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Este estudo computacional baseado em banco de dados não envolve participantes humanos, experimentos com animais ou amostras clínicas. De acordo com o Artigo 32 das Medidas da China para Revisão Ética das Ciências da Vida e Pesquisa Médica envolvendo Sujeitos Humanos, estudos que utilizam dados publicamente obtidos legalmente, não causam danos a sujeitos humanos, não envolvem informações pessoais sensíveis e não possuem interesses comerciais são elegíveis para isenção da revisão ética. Portanto, não é necessária aprovação ética para este estudo.
O desenho experimental e a linha analítica deste estudo estão ilustrados no fluxograma (Figura 1).
Figura 1: Fluxo de trabalho geral do estudo. O fluxograma ilustra o fluxo de trabalho sequencial da farmacologia em rede e das análises de acoplamento molecular, incluindo a aquisição de componentes ativos e alvos da Decocção de Sishen (SSD), coleta de alvos relacionados à gota, identificação de alvos sobrepostos, construção da rede fármaco–componente–alvo–doença e da rede de interação proteína–proteína (PPI), análises de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomas (KEGG). e simulações de acoplamento molecular. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Aquisição de Componentes Ativos e Proteínas-Alvo do SSD
Em 2 de janeiro de 2026, os componentes químicos ativos das cinco ervas que compõem a SSD, a saber: Huangqi, Yuanzhi, Huainiuxi, Shihu e Jinyinhua, foram recuperados do banco de dados21 da Farmacologia dos Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP). Foram aplicados critérios de triagem baseados em propriedades farmacocinéticas: biodisponibilidade oral (OB) de ≥30% e semelhança de fármaco (DL) de ≥0,1822. Componentes que atendem a esses critérios foram considerados potenciais ingredientes ativos. Alvos correspondentes para cada componente eram então coletados. Como o TCMSP não possuía dados completos para Yuanzhi e Shihu, os componentes químicos dessas duas ervas foram ainda recuperados do banco de dados Herb 2.0 no mesmo dia. Após obter os nomes dos componentes, uma busca reversa era realizada no TCMSP usando os nomes dos componentes e os números CAS correspondentes como palavras-chave para recuperar as informações-alvo. Para compostos obtidos do banco de dados Herb, apenas aqueles que foram correspondidos com sucesso a entradas no TCMSP por nome de componente ou número CAS foram mantidos. Os compostos pareados foram então submetidos aos mesmos critérios de triagem farmacocinética (OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18) usando dados TCMSP, e compostos sem informações completas de OB ou DL foram excluídos. Todos os compostos combinados e filtrados foram verificados manualmente em relação aos registros originais do Herb 2.0 para evitar identificações erradas. Subsequentemente, as informações de alvos derivadas do banco de dados de Ervas foram fundidas com as das ervas restantes para gerar o conjunto completo de alvos de ingredientes ativos para SSD.
Todas as proteínas-alvo recuperadas foram padronizadas para símbolos genéticos oficiais usando o banco de dados UniProt. Uma correspondência um a um foi estabelecida mantendo apenas as entradas revisadas por humanos (Swiss-Prot) e excluindo as entradas não revisadas (TrEMBL). Quando múltiplas isoformas correspondiam ao mesmo símbolo gênico, a isoforma canônica era selecionada. O conjunto de dados padronizado de alvos foi mantido para análises genéticas subsequentes que se cruzam.
Coleta de Alvos Relacionados à Gota
Em 2 de janeiro de 2026, buscas sistemáticas foram realizadas no banco de dados GeneCards e no banco de dados OMIM usando "gota" como palavra-chave da doença para obter alvos relacionados à gota. Os alvos obtidos dos dois bancos de dados foram exportados para planilhas WPS (versão 12.1.0). A coluna de Símbolos Genéticos do OMIM foi posicionada ao lado da coluna de Símbolos Gênicos do GeneCards, e alvos duplicados foram removidos usando a função "Remover Duplicatas" baseada em correspondências exatas dos símbolos oficiais do gene de forma insensível a maiúsculas e minúsculas. Os alvos dos dois bancos de dados foram então fundidos para construir um conjunto abrangente de alvos de doenças relacionadas à gota.
Identificação de Alvos Sobrepostos Fármaco–Doença
O conjunto de alvos de medicamentos obtido por triagem em componente ativo e o conjunto de alvos relacionados à gota foram colocados na mesma pasta do projeto (D:\Venn). O software R (versão 4.4.0) foi lançado, e o pacote readxl foi usado para importar arquivos Excel (.xlsx) contendo as listas de destino. O pacote dplyr era usado para manipulação de dados, incluindo filtragem e renomeação de colunas antes da análise de interseções. Os dois conjuntos de alvos foram então convertidos em vetores de caracteres, e alvos sobrepostos foram identificados usando a função calculate.overlap() do pacote VennDiagram. O pacote VennDiagram era instalado a partir do CRAN usando o comando install.packages("VennDiagram") e armazenado no caminho padrão da biblioteca R. Se aparecesse uma mensagem indicando que o pacote já havia sido instalado, a instalação era considerada bem-sucedida. O diretório de trabalho era definido usando o comando setwd("D:\\Venn"), que designava a pasta contendo os arquivos de entrada e servia como diretório de saída. A receita R foi então executada para calcular a interseção entre o conjunto alvo do medicamento e o conjunto de alvos da doença relacionada à gota. Os alvos sobrepostos resultantes foram definidos como potenciais alvos terapêuticos da SSD para o tratamento da gota.
Construção da Rede "Componente Medicamento-Alvo-Doença"
Os genes intersectantes identificados pela sobreposição entre alvos SSD e alvos relacionados à gota eram salvos como o arquivo overlapping_targets.txt , e as informações do componente ativo do SSD eram salvas como o arquivo drug_components.txt . Ambos os arquivos foram colocados na pasta do projeto (D:\Network), que servia como diretório de trabalho para a análise. Para garantir a reprodutibilidade, essa análise foi realizada usando R. As operações de leitura, filtragem e fusão de dados foram realizadas usando uma combinação de funções base R, incluindo read.table(), write.table() e merge(), juntamente com o pacote dplyr para manipulação de quadros de dados. O comando setwd("D:\Network") foi executado para definir explicitamente o diretório de trabalho.
A função graph_from_data_frame() era usada como a função central de integração. Cada linha de drug_components.txt ligava um componente ativo ao seu gene-alvo correspondente usando símbolos oficiais do gene. Apenas alvos presentes em overlapping_targets.txt foram mantidos, e nenhuma filtragem adicional foi aplicada além do requisito de interseção. O conjunto de dados resultante da rede foi exportado como network.txt em formato de lista de aresta. Cada linha continha duas colunas (nó1 e nó2), onde nó1 representava a fórmula SSD ou um componente ativo, e nó2 representava um componente ativo ou um gene alvo. O nó da doença ("gota") era conectado à fórmula SSD como uma aresta separada. Os pesos das arestas não foram atribuídos, e todas as arestas foram tratadas igualmente (largura das arestas = 0,8).
O arquivo network.txt foi importado para o software de visualização de rede Cytoscape (versão 3.7.2). A ferramenta NetworkAnalyzer integrada foi acessada por meio das Ferramentas → Análise → Rede de Análise Rede para obter a estrutura básica da rede, e "Distribuição de Graus" foi selecionada como o quadro analítico. Formas e cores de nós foram atribuídas de acordo com os tipos de nós: losangos azuis representavam a fórmula SSD, retângulos azuis representavam componentes ativos, elipses laranja representavam genes-alvo da doença e octógonos vermelhos representavam a entidade da doença da gota. O tamanho do nó foi definido para ser proporcional ao grau do nó (tamanho do nó = 30 + grau × 5, tamanho máximo = 100).
Construção da Rede de Interação Proteína–Proteína (PPI)
O conjunto filtrado de genes-alvo que se cruzam foi importado para o banco de dados STRING (versão 12.0) em 2 de janeiro de 2026. A espécie foi restrita ao Homo sapiens, o limiar mínimo de confiança de interação foi definido para alta confiança (0,700), proteínas desconectadas foram ocultas, as fontes de interação incluíram todos os canais de evidência disponíveis e todos os outros parâmetros foram mantidos em suas configurações padrão para obter interações proteína-proteína conhecidas e previstas. Os dados de rede resultantes eram exportados no formato de valores separados por tabulação (TSV) usando as opções padrão de exportação.
A rede exportada foi importada para o software de visualização de rede para visualização e análise topológica. As propriedades da rede foram calculadas usando a ferramenta embutida NetworkAnalyzer (Ferramentas → Network Analysis → Analyze Network). As métricas calculadas incluíam grau, centralidade entre os níveis e centralidade de proximidade. Os tamanhos dos nós foram mapeados para valores de grau usando uma função de mapeamento contínuo (tamanho do nó = 20 + grau × 3, tamanho máximo = 80).
Os alvos hub foram identificados ordenando todos os nós de acordo com os valores de grau em ordem decrescente. Nós com valores de grau mais altos eram considerados mais centrais dentro da rede. Nós isolados (grau = 0) foram excluídos da visualização. O layout da rede foi organizado em círculos concêntricos do centro para fora de acordo com a conectividade dos nós, e as cores dos nós foram mapeadas usando um gradiente azul para ciano correspondente aos valores crescentes de grau. A rede resultante foi usada para identificar os principais alvos do hub envolvidos nos potenciais efeitos terapêuticos do SSD contra a gota.
Análise de Enriquecimento de Ontologia Gênica (GO)
Com base nos genes-alvo sobrepostos identificados, a análise de enriquecimento funcional GO foi realizada usando R. Os pacotes Bioconductor necessários foram instalados no caminho padrão da biblioteca R e carregados no ambiente de análise. O arquivo de genes que se intersectam era armazenado no diretório do projeto (D:\GO), e o diretório de trabalho era definido usando a função setwd().
A conversão e anotação do identificador gênico foram realizadas usando o pacote Bioconductor org. Hs.eg.db (versão 3.20.0). Símbolos oficiais de genes foram convertidos para IDs de genes Entrez usando a função bitr() no pacote de análise de enriquecimento clusterProfiler (versão 4.21.0). Apenas genes que apresentavam mapeamentos únicos um para um foram mantidos para análises posteriores, enquanto entradas ambíguas ou não mapeadas foram excluídas.
A análise de enriquecimento GO foi realizada utilizando o pacote de análise de enriquecimento. A função enrichGO() foi usada com as categorias ontológicas Processo Biológico (BP), Componente Celular (CC) e Função Molecular (MF). A significância estatística foi determinada usando o método de correção de múltiplos testes de Benjamini–Hochberg, com um valor P ajustado < 0,05 considerado significativo.
Para cada categoria de ontologia, termos significativamente enriquecidos foram classificados de acordo com o fator de enriquecimento:
EF = (contagem de genes / genes de fundo total) ÷ (tamanho do termo / genes do genoma total)
Os 10 melhores termos foram selecionados para análise detalhada. Quando fatores de enriquecimento idênticos ocorreram, termos com valores P ajustados mais baixos foram classificados mais alto.
Os resultados do enriquecimento foram visualizados usando ggplot2 (versão 3.5.1) e enrichplot (versão 1.24.0). Gráficos de bolhas e gráficos de barras eram gerados usando as funções dotplot() e barplot(). O tamanho da bolha representava o número de genes enriquecidos, enquanto a cor correspondia à significância de enriquecimento expressa como −log10 (valor P ajustado). Parâmetros padrão de plotagem foram usados ao longo de todo o processo.
Análise de Enriquecimento da Via KEGG
A análise de enriquecimento de vias KEGG dos alvos que se cruzam como SSD e gota foi realizada usando R e o pacote de análise de enriquecimento descrito anteriormente. Símbolos genéticos foram convertidos em identificadores compatíveis com KEGG usando a função bitr() fornecida pelo pacote de análise de enriquecimento, com KEGG servindo como recurso de anotação. A análise de enriquecimento de vias foi realizada usando a função enrichKEGG() baseada no teste hipergeométrico. A significância estatística foi determinada usando o método de correção de múltiplos testes Benjamini–Hochberg (BH), e caminhos com valor P ajustado < 0,05 foram considerados significativamente enriquecidos.
Os resultados do enriquecimento foram exportados para arquivos de livros compatíveis com Microsoft Excel usando o pacote openxlsx (versão 4.2.8.1) e a função write.xlsx() para revisão e preparação de figuras subsequentes.
Uma rede de interação alvo-caminho multinível foi posteriormente construída usando o software de visualização de rede. Os dados de rede eram importados usando o File → Import → Network from File. Os nós consistiam em nós do gene alvo e nós da via KEGG significativamente enriquecidos (valor P ajustado por BH < 0,05), enquanto as arestas representavam associações documentadas entre genes-alvo e vias enriquecidas identificadas durante a análise de enriquecimento. A visualização de redes era realizada usando o painel de Estilo do software de visualização de rede, com os genes-alvo exibidos como elipses cinza e caminhos exibidos como retângulos ciano. Nenhum plugin adicional foi utilizado. A rede foi gerada manualmente a partir da tabela de saída de enriquecimento para visualizar as relações entre os alvos centrais e caminhos significativamente enriquecidos.
Validação de Acoplamento Molecular
Os arquivos de estrutura 3D (formato MOL2) dos 10 principais componentes ativos classificados por conectividade alvo na rede "fármaco–componente–alvo–doença" foram baixados do banco de dados TCMSP. A conectividade alvo foi definida como o grau do nó (ou seja, o número de conexões diretas entre um componente ativo e genes alvo na rede). Os componentes ativos foram classificados em ordem decrescente de acordo com os valores de grau, e os 10 melhores componentes foram selecionados para análise de acoplamento molecular.
As estruturas cristalinas das 10 principais proteínas-alvo hub identificadas na rede PPI foram obtidas do Banco de Dados de Proteínas (PDB) do RCSB em 23 de janeiro de 2026. A espécie foi restrita ao Homo sapiens. Para cada proteína-alvo, a estrutura com maior resolução cristalográfica (menor valor de Å), sem mutações e cocristalizada com um ligante ou inibidor nativo foi escolhida preferencialmente. Se múltiplas estruturas atendessem a esses critérios, a estrutura com maior resolução e cobertura de sequência proteica mais completa era selecionada. As seguintes estruturas PDB foram utilizadas: 1GKC (MMP9), 5WHH (BCL2), 2P33 (JUN), 1RHJ (CASP3), 1WT5 (EGFR), 7APJ (AKT1), 1DU3 (TNF), 1T4Q (IL1B), 4NI9 (IL6) e 9CKJ (TP53).
Simulações de acoplamento molecular foram realizadas usando o servidor online CB-Dock 2 (versão web, acessada em 23 de janeiro de 2026), que emprega o AutoDock Vina como motor de acoplamento. As estruturas proteicas foram pré-processadas automaticamente pelo servidor, incluindo a remoção de heteroátomos e a preparação das estruturas dos receptores. Os ligandos eram enviados no formato MOL2. Foi utilizada a detecção de cavidades independente do molde, com cinco possíveis cavidades de ligação automaticamente identificadas para cada estrutura proteica. Os cálculos de acoplamento foram realizados usando os parâmetros padrão do motor de acoplamento: exaustividade = 8, faixa de energia = 4 e número máximo de modos de ligação = 9.
Para cada par alvo–composto, o acoplamento foi realizado independentemente dentro de cada uma das cinco cavidades detectadas. As posturas de acoplamento foram avaliadas usando a função de pontuação do motor de acoplamento, e a pose com menor energia de ligação dentro de cada cavidade foi mantida como conformação representativa para essa cavidade. Entre as cinco conformações representativas, a pose de acoplamento com a energia de ligação globalmente mais baixa foi selecionada como o resultado final do acoplamento para aquele par alvo–composto e usada em análises subsequentes.
O menor valor de energia de ligação obtido para cada resultado de acoplamento foi registrado em uma planilha e importado para a plataforma online de plotagem Weishengxin (acessada em 23 de janeiro de 2026) para gerar um mapa de calor usando parâmetros padrão. O mapa de calor utilizava um gradiente de cor amarelo para vermelho, agrupamento hierárquico de ligação completa e distância euclidiana como métrica de agrupamento.
As interações entre ligações de hidrogênio eram automaticamente identificadas pelo módulo de análise do servidor de acoplamento com base em critérios geométricos. Uma ligação de hidrogênio foi definida como uma interação entre uma distância doador–aceitador ≤ 3,5 Å e um ângulo doador–hidrogênio–aceitador ≥ 120°. As ligações de hidrogênio eram exibidas como linhas tracejadas em diagramas de interação bidimensional e tridimensional. O par proteína-alvo com componente ativo, que exibe a menor energia de ligação globalmente entre todas as combinações de acoplamento, foi selecionado para análise detalhada de interação. Essa seleção baseava-se em um único par alvo–composto, em vez de uma pose de acoplamento individual, e tinha como objetivo identificar a interação prevista mais forte dentro da rede. A pose final representativa de acoplamento correspondente a esse par alvo–composto foi usada para visualização e análise de interação.
Diagramas de interação tridimensionais e bidimensionais foram gerados usando ChimeraX versão 1.5 e LigPlot+ versão 2.2, respectivamente. No ChimeraX, as proteínas eram exibidas usando a representação padrão de desenho animado, os ligantes eram exibidos no modo bastão, as ligações de hidrogênio eram mostradas como linhas tracejadas e o esquema de cores padrão era aplicado. No LigPlot+, a identificação das ligações de hidrogênio foi realizada usando o algoritmo HBPLUS, com um limiar de distância doador-aceitador de 3,9 Å e um limiar de ângulo de 90°. Todos os outros parâmetros de visualização foram mantidos em suas configurações padrão.