Artigo de investigação

A modificação por N6-metiladenosina de Rab27A promove a osteoporose ao influenciar a diferenciação de osteoclastos no modelo de camundongos ovariectomizados

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DOI:

10.3791/71964

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11 de agosto de 2026

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O YTHDC1 promove a exportação citoplasmática do Rab27A modificado por m6A, enquanto IGF2BP2 estabiliza o Rab27A no citoplasma, aumentando assim a diferenciação dos osteoclastos e contribuindo para a osteoporose.

Resumo

O desenvolvimento de novas terapias para osteoporose tem atraído cada vez mais atenção. Rab27A é regulado em alta durante a diferenciação dos osteoclastos, e a modificação com N6-metiladenosina (m6A) emergiu como um importante regulador epigenético em doenças ortopédicas. Análises bioinformáticas previram que Rab27A contém múltiplos sítios de modificação de m6A e interage com várias proteínas associadas a m6A. Experimentos de knockdown foram realizados para avaliar o papel de Rab27A na diferenciação osteoclasta e osteoporose, utilizando um modelo murino ovariectomizado (OVX). A depleção de Rab27A atenuou a osteoporose e aumentou a porcentagem de formação óssea de 14,73% para 28,13% (P < 0,05) em camundongos OVX. Western blot e PCR quantitativa demonstraram que o knockdown do Rab27A reduziu a expressão de proteínas e mRNA dos marcadores osteoclastos TRAP, NFATc1 e c-FOS, suprimindo assim a diferenciação de osteoclastos dos macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) induzidos pelo fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF) e pelo ativador receptor do ligante do fator nuclear κB (RANKL). A coloração TRAP mostrou ainda que a depleção de Rab27A reduziu significativamente a atividade TRAP de 24,1% para 12,9% (P < 0,01) após a indução de M-CSF e RANKL. Ensaios de imunoprecipitação de RNA confirmaram interações entre Rab27A e as proteínas leitoras de m6A YTHDC1 e IGF2BP2. O fracionamento nuclear e citoplasmático demonstrou que o YTHDC1 facilita a exportação citoplasmática de Rab27A modificado por m6A. Além disso, análises q-PCR e western blot mostraram que a redução de YTHDC1 ou IGF2BP2 reduziu a expressão de Rab27A e diminuiu a expressão de TRAP, NFATc1 e c-FOS, suprimindo assim a diferenciação de osteoclastos induzida por M-CSF e RANKL. Coletivamente, esses achados indicam que a exportação citoplasmática mediada por YTHDC1 e a estabilização mediada por IGF2BP2 do Rab27A modificado por m6A promovem a diferenciação de osteoclastos e contribuem para a perda óssea no modelo de camundongos OVX.

Introdução

A osteoporose (OP) é um distúrbio esquelético comum caracterizado pela deterioração da microarquitetura óssea e redução da densidade mineral óssea, resultando em um risco aumentado de fraturas em todoo mundo 1,2,3. Fraturas osteoporóticas ocorrem com mais frequência no antebraço, úmero, quadril e coluna, sendo particularmente prevalentes entre adultos mais velhos. Essas fraturas prejudicam substancialmente a qualidade de vida e impõem consideráveis encargos físicos, psicológicos e socioeconômicos aos pacientes, suas famílias e sistemas desaúde 3. Consequentemente, a prevenção, manejo e tratamento da osteoporose continuam sendo prioridades clínicas e de saúde pública importantes.

Diversas estratégias terapêuticas foram desenvolvidas para osteoporose e geralmente podem ser classificadas em duas categorias: agentes formadores ósseos e terapias anti-reabsortivas 4,5. Os anti-resorptivos tradicionais incluem bisfosfonatos, raloxifeno e ranelato de estrôncio, enquanto agentes mais recentes incluem denosumabe, odanacatibe e saracatinibe. As terapias formadoras de ossos incluem hormônio paratireoidiano (PTH 1–84), enquanto vários candidatos adicionais, como MK-5442, AMG 785 e BHQ 880, estão em desenvolvimentoclínico 5. Embora esses tratamentos possam ser eficazes, muitos estão associados a efeitos adversos significativos, eficácia limitada a longo prazo ou restrições ao usoprolongado 4,6,7,8,9. Por exemplo, a administração a longo prazo de aminobisfosfonatos e denosumebe pode prejudicar a remodelação ósseanormal 5. Portanto, identificar alvos terapêuticos mais seguros e eficazes continua sendo um objetivo importante na pesquisa sobre osteoporose.

As proteínas Rab são reguladores-chave do tráfego intracelular de vesículas e sinalização celular, participando de diversos processos biológicos, incluindo infecção viral, autofagia e organizaçãocitoesquelética 10. Nos últimos anos, a atenção crescente tem sido direcionada aos papéis das proteínas da família Rab no metabolismo ósseo e na osteoporose. Rab44 foi relatado como regulador da diferenciação de osteoclastos modulando a sinalização intracelular de Ca2⁺ e o fator nuclear ativador das células T 1 ativadas (NFATc1) no ativador receptor dos macrófagos 11 tratados com fator nuclear κB (RANKL). Osteoclastos são células multinucleadas derivadas de precursores da linhagem de macrófagos e desempenham papéis essenciais na reabsorção óssea e na homeostaseesquelética 12,13,14,15,16,17,18,19. Portanto, compreender os mecanismos moleculares que regem a diferenciação dos osteoclastos é fundamental para desenvolver novas abordagens terapêuticas para a osteoporose.

Rab27A é um membro importante da família Rab GTPase e é amplamente expresso em células secretoras e imunes. Ele desempenha papéis fundamentais no transporte de vesículas, exocitose e sinalização intracelular 20,21,22,23,24,25,26,27. Estudos anteriores demonstraram que Rab27A regula a desgranulação eosinófila durante a inflamação das vias aéreas e controla a mobilização vesicular associada à atividade da NADPH oxidase em macrófagosativados 20.23. Notavelmente, evidências acumuladas indicam que a expressão de Rab27A é significativamente aumentada durante a diferenciação osteoclasta. Shimada-Sugawara et al. relataram que a expressão de Rab27A aumenta durante a diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) em osteoclastos, sugerindo um possível papel na osteoclastogênese28. Coletivamente, esses achados sugerem que o Rab27A pode influenciar a formação e a função dos osteoclastos ao regular o tráfego vesicular e as vias de sinalização intracelular28,29.

N6-metiladenosina (m6A) é a modificação interna de RNA mais abundante em RNAs mensageiros eucarióticos e RNAs não codificantes, e atua como um regulador crítico do metabolismo do RNA e da expressão gênica. Como a primeira modificação identificada de mRNA em mamíferos, o m6A tem sido implicado em inúmeros processos biológicos, incluindo estabilidade do RNA, emendamento, transporte e translação. Wang et al. demonstraram que as modificações m6A, comumente ocorrendo dentro de motivos de sequência conservadas, são reconhecidas por proteínas contendo domínio YTH e contribuem para a regulação da estabilidade e metabolismo domRNA 30. Além disso, a modificação do m6A tem sido implicada em diversas funções biológicas, incluindo estabilidade do genoma, regulação transcricional, organização da cromatina, progressão do câncer e respostasimunológicas 31. Estudos recentes também destacaram papéis importantes da sinalização m6A em doenças relacionadas ao osso eosteoporose 32.

Entre as proteínas leitoras de m6A, a YTHDC1 funciona como um leitor nuclear que regula o processamento de RNA e a exportação nuclear, enquanto a proteína de ligação ao mRNA 2 (IGF2BP2), fator de crescimento semelhante à insulina, estabiliza transcritos modificados por m6A no citoplasma. Chen et al. demonstraram que o YTHDC1 promove a exportação nuclear do circNSUN2 modificado por m6A, que subsequentemente interage com IGF2BP2 para estabilizar o mRNA do HMGA2 e promover a metástase do câncercolorretal 33. Esses achados sugerem que a regulação coordenada por YTHDC1 e IGF2BP2 pode representar um mecanismo geral que controla o destino dos transcritos modificados por m6A.

O presente estudo investigou sítios previstos de modificação de m6A dentro do mRNA Rab27A e examinou suas interações com YTHDC1 e IGF2BP2. Descobriu-se que YTHDC1 facilitava a exportação nuclear de transcritos de Rab27A modificados por m6A, enquanto IGF2BP2 interagia com Rab27A no citoplasma e aumentava sua estabilidade. Por meio desse mecanismo regulatório, Rab27A promoveu a diferenciação dos osteoclastos e contribuiu para a progressão da osteoporose. Coletivamente, os achados identificam uma via regulatória dependente de m6A anteriormente não reconhecida, envolvendo YTHDC1, IGF2BP2 e Rab27A na diferenciação de osteoclastos. Esses resultados fornecem novos insights sobre a patogênese molecular da osteoporose e podem facilitar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas voltadas para a regulação mediada por m6A do Rab27A.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Proteção e Utilização Animal do Hospital Afiliado da Southwest Medical University (Aprovação nº 2024-Ethics-042). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes ARRIVE, a Lei de Procedimentos Científicos (Animais do Reino Unido) de 1986 e diretrizes associadas, a Diretiva da UE 2010/63/UE e o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Publicação NIH nº 8023, revisada em 1978). Os camundongos foram alocados aleatoriamente para grupos experimentais, e a sequência de alocação foi ocultada do pesquisador. Toda a aquisição e análise de dados, incluindo avaliação histológica, análise de imagens por tomografia computacional (micro-CT) e análises estatísticas, foram realizadas por pesquisadores cegados à alocação de grupos. Nenhum animal ou amostra foi excluído das análises. Todos os reagentes, equipamentos, softwares e outros recursos usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Construção do modelo de Ovariectomia (OVX)

Vinte e quatro fêmeas do tipo selvagem C57BL/6 camundongos de 8 semanas foram usadas para estabelecer um modelo de osteoporose. Após um período de aclimatação de 1 semana, os camundongos foram aleatoriamente designados para o grupo Sham ou OVX. O modelo OVX foi estabelecido por ovariectomia bilateral, conforme descritoanteriormente 34,35. Camundongos operados por simulação passaram por exposição cirúrgica dos ovários sem remoção.

Para a entrega do gene intra-femoral, vetores lentivirais que expressam sh-Rab27A ou sh-NC foram injetados 7 dias após a cirurgia OVX, conforme relatadoanteriormente 36,37. Brevemente, partículas lentivirais concentradas (1 × 106 unidades transdutoras/mL) foram injetadas no fêmur pela rota patelar usando uma agulha calibre 22 sob anestesia. Cada camundongo recebeu 20 μL de suspensão lentiviral. A incisão foi posteriormente suturada, e os animais foram monitorados durante toda a recuperação.

Todos os experimentos com animais foram realizados sob condições específicas livres de patógenos. As amostras do femur foram coletadas 8 semanas após a cirurgia. Pelo menos seis camundongos por grupo foram usados para análises histológicas e extração de RNA ou proteínas.

2. Imagem micro-CT in vivo

Uma tomografia microcomputadorizada (micro-CT) foi realizada para avaliar a morfologia óssea trabecular. A tíbia direita de cada camundongo foi escaneada in vivo antes da cirurgia OVX às 14 semanas de idade. Exames de acompanhamento eram realizados semanalmente até as 22 semanas de idade. Pelo menos seis camundongos por grupo foram incluídos na análise micro-CT.

Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital de sódio intraperitoneal (50 mg/kg de peso corporal). A anestesia adequada foi confirmada pela ausência do reflexo de beliscão do dedo do pé e pelo monitoramento contínuo da frequência respiratória, mantendo-a durante todo o procedimento de imagem. Todos os procedimentos de eutanásia foram realizados de acordo com o protocolo animal aprovado, as diretrizes institucionais de bem-estar animal e as regulamentações nacionais para eutanásia de animais de laboratório.

Com 24 semanas de idade, os camundongos foram eutanasiados por luxação cervical após anestesia profunda, e ambas as tíbias foram coletadas para exame ex vivo usando o mesmo protocolo de imagem. Os parâmetros de varredura incluíam um voxel de 10,4 μm, uma tensão de 55 kV, uma corrente de 145 μA, um campo de visão de 32 mm, 1500/750 amostras por projeção e um tempo de integração de 100 ms.

As imagens foram processadas usando um algoritmo de correção de endurecimento de feixe polinomial de terceira ordem, calibrado contra um fantasma de 1200 mg HA/cm3 . Fração de volume ósseo (VB/TV), espessura trabecular (Tb.Th) e número trabecular (Tb.N) foram quantificados na metáfise distal do fémur localizada a 1,0 mm proximal da placa de crescimento.

3. Transfecção de plasmídeos

Plasmídeos sh-Rab27A e sh-NC foram gerados e usados para a produção de lentivírus. Plasmídeos de embalagem lentival e construtos de shRNA foram co-transfectados em células HEK293T conforme as instruções do fabricante. Os títulos virais foram determinados antes da administração intrafemoral, conforme descritoanteriormente, 36. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

4. Coloração por hematoxilina e eosina (HE)

As amostras femurais foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 24 horas, descalcificadas em EDTA a 10% por 4 semanas, crioprotegidas em 30% de sacarose/PBS, embutidas em parafina e seccionadas com espessura de 5 μm. As seções do tecido foram coradas com hematoxilina e eosina e examinadas ao microscópio óptico. Pelo menos seis camundongos por grupo foram analisados.

5. Coloração com fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP)

A coloração por TRAP das seções femures foi realizada de acordo com as instruções dofabricante 38. A atividade de TRAP em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) foi avaliada usando um ensaio de coloração TRAP. Osteoclastos maduros foram definidos como células multinucleadas TRAP-positivas contendo pelo menos três núcleos. Foram realizadas três réplicas biológicas independentes, cada uma com três réplicas técnicas.

6. q-PCR

O RNA total foi isolado usando reagente TRIzol conforme as instruções do fabricante. DNA complementar foi sintetizado usando transcriptase reversa e submetido a PCR quantitativa em tempo real usando química SYBR Green. Foram realizadas três réplicas biológicas independentes, cada uma com três réplicas técnicas.

As sequências de primers eram as seguintes:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTGTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTTCAAAAT

ARMADILHA: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTCTCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTAA

C-FOS: F, TÁTICA DE TACCCCCCCAGGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actina: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western blot

Células ou tecidos foram lisados usando tampão RIPA suplementado com inibidores de protease. As concentrações de proteína foram determinadas usando um ensaio de Bradford. Quantidades iguais de proteína (20 μg) foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de polivinilideno fluoreto (PVDF) ou nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1 hora em temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 ou β-actina. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários apropriados por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas usando procedimentos padrão de detecção. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

8. Cultura celular

Macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) foram isolados conforme descritoanteriormente: 39. Células da medula óssea colhidas de fêmures de camundongos foram cultivadas durante a noite em meio essencial α mínimo suplementado com 10% de soro fetal bovino, 30 ng/mL fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂. Células não aderentes foram coletadas e cultivadas em um sistema stromal livre de células contendo 30 ng/mL DE M-CSF. Após 3 dias, células aderentes foram colhidas como BMMs e posteriormente cultivadas na presença de 30 ng/mL m-CSF e 50 ng/mL ativador do receptor do ligante fator nuclear κB (RANKL) por 72 horas para induzir a diferenciação do osteoclasto.

9. Interferência de RNA (RNAi)

Pequenos RNAs interferentes (siRNAs) foram sintetizados e transfectados usando um reagente de transfecção à base de lipídios, conforme as instruções do fabricante. As células foram semeadas com uma densidade de 2 ×10 4 células por poço em placas de seis poços antes da transfecção. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

As sequências de alvos eram as seguintes:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Imunofluorescência

As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 minutos e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 por 10 minutos. Após o bloqueio com albumina sérica bovina a 5% por 30 minutos, as células foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C.

Após a lavagem, anticorpos secundários conjugados com fluoróforo foram aplicados por 30 minutos em temperatura ambiente. Núcleos foram contra-coloridos com DAPI, e imagens foram adquiridas usando microscopia confocal. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

11. Separação nuclear e citoplasmática

Frações nucleares e citoplasmáticas foram isoladas conforme as instruções do fabricante. As células foram lisadas no gelo por 10 minutos e centrifugadas a 500 × g por 3 minutos a 4 °C. O sobrenadante contendo componentes citoplasmáticos foi coletado, enquanto o pellet contendo núcleos foi lavado e processado separadamente.

12. Imunoprecipitação de proteínas de ligação a RNA (RIP)

Os ensaios de imunoprecipitação de RNA (RIP) foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Por um breve período, as células foram lisadas no gelo por 30 minutos. Após a centrifugação, os supernadantes foram incubados durante a noite com anticorpos e esferas de agarose da proteína A/G. Após a lavagem, proteínas imunoprecipitadas foram analisadas por western bloting, e RNA co-imunoprecipitado foi analisado por PCR quantitativa em tempo real. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

13. Ensaio de estabilidade de mRNA Rab27A

O RNA total foi extraído nos momentos indicados após IGF2BP2 knockdown. Posteriormente, foram realizadas transcrições reversas e PCR quantitativa em tempo real. Os níveis de mRNA de Rab27A foram normalizados para o grupo si-NC correspondente em 0 horas. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas.

14. Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados de forma independente usando pelo menos três réplicas biológicas. Para q-PCR, interferência de RNA, coloração TRAP, western blot e outros ensaios baseados em células, cada réplica biológica incluiu três réplicas técnicas, salvo especificação em contrário. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (DS).

As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism versão 9.0 e o software SPSS. Comparações entre dois grupos foram realizadas usando um teste t de Student de duas caudas. Comparações entre múltiplos grupos foram analisadas usando análise bidirecional da variância (ANOVA), seguidas pelo teste de múltiplas comparações pós-hoc de Tukey para ajustar para múltiplas comparações. Um valor P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A redução de Rab27A reduziu a osteoporose in vivo.

Para investigar o papel de Rab27A na osteoporose, o knockdown de Rab27A foi realizado em um modelo murino ovariectomizado (OVX) estabelecido usando métodos previamenterelatados 34,40. O desenho geral do estudo é resumido na Figura 1. A análise por tomografia microcomputadorizada demonstrou que a densidade mineral óssea, fração de volume ósseo (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th) e número trabecular (Tb.N) foram significativamente reduzidos em camundongos OVX em comparação com controles Sham (Figura 2A). Esses achados confirmaram o estabelecimento bem-sucedido do modelo da osteoporose. O knockdown do Rab27A restaurou significativamente todos os parâmetros estruturais ósseos medidos, indicando atenuação da perda óssea induzida por OVX e da deterioração microarquitetônica (Figura 2A).

O exame histológico reforçou ainda mais esses achados. A coloração por hematoxilina e eosina revelou perda óssea trabecular marcada e perturbação da arquitetura trabecular em camundongos OVX em comparação com o grupo Sham (Figura 2B). Em contraste, a depleção de Rab27A aliviou a deterioração trabecular e restaurou parcialmente a morfologia óssea (Figura 2B). Como Rab27A foi implicado na diferenciaçãoosteoclasta 28, a atividade osteoclasta foi avaliada por coloração por fosfatase ácida resistente a tartrato (TRAP). A atividade de TRAP foi marcadamente elevada em camundongos OVX em comparação com controles Sham e significativamente reduzida após a redução do Rab27A (Figura 2C).

A expressão de marcadores associados ao osteoclasto foi posteriormente examinada. A análise de Western blot demonstrou que os níveis de proteína Rab27A, TRAP, NFATc1 e c-FOS foram significativamente aumentados em camundongos OVX e foram reduzidos após a depleção de Rab27A (Figura 2D). Resultados consistentes foram obtidos no nível transcricional, com PCR quantitativa em tempo real (q-PCR) demonstrando padrões de expressão semelhantes para Rab27A, TRAP, NFATc1 e expressão de mRNA c-FOS (Figura 2E).

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Figura 1: Visão esquemática do desenho experimental e do mecanismo regulatório proposto subjacente à regulação mediada por YTHDC1 e IGF2BP2 do Rab27A modificado por m6A durante a diferenciação de osteoclastos e progressão da osteoporose. Um modelo de camundongo ovariectomizado (OVX) e um ativador receptor do modelo de diferenciação de osteoclasto induzido pelo fator nuclear fator κB (RANKL)/fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) foram usados para investigar o papel do Rab27A na osteoclastogênese. Foram realizados ensaios de knockdown com Rab27A, fracionamento nuclear e citoplasmático, e imunoprecipitação de RNA para avaliar marcadores de diferenciação de osteoclastos (TRAP, NFATc1 e c-FOS), expressão de Rab27A e localização subcelular. O YTHDC1 facilitou a exportação citoplasmática de Rab27A modificado por m6A, enquanto IGF2BP2 estabilizou Rab27A no citoplasma. Juntos, esses mecanismos regulatórios coordenados promoveram a diferenciação dos osteoclastos e contribuíram para a perda óssea no modelo OVX. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: A redução de Rab27A reduziu a osteoporose in vivo. (A) Análise morfométrica do osso trabecular. A densidade mineral óssea, a fração de volume ósseo (BV/TV), a espessura trabecular (Tb.Th) e o número trabecular (Tb.N) foram quantificados. **P < 0,01, ***P < 0,001. (B) Avaliação histológica do osso trabecular femoral após a depleção de Rab27A. A coloração por hematoxilina e eosina (HE) foi realizada para avaliar alterações estruturais no fêmur distal. Os grupos OVX e OVX + sh-NC serviam como controles. Barra da escala = 50 μm. ***P < 0,001. (C) Coloração por armadilhas das seções femorais. A atividade do TRAP foi avaliada para analisar a atividade osteoclasta. Os grupos OVX e OVX + sh-NC serviam como controles. Barra da escala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expressão de Rab27A, TRAP, NFATc1 e c-FOS após a depleção de Rab27A. A expressão proteica foi determinada por western blotting (D), e a expressão de mRNA foi determinada por q-PCR (E). β-actina servia como controle de carga. **P < 0,01, ***P < 0,001. O grupo Sham passou por exposição cirúrgica dos ovários sem ovariectomia, enquanto o grupo OVX passou por ovariectomia bilateral. sh-NC, RNA curto de curva controle negativo. Seis camundongos foram incluídos em cada grupo experimental. Os dados são apresentados como média ± SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Knockdown da diferenciação de osteoclastos suprimidos por Rab27A dos BMMs induzida por M-CSF e RANKL

Para avaliar ainda mais o papel do Rab27A durante a osteoclastogênese, macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) foram estimulados com fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) e ativador receptor do ligante do fator nuclear κB (RANKL) para induzir a diferenciaçãoosteoclasta 28.

Análises quantitativas de PCR em tempo real e western blot demonstraram que a estimulação de M-CSF e RANKL aumentou significativamente a expressão de mRNA e proteínas de Rab27A, enquanto a transfecção com si-Rab27A reduziu efetivamente a expressão de Rab27A (Figuras 3A, B). A coloração com TRAP demonstrou um aumento significativo na atividade osteoclasta após o tratamento com M-CSF e RANKL. O knockdown do Rab27A reduziu significativamente a atividade do TRAP em comparação com o grupo induzido (Figura 3C).

A expressão dos marcadores de diferenciação osteoclasta foi posteriormente examinada. A análise quantitativa em tempo real por PCR demonstrou que os níveis de mRNA de TRAP, NFATc1 e c-FOS aumentaram significativamente após a indução do osteoclasto e foram reduzidos pela depleção de Rab27A (Figura 3D). Resultados semelhantes foram observados no nível proteico pelo western blot (Figura 3E).

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Figura 3: Knockdown da diferenciação de osteoclastos suprimidos por Rab27A dos macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) induzidos por M-CSF e RANKL. (A–B) Expressão de Rab27A após indução do osteoclasto. Os níveis de mRNA (A) e proteína (B) de Rab27A foram determinados por q-PCR e western bloting, respectivamente. β-actina servia como controle de carga. P < 0,001. (C) Coloração por TRAP em osteoclastos derivados de BMM. O aumento da atividade TRAP induzido pelo M-CSF e RANKL foi suprimido após o knockdown do Rab27A. Barra da escala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expressão de marcadores de diferenciação osteoclasta após a depleção de Rab27A. Os níveis de mRNA TRAP, NFATc1 e c-FOS foram determinados por q-PCR (D), e os níveis de proteína foram determinados por western blot (E). β-actina servia como controle de carga. **P < 0,01, ***P < 0,001. Controle de células não tratadas; si-NC, siRNA controle negativo. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas. Os dados são apresentados como média ± SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

A exportação citoplasmática do Rab27A modificado com m6A foi facilitada pelo YTHDC1

Para investigar o possível envolvimento da modificação m6A na regulação de Rab27A, foram realizadas análises bioinformáticas. Múltiplos locais previstos de modificação de m6A foram identificados dentro do transcrito Rab27A (Figura 4A). Além disso, a análise de predição de interação sugeriu possíveis associações entre Rab27A e as proteínas leitoras de m6A YTHDC1 e IGF2BP2 (Figura 4B).

Para validar a interação entre o mRNA YTHDC1 e Rab27A, foram realizados ensaios de imunoprecipitação de RNA (RIP). O mRNA Rab27A foi significativamente enriquecido em complexos imunoprecipitados com anticorpo anti-YTHDC1 em comparação com o controle da imunoglobulina G (IgG) (Figura 4C).

Como o YTHDC1 funciona como um leitor nuclear de m6A envolvido na exportação deRNA 41, foram realizados ensaios de fracionamento nuclear e citoplasmático. O knockdown do YTHDC1 aumentou significativamente a retenção nuclear do mRNA Rab27A, ao mesmo tempo em que reduzia sua abundância citoplasmática (Figura 4D).

O efeito do YTHDC1 na expressão de Rab27A foi avaliado mais detalhadamente. A análise quantitativa de PCR em tempo real demonstrou que a depleção de YTHDC1 reduziu a expressão de mRNA Rab27A (Figura 4E). Consistentemente, a análise por western blot mostrou diminuição na expressão da proteína Rab27A após o knockdown do YTHDC1 (Figura 4F).

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Figura 4: A exportação citoplasmática do Rab27A modificado com m6A foi facilitada pelo YTHDC1. (A) Locais de modificação de m6A previstos dentro de Rab27A identificados usando a ferramenta de predição SRAMP. (B) Interações previstas entre Rab27A e as proteínas leitoras de m6A YTHDC1 e IGF2BP2 identificadas usando StarBase. (C) Ensaio de imunoprecipitação de RNA (RIP) demonstrando a interação entre o mRNA YTHDC1 e Rab27A. **P < 0,01. IgG serviu como controle negativo. O enriquecimento Rab27A foi normalizado à porcentagem de entrada. A faixa de imunoblot YTHDC1 reflete a eficiência da imunoprecipitação. (D) Análise de fracionamento nuclear e citoplasmático demonstrando aumento da retenção nuclear de Rab27A após o knockdown do YTHDC1. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E–F) Expressão de YTHDC1 e Rab27A após o knockdown do YTHDC1. A expressão de mRNA foi determinada por q-PCR (E), e a expressão proteica foi determinada por western blotting (F). β-actina servia como controle de carga. **P < 0,01. si-NC, siRNA controle negativo. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas. Os dados são apresentados como média ± SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estabilização de Rab27A por meio da interação com IGF2BP2

A interação entre IGF2BP2 e Rab27A foi investigada usando ensaios RIP. O mRNA Rab27A foi significativamente enriquecido em complexos imunoprecipitados com anticorpo anti-IGF2BP2 em comparação com o controle IgG, indicando uma associação entre IGF2BP2 e o mRNA Rab27A (Figura 5A).

A análise de imunofluorescência demonstrou colocalização de IGF2BP2 e Rab27A predominantemente dentro do citoplasma (Figura 5B). Para determinar o efeito funcional da IGF2BP2 na expressão de Rab27A, IGF2BP2 foi silenciado usando siRNA. A análise quantitativa de PCR em tempo real revelou uma redução significativa nos níveis de mRNA Rab27A após IGF2BP2 depleção (Figura 5C). Consistente com esses achados, a análise western blot mostrou diminuição da expressão da proteína Rab27A após IGF2BP2 knockdown (Figura 5D).

O efeito da IGF2BP2 sobre a estabilidade do mRNA Rab27A foi posteriormente avaliado. IGF2BP2 depleção reduziu significativamente a meia-vida do mRNA Rab27A e reduziu a estabilidade dos transcritos (Figura 5E).

figure-results-5
Figura 5: Estabilização de Rab27A por meio da interação com IGF2BP2. (A) Ensaio de imunoprecipitação de RNA demonstrando a associação entre IGF2BP2 e o mRNA Rab27A. IgG serviu como controle negativo. O enriquecimento Rab27A foi normalizado à porcentagem de entrada. P < 0,001. (B) Análise de imunofluorescência demonstrando a colocalização de Rab27A e IGF2BP2 no citoplasma. Núcleos foram contra-coloridos com DAPI. Barra de escala = 20 μm. (C–D) Regulação para baixo de Rab27A após IGF2BP2 depleção. Os níveis de mRNA Rab27A foram determinados por q-PCR (C), e os níveis de proteína foram determinados por western blotting (D). β-actina servia como controle de carga. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Estabilidade do mRNA Rab27A após IGF2BP2 knockdown. Os níveis de mRNA de Rab27A foram normalizados para o grupo si-NC correspondente em 0 h. **P < 0,01. si-NC, siRNA controle negativo. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas. Os dados são apresentados como média ± SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O silenciamento de YTHDC1 ou IGF2BP2 diferenciação osteoclasta suprimida de BMMs induzida por M-CSF e RANKL

Para investigar mais a fundo a relação funcional entre YTHDC1, IGF2BP2 e Rab27A durante a diferenciação de osteoclastos, experimentos de knockdown foram realizados em BMMs.

A estimulação de M-CSF e RANKL aumentou significativamente a expressão de mRNA de Rab27A, YTHDC1 e IGF2BP2 (Figura 6A). Correspondentemente, a expressão proteica dessas moléculas também foi elevada após a indução osteoclasta (Figura 6B). Silenciar tanto o YTHDC1 quanto o IGF2BP2 reduziu significativamente a expressão de Rab27A, enquanto o knockdown de um regulador não afetou substancialmente a expressão do outro.

A coloração TRAP demonstrou que a depleção de YTHDC1 ou IGF2BP2 suprimiu significativamente a atividade osteoclasta induzida por M-CSF e RANKL (Figura 6C). Além disso, a análise quantitativa em tempo real por PCR revelou redução na expressão de TRAP, NFATc1 e c-FOS após YTHDC1 ou IGF2BP2 knockdown (Figura 6D). A análise de Western blot confirmou reduções correspondentes no nível da proteína (Figura 6E).

Coletivamente, esses achados indicam que YTHDC1 e IGF2BP2 promovem a diferenciação de osteoclastos por meio da regulação da expressão de Rab27A.

figure-results-6
Figura 6: Silenamento do YTHDC1 ou IGF2BP2 diferenciação osteoclasta suprimida de BMMs induzida por M-CSF e RANKL. (A–B) Expressão de Rab27A após YTHDC1 ou IGF2BP2 knockdown. Os níveis de mRNA (A) e proteína (B) de Rab27A foram determinados por q-PCR e western bloting, respectivamente. β-actina servia como controle de carga. P < 0,001. (C) Coloração TRAP demonstrando supressão da atividade osteoclasta após YTHDC1 ou IGF2BP2 depleção. Barra da escala = 50 μm. **P < 0,01, ***P < 0,001. (D–E) Expressão de marcadores de diferenciação osteoclasto após YTHDC1 ou IGF2BP2 depleção. Os níveis de mRNA TRAP, NFATc1 e c-FOS foram determinados por q-PCR (D), e os níveis de proteína foram determinados por western blot (E). β-actina servia como controle de carga. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Controle de células não tratadas; si-NC, siRNA controle negativo. Três réplicas biológicas independentes foram realizadas. Os dados são apresentados como média ± SD. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados durante o estudo atual (incluindo dados de western blot, conjuntos de dados de imagem, análises quantitativas e arquivos fonte) durante este estudo foram fornecidos no Arquivo Suplementar 1.

Arquivo Suplementar 1: Os conjuntos de dados e dados brutos deste estudo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A diferenciação osteoclasta desempenha papéis essenciais na remodelação óssea, reabsorção óssea, reparo de fraturas e homeostase esquelética12˒15˒17˒18˒42˒43. A atividade excessiva dos osteoclastos é um dos principais fatores que contribuem para a osteoporose, tornando a identificação de vias regulatórias que controlam a diferenciação dos osteoclastos um objetivo importante da pesquisa. Diversas terapias anti-resorptivas voltadas para a função osteoclasta demonstraram eficácia clínica 6,44,45. Por exemplo, o denosumabe tem sido associado à redução da incidência de fraturas e a um perfil de segurançafavorável 6, enquanto o inibidor da catepsina K ONO-5334 apresentou efeitos benéficos sobre a densidade mineral óssea e a resistência óssea em primatas não humanos ovariectomizados44. O presente estudo identificou um mecanismo regulatório dependente de m6A anteriormente não reconhecido, envolvendo YTHDC1, Rab27A e IGF2BP2 que promove a diferenciação de osteoclastos e a progressão da osteoporose. Esses achados fornecem novos insights sobre a regulação molecular da osteoclastogênese e sugerem potenciais alvos terapêuticos para a osteoporose.

Rab27A já foi implicado anteriormente na diferenciação osteoclasta e na reabsorção óssea por meio da regulação do tráfego vesicular e sinalização intracelular, podendo também influenciar cascatas de sinalização induzidas por RANKL por meio da reciclagem endossômica dereceptores-chave 28,29. Consistente com esses relatos, a expressão de Rab27A aumentou significativamente durante a diferenciação de osteoclastos, enquanto a depleção de Rab27A suprimiu a diferenciação de osteoclastos in vitro e aliviou a perda óssea associada à osteoporose in vivo. Esses achados apoiam um papel crítico do Rab27A na biologia dos osteoclastos e ampliam ainda mais observações anteriores ao demonstrar que a atividade do Rab27A é regulada por mecanismos dependentes do m6A. Coletivamente, os achados sugerem que o Rab27A modificado por m6A pode regular esses processos no nível pós-transcricional e, consequentemente, influenciar a atividade reabsortiva óssea.

Evidências acumuladas indicam que a modificação m6A contribui para o desenvolvimento e progressão de doenças relacionadas aosossos 32. Análises bioinformáticas identificaram múltiplos sítios de modificação de m6A supostos dentro do mRNA Rab27A (Figura 4A), e estudos funcionais demonstraram que YTHDC1 e IGF2BP2 regulam a expressão de Rab27A e a diferenciação dos osteoclastos (Figuras 4–6). Esses achados sugerem que a modificação de m6A é um importante mecanismo regulador a montante que controla a função de Rab27A durante a osteoclastogênese. Como múltiplos sítios m6A previstos foram identificados dentro de Rab27A, estudos futuros devem determinar se locais individuais ou combinações de sítios são necessários para a regulação de Rab27A. A construção de mutantes Rab27A deficientes em m6A e experimentos subsequentes de resgate forneceriam evidências diretas da importância funcional da modificação de m6A nesse caminho.

Mecanisticamente, o presente estudo demonstrou que o YTHDC1 interage com o mRNA Rab27A e facilita sua exportação nuclear. Após a translocação citoplasmática, IGF2BP2 se associa diretamente ao mRNA Rab27A e aumenta a estabilidade dos transcritos. Consequentemente, a depleção de YTHDC1 ou IGF2BP2 reduziu a expressão de Rab27A e suprimiu a diferenciação dos osteoclastos. Esses achados apoiam um modelo no qual YTHDC1 e IGF2BP2 cooperam para manter a expressão de Rab27A coordenando o transporte e a estabilidade do mRNA. Esse mecanismo regulador amplia o entendimento atual sobre a regulação mediada por m6A da diferenciação osteoclasta e identifica múltiplos componentes dessa via como potenciais alvos terapêuticos.

Várias limitações devem ser reconhecidas. Primeiro, embora tenha demonstrado que Rab27A regula a diferenciação dos osteoclastos, seus potenciais efeitos na função dos osteoblastos não foram investigados. Como a homeostase óssea depende do equilíbrio entre a reabsorção óssea mediada por osteoclastos e a formação óssea mediada por osteoblastos, estudos futuros devem avaliar se Rab27A também influencia a diferenciação ou atividade dos osteoblastos. Segundo, o presente estudo baseou-se principalmente em abordagens de perda de função. A superexpressão complementar de Rab27A, YTHDC1 e IGF2BP2, juntamente com experimentos de resgate usando mutantes Rab27A deficientes em m6A, fortaleceriam ainda mais o modelo regulatório proposto. Terceiro, embora vários sítios m6A supostos dentro do mRNA Rab27A tenham sido previstos usando abordagens bioinformáticas, os locais específicos responsáveis por regular a função Rab27A permanecem não identificados e exigem validação experimental. Por fim, estudos adicionais são necessários para determinar se outras proteínas leitoras de m6A, proteínas de ligação a RNA ou vias de sinalização participam da regulação de Rab27A durante a diferenciação de osteoclastos.

A regulação imune surgiu como um componente importante da patogêneseda osteoporose 46,47. Rab27A estabeleceu funções na secreção de células imunes, liberação de grânulos citotóxicos, desgranulação de neutrófilos e regulação do microambientetecidular 48,49,50,51,52,53,54,55. Investigações mais aprofundadas da relação entre Rab27A, regulação imune e homeostase óssea podem fornecer informações adicionais sobre a patogênese da osteoporose.

Investigações futuras devem priorizar várias áreas-chave. Primeiro, é necessária uma mutagênese sistemática dos sítios m6A previstos dentro de Rab27A para identificar os sítios funcionais de ligação envolvidos na regulação mediada por YTHDC1 e IGF2BP2. Segundo, a superexpressão de Rab27A, YTHDC1 e IGF2BP2, juntamente com experimentos de resgate usando mutantes Rab27A deficientes em m6A, será essencial para estabelecer a contribuição direta do eixo regulatório YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2. Terceiro, a validação dessa via em modelos adicionais de osteoporose e a avaliação da função Rab27A em osteoblastos serão importantes para fundamentar ainda mais os achados atuais.

Em conclusão, o presente estudo identificou um novo eixo regulatório YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 que promove a diferenciação dos osteoclastos e a progressão da osteoporose. O YTHDC1 facilitou a exportação nuclear de mRNA de Rab27A modificado por m6A, enquanto IGF2BP2 melhorou a estabilidade do mRNA Rab27A no citoplasma. Esses eventos regulatórios coordenados aumentaram a expressão de Rab27A e promoveram a osteoclastogênese. Coletivamente, os achados ampliam a compreensão atual da regulação mediada por m6A na osteoporose e fornecem uma base para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas voltadas para a via YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2.

Divulgações

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esse trabalho foi financiado pelo Projeto de Cooperação Estratégica Científica e Tecnológica entre o Hospital Popular de Pengzhou e a Universidade de Medicina do Sudoeste (Bolsa nº 2023PZXNYD01) para Lian Tang.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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