A coleta de sangue na artéria caudal em ratos sob anestesia com isoflurano permite a obtenção controlada de volumes sanguíneos comparativamente grandes com baixo estresse. A recuperação rápida e a adequação para amostragens repetidas tornam este método ideal para estudos longitudinais que exigem parâmetros fisiológicos confiáveis.
Relatório rápido
A Coleta de Sangue da Artéria Caudal em Ratos Anestesiados com Isoflurano Reduz o Estresse e Melhora a Confiabilidade
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este método descreve a coleta de sangue por meio da artéria da cauda em ratos anestesiados com isoflurano. O uso de isoflurano minimiza movimentos defensivos, permitindo assim um procedimento controlado e de baixo estresse tanto para o animal quanto para o pesquisador. Outras vantagens incluem a recuperação rápida dos animais após a coleta, devido à natureza de curta duração do isoflurano, a capacidade de coletar volumes sanguíneos comparativamente grandes a partir de um único local de punção e a adequação da técnica para coletas sanguíneas repetidas. Além disso, o fluxo sanguíneo arterial rápido pode reduzir a probabilidade de artefatos de coagulação, embora isso não tenha sido especificamente avaliado no presente estudo. Os resultados foram determinados como parte de um estudo farmacocinético. A coleta de sangue foi bem-sucedida em todos os animais, resultando em uma taxa de sucesso de 100%. Nenhuma perda significativa de peso corporal foi observada 24 h após a coleta de sangue, e os animais apresentaram recuperação rápida, sem sinais visíveis de sofrimento ou complicações relacionadas ao procedimento. De modo geral, esta abordagem é altamente adequada para configurações experimentais que exigem coleta de sangue confiável e reprodutível com estresse mínimo de manipulação. Após uma breve fase de aprendizado, o procedimento mostrou-se confiável para uso experimental de rotina. Contudo, deve-se considerar a influência potencial da anestesia com isoflurano sobre parâmetros de gases sanguíneos, metabólicos e endócrinos ao planejar experimentos e interpretar os resultados.
Introdução
A coleta de sangue é uma técnica fundamental na pesquisa experimental com ratos para avaliar parâmetros fisiológicos e farmacocinéticos. As técnicas recomendadas incluem incisão da cauda, coleta da veia lateral da cauda, veia safena, veia sublingual, veia jugular e seio retro-orbital, além de cateterização1,2,3,4,5,6,7. No entanto, a escolha do método depende dos resultados desejados, e cada um possui limitações inerentes.
A coleta de sangue pela veia lateral da cauda e a incisão da cauda podem fornecer volumes limitados, enquanto a coleta retro-orbital, embora eficiente, é mais invasiva, afeta a recuperação1 e apresenta riscos de danos teciduais4,8 e preocupações éticas. A coleta da veia safena exige contenção e depilação do local da punção2, o que pode induzir estresse e afetar os resultados experimentais. Coletas repetidas de sangue da veia safena também podem ser desafiadoras devido ao comprimento curto da veia e à hemostasia. O mesmo se aplica à veia sublingual. Embora grandes volumes sanguíneos possam ser obtidos rapidamente por punção da veia jugular, existe o risco de lesão pulmonar que pode levar à pneumotórax. Além disso, como a veia não é visível, a punção deve ser realizada de forma cega6.
Neste contexto, métodos aperfeiçoados que minimizam o sofrimento animal ao mesmo tempo em que garantem alta qualidade da amostra estão se tornando cada vez mais importantes. A coleta de sangue da artéria da cauda sob anestesia com isoflurano oferece tal abordagem. O uso de anestesia inalatória de curta duração reduz o estresse provocado pelo manejo e facilita um procedimento controlado. Além disso, espera-se que a coleta de sangue arterial forneça amostras de sangue de boa qualidade com risco reduzido de artefatos de coagulação devido ao fluxo sanguíneo rápido. A técnica é particularmente adequada para coletas repetidas e delineamentos de estudos longitudinais, pois os animais se recuperam rapidamente e a perturbação fisiológica é minimizada. No geral, este método combina confiabilidade técnica com melhoria no bem-estar animal e, portanto, é muito adequado para configurações experimentais que exigem medições sanguíneas precisas e reprodutíveis.
Protocolo
Todos os experimentos envolvendo o método apresentado foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Viena e pelo Ministério Austríaco de Educação, Ciência e Pesquisa.
1. Preparação
OBSERVAÇÃO: Prepare todos os materiais necessários antes da anestesia para garantir um procedimento suave e eficiente.
- Encha a seringa com citrato a 3,2% (a quantidade depende dos parâmetros desejados) para prevenir a coagulação sanguínea.
- Regule o fluxo de oxigênio para 0,5 L/min, direcionando-o para a câmara de indução e para a máscara.
- Oclua a mangueira conectada à máscara para garantir que o gás de indução e o oxigênio sejam direcionados exclusivamente para a câmara.
- Retire o rato da gaiola e coloque-o dentro da câmara de indução.
- Feche a tampa da câmara de indução, certificando-se de que a cauda ou as patas do rato não fiquem presas.
- Regule o isoflurano para 3% (dependendo do sistema de mangueiras) e mantenha até que o animal apresente perda de movimento espontâneo e do reflexo de endireitamento.
- Balançe suavemente a câmara para frente e para trás para confirmar a perda do reflexo de endireitamento.
- Oclua a mangueira conectada à caixa para redirecionar o gás e o oxigênio para a máscara.
- Abra a tampa da câmara e retire o rato.
- Coloque o rato em posição supina sobre o tapete aquecido (38 °C), com o nariz posicionado dentro da máscara (Figura 1).
- Limpe a cauda com água e seque com papel-toalha.
- Desinfete a cauda com álcool.
- Confirme a ausência do reflexo interdigital apertando entre os dedos da pata traseira do rato e verificando a falta de resposta de retirada.
Figura 1: Posição do rato. O rato é posicionado de costas, com o nariz colocado na máscara de anestesia. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
2. Coleta de sangue
OBSERVAÇÃO: A artéria localiza-se na face ventral da cauda. O local ideal para punção situa-se entre a parte média e a distal da cauda. A artéria é identificada principalmente por sua posição anatômica, mas em ratos com pigmentação clara (por exemplo, Sprague Dawley), a artéria ventral da cauda pode ocasionalmente ser visível como um vaso esbranquiçado esverdeado. Nesse caso, a artéria ventral da cauda geralmente pode ser prontamente identificada na base da cauda por sua posição anatômica na linha média ventral. Uma vez identificada, seu trajeto pode ser seguido em direção distal até o local pretendido para punção.
- Siga a artéria do proximal para o distal.
- Oriente a bisel da agulha para cima.
- Insira a agulha em um ângulo aproximado de 30 ° (Figura 2).
- Avance a agulha cranialmente e depois paralelamente à cauda (Figura 2).
- Aspire o sangue para dentro da seringa (Figura 2).
NOTA: Se a agulha puder ser avançada facilmente, retire o volume necessário de sangue de acordo com as diretrizes aplicáveis. Se a pressão sanguínea for muito baixa para a coleta, reduza a concentração de isoflurano para 2,5% e repita o procedimento sem remover a agulha do local da punção. Para cada coleta subsequente de sangue, o local da punção deve ser posicionado cranialmente ao local anterior. - Use um cotonete para pressionar o local da injeção antes de remover a agulha.
- Desligue a anestesia gasosa e verifique o local da inserção.
NOTA: Assim que a hemorragia cessar, devolva o rato à sua gaiola de origem.
Figura 2: Local da punção. O local da punção situa-se ventralmente entre o terço médio e o terço distal da cauda, e a agulha deve ser inserida em um ângulo de 30°. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
3. Processamento do sangue
- Despeje o sangue coletado em um tubo.
- Armazene o sangue em gelo até a centrifugação.
Resultados
Os dados apresentados neste artigo metodológico foram obtidos durante um estudo farmacocinético. Apenas ratos Sprague Dawley machos com idade entre 6 e 8 semanas e peso corporal variando de 393 g a 429 g foram incluídos. Uma única amostra de sangue (0,3 mL) foi coletada da artéria da cauda no dia 0. O peso corporal foi registrado imediatamente antes da coleta de sangue e novamente 24 h após a amostragem. O gás anestésico foi rapidamente exalado, e os animais se recuperaram rapidamente. Logo em seguida, começaram a se alimentar e não apresentaram sinais de comprometimento do bem-estar geral. Os ratos não exibiram sinais de estresse ou medo ao serem retirados da gaiola para coletas subsequentes de sangue. Além disso, nenhum comportamento defensivo foi observado nos dias seguintes ao procedimento. Nenhum hematoma foi visível na cauda quando o procedimento foi realizado corretamente. Os animais não apresentaram sinais de dor nem imediatamente após a coleta de sangue nem nos dias seguintes, e os locais de coleta na cauda também eram indolores ao toque. Nenhuma perda de peso corporal foi observada nas 24 h seguintes à coleta de sangue. O peso corporal médio aumentou de 409 g no dia 0 para 419 g no dia 1, correspondendo a um ganho médio de peso corporal de 2,6% ±± 1,1%, sugerindo que o procedimento de coleta de sangue foi bem tolerado (Figura 3).
Figura 3: Variação do peso corporal. Peso corporal (g) antes (d0) e 24 h após (d1) a coleta de sangue em ratos (n = 12). Nenhuma perda de peso corporal foi observada após a coleta de sangue. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Discussão
A técnica de coleta de sangue apresentada na artéria caudal é particularmente adequada para estudos que exigem coletas repetidas de sangue ou volumes comparativamente grandes de amostra sanguínea. Em comparação com a coleta da veia caudal, a técnica facilita a obtenção de volumes maiores de sangue a partir de um único local de punção e pode oferecer vantagens práticas para coletas repetidas, já que a venopunção repetida pode tornar-se mais difícil devido à formação de hematoma e à reduzida acessibilidade venosa. De acordo com as recomendações da Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Sociedade de Ciências de Animais de Laboratório (GV-SOLAS) e da Federação de Associações Europeias de Ciências de Animais de Laboratório (FELASA), uma única coleta de sangue não deve exceder 10% do volume sanguíneo circulante, enquanto coletas diárias repetidas devem ser limitadas a aproximadamente 1% do volume sanguíneo circulante a cada 24 horas, seguidas por um período apropriado de recuperação. A técnica descrita permite obter esses volumes recomendados de coleta de forma confiável e reprodutível, tornando-a adequada tanto para protocolos de coleta única quanto para coletas repetidas de sangue.
Uma técnica ideal de coleta de sangue deve fornecer volumes sanguíneos suficientes para as análises pretendidas, minimizando ao mesmo tempo o estresse do procedimento e garantindo amostras de alta qualidade. A coleta de sangue do plexo venoso retro-orbital e da veia sublingual pode provocar problemas de coagulação devido ao trauma tecidual8,9, o que seria subótimo para estudos de coagulação. Da mesma forma, técnicas por gotejamento—como "massagear" a veia da cauda—também poderiam levar à coagulação induzida pela amostragem. Em comparação com esses métodos de coleta, o sangue arterial obtido pela cauda parece menos propenso à coagulação prematura. Isso pode ser atribuído ao processo rápido de coleta, à ausência de trauma tecidual e ao contato imediato do sangue com citrato na seringa, o que efetivamente previne a coagulação. Outras técnicas, como a punção da veia jugular, apresentam risco de lesão orgânica1,6, e os procedimentos recomendados de cateterização exigem anestesia geral, seguidos de cuidados pós-operatórios e manejo de feridas. A lavagem regular do cateter é necessária para prevenir obstruções, e existe sempre o risco de os animais removerem o cateter.
A coleta de sangue da artéria caudal exige uma breve sedação, pois os animais precisam ser posicionados em decúbito dorsal e a punção é dolorosa, tornando prováveis movimentos defensivos. O uso da anestesia com isoflurano minimiza os movimentos defensivos, permitindo que o procedimento seja realizado de maneira controlada e eficiente. Como resultado, a coleta de sangue pode ser concluída rapidamente, reduzindo a carga total sobre o animal em comparação com técnicas de venipuntura utilizando a veia da cauda, nas quais pode levar mais tempo para coletar a quantidade desejada de sangue. A ausência de movimentos defensivos também reduz a probabilidade de múltiplas picadas com a agulha. Importante ressaltar que os animais não percebem conscientemente o procedimento, recuperam-se rapidamente e geralmente retomam o comportamento normal logo após a coleta1. Após a coleta de sangue, os animais se recuperaram rapidamente da anestesia com isoflurano e normalmente retomaram o comportamento habitual logo em seguida. No presente estudo, o peso corporal medido 24 h após a coleta de sangue mostrou um leve aumento em comparação com o valor basal, sugerindo que a ingestão alimentar não foi afetada negativamente pelo procedimento e indicando uma recuperação de curto prazo sem intercorrências.
Sabe-se que o isoflurano reduz a pressão arterial10,11, o que pode complicar a coleta de sangue venoso devido à diminuição do enchimento venoso. Em contraste, realizar a coleta venosa sem anestesia exige contenção1,2, o que pode induzir estresse significativo e potencialmente afetar os resultados experimentais. Além disso, o estresse provoca vasoconstrição, o que também pode dificultar a coleta de sangue. A pressão arterial reduzida pode também afetar a coleta arterial; no entanto, em nossa experiência, esse problema pode ser facilmente gerenciado ajustando-se a concentração de isoflurano, mantendo assim um fluxo sanguíneo suficiente para a coleta.
Sabe-se, no entanto, que o isoflurano também influencia parâmetros fisiológicos, particularmente os valores dos gases sanguíneos, devido à depressão respiratória12,13. O isoflurano pode afetar a função respiratória e a troca gasosa, potencialmente alterando os níveis arteriais de oxigênio e dióxido de carbono. Vários estudos demonstraram que o isoflurano também pode alterar parâmetros metabólicos e endócrinos, incluindo glicose sanguínea, lactato, insulina, corticosterona e metabolismo lipídico14,15,16. Apesar disso, demonstrou-se que o isoflurano induz menos alterações em parâmetros relacionados ao estresse do que vários outros regimes anestésicos e oferece as vantagens de indução rápida, tempo curto de recuperação e controle preciso da profundidade anestésica, tornando-o adequado para procedimentos rotineiros de coleta de sangue14. Consequentemente, a possível influência do isoflurano deve ser considerada ao planejar e interpretar experimentos, pois amostras de sangue arterial obtidas sob anestesia podem não refletir com precisão as condições fisiológicas basais. Em estudos farmacocinéticos, no entanto, esses efeitos geralmente têm pouca relevância em comparação com os benefícios de obter amostras de sangue reprodutíveis enquanto se minimiza o estresse relacionado ao manejo.
Uma consideração adicional é a exposição ocupacional do pesquisador ao isoflurano. Como o sistema não é totalmente fechado, existe o risco de exposição ao gás anestésico durante o procedimento. Trabalhar sob uma capela de fluxo laminar ou com sistemas de aspiração apropriados minimizaria a exposição, mas esse equipamento pode não estar disponível em todos os ambientes experimentais.
No geral, a técnica descrita representa uma alternativa valiosa aos métodos convencionais de coleta de sangue, combinando qualidade esperada do amostra com redução do estresse e condições de manuseio aprimoradas. Oferece benefícios claros em termos de bem-estar animal e eficiência do procedimento. Sua adequação depende, em última instância, da questão de pesquisa específica, mas é particularmente vantajosa em condições experimentais nas quais parâmetros sanguíneos confiáveis e mínima perturbação fisiológica são essenciais.
Divulgações
O autor não tem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
O autor gostaria de agradecer Katharina Tillmann por inspirá-la a publicar este método.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de Anestesia | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | Anestesia Gasosa |
| Vacuete com Citrato (Citrato de Sódio 3,2%) | Greiner Bio-One | 454332 | Anticoagulante |
| Tubo Eppendorf 1,5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | Armazenamento de Sangue |
| Isóflurano Líquido (Isospire) | Dechra | Anestesia Gasosa | |
| Agulha (25 G ´ 5/8'') | BD Microlance | 300600 | Coleta de Sangue |
| Seringa 1 mL (Tuberculina Luer) | Chirana | CHTUB01 | Coleta de Sangue |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | Sistema de Aquecimento |
| Compressa de Celulose Zelletten 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | Hemostasia |
Referências
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