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Artigo de método

A metafase DNA-FISH se espalha para distinguir o DNA extracromossômico de regiões de coloração homogênea em linhas celulares de câncer humano

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DOI:

10.3791/71970

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4 de agosto de 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Relatamos um protocolo de propagação metafásica DNA-FISH que detecta visualmente o número de cópias locustais e a localização dentro do genoma. Essa abordagem permite a resolução de estados de amplificação por célula única, especificamente em linhas celulares cancerígenas contendo DNA extracromossômico e regiões de coloração homogênea.

Resumo

O sequenciamento do genoma inteiro identifica amplificações focais de DNA com resolução de pares de bases, mas não pode determinar se sequências amplificadas residem no DNA extracromossômico (ecDNA, também conhecido como minutos duplos) ou em regiões de coloração homogênea (HSRs) integradas cromossômicamente. As dispersões metafásicas de hibridização in situ de fluorescência do DNA (DNA-FISH) continuam sendo o padrão ouro para distinguir esses estados de amplificação em resolução de célula única. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para disseminação da metafase DNA-FISH utilizando linhagens celulares de câncer humano, abrangendo cultura celular, parada de metafase, tratamento hipotônico, fixação, disseminação de cromossômicos, hibridização por sonda fluorescente e imagem por fluorescência. O protocolo incorpora etapas intermediárias de controle de qualidade para verificar a dispersão cromossômica bem-sucedida e otimizar a qualidade da dispersão da metafase, tornando o fluxo de trabalho acessível a laboratórios sem expertise especializada em citogenética. Os resultados demonstram visualização clara dos estados de amplificação de ECDNA e HSR usando sondas específicas do locus e ilustram artefatos técnicos comuns que podem afetar a interpretação. Esse protocolo oferece uma abordagem robusta e reprodutível para estudar a organização estrutural da amplificação de oncogenes em células cancerígenas.

Introdução

O genoma humano é organizado não apenas por sua sequência, mas também por sua estrutura, e mudanças em sequência ou estrutura podem levar ao câncer 1,2,3,4. A amplificação oncogênica está presente em aproximadamente 40% de todos os tumores, onde contribui para a iniciação, crescimento, metástase e resistência ao medicamento5. Em alguns casos, oncogenes amplificados são transportados por DNAs extracromossômicos (ecDNAs, também chamados de minutos duplos), que são elementos circulares, autorreplicantes e de fita dupla, que residem fora dos cromossomoslineares 6,7,8,9. ecDNAs são centenas de kilobases até megabases de tamanho10, 11. Devido à ausência de centrômeros, eles se segregam assimetricamente durante a mitose, levando a até 100+ cópias em um único núcleo 12,13,14,15,16,17,18. Essa segregação desigual gera variabilidade no número de cópias entre as células-filhas, o que impulsiona a rápida evolução tumoral e o baixo desfecho dos pacientes17,19.

Os ecDNAs existem em relação dinâmica com regiões de coloração homogênea (HSRs) (Figura 1A)8,18. As HSRs são amplificações focais intracromossômicas que podem surgir pela reintegração de ecDNAs em um único locus nogenoma 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Esses dois estados, ecDNAs e HSRs, podem se interconverter, revelando que a amplificação por oncogenes é estruturalmenteplástica 24,25,32,33. Essa interconversão tem relevância terapêutica porque os ecDNAs podem transitar para o estado HSR na presença de medicamentos 32,33,34,35,36,37,38. Células que passam por essa transição para o estado HSR então tornam-se resistentes ao medicamento sob pressãoterapêutica 33. As HSRs também parecem ser mais frequentes em tumores malignos do que em tumoresbenignos 39. Apesar de sua relevância clínica, nenhuma estratégia aprovada pela FDA mira o estado HSR, em parte porque os métodos para distinguir essas estruturas de amplificação continuam subutilizados.

Embora os estados de ecDNA e HSR tenham consequências clínicas distintas, as abordagens atuais de sequenciamento não conseguem distingui-los de forma confiável. O sequenciamento do genoma inteiro (WGS) agora identifica regiões amplificadas com resolução de par de bases40. O WGS tem sido valioso na definição da composição de sequências de ecDNAs e HSRs, mas em detrimento da resolução espacial. Ao contrário das abordagens citogenéticas tradicionais, a WGS sozinha não pode determinar se uma sequência amplificada reside em ecDNAs ou está integrada a um cromossomo como HSR 41,42,43. Como resultado, métodos que preservam o contexto espacial da amplificação continuam essenciais para entender a biologia desses estados distintos.

Nos últimos 40 anos, as propagações de metafase de hibridização in situ por fluorescência do DNA (DNA-FISH) serviram como padrão ouro para identificar e distinguir estados de amplificação de ecDNA eHSR 42,44,45,46. Na verdade, ECDNAs e HSRs foram identificados e caracterizados inicialmente por meio de análises citogenéticas baseadas emmetafases 7,47. Antes do uso generalizado de sondas fluorescentes, a hibridização in situ era realizada usando sondas de DNA radiomarcadas, que também foram usadas para visualizar ecDNAs e HSRs48,49. À medida que o WGS ganhou popularidade, as propagações da metafase DNA-FISH tornaram-se menos comuns. Muitos aspectos do fluxo de trabalho estão espalhados pela literatura citogenética, e protocolos otimizados são tipicamente mantidos em grupos de pesquisa individuais ou laboratórios de citogenética que tratam o método comoproprietário 50,51. Aqui, descrevemos um protocolo de propagação metafásica DNA-FISH para resolver visualmente o estado de amplificação no nível de célula única.

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Protocolo

Todos os procedimentos de cultura de células humanas foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais.

1. Deter células em metafase usando Colcemídeo (N-metil-N-deacetil-colchicina)

  1. Comece com aproximadamente 2,0 × 106–2,0 × 107 células cancerígenas ou outras células cultivadas. Poucas células demais gerarão menos dispersões de metafase, enquanto células demais podem resultar em fixação insuficiente.
  2. Determine o tempo de incubação apropriado do Colcemídeo para o sistema experimental. O tempo de incubação afeta o número de dispersões metafásicas obtidas e o comprimento cromossômico, e as condições ideais variam entre os tipos celulares.
    NOTA: Tempos de incubação mais curtos resultam em menos células paradas na metafase no momento da coleta. Tempos de incubação mais longos produzem mais cromossomos condensados com braços mais curtos, tornando a análise mais difícil. Para linhagens celulares cancerígenas com tempo de duplicação aproximado de 24 horas, períodos de incubação que variam de 45 minutos até a noite produzem propagações metafásicas adequadas. Otimize o tempo de incubação para células com tempos de duplicação mais lentos. Uma incubação de 2 horas geralmente é suficiente para produzir um número adequado de dispersões em metafase com comprimentos cromossômicos adequados para análise.
  3. Calcule a quantidade de Colcemídeo necessária para alcançar uma concentração final de 10 μL/mL no meio de cultura celular apropriado.
    NOTA: Mantenha as células em crescimento logarítmico passando ou semeando-as pelo menos 24 horas antes da parada da metafase. Trate as células com Colcemídeo quando as culturas atingirem 70%–90% de confluência.
  4. Dilua a solução de estoque de Colcemídeo 1:1 com água ultrapura estéril. Adicione o volume adequado à cultura e incube por 45 minutos até durante a noite em uma incubadora de cultura celular.

2. Colheita de células

  1. Prepare o fixador fresco de Carnoy (metanol 3:1: ácido acético). Mantenha o fixador no gelo durante todo o processo de fixação.
  2. Prepare uma solução fresca de 0,075 M KCl e aqueça-a em um banho-maria a 37 °C.
  3. Colete as células em um pellet e registre a contagem de células. Use esse valor para calcular o volume final de ressuspensão.
    NOTA: Descolar células aderentes por tripsinização. Transfira as células de suspensão diretamente para tubos centrífugos de 15 mL. Descarte Colcemid e meios contendo Colcemid conforme as diretrizes institucionais de resíduos perigosos.
  4. Lave as células com PBS.
  5. Suspenda suavemente as células em 10 mL de KCl morno de 0,075 M e misture por inversão suave. Esse tratamento hipotônico incha as células, permitindo que elas se rompam e dispersem os cromossomos durante a preparação da lâmina.
  6. Incube as células em banho-maria a 37 °C por 30 minutos.
  7. Adicione lentamente 2 mL de fixador Carnoy's gelado enquanto mistura suavemente a suspensão por inversão.
  8. Deixe as células descansarem por 5 minutos.
  9. Centrifuge a 500 × g por 5 minutos em temperatura ambiente (RT).
  10. Aspire cuidadosamente o sobrenadante ou remova-o com uma pipeta.
  11. Adicione lentamente 10 mL de fixador Carnoy's gelado em incrementos de 0,5 mL enquanto mistura suavemente após cada adição.
  12. Deixe as células em reposo por 10 minutos em tempo de descanso.
  13. Centrifuge a 650 × g por 5 minutos no RT.
  14. Repita os passos 2.10–2.13 duas vezes
  15. Durante a lavagem final, deixe as células suspensas no fixador de Carnoy.
    PAUSA: Armazene a suspensão de célula fixa a −20 °C ou prossiga imediatamente para a Seção 3.
    NOTA: Para amostras contendo menos de aproximadamente 3 × 106 células, realize a fixação em tubos microcentrífugas de 1,5 mL em vez de tubos cônicos maiores. Reduzir os volumes de 0,075 M KCl e o fixador de Carnoy 10 vezes, mantendo todos os tempos de incubação, temperaturas e condições de centrifugação.

3. Queda de mesa

  1. Retire a amostra de −20 °C e descongele-a para RT.
  2. Centrifuge a 800 × g por 7 minutos em tempo de descanso.
  3. Etiquete as lâminas de vidro e coloque-as no gelo.
  4. Usando a contagem de células obtida antes da fixação, calcule o volume do fixador de Carnoy necessário para resuspender o pellet em uma concentração final de aproximadamente 5 × 106 células/mL. Após a centrifugação, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta, deixando o volume calculado do fixador acima do pellet.
  5. Resuspenda as células fixas no fixador de Carnoy usando uma pipeta P1000.
  6. Transfira aproximadamente 300 μL da suspensão de célula fixa para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  7. Resuspenda completamente a amostra usando uma pipeta P200, pipeteando várias vezes para cima e para baixo.
  8. Aspire 60 μL das células ressuspensas usando uma pipeta P200.
  9. Segure a ponta da pipeta aproximadamente 1 m acima do lâmina de vidro sobre gelo e mire no centro do lâmina.
  10. Dispense lentamente uma gota da suspensão da célula no ferrolho.
    NOTA: Marque o local da queda na borda do lâmina com um marcador resistente ao etanol para facilitar a identificação nas etapas seguintes.
  11. Deixe as células secarem no gelo por 10 minutos.
  12. Coloque os lâminas em uma incubadora de lâminas a 80 °C por 10 minutos.
  13. Remova os slides com uma pinça e deixe esfriar ao toque.
  14. Examine as lâminas usando um microscópio de contraste de fase com um objetivo de 10× ou 20×. Confirme a presença de múltiplas dispersões de metafase bem dispersas sem sobreposição excessiva.

4. Pré-tratamento do ferrolho

  1. Prepare potes Coplin para as etapas de lavagem
    1. Prepare cada reagente fresco: 70% de ácido acético (40 mL), PBS (40 mL), PBS (45 mL), 70% de etanol (40 mL), 85% de etanol (40 mL) e 100% de etanol (40 mL).
  2. Coloque as lâminas de vidro em ácido acético a 70% por 2 minutos.
  3. Coloque as lâminas de vidro em 40 mL de PBS por 30 segundos.
  4. Coloque as lâminas de vidro em 45 mL de PBS por 5 minutos.
  5. Desidrate os deslizamentos do copo sequencialmente em 70%, 85% e 100% etanol por 1 minuto cada.
  6. Seque os slides ao ar no RT por 10 minutos.

5. Prepare a sonda

NOTA: Este protocolo utiliza sondas de DNA-FISH específicas para locus, comercialmente disponíveis, que hibridizam em uma região genômica de interesse.

  1. Selecione uma sonda que tenha como alvo o locus amplificado a ser examinado. Descongele a sonda e o buffer de hibridização conforme as instruções do fabricante. Deixe a sonda atingir o RT antes do uso.
  2. Prepare uma mistura de sonda contendo 1 μL de sonda e 4 μL de tampão de hibridização para cada lâmina de vidro.
    NOTA: A concentração ideal da sonda pode depender do fabricante e da sonda. A concentração aqui especificada foi otimizada de acordo com as sondas utilizadas neste estudo. No entanto, otimize a concentração da sonda para cada novo locus.
  3. Aplique 5 μL da mistura de sonda/tampão de hibridização no centro de cada ponto de gota na lâmina de vidro.
    NOTA: As sondas são sensíveis à luz. Minimize a exposição à luz durante o restante do procedimento armazenando os slides em uma gaveta escura entre as etapas e durante o processamento de outros slides.
  4. Coloque cuidadosamente uma capa sobre a amostra.
  5. Sele as bordas da cobertura com cimento de borracha.
  6. Coloque os lâminas de vidro em uma câmara úmida.
  7. Hibridize a sonda conforme o protocolo do fabricante. Permitir que a hibridização prossiga durante a noite (12–18 horas).

6. Lavagens pós-hibridização, contra-coloração, montagem e imagem

  1. Prepare potes Coplin para as etapas de lavagem
    1. Prepare cada reagente fresco: 2× SSC (40 mL), 0,4× SSC (40 mL), 70% etanol (40 mL), 85% etanol (40 mL), 100% etanol (40 mL) e PBS (45 mL).
    2. Prepare e armazene o SSC como solução de estoque 20× (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio, pH 7,0). Para preparar 1 L, dissolva 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio em 1 L de água ultrapura. Dilua o estoque para preparar soluções de trabalho de 2× SSC e 0,4× SSC conforme necessário.
  2. Aqueça a solução de 0,4× SSC a 72 °C em banho-maria.
  3. Remova os lâminas de vidro da câmara úmida e remova cuidadosamente o cimento de borracha.
  4. Coloque os slides de vidro em 2× SSC por 2 minutos em RT. Remova cuidadosamente os slides.
  5. Coloque as lâminas de vidro em 0,4× SSC pré-aquecidos a 72 °C por 2 minutos.
  6. Coloque os slides de vidro em 2× SSC por 1 minuto em RT.
  7. Desidrate os deslizamentos do copo sequencialmente em 70%, 85% e 100% etanol por 1 minuto cada.
  8. Seque os slides ao ar no RT por 10 minutos no escuro.
  9. Dilua 1 mg/mL de DAPI 1:1000 em PBS até um volume final de 1 mL.
    NOTA: Esta alíquota pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
  10. Pipete 10 μL do DAPI diluído em cada lâmina de vidro no local de queda marcado.
  11. Coloque cuidadosamente um engobe sobre a amostra para garantir que a solução DAPI se espalhe uniformemente.
  12. Incube os slides no escuro por 5 a 10 minutos.
  13. Coloque as lâminas de vidro em PBS por 30 segundos.
  14. Remova as coberturas.
  15. Coloque as lâminas de vidro em PBS por 2 minutos.
  16. Desidrate o vidro deslizando mergulhando brevemente em 70%, 85% e 100% de etanol por aproximadamente 10 s cada.
  17. Seque os slides ao ar no RT por 10 minutos no escuro.
  18. Adicione 15 μL de meio de montagem em cada lâmina de vidro e depois coloque uma cobertura por cima.
  19. Deixe o meio de montagem se espalhar uniformemente e depois limpe suavemente o excesso.
  20. Vede as bordas da capa com esmalte.
  21. Deixe o esmalte secar por 15 minutos em tempo de descanso no escuro.
    PAUSA: Armazene os slides a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
  22. Imagine os slides.
    NOTA: As imagens foram obtidas usando um microscópio de fluorescência invertida com objetivo de imersão em óleo de 60×.
  23. Colete múltiplos z-stacks para cada canal de fluorescência para capturar o sinal durante toda a profundidade da dispersão da metafase.
  24. Desconvolva as pilhas de imagens usando um algoritmo de estimativa de máxima verosimilhança para melhorar a clareza do sinal e reduzir a fluorescência fora de foco.
  25. Processe e analise as imagens finais no ImageJ, e selecione o plano focal ótimo para cada dispersão de metafase antes da análise a jusante.

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Resultados

Este protocolo (Figura 1B) fornece cromossomos metafásicos limpos, bem dispersos e intactos, adequados para análise citogenética, com cromossomos e sinais DNA-FISH claramente visíveis por microscopia de fluorescência. O uso de um microscópio de campo claro/contraste de fase em baixa ampliação (10× ou 20×) é uma etapa importante de controle de qualidade para verificar se os núcleos romperam e os cromossomos se dispersaram (Figura 2

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Discussão

Apesar de suas vantagens bem estabelecidas, as propagações da metafase DNA-FISH são subutilizadas na era do WGS. A organização física do DNA amplificado é funcionalmente significativa, pois pode influenciar o comportamento biológico a jusante e a resposta terapêutica 61,62,63,64. Oncogenes amplificados focalmente podem existir em ecDNA ou dentro de HSRs, e esse...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo NIH R00HG011467 e CPRIT RR23004 para o G.S.E. A imagem para este projeto foi apoiada pelo Núcleo Integrado de Microscopia do Baylor College of Medicine, com financiamento do NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). Os autores agradecem ao Dr. Pawel Stankiewicz por seus conselhos desde o início. Os autores também agradecem ao Dr. Paul Mischel (Universidade de Stanford) por fornecer as linhas celulares GBM39ec e GBM39hsr.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
15-mL conical centrifugeany sourceNACentrifugação. 
15-mL conical tubesany sourceNAColeta de células.
200 proof ethanolany sourceNAPassos de lavagem. 
Ácido Acético, glacial, 99,7%Millipore Sigma695092Fixador Carnoy e passos de lavagem de lâmina.
Antifade Mounting MediumFisherScientificNC9265087Montagem de lâmina após a preparação concluída
Gabinete de segurança biológica com saída de vácuoany sourceNAArmazenamento de produtos químicos.
Colcemid (N-metil-N-deacetil-colchicina)Millipore Sigma10295892001Liga-se à tubulina, prende as células em metáfase.
Coplin jarsany sourceNAPassos de lavagem. 
DAPI (4',6-diamino-2-fenilindol)Milipore SigmaD8417-1MGCorante de DNA fluorescente.
EGFR/CON7 FISH probe Empire GenomicsEGFR-CHR07Sonda fluorescente específica de locus. 
Elmer's rubber cementany sourceNAManter a lâmina de cobertura no lugar durante a hibridização da sonda durante a noite.
Marcador permanente resistente ao etanolany sourceNARótulo de lâmina.
Microscópio fluorescenteany sourceNAImagem da lâmina. 
Lâmina de Vidro, pré-limpaVWR48311-703Para colocar as dispersões de metáfase e realizar DNA-FISH.
Incubadora com CO2 umidificadoany sourceNAIncubação de células vivas.
Hybridization BufferEmpire GenomicsHyb-BufferBuffer usado com a sonda. 
Balde de geloany sourceNAManter o fixativo de Carnoy frio. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GInchar as células antes da fixação. 
Metanol, 99,9%, grau HPLCMillipore Sigma1060351000Para fixativo de Carnoy. 
Microcentrifugaany sourceNACentrifugação. 
Tubos de microcentrifugaany sourceNAPara células durante a fixação e para preparação da sonda. 
MYC / SE 8 ProbeLeicaKI-10106Sonda fluorescente específica de locus. 
PBS, pH 7,4Gibco10010-023Passos de lavagem. 
Microscópio de contraste de faseany sourceNAImagem das dispersões de metáfase imediatamente após a colocação
Pontas de pipetaany sourceNAPipetagem.
Cloreto de sódioMillipore SigmaS9888Para o tampão SSC.
Citrato de sódioMillipore Sigma567446Para o tampão SSC.
Água estéril ultrapuraany sourceNAPassos de lavagem. 
Incubadora de lâmina programável ThermoBriteany sourceNAIncubação de lâmina.
Tenazesany sourceNAPara passos de lavagem da lâmina. 
Banho d'águaany sourceNAPara a incubação de KCl. 

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