração de Panax notoginseng. saponinas (SNP) e BSP exerce um efeito sinérgico nos modelos14 de úlceras gástricas alcoólicas, e preparações relacionadas ao SQBJ mostraram efeitos protetores mucosos significativos em estudos pré-clínicos de refluxo, esofagite e úlcera péptica15. No entanto, atualmente não há verificação experimental sistemática in vitro do mecanismo da via de sinalização subjacente ao efeito protetor da mucosa gástrica do SQBJ, especialmente do papel central da via PI3K/AKT e sua relação regulatória com o MAPK. Enquanto isso, a associação causal entre os compostos constituintes fundamentais e os receptores funcionais do SQBJ ainda não foi totalmente elucidada.
Para suprir essas lacunas, o presente estudo adotou uma estratégia de pesquisa integrada que combina farmacologia em rede e verificação experimental in vitro , empregando a linhagem celular GES-1 desafiada com etanol como plataforma experimental para investigar o potencial mecanismo molecular subjacente aos efeitos protetores epiteliais gástricos do SQBJ, com ênfase no estresse oxidativo, respostas inflamatórias, processos apoptóticos e sinalização relacionada a PI3K/AKT. e mudanças associadas ao MAPK. Primeiramente, usamos o LY294002 inibidor de PI3K para avaliar preliminarmente o envolvimento da sinalização PI3K/AKT e descobrimos que inibir essa via atenuava o efeito protetor do SQBJ, sugerindo que a sinalização relacionada a PI3K/AKT contribui para a citoproteção mediada pelo SQBJ. Em segundo lugar, exploramos a associação entre as mudanças relacionadas ao PI3K/AKT e a regulação das vias MAPK, fornecendo evidências preliminares de que mudanças na sinalização do MAPK podem estar ligadas à modulação SQBJ da resposta funcional do eixo PI3K/AKT. Coletivamente, este trabalho estabelece uma estrutura molecular invitro para avaliar como o SQBJ mitiga a lesão epitelial gástrica induzida por etanol e fornece evidências preliminares para a exploração adicional de fórmulas compostas da MTC na lesão mucosa gástrica alcoólica. No entanto, ainda são necessários experimentos com animais para confirmar se esses efeitos protetores celulares podem ser traduzidos in vivo. Eficácia terapêutica dentro de modelos experimentais de úlcera gástrica causada pelo álcool (Figura Suplementar S1).
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Este estudo não envolveu participantes humanos, amostras de tecido humano, amostras clínicas ou experimentos com animais. Recursos de banco de dados públicos e anonimizados foram usados para análise farmacológica em rede, e células GES-1 comercialmente disponíveis foram usadas para experimentos in vitro. Portanto, aprovação ética formal e consentimento informado não eram exigidos. Informações detalhadas sobre os principais reagentes, anticorpos, kits de ensaio, instrumentos, fabricantes, números de catálogo e Identificadores de Recursos de Pesquisa (RRIDs), quando aplicável, são resumidas na Tabela de Materiais.
Preparação e controle de qualidade do extrato aquoso de SQBJ
Materiais herbais
As matérias-primas de Panax notoginseng (Burk.), F. H. Chen (raiz e rizoma) e Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tubérculo) foram obtidos de um fornecedor comercial de medicina tradicional chinesa e posteriormente autenticados por um farmacêutico sênior da MTC após a Farmacopeia Chinesa (edição de 2025). Espécimes voucher (Nº SQBJ-20240301, Nº PN-20240301, nº BS-20240301) foram depositados no herbário da nossa instituição. As duas ervas foram trituradas e misturadas em uma proporção de massa de 1:1 para preparar o pó de SQBJ.
Preparação do extrato aquoso de SQBJ
O pó de SQBJ passou por duas extrações sucessivas de refluxo com água desionizada em uma proporção sólido-líquido de 1:10 (g/mL) por 1 hora por sessão. Em seguida, os extratos coletados foram combinados e passados por quatro camadas de gaze médica para remover material residual. O filtrado resultante foi concentrado sob pressão reduzida a 60 °C até atingir uma densidade relativa de 1,05–1,10, seguido por liofilização a vácuo para obter pó de extrato aquoso SQBJ, com rendimento final de extração de 18,2% ± 0,6%. O pó do extrato foi selado e armazenado a −20 °C, dissolvido em meio DMEM sem soro, e posteriormente passado por um filtro de membrana de 0,22 μm para esterilização antes dos experimentos celulares.
Controle de qualidade do extrato aquoso SQBJ
Para avaliar a consistência de lote a lote e a padronização do extrato aquoso do SQBJ, realizamos determinação quantitativa juntamente com cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e perfilamento de impressões digitais. A Tabela de Materiais lista os parâmetros técnicos abrangentes referentes ao sistema HPLC. Com base nos perfis químicos de ambas as ervas constituintes, focamos em quatro marcadores representativos: notoginsenosídeo R1, ginsenósido Rg1, ginsenósido Rb1 e militarino. No entanto, essa estratégia de controle de qualidade baseada em HPLC refletia principalmente vários constituintes representativos e não forneceu um perfil químico abrangente de todos os compostos ativos no SQBJ.
A separação cromatográfica foi alcançada por meio de uma coluna C18 de fase reversa (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). A operação foi mantida a uma temperatura de coluna de 30 °C, com vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 10 μL e comprimento de onda de detecção de 203 nm. A composição da fase móvel consistia em acetonitrila (A) e solução aquosa de ácido fosfórico (B), utilizando a seguinte elução em gradiente: 0–15 min, 19% A; 15–35 min, 19%–35% A; 35–55 min, 35%–55% A; e 55–60 min, 55%–19% A. Informações detalhadas sobre instrumentos e colunas são fornecidas na Tabela de Materiais.
Preparação de substâncias de referência
Para realizar uma análise quantitativa, adquirimos padrões comerciais para notoginsenosídeo R1, ginsenósido Rg1, ginsenósido Rb1 e militare, todos com pureza ≥ 98%. Os produtos químicos de referência individuais foram precisamente medidos e dissolvidos em um único estoque de metanol para obter uma solução de referência mista uniforme com concentração final de 50 μg/mL para cada componente.
Preparação de exemplo:
O extrato aquoso de pó seco de SQBJ (50 mg) foi medido com precisão, seguido pela dissolução usando 25 mL de metanol de grau analítico. Essa mistura passou por um tratamento de banho ultrassônico por 30 minutos sob parâmetros controlados de instrumentação (potência: 250 W; frequência: 40 kHz). Após o equilíbrio de volta à temperatura ambiente ambiente, o líquido foi passado por uma membrana de filtro orgânico de 0,22 μm para obter a solução analítica final do teste.
Resultados da determinação de conteúdo:
Os teores médios dos componentes característicos do núcleo em três lotes consecutivos do extrato aquoso SQBJ foram os seguintes: notoginsenosídeo R1 3,12 ± 0,11 mg/g, ginsenósido Rg1 8,45 ± 0,23 mg/g, ginsenósido Rb1 5,26 ± 0,18 mg/g, e militarino 2,78 ± 0,09 mg/g, com o RSD de cada componente < 5% entre os lotes, confirmando boa consistência do extrato de lote para lote.
Declaração de ética e conformidade
Nem testes em animais nem a inclusão de amostras clínicas humanas, biópsias de tecidos e sujeitos vivos estiveram envolvidos durante todo o estudo. A análise farmacológica em redes foi realizada usando bancos de dados públicos disponíveis, incluindo TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem e RCSB PDB. Todos os dados recuperados desses bancos de dados eram publicamente acessíveis e anonimizados; portanto, o perfil bioinformático estava totalmente isenta da exigência de consentimento informado formal ou supervisão ética adicional.
Os experimentos in vitro presentes foram realizados utilizando a linha celular epitelial da mucosa gástrica humana GES-1, disponível comercialmente. Nenhuma célula humana primária ou material biológico derivado do paciente foi utilizado. A linha celular foi obtida de um repositório celular autenticado e manuseada de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e cultura celular. Como esse estudo envolveu apenas linhagens celulares estabelecidas e bancos de dados públicos disponíveis, ele foi isento da aprovação formal do comitê de ética institucional. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com os requisitos institucionais relevantes de segurança laboratorial e conformidade em pesquisa.
Estudos de farmacologia em redes
Identificação e triagem de alvos de princípios ativos
Os componentes ativos de Panax notoginseng e Bletilla striata., as duas ervas constituintes do SQBJ, foram recuperados de bancos de dados públicos disponíveis. Todas as informações derivadas de bancos de dados usadas neste estudo eram de acesso público e não continham informações pessoais identificáveis. Usando nomes botânicos como consultas, identificamos fitoquímicos candidatos a partir do Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP). Para identificar moléculas bioativas elegíveis, o protocolo de triagem aplicou limiares de biodisponibilidade oral (OB) ≥ 20% e semelhança com o fármaco (DL) ≥ 0,1. Em seguida, identificamos os potenciais alvos genéticos a jusante associados a esses componentes candidatos, omitindo quaisquer constituintes sem alvos genéticos válidos correspondentes. Todos os genes-alvo foram anotados e padronizados via Universal Protein Resource (UniProt), restringindo a busca no banco de dados de referência exclusivamente ao Homo sapiens, gerando assim a lista final de genes-alvo para os componentes ativos funcionais do SQBJ.
Recuperação de alvos relacionados à patologia
Para compilar genes ligados à condição, consultamos três bancos de dados públicos: GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) e DrugBank, com "úlcera gástrica" como termo de busca. O conjunto de dados multiplataforma foi posteriormente mesclado, seguido pela eliminação de entradas redundantes para estabelecer uma lista padronizada de genes-alvo associados a úlceras gástricas.
Construção de redes para ingredientes, alvos e doenças
Determinamos a sobreposição dos genes-alvo entre os componentes ativos do SQBJ e a úlcera gástrica. Posteriormente, uma rede de interação multi-camada foi construída usando software de visualização de rede. Para avaliar a importância do nó, o algoritmo integrado de avaliação topológica calculou os parâmetros topológicos de cada nó, incluindo a centralidade de grau e intermediária. Com base nesses valores calculados, identificamos os componentes ativos e os principais alvos funcionais da SQBJ no tratamento da úlcera gástrica.
Mapeamento de redes de interação proteína-proteína (PPI)
Os alvos de consenso identificados compartilhados entre SQBJ e úlcera gástrica foram cruzados com o banco de dados STRING. Nossa consulta especificou o modelo de análise multiproteica, restringindo o contexto analítico ao Homo sapiens. Os IBPs foram filtrados com um limiar mínimo de confiança de interação de confiança média (> 0,4).
Os registros funcionais de conectividade resultantes eram exportados como um arquivo TSV, que posteriormente foi integrado a um software dedicado de visualização de redes para análise de PPI. Com base na topografia de conexão calculada, avaliamos os nós funcionais centrais da rede classificando o valor específico de grau de cada nó.
Anotação funcional a jusante e mapeamento de caminhos
Para elucidar os papéis biológicos dos nós de interseção compartilhados, realizamos análise de enriquecimento funcional da Gene Ontology (GO) e análise de enriquecimento de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), utilizando uma ferramenta de anotação bioinformática acessível na web. A classificação funcional categoriza os genes em três categorias clássicas: processo biológico (BP), componente celular (CC) e função molecular (MF). Gráficos de bolhas e gráficos de barras para resultados de enriquecimento foram gerados usando uma plataforma online de bioinformática para mapear os processos biológicos primários e as vias de sinalização associados ao efeito terapêutico do SQBJ na úlcera gástrica.
Simulação computacional de acoplamento molecular
Os arquivos de geometria espacial dos componentes ativos principais do SQBJ foram baixados de bancos de dados públicos de compostos e posteriormente salvos como arquivos MOL2 usando software de processamento de arquivos. Também obtivemos as estruturas cristalinas tridimensionais das proteínas alvo centrais consultando o Banco de Dados de Proteínas. Essas estruturas macromoleculares foram pré-processadas removendo ligantes originais e moléculas de água, e os modelos limpos resultantes foram salvos no formato PDB. Para simular a energética de ligação receptor-ligante, a verificação de acoplamento envolvendo componentes ativos centrais e proteínas alvo foi executada por meio de software padrão de acoplamento molecular computacional. Os resultados do acoplamento foram otimizados e renderizados usando software de visualização molecular.
Cultura celular
Células epiteliais gástricas de origem humana foram cultivadas utilizando meio RPMI-1640 integrado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina–estreptomicina a 37 °C sob uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂. Identificamos a cultura de origem como uma linha celular estabelecida, obtendo o estoque inicial de um repositório celular autenticado. Em uma confluência observada de 80–90%, as monocamadas foram enxaguadas 2 vezes com PBS seguidas de descolamento usando 0,25% de tripsina-EDTA por 2 minutos a 37 °C. Para encerrar a reação enzimática de clivage, introduzimos um volume igual de meio completo. A suspensão celular resultante foi centrifugada a 1.000 × g . por 5 minutos, após o que a pelota foi ressuspensa em meio fresco e completo e resemeada na densidade apropriada. As culturas foram retornadas a condições idênticas de incubação. Durante todo o período de propagação, um microscópio de contraste de fase invertido foi utilizado para avaliar a viabilidade, morfologia e status de crescimento celular, e células em sua fase logarítmica de crescimento foram rotineiramente coletadas para análises posteriores.
Estabelecimento e tratamento do modelo de lesão celular GES-1 induzido por etanol
Células GES-1 em fase logarítmica foram semeadas em 5 × 10 células de5 poços em placas de 6 poços ou 1 × 10 célulasde 4 poços em placas de 96 poços e incubadas durante a noite para aderir. A lesão induzida pelo etanol foi estabelecida ao expor células a 500 mmol/L de etanol em RPMI-1640 não suplementado por 4 horas. Essa condição foi selecionada com base em experimentos preliminares de concentração e resposta no tempo. No ensaio preliminar, 250 mmol/L de etanol por 4 horas causou apenas lesão leve, com a viabilidade celular permanecendo em aproximadamente 78,6 ± 5,4%, enquanto 750 mmol/L de etanol reduziu a viabilidade para 32,8 ± 4,7%, indicando citotoxicidade excessiva. A exposição a etanol de 500 mmol/L por 4 horas reduziu a viabilidade celular para 54,7 ± 4,9%, o que produziu lesão moderada a grave reproduzível, mantendo células viáveis suficientes para intervenções subsequentes e ensaios mecanicistas. Portanto, foi selecionado etanol de 500 mmol/L para 4 horas para o estabelecimento do modelo. Essa condição foi usada para simular lesão epitelial aguda induzida por etanol in vitro e não reproduz totalmente o padrão fisiológico de exposição da mucosa gástrica in vivo.
Para intervenção farmacológica, três concentrações de extrato aquoso de SQBJ (5, 10 e 50 μg/mL) foram selecionadas e administradas imediatamente após o desafio com etanol. No braço de inibição do PI3K, as células foram pré-incubadas com 20 μmol/L LY294002 por 30 minutos antes do co-tratamento com etanol e da concentração ótima de SQBJ. Uma coorte controle positiva recebeu 20 μmol/L omeprazol imediatamente após a exposição ao etanol. O omeprazol foi usado como agente gastroprotetor de referência, em vez de comparador de dose equivalente. A concentração foi selecionada com base em uma avaliação preliminar de citotoxicidade e nos intervalos de intervenção in vitro comumente utilizados, e tinha como objetivo fornecer uma referência farmacológica para a proteção celular. As células de controle foram mantidas em meio completo sem etanol ou agentes adicionais. Todas as incubações foram realizadas em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂ a 37 °C. Cada grupo experimental compreendia pelo menos três poços replicados, e todo o protocolo era executado independentemente 3x.
Determinação da concentração ótima de SQBJ via método CCK-8
Elementos de HGE/GES-1 em fase logarítmica foram placados em vetores de 96 poços com densidade de 1 × 104 células/poço e incubados durante a noite em meio RPMI-1640 completo sob condições padrão (37 °C, 5% CO₂) para garantir a aderência. As culturas foram randomizadas em quatro grupos: controle veicular (apenas médio completo), intervenção de SQBJ em baixa dose (5 μg/mL), intervenção em SQBJ em dose média (10 μg/mL) e intervenção em SQBJ em alta dose (50 μg/mL); essas três concentrações foram utilizadas para triagem terapêutica e preparadas dissolvendo o SQBJ em PBS. Todas as condições foram testadas em pelo menos três poços paralelos, e o protocolo total foi repetido em três lotes experimentais distintos. Após o período de tratamento designado, cada poço recebeu 10 μL do reagente CCK-8, seguido por um período de incubação de 2 h a 37 °C. A densidade óptica (OD) em 450 nm foi medida usando um leitor de microplacas. A porcentagem de viabilidade celular foi calculada como (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100%, permitindo a identificação da concentração mais eficaz de SQBJ para experimentos subsequentes.
qPCR
Elementos GES-1 em fase logarítmica foram cultivados em placas de 6 poços (5 × 10 célulasde 5 poços) e mantidos durante a noite a 37 °C em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO₂ para permitir a aderência. Em seguida, as células foram expostas à concentração ideal pré-determinada de SQBJ e colhidas no início (0 h) e 6, 12, 24 e 48 horas após o tratamento para determinar a resposta dinâmica das moléculas sinalizadoras. Com base nos resultados do curso temporal, o intervalo de 24 horas foi escolhido para ensaios mecanicistas subsequentes porque apresentou a resposta de sinalização mais forte, mantendo a viabilidade celular estável. Cada ponto de tempo era representado por três poços triplicados, e todo o experimento era repetido independentemente 3 vezes.
Isolamos o RNA total usando um reagente de extração especializado, avaliando a concentração e a qualidade do rendimento com um espectrofotômetro. Todas as amostras apresentaram uma razão de absorção A₂₆₀/A₂₈₀ dentro da faixa de 1,8 e 2,0. Um kit de transcrição reversa com limpador de gDNA foi usado para transcrever reversamente o cDNA a partir de 1 μg de RNA total. A análise por PCR em tempo real foi realizada por meio de um sistema quantitativo de PCR com primers para PI3K, AKT, p38, JNK, ERK e o gene de referência GAPDH. Detalhes do sistema de PCR, reagentes e serviço de síntese de espoletas estão detalhados na Tabela de Materiais. Os primers foram projetados para regiões específicas dos genes humanos correspondentes. Protocolo qPCR: ativação a quente a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 5 s e recozimento/extensão a 60 °C por 30 s. O cálculo da expressão do mRNA do gene alvo baseou-se no método relativo quantitativo de PCR com o método 2-ΔΔCt .
ELISA
Os supernadantes foram colhidos e eliminados por centrifugação a 1.200 × g . por 10 minutos a 4 °C para remoção de detritos celulares. Os níveis de mediadores inflamatórios (CRP, IL-6, TNF-α) e índices de estresse oxidativo (SOD, MDA, GSH) foram avaliados usando kits ELISA comerciais seguindo as instruções específicas do fabricante. Os perfis de concentração desses alvos foram verificados com formulações comerciais de ensaios conforme as instruções dos fornecedores. Cada grupo experimental compreendia três poços replicados, e o procedimento foi executado em três lotes separados de culturas celulares para confirmar a reprodutibilidade dos dados experimentais. Brevemente, 100 μL de sobrenadantes padrão ou clarificados foram dispensados em placas de reação pré-revestidas e incubados a 37 °C por 90 minutos. Após três ciclos de lavagem sucessivos, cada cavidade recebeu 100 μL do anticorpo específico de detecção para uma incubação de 60 minutos a 37 °C, seguida por mais três ciclos de lavagem. Em seguida, foi introduzida a solução substrato (100 μL), e as amostras foram protegidas da luz por 15 minutos antes de bloquear a reação enzimática com 50 μL de solução de parada. A densidade óptica em 450 nm foi detectada por meio de um leitor de microplaca. As concentrações foram interpoladas a partir das curvas padrão correspondentes. Para minimizar o viés causado por diferenças no número de células ou mudanças induzidas pelo tratamento na viabilidade celular, os perfis MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α e IL-6 foram calibrados em relação ao conteúdo proteico de cada amostra analítica, conforme determinado pelo ensaio BCA, e expressos como valores relativos em comparação com o grupo controle.
Detecção de ROS intracelular em células GES-1 usando sonda fluorescente DCFH-DA
Para quantificar os níveis de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ROS), utilizamos o indicador fluorogênico permeável à membrana DCFH-DA. As células colhidas foram ressuspensas em RPMI-1640 não suplementado contendo 10 μmol/L DCFH-DA e mantidas por 20 minutos sob condições padrão de cultura (37 °C, 5% CO₂) no escuro. Após três lavagens sucessivas com meio sem soro para sonda livre e não ligada, a intensidade da fluorescência foi monitorada por citometria de fluxo com excitação de 488 nm e emissão de 525 nm. Os níveis relativos de ROS foram relatados como a intensidade média de fluorescência para cada grupo de tratamento, normalizados para o número de células viáveis determinados em poços paralelos usando o ensaio CCK-8, e expressos em relação ao grupo controle correspondente.
Determinação do potencial da membrana mitocondrial (ΔΨm)
Avaliamos alterações no potencial da membrana mitocondrial (ΔΨm) usando um kit comercial de ensaio JC-1. Resumidamente, as células colhidas foram ressuspensas em uma solução de trabalho JC-1 recém-preparada — uma mistura de volume igual de corante JC-1 e tampão de coloração fornecidos pelo kit — até uma concentração final de célula de 1 × 106 células/mL. Após incubação por 20 minutos a 37 °C em um ambiente umidificado contendo 5% de CO₂, protegido da luz para evitar branqueamento, a amostra foi colhida por centrifugação (800 × g., 5 minutos) e enxaguada uma vez com 1 mL de tampão de coloração JC-1 gelado. A fluorescência foi posteriormente adquirida por citometria de fluxo.
Agregados JC-1 (indicativos de ΔΨm intactos) foram monitorados via canal FL2 usando comprimentos de onda de excitação de 488 nm e emissão de 590 nm, enquanto monômeros JC-1 (indicativos da dissipação de ΔΨm) foram rastreados pelo canal FL1 usando configurações de excitação de 488 nm e emissão de 525 nm. O ΔΨm foi expresso como a proporção do sinal de fluorescência vermelho para verde; valores de queda indicam despolarização mitocondrial.
Determinação do nível de ATP intracelular
A funcionalidade mitocondrial foi avaliada por quantificação intracelular de ATP usando um kit de ensaio de ATP. Uma reação bioluminescente luciferina–luciferase foi empregada para determinar o teor de ATP, que é diretamente proporcional à atividade mitocondrial. Brevemente, as células colhidas foram ressuspensas em um tampão de lise de ATP gelado e mantidas por uma janela de lise de 5 minutos no gelo. A centrifugação foi então realizada a 12.000 × g. por 5 minutos a 4 °C, após o que 20 μL do sobrenadante liberado obtido foram transferidos para microplacas opacas brancas de 96 poços. Subsequentemente, 100 μL de solução de trabalho de detecção de ATP recém-preparada — uma mistura de reagente de luciferase e substrato de luciferina preparada seguindo o protocolo fornecido — foram introduzidos em cada cavidade. O sinal de luminescência resultante era prontamente capturado com um leitor de microplacas de luminescência. Para obter níveis relativos de ATP, os valores de luminescência bruta foram normalizados para as concentrações individuais de proteína supernadante quantificadas com um kit comercial de ensaio de proteínas BCA, corrigindo assim variações no número de células.
Detecção de apoptose celular por coloração dupla com Annexin V/PI
A detecção de células apoptóticas foi realizada com uma configuração comercial de ensaio de morte celular Annexin V-FITC/PI, conforme descrito pelo fabricante. Após a lavagem, os pellets foram ressuspensos em um tampão de ligação Annexin V-FITC a uma densidade celular de 1 × 106 células/mL (195 μL por amostra). Subsequentemente, cada tubo independente recebeu 5 μL de Annexin V-FITC seguidos por 10 μL de solução de coloração PI. A amostra foi cuidadosamente vórtice e incubada no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos. Após esse processo, as células apoptóticas foram monitoradas por meio de um citômetro de fluxo. Os respectivos canais fluorescentes facilitaram a diferenciação entre células viáveis (Annexin V⁻/PI⁻), células apoptóticas iniciais (Annexin V⁺/PI⁻) e células apoptóticas/necróticas tardias (Annexin V⁺/PI⁺). A porcentagem de células apoptóticas em cada grupo foi quantificada seguindo esses parâmetros de gate.
Western blot
As membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra Bcl-2, Bax, Caspase-3 clivada, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 e GAPDH. Os anticorpos foram selecionados com base nas informações de validação para amostras humanas e aplicações com western blot. RRIDs foram adicionados para todos os anticorpos com registros disponíveis no Registro de Anticorpos ou no Portal RRID. Os níveis de proteína alvo foram normalizados para GAPDH. Após protocolos padrão de lavagem, os blots foram expostos a anticorpos secundários conjugados com HRP por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas foram detectadas usando uma solução de substrato ECL. Os valores de cinza da banda Western blot foram avaliados usando software de análise digital de imagem.
Coloração por imunofluorescência
As monocamadas GES-1 foram estabelecidas em coberturas de vidro dentro de placas de 24 poços antes dos tratamentos indicados. Após o tratamento, a fixação foi realizada utilizando paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente, seguida pela permeabilização de membrana usando 0,3% de Triton X-100 em PBS por 10 minutos, e bloqueio com albumina sérica bovina a 5% por 30 minutos a 37 °C. Os coverslips foram então transferidos para incubação durante a noite a 4 °C, com anticorpos primários direcionados para AKT, p38, JNK e ERK. Após três lavagens sucessivas de PBS, as amostras foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com um anticorpo secundário anti-coelho conjugado com fluorescência, protegido da luz. A contracoloração DAPI foi aplicada por 5 minutos para visualizar núcleos. Os coverslips foram posteriormente montados com reagente anti-descolorimento, e a coleta de dados utilizou um microscópio confocal a laser para determinar a distribuição subcelular das proteínas alvo. Todas as imagens de imunofluorescência foram capturadas sob os mesmos parâmetros de imagem, usando uma lente objetiva de 20×. Barras de escala correspondentes a 50 μm foram adicionadas a todas as imagens representativas de imunofluorescência.
Análise estatística
Os valores quantitativos são ilustrados como a média ± desvio padrão (SD), originados de pelo menos três execuções experimentais independentes, com cada amostra verificada em triplicado. As análises estatísticas foram realizadas por meio de ferramentas especializadas de análise numérica. Para determinar variações distintas entre múltiplas coortes, utilizamos análise unidirecional da variância (ANOVA) juntamente com o teste post hoc de Tukey para comparações entre grupos. Um limiar de duas caudas de P < 0,05 de significância estatística designada.
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Dissecação bioinformática dos mecanismos mediados por SQBJ em úlcera gástrica
Para explorar como o SQBJ pode exercer suas ações farmacológicas sobre a GU, inicialmente previmos os alvos correspondentes aos seus principais constituintes bioativos. Usando programação R, extraímos e eliminamos entradas redundantes entre esses componentes bioativos, resultando em 411 alvos candidatos. Posteriormente, alvos patológicos ligados a GU foram colhidos por meio de consultas às p...
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O objetivo principal desta investigação foi avaliar se o SQBJ, uma fórmula clássica composta da MTC composta por Panax notoginseng e Bletilla striata, possui atividade citoprotetora contra danos epiteliais da mucosa gástrica desencadeados por etanol dentro de um modelo celular GES-1, com envolvimento de sinalização relacionada a PI3K/AKT e redução associada em mediadores inflamatórios, indicadores de estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e eventos apoptóticos. As p...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Este estudo foi financiado pelo Projeto Geral do Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia da Medicina Tradicional Chinesa da Província de Jiangsu (2023), Número do Projeto: MS2023118.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Apoptosis assay | Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | Beyotime | C1062L |
| ATP assay | Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 |
| Buffer | PBS | Solarbio | — |
| Cell digestion reagent | 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 |
| Cell line | GES-1 human gastric mucosal epithelial cells | Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | SCSP-533 |
| Cell viability assay | CCK-8 reagent | — | — |
| Confocal microscope | LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 |
| Culture medium | RPMI-1640 | Gibco | — |
| ELISA kit | Human CRP ELISA Kit | R&D Systems | DCPR00 |
| ELISA kit | Human IL-6 ELISA Kit | R&D Systems | DTAM00D |
| ELISA kit | Human TNF-α ELISA Kit | R&D Systems | — |
| Flow cytometer | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Herbal material | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. BS-20240301 |
| Herbal material | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (root and rhizome) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. PN-20240301 |
| Herbal material | Sanqi Baiji San powder | In-house preparation | Voucher No. SQBJ-20240301 |
| HPLC column | ZORBAX SB-C18 column | Agilent Technologies | 4.6 mm × 250 mm, 5 μm |
| HPLC system | 1260 Infinity II HPLC system | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| IF secondary antibody | Alexa Fluor 594–conjugated anti-rabbit IgG | Invitrogen | A11012 |
| Inverted microscope | CKX41 inverted phase-contrast microscope | Olympus | CKX41 |
| Luminescence reader | Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membrane | PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 |
| Microplate reader | iMark microplate reader | Bio-Rad | iMark |
| Mitochondrial membrane potential kit | JC-1 Assay Kit | Beyotime | C2006 |
| Nuclear stain | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Online platform | Online bioinformatics plotting platform | Bioinformatics online analysis platform | Online platform |
| Online platform | Web-based enrichment analysis platform | Metascape | Online platform |
| Oxidative stress assay | GSH Assay Kit | Beyotime | S0052 |
| Oxidative stress assay | MDA Assay Kit | Beyotime | S0131 |
| Oxidative stress assay | SOD Assay Kit | Beyotime | S0109 |
| PI3K inhibitor | LY294002 | MCE | S1105 |
| Positive control drug | Omeprazole | MCE | HY-B0053 |
| Primary antibody | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Primary antibody | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Primary antibody | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Primary antibody | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Primary antibody | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Primary antibody | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Primary antibody | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Primary antibody | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Primary antibody | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Primary antibody | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Primary antibody | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Primary antibody | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Primary antibody | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Primary antibody | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Primer | AKT forward | — | — |
| Primer | AKT reverse | — | — |
| Primer | ERK forward | — | — |
| Primer | ERK reverse | — | — |
| Primer | GAPDH forward | — | — |
| Primer | GAPDH reverse | — | — |
| Primer | JNK forward | — | — |
| Primer | JNK reverse | — | — |
| Primer | p38 forward | — | — |
| Primer | p38 reverse | — | — |
| Primer | PI3K forward: | — | — |
| Primer | PI3K reverse | — | — |
| Protease inhibitor | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Protein assay | BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 |
| Protein lysis buffer | RIPA buffer | Beyotime | P0013B |
| Public database | DrugBank | DrugBank Online | Online database |
| Public database | GeneCards | Weizmann Institute of Science | Online database |
| Public database | Online Mendelian Inheritance in Man | Johns Hopkins University | Online database |
| Public database | PubChem compound database | National Center for Biotechnology Information | Online database |
| Public database | RCSB Protein Data Bank | RCSB PDB | Online database |
| Public database | STRING protein interaction database | STRING Consortium | Online database |
| Public database | Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform | TCMSP | Online database |
| Public database | Universal Protein Resource | UniProt Consortium | Online database |
| Real-time PCR system | CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
| Reverse transcription kit | PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio | RR047A |
| RNA extraction reagent | TRIzol reagent | — | — |
| ROS probe | DCFH-DA | Beyotime | S0033 |
| Secondary antibody | HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 7074 |
| Software | Cytoscape | Cytoscape Consortium | 3.9.1 |
| Software | GraphPad Prism | GraphPad Software |