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Força e Duração do Sinal do TCR na Ativação e Diferenciação de Linfócitos T CD8+ Primários de Camundongo: Uma Abordagem In Vitro Padronizada

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DOI:

10.3791/71979

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25 de agosto de 2026

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método sistemático para ativar linfócitos T CD8+ naïve de camundongo primários utilizando uma abordagem de estimulação graduada do TCR, permitindo a análise abrangente da proliferação, ativação e produção de citocinas de linfócitos T CD8+ em diferentes intensidades de sinal do TCR.

Resumo

A intensidade e a duração do sinal do receptor de células T (TCR) são determinantes críticos da ativação, proliferação e diferenciação funcional de células T CD8⁺. No entanto, modelos padronizados in vitro que comparem sistematicamente como diferentes entradas de sinal do TCR moldam o destino das células T ainda são limitados. Este estudo apresenta um método reprodutível para ativar células T primárias de camundongos in vitro utilizando anti-CD3 ligado à placa e anti-CD28 solúvel, suplementado com interleucina-2 (IL-2), e examina como a modulação da concentração de anti-CD3 (força do sinal) e do tempo de estimulação (duração do sinal) influencia os resultados da ativação das células T. Descrevemos um protocolo para o isolamento de células T naïve de camundongos C57BL/6, seguido pela estimulação em uma faixa de concentrações de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) e durações (6–48 h). Realizamos análise por citometria de fluxo para avaliar a sinalização precoce induzida pelo TCR por meio da proteína ribossomal S6 fosforilada intracelular (p-S6) como indicador da atividade do complexo 1 do alvo mecanístico da rapamicina (mTORC1), e posteriormente avaliamos eventos downstream, incluindo marcadores de ativação de superfície (CD69, CD25, ICOS, PD-1), proliferação celular por meio da diluição do corante violeta de rastreamento de proliferação (CTV) e expressão de moléculas efetoras (Granzima B, TNF-α) como indicadores de diferenciação funcional. O método fornece um guia visual claro e passo a passo para a realização de estimulações reprodutíveis de células T, permitindo aos pesquisadores dissecar como parâmetros específicos do sinal do TCR direcionam as decisões de destino das células T. Essa abordagem não apenas apoia estudos mecanicistas da ativação e diferenciação de células T, mas também oferece uma plataforma para otimizar a condicionamento de células T para imunoterapia adotiva e ensaios de sensibilização in vitro. Ao integrar demonstração em vídeo com narração detalhada do protocolo, este protocolo aumentará a transparência metodológica e a reprodutibilidade na pesquisa de imunologia de células T.

Introdução

Os linfócitos T são indispensáveis para respostas imunes protetoras contra patógenos e tumores. Os linfócitos T ingênuos são ativamente mantidos em um estado de quiescência para preservar sua sobrevivência e persistência a longo prazo1. Após estimulação por antígeno, os linfócitos T saem da quiescência, passam por expansão clonal e diferenciação efetora2. A sinalização do receptor de células T (TCR) atua como o processo central para iniciar e regular as respostas imunes adaptativas3. Após o reconhecimento específico de moléculas de peptídeo-complexo major de histocompatibilidade (pMHC) apresentadas na superfície de células apresentadoras de antígenos (APCs), uma cascata de eventos de sinalização é desencadeada, promovendo assim a expansão clonal e a diferenciação funcional dos linfócitos T4,5,6.

A intensidade da estimulação do TCR, determinada por fatores-chave como afinidade, avidade e concentração do antígeno, desempenha um papel fundamental na regulação da magnitude da ativação de linfócitos T, na aquisição de funções efetoras e na trajetória de diferenciação em subconjuntos distintos de células T efetoras ou de memória7,8,9. Os modelos atuais in vitro para investigar a ativação de linfócitos T dependente do TCR empregam predominantemente anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 ligados a placas ou a microesferas, que fornecem simultaneamente a ligação do TCR e sinais coestimulatórios10,11. Embora esses sistemas sejam amplamente utilizados, normalmente empregam apenas uma única concentração, muitas vezes saturante, do anticorpo anti-CD3, permitindo apenas uma comparação binária do tipo tudo-ou-nada da ativação de linfócitos T, em vez de capturar a faixa dinâmica de intensidades de sinal do TCR alcançáveis com um gradiente titulado de estímulos12,13.

O protocolo descrito aqui fornece um sistema in vitro padronizado e reprodutível para avaliar sistematicamente como forças graduadas do sinal do TCR modulam a ativação, a proliferação e os fenótipos funcionais de linfócitos T CD8+ murinos primários, utilizando gradientes titulados de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) e uma concentração constante de anti-CD28 (1 µg/mL). Esta abordagem baseia-se na citometria de fluxo multiparamétrica, que avalia tanto os eventos iniciais de sinalização — por meio da proteína ribossomal S6 fosforilada intracelular (p-S6) como indicador da atividade do complexo 1 alvo mecanístico da rapamicina (mTORC1) — quanto os desfechos celulares posteriores, incluindo a proliferação monitorada pela diluição de CTV, marcadores de superfície de ativação (CD69, CD25, coestimulador induzível de linfócitos T [ICOS], proteína 1 de morte celular programada [PD-1]) e a expressão de moléculas efetoras (Granzima B, fator de necrose tumoral alfa [TNF-α]), ao longo de um período de tempo entre 6 e 48 horas.

Nosso protocolo emprega um gradiente de concentração de anticorpos anti-CD3 ligados à placa para modular com precisão a intensidade da estimulação, imitando assim a avidez diferencial de ligação do TCR observada em condições fisiológicas. O método alcança alta eficiência no cruzamento do TCR e ativação robusta de linfócitos T primários em repouso. O procedimento padronizado de revestimento garante distribuição uniforme dos anticorpos na superfície da placa, resultando em estimulação consistente entre as células dentro do mesmo lote e excelente reprodutibilidade experimental. Este formato oferece uma abordagem economicamente viável e operacionalmente simples para a ativação de linfócitos T.

No entanto, certas limitações dessa abordagem devem ser reconhecidas. A estimulação mediada por anticorpos anti-CD3/CD28 difere acentuadamente do contexto fisiológico in vivo. Embora métodos experimentais que utilizam apenas anticorpos agonistas anti-CD3 e anti-CD28 para avaliar a ativação de linfócitos T possam fornecer leituras eficazes da ativação, eles não conseguem recapitular completamente as interações entre células apresentadoras de antígeno e linfócitos T, bem como o microambiente de coestimulação que ocorre em condições fisiológicas14.

Apesar dessas limitações, este protocolo oferece uma plataforma sistemática e reprodutível que serve como uma ferramenta valiosa e acessível para investigar respostas de linfócitos T dependentes da intensidade do sinal do TCR e pode complementar modelos mais complexos específicos para antígenos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Terceira Universidade Médica Militar.

1. Preparação dos reagentes e placas

  1. Prepare o anticorpo anti-CD3 adsorvido em placa em PBS estéril nas concentrações de 0,1, 0,5, 1, 5 e 10 µg/mL.
  2. Adicione 50 µL da solução de revestimento com anti-CD3 por poço em placas de 96 poços com fundo plano.
  3. Sobreponha as placas com filme vedante e incube durante a noite a 4 °C.
  4. Aspire a solução de revestimento e lave cada poço duas vezes com 200 µL de PBS estéril antes da adição das células.

2. Isolamento de linfócitos T CD8+ naïve do baço de camundongo

  1. Selecione camundongos machos C57BL/6 com 6–8 semanas de idade (adquiridos da Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) e eutanazie-os por inalação de CO2 seguida de fratura cervical. Os camundongos são mantidos em condições livres de patógenos específicos, com ciclo de 12 h de luz/escuro e livre acesso a alimento e água. No mínimo, 3 camundongos são utilizados por experimento independente.
  2. Incise cuidadosamente o peritônio com tesoura cirúrgica para expor o baço, segure e retire o baço com pinça e coloque-o em uma placa de coleta contendo RPMI 1640 pré-resfriado suplementado com 2% de soro bovino fetal (FBS) (R2). Mantenha a placa em gelo até a dissociação.
    NOTA: Colete todos os cadáveres animais e resíduos de cultura celular em sacos de biohazard designados e autoclave-os a 121 °C por 20 min antes do descarte.
  3. Remova o baço da placa de coleta e transfira-o para uma placa de 60 mm contendo 3 mL de tampão de lise 1 × amônio-cloreto-potássio (ACK).
  4. Prepare uma suspensão unicelular esmagando suavemente o baço através de um filtro celular de 70 µm usando o êmbolo de uma seringa de 3 mL.
  5. Incube a suspensão por 1 min à temperatura ambiente (RT), depois adicione 3 mL de meio R2 pré-resfriado para neutralizar o tampão de lise de amônio-cloreto-potássio (ACK).
  6. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 500 × g por 5 min a 4 °C.
  7. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 10 mL de tampão de marcação para citometria de fluxo (PBS com 2% de FBS).
  8. Filtre a suspensão através de um filtro celular de 70 µm para um novo tubo cônico de 15 mL, depois centrifugue novamente a 500 × g por 5 min a 4 °C.
    NOTA: O azida sódica deve ser omitido do tampão de marcação para citometria de fluxo para preservar a viabilidade celular em ensaios funcionais. Todas as amostras devem ser mantidas a 4 °C e analisadas imediatamente.
  9. Aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 200 µL de coquetel de anticorpos biotinilados por baço de camundongo (contendo anti-CD16/32 (bloqueio Fc), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 e anti-F4/80).
  10. Incube em gelo por 25 min, invertendo suavemente o tubo a cada 5 min para garantir mistura completa.
  11. Lave as células com grande volume de tampão de marcação para citometria de fluxo, centrifugue a 500 × g por 5 min e descarte o sobrenadante.
  12. Re-suspenda o pellet no mesmo volume de tampão de marcação para citometria de fluxo utilizado para o coquetel de anticorpos biotinilados, adicione microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina na metade desse volume e incube em gelo por 15 min, invertendo suavemente o tubo a cada 5 min para garantir mistura completa.
  13. Centrifugue brevemente o tubo, coloque-o em um suporte magnético por 2–3 min e transfira cuidadosamente o sobrenadante (células T CD8+ naïve enriquecidas) para um novo tubo cônico de 15 mL.
  14. Lave as células coletadas uma vez com tampão de marcação para citometria de fluxo, centrifugue novamente a 500 × g por 5 min.
  15. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS (R10) para aplicações posteriores.

3. Marcação com corante violeta de rastreamento de proliferação (CTV) para acompanhamento da proliferação

  1. Prepare uma solução trabalho de CTV 2 × (10 µM) fresca imediatamente antes do uso. Misture completamente a solução estoque de CTV 5 mM (em dimetilsulfóxido [DMSO]) por vortex e dilua-a adicionalmente com PBS estéril para obter uma concentração final de 10 µM.
    CAUTION: Manipule a solução estoque de CTV (preparada em DMSO) com luvas de nitrila em capela, pois o DMSO facilita a absorção cutânea de compostos tóxicos. Evite inalação e contato com a pele.
  2. Resuspenda metade das células T CD8+ naïve isoladas em PBS pré-resfriado a uma densidade de 8 × 107 células/mL.
  3. Adicione rapidamente um volume igual de solução trabalho de CTV 2 × (10 µM) à suspensão celular e misture bem por pipetagem, obtendo uma concentração final de CTV de 5 µM.
  4. Incube as células à temperatura ambiente no escuro por 20 min, invertendo suavemente os tubos a cada 5 min para garantir uma mistura completa.
  5. Adicione 5 volumes de meio de cultura (contendo pelo menos 10% de SBF) às células e incube por 5 min no gelo para remover qualquer corante livre.
  6. Centrifugue as células a 500 × g por 5 min e ressuspenda o pellet em meio completo R10 recém-preaquecido, suplementado com anti-CD28 (concentração final: 1 µg/mL) e IL-2 (concentração final: 10 ng/mL).
  7. Adicione 250 µL de suspensão celular (contendo 6 × 105 células) a cada poço das placas de 96 poços previamente revestidas.
  8. Cultive as células a 37 °C com 5% de CO₂ por até 48 h.

4. Detecção de CTV por citometria de fluxo

  1. Coletar as células em uma placa de fundo redondo de 96 poços aos 6, 36 e 48 h. Centrifugar a 500 × g durante 5 min e lavar duas vezes com tampão de marcação para citometria de fluxo.
  2. Para marcação de superfície, incubar as células com 50 µL de um coquetel de anticorpos contendo anti-CD8, corante viável fixável e anti-CD44 por 30 min no gelo no escuro.
    NOTA: Coletar todos os sobrenadantes contendo anticorpos conjugados a fluoróforos em recipientes designados para resíduos suplementados com hipoclorito de sódio a 0,5% para descontaminação e descartá-los de acordo com os protocolos institucionais para resíduos biologicamente perigosos.
  3. Lavar as células duas vezes com tampão de marcação para citometria de fluxo e ressuspender em 200 µL de tampão de marcação para citometria de fluxo para aquisição no citômetro de fluxo.
  4. Adquirir as amostras em um citômetro de fluxo equipado com três lasers. Preparar tubos controle monocromáticos utilizando células marcadas para definir os parâmetros de compensação.
  5. Aplicar a seguinte estratégia de seleção: excluir detritos pela seleção de dispersão para frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC), eliminar dupletos pela seleção de células singulares e selecionar linfócitos T CD8+ viáveis (negativos para corante viável fixável) para análise.
  6. Coletar pelo menos 1 × 104 eventos de células T CD8+ selecionadas por amostra. Analisar os dados utilizando o software de análise de citometria de fluxo e calcular a proporção de células que sofreram uma ou mais divisões utilizando o módulo de análise de proliferação.

5. Coloração de superfície e intracelular para ativação e sinalização

  1. Resuspenda a outra metade das células T CD8+ ingênuas em R10 suplementado com anti-CD28 a 1 µg/mL e IL-2 a 10 ng/mL, na concentração de 2,4 × 106 células/mL.
  2. Adicione 250 µL da suspensão celular (6 × 105 células) a cada poço das placas de 96 poços pré-revestidas.
  3. Cultive as células a 37 °C com 5% de CO₂ por até 48 h.
  4. Nos pontos de tempo indicados (6, 10, 12, 24 e 36 h), colete as células em uma placa de fundo redondo de 96 poços.
    NOTA: O tempo de 6 h capta a sinalização inicial do TCR (fosfo-S6) e CD69; este último é avaliado adicionalmente aos 12, 24 e 36 h para captar sua cinética completa. CD25, PD-1 e ICOS são monitorados aos 10, 12, 24 e 36 h; o ponto de tempo de 48 h é reservado para a proliferação (Seção 4) e detecção de citocinas (Seção 6).
  5. Centrifugue a 500 × g durante 1 minuto e resuspenda o pellet celular em 200 µL de tampão de marcação para citometria de fluxo.
  6. Centrifugue a 500 × g durante 1 minuto e aspire o sobrenadante. Lave as células duas vezes com 200 µL de tampão de marcação para citometria de fluxo.
  7. Para marcação de superfície, incube as células com 50 µL de um coquetel de anticorpos contendo anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS e corante viável fixável por 30 minutos no gelo, protegido da luz.
  8. Lave as células três vezes com tampão de marcação para citometria de fluxo para remover anticorpos não ligados.
  9. Resuspenda o pellet celular em 200 µL de paraformaldeído a 1%, e fixe as células à temperatura ambiente (RT) por 15 minutos, protegido da luz.
    CAUTELA: Realize todos os passos que envolvem paraformaldeído em capela de exaustão para evitar inalação de vapores. Colete todos os resíduos líquidos contendo fixador em um recipiente separado, identificado para descarte de produtos químicos perigosos.
  10. Centrifugue a 500 × g durante 1 minuto e lave uma vez com tampão de marcação para citometria de fluxo.
  11. Pré-aqueça o tampão de lise/fixação 5 × à temperatura ambiente e prepare a solução de trabalho 1 × com água destilada.
  12. Adicione 200 µL da solução de trabalho (tampão de lise/fixação 1 ×) a cada poço e incube as células à temperatura ambiente, protegido da luz, por 30 minutos.
  13. Lave duas vezes com tampão de permeabilização/lavagem 1 × para marcação de epítopos fosforilados. Resuspenda o pellet em tampão de permeabilização/lavagem 1 × para marcação de epítopos fosforilados e incube à temperatura ambiente, protegido da luz, por 10 minutos.
  14. Centrifugue a 500 × g durante 1 minuto e descarte os sobrenadantes.
  15. Para marcação intracelular, incube as células com 50 µL de um coquetel de anticorpos contendo anti-p-S6 por 60 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz.
  16. Lave as células três vezes com tampão de permeabilização/lavagem 1 × para marcação de epítopos fosforilados.
  17. Para marcação com anticorpo secundário, incube as células com 50 µL de um coquetel de anticorpos contendo anticorpo secundário anti-coelho por 30 minutos no gelo, protegido da luz.
  18. Lave as células três vezes com tampão de permeabilização/lavagem 1 × para marcação de epítopos fosforilados e uma vez com tampão de marcação para citometria de fluxo.
  19. Resuspenda o pellet celular em 200 µL de tampão de marcação para citometria de fluxo e adquira as amostras no mesmo citômetro de fluxo.
  20. Aplicar a mesma estratégia de seleção de eventos descrita na Seção 4.5 e coletar pelo menos 1 × 104 células T CD8+ por amostra.
  21. Analise a intensidade média de fluorescência (MFI) para cada marcador utilizando software de análise de citometria de fluxo.

6. Bloqueio e detecção de citocinas intracelulares

  1. 5 h antes da colheita, adicione 100 µL por poço de R10 fresco suplementado com PMA (50 ng/mL), ionomicina (1 µg/mL), inibidores de transporte proteico (monensina) (1:1000) e inibidores de transporte proteico (baseados em brefeldina A) (1:1000). Misture suavemente e devolva as placas ao incubador a 37 °C para bloquear a secreção de citocinas e permitir o acúmulo intracelular.
  2. No ponto de tempo desejado, colete as células em uma placa de fundo redondo de 96 poços.
  3. Centrifugue a 500 × g durante 1 min e reconstitua o pellet celular em 200 µL de tampão de marcação para citometria de fluxo.
  4. Centrifugue a 500 × g durante 1 min e aspire o sobrenadante. Lave duas vezes com 200 µL de tampão de marcação para citometria de fluxo.
  5. Para marcação de marcadores de superfície, incube as células com 50 µL de um coquetel de anticorpos contendo anti-CD44, anti-CD8 e corante viável fixável por 30 min no gelo, protegido da luz.
  6. Lave três vezes com tampão de marcação para citometria de fluxo para remover anticorpos não ligados.
  7. Permeabilize as células adicionando 200 µL de solução de fixação e permeabilização e incube por 30 min no gelo, protegido da luz.
    CAUTION: Realize todos os passos que envolvem a Solução de Fixação/Permeabilização (contendo paraformaldeído) em capela de exaustão para evitar inalação de vapores. Colete todos os resíduos líquidos contendo fixador em um recipiente separado identificado para descarte químico perigoso.
  8. Centrifugue a 500 × g durante 1 min e descarte o sobrenadante no resíduo químico perigoso.
  9. Lave as células três vezes com tampão de permeabilização/lavagem 1 ×.
  10. Para marcação intracelular de citocinas, incube com 50 µL de um coquetel de anticorpos contendo anti-TNF-α e anti-Granzima B por 30 min no gelo, protegido da luz.
  11. Lave as células três vezes com tampão de permeabilização/lavagem 1 × para remover anticorpos não ligados e realize uma lavagem final com tampão de marcação para citometria de fluxo.
  12. Reconstitua o pellet celular em 200 µL de tampão de marcação para citometria de fluxo e adquira as amostras no mesmo citômetro de fluxo.
  13. Aplicar a mesma estratégia de seleção de eventos descrita na Seção 4.5 e coletar pelo menos 1 × 104 células T CD8+ por amostra. Analise a porcentagem de positividade e a MFI para cada marcador utilizando software de análise de citometria de fluxo.

Resultados

Para investigar os efeitos de diferentes intensidades de estimulação com anti-CD3 na ativação de linfócitos T, isolamos esplenócitos murinos e purificamos células T CD8+ para cultivo in vitro, seguido da realização de ensaios de ativação de células T e análise por citometria de fluxo. Para análise dos dados, os linfócitos foram primeiramente selecionados utilizando uma combinação de FSC-A e SSC-A, seguido do isolamento de células únicas por meio de FSC-H e FSC-W, e depois SSC-H com SSC-W. As células T CD8+ viáveis foram então selecionadas utilizando CD8 combinado com corante de viabilidade fixável para análises posteriores (Figura 1A).

Para validar que o sistema de estímulo com anticorpo imobilizado em placa ativa efetivamente os linfócitos T in vitro, examinamos a fosforilação da proteína ribossomal S6 (p-S6), um indicador bem estabelecido da atividade de mTORC1 e um ponto de convergência das vias PI3K-mTOR e MEK-ERK MAPK downstream do sinal proveniente do TCR15,16. Em consonância com esses achados, observamos um aumento dependente da dose nos níveis de p-S6 seis horas após o estímulo, com concentrações crescentes de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) (Figura 1B), confirmando que o sistema com anti-CD3 imobilizado em placa ativa o eixo TCR-mTORC1-S6 de maneira dependente da intensidade do sinal. Esse evento precoce de fosforilação é compatível com o envolvimento de vias metabólicas dependentes de mTORC1 que sustentam a subsequente proliferação e diferenciação efetora dos linfócitos T.

A proliferação celular foi avaliada por citometria de fluxo de diluição de CTV após estimulação do TCR com concentrações crescentes de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) em três pontos temporais após a estimulação: 6, 36 e 48 h. No ponto inicial de sinalização de 6 h, apenas uma diluição proliferativa mínima foi observada em todas as condições de estimulação. Após 36 h, o grupo com baixa dose de estimulação (0,1 µg/mL) ainda não conseguiu induzir expansão clonal apreciável, enquanto os grupos com doses intermediária e alta exibiram picos bem definidos de diluição de CTV (5 e 10 µg/mL), indicando o início da progressão do ciclo celular. Em 48 h, os fenótipos proliferativos diferenciais entre as concentrações de estimulação foram mais acentuados. A estimulação fraca do TCR (0,1 µg/mL) resultou em apenas 1,25% de células proliferantes e um único pico não diluído de CTV, indicando ativação subótima. A estimulação intermediária (1–5 µg/mL) induziu três picos de divisão definidos, com frações proliferativas aumentando de 70,8% para 84,0%. A estimulação forte (10 µg/mL) atingiu a fração proliferativa mais alta (89,5%), exibindo o número máximo de gerações de divisão e demonstrando a detecção de saturação da proliferação (Figura 2).

Em seguida, examinamos a expressão dos marcadores precoces de ativação CD69 e CD25. Notavelmente, o presente estudo revelou uma upregulação rápida e dependente da dose da expressão de CD69, com base na intensidade de fluorescência mediana (MFI). Sob estimulação intermediária e forte (5 e 10 µg/mL), CD69 foi rapidamente elevado em 24 h, seguido por uma diminuição gradual entre 24 e 36 h. No entanto, sob estimulação fraca (0,1, 0,5 e 1 µg/mL), CD69 foi progressivamente elevado durante toda a janela de estimulação. O perfil cinético de expressão de CD69 descrito acima é consistente com seu papel como marcador precoce de ativação de linfócitos T (Figura 3A)17. Curiosamente, observamos que a expressão de CD25 exibiu um aumento progressivo de maneira dependente da dose e do tempo (Figura 3B). Consistente com pesquisas anteriores, a upregulação de CD25 foi mais lenta do que a de CD69, especialmente sob estimulação ótima18,19.

Para investigar mais a fundo o efeito regulador da intensidade da estimulação do TCR sobre a expressão de receptores inibitórios e moléculas coestimuladoras em linfócitos T CD8+, analisamos os níveis de expressão de PD-1 e ICOS. A expressão induzível de PD-1 depende de estimulação intensa do TCR. No grupo de estimulação de baixa intensidade (0,5–1 µg/mL), o PD-1 foi expresso em níveis baixos durante todo o período de estimulação. Em contraste, no grupo de estimulação de intensidade média a alta (5–10 µg/mL), a expressão de PD-1 aumentou gradualmente a partir de 10 h e atingiu o pico em 36 h (Figura 4A). A expressão de ICOS também aumentou proporcionalmente com a intensidade crescente da estimulação e atingiu seu nível máximo em 5–10 µg/mL em 36 h (Figura 4B). Esses resultados sugerem que a estimulação intensa do TCR pode aumentar significativamente os níveis de expressão de PD-1 e ICOS.

Por fim, examinamos a capacidade funcional de linfócitos T estimulados após reestimulação com PMA e ionomicina em 24 h e 48 h pós-estimulação. Em 24 h, quantificamos a produção de TNF-α e Granzima B e observamos que as frequências de células TNF-α+, Granzima B+ e TNF-α+Granzima B+ foram progressivamente aumentadas de maneira dependente da dose de anti-CD3 (Figura 5A, B). Consistentemente, o MFI de TNF-α e Granzima B também mostrou um aumento dependente da concentração e atingiu o máximo sob estimulação de alta intensidade (10 µg/mL) (Figura 5C), refletindo uma diferenciação precoce em células efetoras dependente da dose, induzida pela intensidade graduada do sinal do TCR. Em 48 h, no entanto, esse padrão se inverteu acentuadamente. Concentrações mais altas de anti-CD3 reduziram significativamente as porcentagens de células TNF-α+Granzima B+ e reprimiram os níveis de expressão das moléculas efetoras em base por célula.

Todos os dados apresentados são representativos de 3 experimentos independentes. As análises estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA unidirecional ou bidirecional com teste post-hoc de Tukey; os dados são representados como média ± erro padrão da média (SEM). A viabilidade celular consistentemente excedeu 90%, e um mínimo de 1 × 104 eventos de células T CD8+ viáveis foi adquirido por amostra.

Dados de citometria de fluxo: diagramas de seleção de população celular, histogramas de quantificação proteica e gráfico de barras.
Figura 1: Ativação in vitro e análise por citometria de fluxo de linfócitos T CD8+. (A) Linfócitos T CD8+ purificados de esplenócitos de camundongo foram estimulados in vitro com diferentes concentrações de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) combinadas com uma concentração fixa de anti-CD28 (1 µg/mL) por 6 a 48 h, seguidos por análise de ativação celular por citometria de fluxo. Debris celulares foram excluídos por seleção com base na dispersão para frente (FSC) e dispersão lateral (SSC), dupletos foram excluídos por meio da seleção de células singletas, e células T CD8+ negativas para corante de viabilidade fixável foram finalmente selecionadas para análises posteriores. (B) Fosforilação da proteína ribossomal S6 (p-S6) em linfócitos T CD8+ 6 h após estimulação com as concentrações indicadas de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) mais anti-CD28 constante (1 µg/mL). Histograma representativo (esquerda) e resumo da MFI (direita). Os gráficos de citometria de fluxo são representativos de 3 experimentos independentes. Os dados mostram média ± SEM. Análise estatística: ANOVA unidirecional de medidas repetidas com teste pós-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Ensaio de proliferação celular, gráfico de histograma, mostrando CTV versus porcentagem de proliferação ao longo do tempo.
Figura 2: Análise de proliferação baseada na marcação com corante violeta de rastreamento de proliferação (CTV) de linfócitos T CD8+ primários de camundongo sob estimulação graduada do TCR. Linfócitos T CD8+ marcados com CTV foram estimulados in vitro com anti-CD3 em concentrações crescentes de 0,1–10 µg/mL por 6 a 48 h. A proliferação celular foi avaliada com base na diluição e atenuação da fluorescência do CTV em linfócitos T CD8+ por meio de análise por citometria de fluxo. Os histogramas mostram a distribuição da fluorescência do CTV em cada grupo de concentração, com a porcentagem de células que realizaram uma ou mais divisões indicada. Os gráficos de citometria de fluxo são representativos de 3 experimentos independentes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Análise por citometria de fluxo, expressão de CD69 e CD25, histograma e gráfico de linhas, ativação de células imunes.
Figura 3: Cinética de expressão dos marcadores precoces de ativação CD69 e CD25 em linfócitos T CD8+ após estimulação com anti-CD3. Linfócitos T CD8+ naïve foram estimulados com anti-CD3 ligado à placa nas concentrações indicadas (0,1–10 µg/mL) mais anti-CD28 constante (1 µg/mL). A expressão de CD69 foi medida aos 6, 12, 24 e 36 h; a de CD25 aos 10, 12, 24 e 36 h, e analisada por citometria de fluxo. Os painéis esquerdos mostram histogramas representativos nos pontos de tempo indicados; os painéis direitos apresentam as mudanças dinâmicas na MFI ao longo do tempo. (A) CD69. (B) CD25. Os gráficos de citometria de fluxo são representativos de 3 experimentos independentes. Os dados mostram média ± erro padrão da média (SEM). Análise estatística: ANOVA de dois fatores com medidas repetidas com teste pós-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Análise de citometria de fluxo, expressão de PD-1 e ICOS, histogramas e gráficos, resposta celular ao longo do tempo.
Figura 4: Cinética de expressão do receptor inibitório PD-1 e da molécula coestimuladora ICOS em linfócitos T CD8+ após estimulação com anti-CD3. Linfócitos T CD8+ ingênuos foram estimulados com anti-CD3 ligado à placa nas concentrações indicadas (0,1–10 µg/mL) mais anti-CD28 constante (1 µg/mL). As células foram coletadas aos 10, 12, 24 e 36 h e analisadas por citometria de fluxo. Os painéis esquerdos mostram histogramas representativos nos pontos de tempo indicados; os painéis direitos apresentam as mudanças dinâmicas na MFI ao longo do tempo. (A) PD-1. (B) ICOS. Os gráficos de citometria de fluxo são representativos de 3 experimentos independentes. Os dados mostram média ± erro padrão da média (SEM). Análise estatística: ANOVA bidirecional de medidas repetidas com teste post-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados da análise por citometria de fluxo, expressão de TNF-α e granzima B, gráficos de barras e dispersão, estudo imunológico.
Figura 5: A produção intracelular de citocinas por linfócitos T CD8+ depende da intensidade do TCR. Linfócitos T CD8+ naïve foram estimulados com concentrações crescentes de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) mais anti-CD28 constante (1 µg/mL). Após 24 h e 48 h da estimulação, as células foram coletadas após incubação de 5 h com inibidores do transporte proteico (monensina e brefeldina A) na presença de PMA e ionomicina, para bloquear a secreção de citocinas e permitir o acúmulo intracelular. (A) Os gráficos de contorno mostram as frequências de células positivas para TNF-α e granzima B em cada concentração e ponto temporal indicados. Células não estimuladas serviram como controle negativo. (B) As proporções de células TNF-α+, granzima B+ e TNF-α+ granzima B+. (C) O valor médio de fluorescência (MFI) de TNF-α e granzima B. Os gráficos de citometria de fluxo são representativos de 3 experimentos independentes. Os dados mostram média ± erro padrão da média (SEM). Análise estatística: ANOVA de dois fatores com medidas repetidas seguida pelo teste post-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, não significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

Este protocolo fornece um método sistemático e reprodutível para estudar respostas de células T dependentes da intensidade do sinal do TCR. A estratégia graduada de revestimento com anti-CD3 permite controle preciso sobre a intensidade da estimulação, permitindo aos pesquisadores dissecar a relação quantitativa entre a entrada do TCR e os resultados funcionais downstream. Pontos procedimentais fundamentais incluem a purificação de células T CD8⁺ ingênuas, controle preciso do gradiente de concentração do revestimento com anti-CD3 e normalização rigorosa do número de células por poço. Para garantir a comparabilidade dos dados entre experimentos, também recomendamos o uso de configurações instrumentais consistentes, matrizes de compensação e estratégias de seleção (gating), além da aplicação dos mesmos lotes de anticorpos e lotes de corantes viáveis fixáveis, sempre que viável. A confiabilidade dessas etapas críticas determina diretamente se os resultados experimentais podem refletir com precisão os efeitos de diferentes intensidades de estimulação do TCR sobre a dinâmica fenotípica das células T.

Neste protocolo, utilizamos a estimulação com anticorpos adsorvidos em placa, na qual anticorpos anti-CD3 são diretamente revestidos sobre a superfície da placa de cultura para promover a ligação cruzada do complexo TCR-CD3. Essa abordagem oferece baixo custo, distribuição uniforme dos anticorpos, variabilidade mínima entre poços e excelente reprodutibilidade. Notavelmente, a titulação das concentrações do anticorpo de revestimento permite uma modulação precisa e graduada da intensidade da estimulação, uma característica que distingue este sistema da estimulação com microesferas conjugadas, na qual a densidade de ligante é tipicamente fixa em um nível saturante, limitando a modulação fina do sinal14. No entanto, a estimulação com anticorpos adsorvidos em placa promove uma ligação cruzada do TCR suprafisiológica e sustentada, que difere fundamentalmente do engajamento transitório e dependente de afinidade induzido pelos complexos peptídeo-MHC em células apresentadoras de antígeno. Embora mais fisiologicamente relevante, a estimulação baseada em pMHC é tecnicamente desafiadora, exige expertise especializada para a produção de multímeros e apresenta custos substancialmente mais elevados. Para o isolamento celular, empregamos seleção imunomagnética negativa, que é simples, rápida e economicamente viável. Embora forneça menor pureza em comparação com a citometria de fluxo (FACS), evita o estresse mecânico e a marcação fluorescente, que podem comprometer o estado fisiológico das células classificadas20,21.

Questões principais que podem surgir durante a execução do protocolo incluem baixa pureza na separação, fraca proliferação, citotoxicidade induzida pelo CTV, baixa viabilidade pós-cultivo e coloração inconsistente. Para baixa pureza, certifique-se de misturar adequadamente as células com o coquetel de anticorpos biotinilados e as microesferas revestidas com estreptavidina, aumente o tempo de separação magnética, se necessário, e otimize a proporção entre microesferas e anticorpos para cada novo lote de reagentes. Se for observada mínima proliferação mesmo na maior concentração de anti-CD3, verifique a viabilidade e a pureza (especialmente contaminação por células CD44hi) das células naïve isoladas, confirme o procedimento de revestimento com anti-CD3 (selle as placas com filme vedante durante a incubação noturna a 4 °C e assegure cobertura uniforme do anticorpo) e valide a concentração de IL-2, pois essa citocina é essencial para sustentar a expansão de linfócitos T. Para citotoxicidade induzida pelo CTV, reduza a concentração de coloração mantendo uma resolução clara dos picos de divisão e certifique-se de que a etapa de quenching seja realizada rigorosamente em gelo durante os 5 minutos completos para remover o corante livre residual22,23. Para baixa viabilidade após o cultivo, controle a densidade celular, assegure volume suficiente de meio e mantenha técnica asséptica. Se for observada coloração inconsistente ou alta variabilidade na citometria de fluxo, prepare os coquetéis de anticorpos como misturas-mestre, proteja todas as amostras coradas da luz e utilize os mesmos lotes de anticorpos e os mesmos lotes de corantes vitais fixáveis entre as réplicas.

No entanto, este protocolo apresenta certas limitações. Sendo um sistema in vitro, não consegue recapitular o microambiente tecidual complexo, as interações celulares ou o ambiente de citocinas dos órgãos linfoides secundários. A janela de cultura é limitada a 48 h, restringindo a análise a eventos precoces de ativação e impedindo a avaliação da diferenciação tardia, exaustão ou formação de memória. Além disso, o protocolo depende fortemente de leituras por citometria de fluxo, o que exige rigorosa padronização das configurações do instrumento, matrizes de compensação e estratégias de seleção de eventos em experimentos independentes. Ademais, os achados obtidos com este sistema baseado em anti-CD3/CD28 derivam exclusivamente de linfócitos T CD8+ e podem não ser diretamente generalizáveis para linfócitos T CD4+, cujos limiares de ativação, requisitos de custimulação e trajetórias de diferenciação downstream são conhecidos por diferir12,24,25. Além disso, o estado basal de ativação dos linfócitos T pode variar entre colônias individuais de camundongos devido a diferenças na microbiota comensal, o que constitui uma fonte potencial de variabilidade entre laboratórios que deve ser considerada ao interpretar resultados entre estudos.

O sistema de estimulação graduada descrito aqui permite aos pesquisadores ajustar a intensidade do sinal do TCR a objetivos experimentais específicos com base nos padrões de resposta distintos observados em diferentes leituras. Esses dados revelam que a escolha da concentração de anti-CD3 e do momento da coleta deve ser orientada pela questão biológica em estudo. Para marcadores de ativação imediata, a upregulação de CD69 é detectável já entre 6–12 h em todas as concentrações, mas exibe cinética distinta: concentrações altas (5–10 µg/mL) induzem um pico rápido seguido por declínio, enquanto concentrações baixas (0,5–1 µg/mL) produzem um aumento gradual e sustentado. Para ensaios de proliferação, concentrações abaixo de 1 µg/mL são subótimas e podem servir como controles negativos internos, enquanto 5–10 µg/mL induzem de forma confiável uma expansão clonal robusta, detectável pela diluição de CTV em 48 h. A expressão do receptor co-inibitório PD-1 e da molécula coestimuladora ICOS requer estimulação de alta intensidade (5–10 µg/mL) e atinge seu pico em 36 h, indicando que estudos que investigam essas moléculas devem evitar condições com tempos mais curtos ou doses mais baixas. Para leituras de função efetora (TNF-α e Granzima B), a relação entre intensidade da estimulação e produção de citocinas é dependente do tempo e segue um padrão bifásico distinto. Em 24 h, a produção de moléculas efetoras aumenta positivamente com a concentração de anti-CD3, com doses mais altas promovendo maior produção de citocinas. No entanto, em 48 h, embora os níveis absolutos de células produtoras de citocinas sejam substancialmente elevados em todas as condições em comparação com 24 h, a relação dose-resposta se inverte: concentrações de estimulação mais baixas (0,5–1 µg/mL) resultam em frequências relativamente maiores de células TNF-α⁺ Granzima B⁺ do que doses altas (5–10 µg/mL). Essa inversão sugere que um sinal TCR forte e sustentado, apesar de promover a diferenciação efetora inicial, pode impor uma restrição relativa à manutenção da capacidade de produção de citocinas por célula, possivelmente refletindo o início de exaustão ou hiporresponsividade induzida pela ativação.

Coletivamente, essas observações empíricas posicionam nosso protocolo como um framework de referência que permite aos usuários preselecionar condições de estimulação com base em pontos finais específicos, melhorando assim a eficiência do delineamento experimental e a interpretabilidade dos dados. Além dos estudos mecanicistas básicos, este sistema também pode orientar a otimização de protocolos de expansão de linfócitos T para imunoterapia adotiva, onde a regulação precisa da intensidade do sinal do TCR pode ajudar a direcionar a diferenciação para fenótipos efetores ou de memória favoráveis26,27,28.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Fundo Nacional de Ciências Naturais da China (nº T2394504, LY) e pelo Fundo de Início de Pesquisa do Cientista-Chefe de Lilin Ye (nº R2045, LY).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo cônico de 15 mLLabgicCD-002-15ATubo cônico estéril de centrífuga de 15 mL
Paraformaldeído 4%BeyotimeP0099Fixador aquoso a 4% para preservar células antes da coloração
Placa de 60 mmLabgic12211Placa de cultura celular de 60 mm
Peneira celular de 70 µmLabgicBS-70-CSPeneira de malha de náilon de 70 µm para preparar suspensões celulares únicas
Placa de fundo redondo de 96 poçosBeyotimeFPT016Placa de fundo redondo de 96 poços para cultura celular e coloração
Tampão de lise ACKBeyotimeC3702Tampão de lise de eritrócitos à base de cloreto de amônio
anti-murino CD25Biolegend101910Anticorpo anti-murino CD25 conjugado com APC, clone 3C7, para citometria de fluxo
anti-murino CD28Bio X CellBE0015-1Anticorpo anti-murino CD28 purificado, clone 37.51, para costimulação de linfócitos T
anti-murino CD3Bio X CellBP0001-1Anticorpo anti-murino CD3ε purificado, clone 145-2C11, para ativação de linfócitos T
anti-murino CD69BD Biosciences553237Anticorpo anti-murino CD69 conjugado com PE para coloração de marcador de ativação
anti-murino CD8Invitrogen17-0081-82Anticorpo anti-murino CD8a conjugado com APC, clone 53-6.7, para citometria de fluxo
anti-murino GZMBBiolegend372212Anticorpo anti-granzima B humana/murina conjugado com PerCP/Cyanine5.5, clone QA16A02, para citometria de fluxo intracelular
anti-murino ICOSBD Biosciences565886Anticorpo anti-murino ICOS (CD278) conjugado com BV421 para citometria de fluxo
anti-murino PD-1Biolegend135220Anticorpo anti-murino PD-1 (CD279) conjugado com BV605, clone 29F.1A12, para citometria de fluxo
anti-murino TNF-αInvitrogen46-7321-82Anticorpo anti-murino TNF-α conjugado com PerCP-eFluor 710, clone MP6-XT22, para citometria de fluxo intracelular
anti-murino/humano CD44Biolegend103030Anticorpo anti-murino/humano CD44 conjugado com PE/Cyanine7, clone IM7, para citometria de fluxo
biotina anti-murino CD11bBiolegend101204Anticorpo anti-murino CD11b conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino CD11cBiolegend117304Anticorpo anti-murino CD11c conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino CD16/32Biolegend156604Anticorpo anti-murino CD16/32 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino CD19Biolegend115504Anticorpo anti-murino CD19 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino CD4Biolegend100508Anticorpo anti-murino CD4 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino CD44Biolegend103004Anticorpo anti-murino CD44 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino CD45RBiolegend103204Anticorpo anti-murino CD45R/B220 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino CD49bInvitrogen13-5971-85Anticorpo anti-murino CD49b conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino F4/80Biolegend123106Anticorpo anti-murino F4/80 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino Ly6GBiolegend127604Anticorpo anti-murino Ly6G conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino NK1.1Biolegend108704Anticorpo anti-murino NK1.1 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
biotina anti-murino TER119Biolegend116204Anticorpo anti-murino TER-119 conjugado com biotina para esgotamento de linhagem
Camundongos C57BL/6Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/ACamundongos machos com 6–8 semanas de idade usados nos experimentos
Incubadora de dióxido de carbono (CO2)Thermo Fisher3120Incubadora umidificada de CO2 para cultura de células de mamíferos
Corante CellTrace VioletInvitrogenC34557Corante fluorescente violeta para monitorar a proliferação celular
DMSOSigmaD2650Dissulfóxido de dimetila; solvente para preparar soluções estoque de reagentes
Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado de jumento anti-IgG de coelho (H+L), Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Anticorpo secundário de jumento anti-IgG de coelho (H+L) conjugado com Alexa Fluor 488
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco’s para lavagem e preparação de reagentes
Soro bovino fetal (FBS)GibcoC11995500BTSuplemento sérico para meio de cultura de células de mamíferos
Corante de viabilidade fixávelInvitrogen65-0865-14Corante de viabilidade fixável para excluir células mortas durante a citometria de fluxo
Solução de fixação e permeabilizaçãoBD Biosciences51-2090KZReagente de fixação e permeabilização para coloração intracelular
Placa de fundo plano de 96 poçosLabgic11510Placa de fundo plano de 96 poços para cultura celular e ensaios de estimulação
Citômetro de fluxoBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserCitômetro de fluxo com três lasers para aquisição de fluorescência multicolorida
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZInibidor do transporte de proteínas à base de brefeldina A para coloração de citocinas intracelulares
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZInibidor do transporte de proteínas à base de monensina para coloração de citocinas intracelulares
Sal de cálcio ionomicinaSigmaI3909-1MLIonóforo de cálcio usado com PMA para estimulação celular
Tampão Perm/WashBD Biosciences51-20911KZTampão de permeabilização e lavagem para coloração intracelular
Tampão Phosflow Lyse/FixBD Biosciences558049Tampão 5× para lise simultânea de eritrócitos e fixação de leucócitos
Tampão Phosflow Perm/Wash IBD Biosciences557885Tampão de permeabilização à base de metanol para coloração intracelular de fosfoproteínas
Anticorpo monoclonal de coelho contra proteína ribossômica S6 fosforilada (Ser235/236) (D57.2.2E)Cell Signaling4858SAnticorpo monoclonal de coelho contra proteína ribossômica S6 fosforilada (Ser235/236), clone D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGForbol 12-miristato 13-acetato; ativador usado para estimulação celular ex vivo
Interleucina-2 murina recombinanteGibco200-02-50UGInterleucina-2 murina recombinante para cultura e expansão de linfócitos T
RPMI 1640Life-LabAC01L064Meio Roswell Park Memorial Institute 1640 para cultura de células de mamíferos
Microesferas magnéticas de estreptavidinaBEAVER22307Microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina para esgotamento celular baseado em anticorpos biotinilados
Tampão de coloração para citometria de fluxoNão especificadoNão especificadoTampão de coloração para citometria de fluxo; fornecedor ou fórmula de preparação não fornecidos
Filme laboratorial Parafilm MAmcorPM996Filme laboratorial flexível e autoadesivo para vedar placas, tubos e frascos de cultura
Tampão Lyse/FixBD Biosciences558049Tampão 5× para lise simultânea de eritrócitos e fixação de leucócitos
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Software, versão 10.8.1, para análise de dados de citometria de fluxo

Referências

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Reimpressões e permissões

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