Dispositivo portátil para pré-tratamento de saliva para melhorar a detecção de cortisol

Resumo

Este protocolo descreve um método rápido de pré-tratamento para a saliva para melhorar a detecção do cortisol. Um dispositivo de filtragem portátil é usado para remover mucinas e outras substâncias interferentes, preservando o analito alvo. A saliva pré-tratada apresenta fluxo capilar melhorado, permitindo assim um desempenho de ensaio mais consistente e reprodutível.

Resumo

A detecção de cortisol salivar oferece uma alternativa não invasiva à análise baseada no sangue. No entanto, sua implementação prática permanece limitada pela viscosidade intrínseca da saliva e pela presença de componentes interferentes. Em particular, mucinas e proteínas salivares impedem o fluxo capilar e comprometem a confiabilidade dos ensaios subsequentes de fluxo lateral (LFAs), exigindo assim estratégias de pré-tratamento eficazes e acessíveis. Aqui, apresentamos um dispositivo portátil de pré-tratamento de saliva, chamado SaliFilter, para detecção de cortisol no ponto de atendimento. O dispositivo emprega um mecanismo de filtragem que remove seletivamente componentes interferentes de alto peso molecular, permitindo a passagem de pequenas moléculas, incluindo o cortisol. Operado por pressão manual simples, ele permite o processamento rápido da amostra (~2 min) sem a necessidade de equipamentos externos, tornando-o adequado para ambientes descentralizados. O desempenho do dispositivo foi avaliado usando medições de turbidez, quantificação de proteínas e SDS-PAGE, que confirmaram a remoção eficiente de proteínas mucinas e salivares. Amostras tratadas apresentaram fluxo capilar aprimorado, resultando em operação estável e confiável do LFA. A análise quantitativa demonstrou melhora na reprodutibilidade do sinal, e a detecção de cortisol atingiu um limite de detecção de 1,47 ng mL⁻¹ em faixas de concentração clinicamente relevantes. Esse protocolo estabelece uma estratégia eficaz de pré-tratamento de saliva que melhora a sensibilidade e confiabilidade analítica sem comprometer a integridade do analito. A abordagem proposta oferece uma solução prática e portátil para diagnósticos à base de saliva, com potencial de aplicabilidade para testes no ponto de atendimento e automonitoramento.

Introdução

O cortisol, um hormônio glicocorticoide secretado pelo córtex adrenal, é um biomarcador chave para avaliar o estresse^{fisiológico 1,2}. Pode ser medida em múltiplos fluidos biológicos, incluindo soro, plasma, urina, fluido intersticial e saliva, sendo sangue e saliva os mais comumente usados na prática^{clínica 3}. Embora medições baseadas no sangue forneçam informações quantitativas confiáveis, elas exigem venpunctura invasiva e pessoal treinado, o que limita sua adequação para monitoramento frequente^{ou longitudinal 4,5,6}. Em contraste, a medição de cortisol salivar oferece uma alternativa não invasiva e conveniente, possibilitando aplicações de atendimento e^{automonitoramento 7,8}. Notavelmente, os níveis de cortisol salivares se correlacionam fortemente com as concentrações no sangue, apoiando a saliva como uma amostra substituta confiável⁹. No entanto, a viscosidade intrínseca da saliva e a presença de componentes interferentes dificultam significativamente o desempenho analítico, exigindo um pré-tratamento eficaz antes da análise 10,11,12.

Diversas estratégias de pré-tratamento foram exploradas para enfrentar esses desafios. A centrifugação é amplamente utilizada para remover grandes componentes, como mucinas, proteínas e detritos celulares. No entanto, requer equipamentos laboratoriais volumosos e múltiplas etapas de processamento, o que limita sua aplicabilidade em ambientes^{descentralizados 13,14}. A diluição com soluções tampão pode reduzir a viscosidade e melhorar o fluxo da amostra¹⁵. No entanto, simultaneamente reduz a concentração do analito, comprometendo assim a sensibilidade analítica. Como resultado, as abordagens existentes continuam insuficientes para aplicações no ponto de atendimento, onde o processamento rápido e sem equipamentos e a preservação dos analitos-alvo são essenciais.

Para superar essas limitações, desenvolvemos o SaliFilter, um dispositivo portátil para pré-tratamento de saliva voltado para a detecção de cortisol no ponto de atendimento. O dispositivo emprega um mecanismo de filtragem que remove seletivamente substâncias interferentes de alto peso molecular, permitindo a passagem de pequenas moléculas, incluindo o^{cortisol 16}. Operado manualmente, o dispositivo permite um processamento rápido e amigável sem a necessidade de instrumentação externa. Ao eliminar componentes interferentes, essa abordagem melhora o fluxo capilar em ensaios de fluxo lateral, aumentando assim a confiabilidade analítica. Este protocolo descreve a fabricação do dispositivo e sua aplicação para pré-tratamento rápido de saliva antes da detecção do cortisol, utilizando ensaios de fluxo lateral.

Protocolo

Saliva humana acumulada e desidentificada comercialmente foi usada neste estudo. Nenhum participante humano foi recrutado, e não era necessária aprovação ética institucional.

1. Preparação da amostra de saliva

1. Instrua os participantes a se absterem de comer ou beber por pelo menos 30 minutos antes da coleta da amostra.
2. Prepare a amostra de saliva conforme as instruções do fornecedor.
   NOTA: Este estudo utilizou saliva humana em pool disponível comercialmente para validação em nível de protocolo.
3. Misture delicadamente a amostra de saliva antes do uso para garantir a homogeneidade.
4. Armazene as amostras de saliva a 4 °C e utilize-as dentro do período de armazenamento recomendado pelo fornecedor.

2. Preparação da membrana revestida com RBCM (Figura 1A)

1. Isole o RBCM do sangue total conforme o protocolo¹⁶ previamente relatado.
   1. Use sangue humano total comercialmente obtido com anticoagulante K2EDTA como fonte de RBCM.
   2. Centrifuge o sangue inteiro a 800 × g por 5 minutos e colete a fração de glóbulos vermelhos após remover o plasma e a camada buffy.
   3. Lave o pellet isolado de glóbulos vermelhos três vezes com soro salino tamponado com fosfato (PBS) gelado com 1× usando uma mistura manual suave.
   4. Repose o pellet de glóbulos vermelhos lavados em PBS de 0,25× gelado por 30 minutos para induzir hemólise.
   5. Separe a hemoglobina livre centrifugando a suspensão lisada a 20.000 × g por 30 minutos e coletando o pellet de RBCM.
   6. Lave o pellet de RBCM coletado mais três vezes com 0,25× PBS e armazene o pellet de RBCM rosa claro a −80 °C até novo uso.
2. Prepare uma membrana de polietersulfona (PES) com tamanho de poro de 30 nm e diâmetro de 13 mm.
3. Deposite 100 μL de solução de RBCM a 2% (p/v) em um dos lados da membrana PES. Espalhe ou dispense a solução suavemente em gotas até que toda a superfície da membrana esteja totalmente molhada.
4. Incube a membrana a 50 °C por 30 minutos para garantir um revestimento e secagem uniformes.
5. Armazene a membrana revestida em temperatura ambiente e utilize-a dentro de 15 dias após^{a preparação 17}.
   NOTA: A caracterização detalhada da membrana PES revestida com RBCM foi descrita em nosso estudo^{anterior 16}.

3. Fabricação do dispositivo SaliFilter (Figura 1B)

1. Coloque a membrana revestida com RBCM no suporte designado para o filtro.
2. Monte o dispositivo conectando com segurança os componentes de entrada e saída.
3. Conecte uma seringa de 1 mL na entrada do dispositivo.
   ATENÇÃO: Certifique-se de que todos os componentes estejam bem vedados para evitar vazamentos durante a operação.

4. Pré-tratamento da saliva

1. Carregue 500 μL de saliva na seringa conectada ao dispositivo SaliFilter.
2. Aplique uma pressão manual suave para passar a amostra de saliva pela membrana (~ 2 min).
3. Recolha a saliva pré-tratada na saída.
4. Use a amostra pré-tratada imediatamente ou armazene-a a 4 °C até análise adicional.

5. Análise SDS-PAGE de proteínas salivares

1. Misture 15 μL da amostra com 5 μL de tampão de Laemmli.
2. Coloque a mistura em poços separados de um gel SDS-PAGE a 8%.
3. Realize eletroforese a 150 V por 40 minutos.
4. Tinga o gel com azul Coomassie por 2 horas.
5. Descomprima o gel em água destilada durante a noite.
6. Capture imagens do gel usando um smartphone ou sistema de imagem.

6. Detecção de cortisol usando Ensaio de Fluxo Lateral (LFA)

1. Aplique 150 μL de saliva pré-tratada na almofada da tira de LFA.
2. Deixe a amostra migrar ao longo da faixa por 10 minutos.
3. Capture imagens dos resultados dos testes usando um smartphone ou sistema de imagem.
4. Abra a imagem LFA no ImageJ e use Imagem > Cor > Canais Divididos para separar os canais RGB.
5. Use a imagem do canal verde para análise de intensidade da linha de teste.
6. Selecione uma Região de Interesse (ROI) retangular de 100 × 10 pixels cobrindo a linha de teste e aplique o mesmo tamanho de ROI a todas as imagens de faixas.
7. Meça o valor médio de intensidade do ROI da linha de teste. Selecione uma região de membrana em branco adjacente com o mesmo tamanho de ROI e meça a intensidade de fundo.
8. Calcule a intensidade normalizada da linha de teste da seguinte forma: intensidade normalizada = intensidade da linha de teste − intensidade de fundo.

7. Análise estatística

1. Apresente os dados quantitativos como média ± desvio padrão (DS), salvo indicação em contrário. Defina barras de erro como SD.
   NOTA: Neste estudo, todos os valores de N relatados representam réplicas técnicas realizadas usando alíquotas de saliva humana agrupada comercialmente obtida.
2. Realize uma análise de regressão linear usando os valores normalizados de intensidade da linha de teste obtidos a partir de concentrações de cortisol de 0–8 ng ^mL−1 e calcule o coeficiente de determinação (R²) a partir da curva ajustada.
3. Calcule o limite de detecção (LOD) usando a seguinte equação: LOD = 3,3 × SE / |inclinação|, onde SE é o erro padrão do intercepto y e |inclinação| é o valor absoluto da inclinação obtida a partir da equação de regressão linear. Use o valor absoluto da inclinação porque o LFA competitivo produz uma inclinação negativa.
   NOTA: Neste estudo, não foram realizados testes estatísticos inferenciais nem critérios de significância aplicados.

Resultados

O pré-tratamento eficaz da saliva requer a remoção de componentes interferentes, incluindo mucinas e proteínas, que comprometem o desempenho analítico a jusante. A capacidade de filtração do SaliFilter foi avaliada inicialmente comparando as mudanças de turbidez com as obtidas usando kits comerciais de coleta de saliva (Figura 2A). Saliva não tratada apresentou alta turbidez, enquanto as amostras tratadas com SaliFilter mostraram visivelmente limpas, indican...

Discussão

Diagnósticos à base de saliva oferecem uma alternativa não invasiva à análise de sangue. No entanto, sua adoção mais ampla tem sido limitada pela viscosidade intrínseca da saliva e pela presença de componentes interferentes, como mucinas e proteínas. Esses fatores interrompem o fluxo guiado pelos capilares e comprometem o desempenho de plataformas analíticas simples, incluindo LFAs, exigindo assim um pré-tratamento eficaz da amostra.

Neste estudo, demonstramos...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Artificial saliva	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Para o ensaio de Bradford
Coomassie blue	Abcam, UK	ab119211	Para visualização de bandas de proteínas
Cortisol ELISA Kit	Abcam, UK	ab154996
Cortisol LFA	In-house
Hot plate	Daihan Scientific, República da Coreia)
Hydrocortisone (Cortisol)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Laemmli sample buffer	GenDEPOT, USA	L1200-001	Para desnaturação de proteínas antes do SDS-PAGE
Membrane holder	GVS Filter Technology	1220950	Suporte de 13 mm de diâmetro
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Gels	Bio-Rad, USA	1658000	Para eletroforese em gel
Mucin	Sigma-Aldrich, USA	M2378
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA		Para o ensaio de proteínas
PES membranes	STERLITECH, USA	PES00313100	Membran PES de 0,03 mícrons, 13 mm
Phosphate-buffered saline (PBS)	DUKSAN, República da Coreia	LB004
Pooled Human Saliva	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
Resolving Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Para preparação de gel de resolução
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Alemanha	51.1534.500	Kit de coleta de saliva
Stacking Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Para preparação de gel de empilhamento
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Kit de coleta de saliva
Syringe	koreavaccine, República da Coreia)		Volume de 1 mL
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Para polimerização de acrilamida