Dispositivo portátil para pré-tratamento de saliva para melhorar a detecção de cortisol

Resumo

Este protocolo descreve um método rápido de pré-tratamento para a saliva para melhorar a detecção do cortisol. Um dispositivo de filtragem portátil é usado para remover mucinas e outras substâncias interferentes, preservando o analito alvo. A saliva pré-tratada apresenta fluxo capilar melhorado, permitindo assim um desempenho de ensaio mais consistente e reprodutível.

Resumo

A detecção de cortisol salivar oferece uma alternativa não invasiva à análise baseada no sangue. No entanto, sua implementação prática permanece limitada pela viscosidade intrínseca da saliva e pela presença de componentes interferentes. Em particular, mucinas e proteínas salivares impedem o fluxo capilar e comprometem a confiabilidade dos ensaios subsequentes de fluxo lateral (LFAs), exigindo assim estratégias de pré-tratamento eficazes e acessíveis. Aqui, apresentamos um dispositivo portátil de pré-tratamento de saliva, chamado SaliFilter, para detecção de cortisol no ponto de atendimento. O dispositivo emprega um mecanismo de filtragem que remove seletivamente componentes interferentes de alto peso molecular, permitindo a passagem de pequenas moléculas, incluindo o cortisol. Operado por pressão manual simples, ele permite o processamento rápido da amostra (~2 min) sem a necessidade de equipamentos externos, tornando-o adequado para ambientes descentralizados. O desempenho do dispositivo foi avaliado usando medições de turbidez, quantificação de proteínas e SDS-PAGE, que confirmaram a remoção eficiente de proteínas mucinas e salivares. Amostras tratadas apresentaram fluxo capilar aprimorado, resultando em operação estável e confiável do LFA. A análise quantitativa demonstrou melhora na reprodutibilidade do sinal, e a detecção de cortisol atingiu um limite de detecção de 1,47 ng mL⁻¹ em faixas de concentração clinicamente relevantes. Esse protocolo estabelece uma estratégia eficaz de pré-tratamento de saliva que melhora a sensibilidade e confiabilidade analítica sem comprometer a integridade do analito. A abordagem proposta oferece uma solução prática e portátil para diagnósticos à base de saliva, com potencial de aplicabilidade para testes no ponto de atendimento e automonitoramento.

Introdução

O cortisol, um hormônio glicocorticoide secretado pelo córtex adrenal, é um biomarcador chave para avaliar o estresse^{fisiológico 1,2}. Pode ser medida em múltiplos fluidos biológicos, incluindo soro, plasma, urina, fluido intersticial e saliva, sendo sangue e saliva os mais comumente usados na prática^{clínica 3}. Embora medições baseadas no sangue forneçam informações quantitativas confiáveis, elas exigem venpunctura invasiva e pessoal treinado, o que limita sua adequação para monitoramento frequente^{ou longitudinal}

Protocolo

Saliva humana acumulada e desidentificada comercialmente foi usada neste estudo. Nenhum participante humano foi recrutado, e não era necessária aprovação ética institucional.

1. Preparação da amostra de saliva

1. Instrua os participantes a se absterem de comer ou beber por pelo menos 30 minutos antes da coleta da amostra.
2. Prepare a amostra de saliva conforme as instruções do fornecedor.
   NOTA: Este estudo utilizou saliva humana em pool disponível comercialmente para validação em nível de protocolo.
3. Misture delicadamente a amostra de saliva antes do uso para ga....

Resultados

O pré-tratamento eficaz da saliva requer a remoção de componentes interferentes, incluindo mucinas e proteínas, que comprometem o desempenho analítico a jusante. A capacidade de filtração do SaliFilter foi avaliada inicialmente comparando as mudanças de turbidez com as obtidas usando kits comerciais de coleta de saliva (Figura 2A). Saliva não tratada apresentou alta turbidez, enquanto as amostras tratadas com SaliFilter mostraram visivelmente limpas, indican.......

Discussão

Diagnósticos à base de saliva oferecem uma alternativa não invasiva à análise de sangue. No entanto, sua adoção mais ampla tem sido limitada pela viscosidade intrínseca da saliva e pela presença de componentes interferentes, como mucinas e proteínas. Esses fatores interrompem o fluxo guiado pelos capilares e comprometem o desempenho de plataformas analíticas simples, incluindo LFAs, exigindo assim um pré-tratamento eficaz da amostra.

Neste estudo, demonstramos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Artificial saliva	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Para o ensaio de Bradford
Coomassie blue	Abcam, UK	ab119211	Para visualização de bandas de proteínas
Cortisol ELISA Kit	Abcam, UK	ab154996
Cortisol LFA	In-house
Hot plate	Daihan Scientific, República da Coreia)
Hydrocortisone (Cortisol)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Laemmli sample buffer	GenDEPOT, USA	L1200-001	Para desnaturação de proteínas antes do SDS-PAGE
Membrane holder	GVS Filter Technology	1220950	Suporte de 13 mm de diâmetro
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Gels	Bio-Rad, USA	1658000	Para eletroforese em gel
Mucin	Sigma-Aldrich, USA	M2378
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA		Para o ensaio de proteínas
PES membranes	STERLITECH, USA	PES00313100	Membran PES de 0,03 mícrons, 13 mm
Phosphate-buffered saline (PBS)	DUKSAN, República da Coreia	LB004
Pooled Human Saliva	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
Resolving Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Para preparação de gel de resolução
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Alemanha	51.1534.500	Kit de coleta de saliva
Stacking Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Para preparação de gel de empilhamento
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Kit de coleta de saliva
Syringe	koreavaccine, República da Coreia)		Volume de 1 mL
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Para polimerização de acrilamida