Efeito da Tuina na expressão e comportamento do sono de orexina em estado hipotálmico de insônia primária

Resumo

Este estudo investiga se o Tuina alivia a insônia em um modelo de rato ao regular a expressão hipotalâmica de orexina-A, utilizando ensaios comportamentais, imunohistoquímica e PCR quantitativa em tempo real.

Resumo

A insônia é um distúrbio do sono comum que leva a problemas de funcionamento diurno e aumento do risco de comorbibilidades, impactando significativamente a qualidade de vida dos pacientes. Os tratamentos atuais, principalmente terapia cognitivo-comportamental e farmacoterapia, são limitados por questões como dependência de medicamentos, tolerância e rebote de abstinência. A terapia com Tuina demonstrou regular os sistemas nervoso, endócrino e imunológico, enquanto o sistema de orexinas é um regulador fundamental do ciclo sono-vigília. Isso levou à exploração de se a Tuina alivia a insônia ao modular o sistema de orexinas hipotalâmicas. Este protocolo descreve os métodos de intervenção de Tuina em um modelo de rato de insônia primária induzida pelo método modificado do ambiente aquático múltiplo de plataformas. Randomizamos 64 ratos Wistar em quatro grupos: controle, modelo, Tuina e antagonista da orexina. Avaliações comportamentais (teste de campo aberto, teste do sono induzido por pentobarbital) foram realizadas, e a expressão de Orexin-A no hipotálamo foi detectada por PCR quantitativa em tempo real e imunohistoquímica. O protocolo visa avaliar a eficácia do Tuina e investigar seu potencial mecanismo relacionado ao sistema de orexinas, fornecendo uma referência para a aplicação e o estudo mecanicista do Tuina em distúrbios do sono.

Introdução

A insônia, caracterizada por insatisfação com a duração ou qualidade do sono que leva a comprometimento durante o dia, é um problema global de saúde prevalente com um peso significativo para indivíduos e sistemas^{de saúde 1,2}. Na China, a prevalência da insônia é notavelmente alta, agravando ainda mais seu impacto na saúde^{pública 3}. Esse transtorno está associado a problemas de função cognitiva, aumento do risco de doenças cardiovasculares e alta comorbidade com condições psiquiátricas como depressão e ansiedade ^4,5. O manejo clínico atual baseia-se principalmente em terapia cognitivo-comportamental e farmacoterapia, notadamente benzodiazepinas e sedativos-hipnóticos não benzodiazépinos. No entanto, sua aplicação a longo prazo é limitada pela dependência de medicamentos, tolerância, efeitos residuais diurnos e sintomas de abstinência, destacando a necessidade de alternativas não farmacológicas^{eficazes 6}. Na prática clínica, o Tuina é particularmente adequado para pacientes com insônia primária crônica que buscam intervenções não farmacológicas, especialmente para idosos com alto risco de dependência de medicamentos, bem como para gestantes ou^amamentando.

Como pilar da terapia externa da Medicina Tradicional Chinesa, a Tuina demonstrou vantagens únicas no tratamento da^{insônia 8}. Evidências meta-analíticas mostram que a Tuina supera significativamente medicamentos ou acupuntura sozinha na taxa total efetiva (OR = 4,12), qualidade do sono e estados de ansiedade-depressiva, com alta segurança⁹. Protocolos específicos do Tuina oferecem vantagens distintas: o Tuina tradicional alcança 89,5% de eficácia para insônia do tipo catarro e calor, o atrito abdominal reduz as taxas de recaída para 14,7% (contra 38,2% do Tuina convencional⁾¹⁰. O método Tuina, composto por três partes, aumenta a eficácia da terapia fitoterípica de 80,49% para 92,68%, enquanto melhora a arquitetura do sono e os perfis de^{neurotransmissores 11}. Estudos clínicos e revisões sistemáticas confirmaram que o Tuina pode melhorar significativamente a qualidade do sono, reduzir escores de ansiedade e depressão, e modular os níveis séricos de neurotransmissores como a 5-hidroxitriptamina (5-HT)¹². Acredita-se que seus efeitos terapêuticos sejam mediados pela regulação holística da rede neuroendócrina-imune. Pesquisas recentes têm focado cada vez mais no sistema de orexinas, um sistema neuropeptídico chave originado do hipotálamo lateral e crucial para promover e manter a^{vigília 13}. A hiperatividade anormal dos neurônios da orexina está implicada na fisiopatologia da insônia, enquanto a inibição dessa via mostrou potencial^{terapêutico 14}. Evidências preliminares sugerem que manipulações como o atrito abdominal podem influenciar os níveis cerebrais de Orexin-A em ratos privados de sono^, mas ainda falta uma investigação sistemática sobre se a Tuina exerce seus efeitos antiinsônia especificamente por meio da modulação do sistema de orexinas.

Portanto, com base em um modelo de rato para insônia primária, este estudo tem como objetivo: (1) Avaliar a melhora do comportamento de sono após intervenção padronizada com Tuina, utilizando testes comportamentais; e (2) Investigar o mecanismo subjacente examinando se o efeito de Tuina está associado à regulação negativa da expressão de Orexin-A no hipotálamo, comparando sua eficácia com a de um antagonista do receptor de orexina. Essa pesquisa busca fornecer evidências experimentais para o mecanismo central do Tuina no tratamento da insônia.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e avaliações de bem-estar animal foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Xinjiang (número de aprovação ética: IACUC-20020158). O protocolo segue as diretrizes institucionais para o cuidado e uso dos animais. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

1. Casas 64 ratos Wistar livres de patógenos específicos (SPF) (peso corporal 250 g ± 50 g, distribuição igual de sexo) em um sistema barreira SPF a 18–22 °C com ciclo claro-escuro de 12 horas. Ofereça comida e água à vontade.
2. Após 1 semana de alimentação adaptativa, divida aleatoriamente os ratos em 4 grupos (n = 16 por grupo): controle (Grupo A), modelo (Grupo B), Tuina (Grupo C) e antagonista (Grupo D).

2. Estabelecimento do modelo primário de insônia

NOTA: Exceto pelo Grupo A, ratos dos Grupos B, C e D passam pelo seguinte procedimento de modelagem.

1. Prepare um recipiente cilíndrico de plástico (diâmetro superior: 30 cm, altura: 40 cm) como caixa para ratos.
2. Fixe uma plataforma cilíndrica (diâmetro: 6 cm, altura: 10 cm) no fundo do recipiente.
3. Adicione água ao recipiente até que o nível da água esteja 1 cm abaixo da superfície da plataforma. Mantenha a temperatura da água em 20 °C.
4. Coloque uma malha circular de ferro (diâmetro: 25 cm, tamanho da malha: 1 cm) horizontalmente dentro do recipiente, 15 cm acima da plataforma. Prenda a malha à borda do recipiente usando fios finos de ferro.
5. Coloque água potável e comida na malha de ferro. Troque a água diariamente e limpe e desinfete o recipiente.
6. Coloque um rato por contêiner na plataforma por 8 dias consecutivos.

3. Avaliação do modelo usando teste de sono sinérgico de sódio pentobarbital

1. A solução de sódio pentobarbital é preparada introduzindo diretamente água ultrapura. Pese 1,0 g de pó, adicione água ultrapura esterilizada a 100 mL, dissolva e filtre a 0,22 μm para obter uma solução de 1% (10 mg/mL).
2. No nono dia, injete todos os ratos intraperitonealmente com solução de sódio pentobarbital na dose mínima que induz o sono (determinada em experimentos preliminares).
3. Registre a latência do sono (tempo desde a injeção até a primeira perda do reflexo de endireitamento) e a duração do sono (tempo desde a perda até a recuperação do reflexo de endireitamento). Defina perda do reflexo de endireitamento por 1 minuto como início do sono, e sua recuperação como fim do sono.

4. Intervenção de Tuina

NOTA: As intervenções começam no dia seguinte à avaliação bem-sucedida do modelo e continuam uma vez ao dia por 14 dias consecutivos. Os grupos A e B passam por contenção em um quadro de fixação por 10 minutos diários. Os operadores recebem treinamento rigoroso antes do experimento para garantir consistência na força, frequência e ritmo.

1. Para o Grupo C, fixe o rato em posição supina sobre uma mesa de operação.
2. Fixe delicadamente os quatro membros do rato usando os cinco dedos da mão esquerda, estendendo totalmente o abdômen.
3. Realize Tuina abdominal com a mão direita: use a polpa da falange distal do dedo médio para aplicar força no ponto Guanyuan (CV4, localizado 25 mm abaixo do umbigo). Mantenha os quatro dedos restantes naturalmente estendidos.
4. Acione o dedo médio usando pequenos movimentos circulares anterolaterais a partir da articulação do ombro, realizando atrito translacional circular no sentido anti-horário no abdômen.
5. Siga um caminho circular fechado formado por Jiuwei (CV15, 5 mm abaixo do processo xifoide), Guanyuan (CV4) e pontos bilaterais Daimai (GB26, ponto médio entre a extremidade livre da^12ª costela e a borda superior da crista ilíaca).
6. Mantenha um movimento circular contínuo, suave e contínuo a 5–7 ciclos/min.
7. Faça manipulação no sentido anti-horário por 5 minutos, depois manipulação no sentido horário por 5 minutos.
8. Garanta que a força seja firme e firme, mantendo o rato calmo e sem lutar. Aplique a intervenção uma vez ao dia por 14 dias.

5. Administração antagonista

1. Para o Grupo D, administrar MK-4305 (10 mg/kg) por gástria intragástrica uma vez ao dia durante 14 dias. Dissolva o MK-4305 em soro fisiológico normal para preparar uma solução de 5 mL.

6. Teste em campo aberto

1. Após o período de intervenção, realize-se o teste em campo aberto usando uma caixa cúbica preta (base: 100 cm × 100 cm, altura: 40 cm). Divida o piso em 25 quadrados iguais por linhas cinza (16 periféricas, 9 centrais).
2. Coloque o rato no quadrado central e comece a cronometrar.
3. Registre a distância total percorrida, o número de episódios de criação e o tempo passado na área central em mais de 3 minutos usando um sistema de aquisição de imagem.
4. Após cada teste, remova as fezes e limpe o piso e as paredes internas com 75% de etanol.
5. Operação do sistema de aquisição de imagens
   1. Configure o sistema de aquisição de imagens. Monte uma câmera digital CCD (resolução: 1280 × 720 pixels; taxa de quadros: 25 fps) verticalmente 1,5 m acima do campo aberto. Conecte a câmera a um computador por meio de uma interface USB.
   2. Configure o software de rastreamento e as configurações de análise. Realize rastreamento automatizado usando software de análise comportamental de vídeo. Defina os parâmetros de rastreamento da seguinte forma:
      1. Defina o foco de rastreamento como o ponto central (centro de massa) do rato.
      2. Defina a taxa de quadros para 25 fps tanto para aquisição quanto para análise de imagem.
      3. Calibre a resolução espacial para que cada pixel corresponda a 1,5 mm de distância real com base nas dimensões do campo aberto e na resolução do vídeo.
      4. Defina o limiar de subtração de fundo para 15 níveis de cinza (intervalo: 0–255) para distinguir o rato do fundo.
      5. Defina a duração mínima do evento para 0,2 s (5 quadros) para minimizar detecções de falsos positivos causadas por ruído.
      6. Divida o campo aberto virtualmente em 5 × 5 quadrados de área igual (Zonas 1–25). Defina a zona central como as Zonas 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 e 19 (os quadrados centrais 3 × 3, representando 36% da área total). Defina a zona periférica como os quadrados restantes.
   3. Registre os seguintes parâmetros de saída: distância total percorrida (mm), velocidade média (mm/s), tempo imóvel (s), tempo em movimento (s), tempo gasto em cada zona (s), distância percorrida em cada zona (mm), número de entradas em cada zona e número de episódios de elevação. Verifique os episódios de criação manualmente.

7. Perfusão para imunohistoquímica

NOTA: Use 4 ratos de cada grupo para imunohistoquímica.

1. Prepare solução salina a 0,9% (pré-aquecida a 37 °C) e solução de paraformaldeído a 4% (armazenada a 4 °C).
2. Anestesiamos profundamente os ratos com uretano intraperitoneal (solução de 25%, 0,6 mL/100 g de peso corporal). Confirme perda dos reflexos de pedal, córnea e de endireitamento.
3. Prenda o rato deitado em uma placa de espuma. Abra rapidamente a cavidade torácica cortando a pele, a fáscia e o esterno.
4. Retraa o coração suavemente para expor a aorta. Insira uma agulha pelo ápice ventricular esquerdo até a aorta até que a ponta da agulha fique visível no lúmen aórtico. Certifique-se de que a agulha, o ventrículo esquerdo e a aorta estejam alinhados horizontalmente.
5. Pinze a aorta e a agulha com pinça hemostática. Corte imediatamente o átrio direito para permitir a saída do sangue.
6. Perfunda com 150–200 mL de soro fisiológico pré-aquecido de 0,9% (37 °C). A perfusão bem-sucedida é indicada pelo branqueamento do fígado, mesenterio e membros anteriores, além de fluido claro no átrio direito.
7. Troque para paraformaldeído frio a 4% (4 °C) e perfunde 400 mL. Realize a perfusão inicial rapidamente até que ocorram fasciculações musculares em todo o corpo e rigidez dos membros. Depois, reduza a vazão para 2 gotas/s até que todo o fixador esteja perfuso.
8. Confirme a fixação bem-sucedida quando o cérebro parece pálido e firme.

8. Dissecação cerebral

1. Após a perfusão, decapite o rato e remova cuidadosamente todo o cérebro do crânio.
2. Incenda o crânio ao longo do ponto sagital usando tesoura. Descasque os ossos parietais e occipitais com os rongeurs ósseos.
3. Levante suavemente o cérebro com uma espátula, cortando os nervos cranianos e ópticos com tesouras finas.
4. Para imunohistoquímica: Transfira imediatamente o cérebro inteiro para o paraformaldeído a 4% e fixe a 4 °C por 24 horas.
5. Para PCR quantitativa em tempo real: enxágue a superfície do cérebro com solução fisiológica pré-resfriada, sece com papel filtro, congele em nitrogênio líquido por 5–10 minutos e armazene a –80 °C. Execute todos os passos no gelo.

9. Coloração imunohistoquímica

1. Imergir tecido hipotalâmico na parafina e cortar seções coronais com espessura de 4–5 μm usando um microtomo. Monte seções em slides anti-queda, coza a 65 °C por 1,5 a 2 horas.
2. Seções de dewax em xileno I e II (10 min cada). Reidrate com etanol graduado: etanol anidro I e II (5 min cada), depois 95%, 90%, 80%, 70% etanol (5 min cada), e então água destilada (5 min).
3. Realize a recuperação de antígeno colocando seções em um tampão de citrato de 0,01 M fervente (pH 6,0) em uma panela de pressão. Aqueça até a válvula de pressão subir, depois desligue o aquecimento. Deixe de molho por 10 minutos, depois esfrie naturalmente até a temperatura ambiente.
4. Inative a peroxidase endógena imergindo seções em H₂O₂ fresco a 3% por 10 minutos em temperatura ambiente. Lave 3× com PBS (5 min cada).
5. Faça um círculo no tecido com uma caneta de imunohistoquímica. Aplique anticorpo policlonal anti-HCRT/Orexin-A (diluição 1:50, ~50 μL por lâmina). Incube durante a noite a 4 °C em uma caixa umidificada.
6. No dia seguinte, reaqueça em temperatura ambiente por 20 minutos. Lave 3× com PBS (5 min cada).
7. Aplique um anticorpo secundário marcado com peroxidase de raiz-forte. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave 3× com PBS (3 min cada).
8. Aplique a solução de trabalho marcada com estreptavidina marcada com peroxidase de raiz-forte. Incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave 3× com PBS (5 min cada).
9. Prepare solução de cromogêgeno DAB (0,85 mL de água destilada + 50 μL de cada reagente A, B, C). Aplique em seções e revele por 3 a 10 minutos em temperatura ambiente, monitorando ao microscópio. Pare a reação mergulhando em água da torneira por 3 minutos.
10. Contra-tinga com hematoxilina por 3 minutos. Diferencie em álcool ácido clorídrico a 1% por 1–2 segundos. Azul em água da torneira por 5 minutos.
11. Desidrate com água destilada (3 min), 70%, 80%, 90%, 95% etanol (3 min cada) e etanol anidro I e II (5 min cada). Transparente em xileno I e II (5 min cada).
12. Aplique bálsamo neutro e slip de cobertura. Seca durante a noite a 37 °C.
13. Observe e fotografe seções usando um microscópio óptico (40×, 100×, 200×, 400×). Conte células positivas para Orexina-A (precipitado granular marrom no citoplasma) usando ImageJ.
14. Calcule a pontuação total (0–12) como a pontuação de intensidade da coloração (0 = negativo, 1 = amarelo claro, 2 = marrom claro, 3 = marrom escuro) multiplicado pela pontuação percentual positiva da célula (0 = 0%, 1 = 1–25%, 2 = 26–50%, 3 = 51–75%, 4 = 76–100%). Defina de 1 a 5 como expressão baixa, 6 a 12 como expressão alta.

10. PCR quantitativa em tempo real para mRNA de Orexina-A

1. O processamento de RNA após o descongelamento do tecido deve ser realizado em condições livres de RNase. Os requisitos específicos sem RNase são os seguintes:
   1. Ambiente de trabalho: Use uma área dedicada ao RNA que tenha sido limpa com um descontaminante RNase e exposta à irradiação UV.
   2. Consumíveis: Use tubos de centrífuga certificados livres de RNase e pontas de pipeta, ou, alternativamente, deixe-os de molho em água DEPC 0,1% seguida de autoclav.
   3. Reagentes: Use tampão de lise livre de RNase e água tratada com DEPC.
   4. Operação: Use luvas sem pó durante todo o procedimento, troque de luvas com frequência e evite contato direto com o interior dos consumíveis e das amostras.
   5. Procedimento experimental
      NOTA: Durante as etapas de extração de RNA e transcrição reversa, todos os consumíveis e ferramentas que entram em contato com RNA ou reagentes de transcrição reversa devem estar livres de RNase. Na fase de amplificação por PCR, como o cDNA é uma estrutura de fita dupla e a RNase não pode degradar o DNA de fita dupla, consumíveis e ferramentas nessa fase precisam apenas estar livres de DNase e outras impurezas que possam inibir reações de PCR; não é necessário tratamento adicional sem RNase. Moa tecido hipotalâmico congelado sob nitrogênio líquido. Pese de 50 a 100 mg de pó de tecido em um tubo com 1 mL de Trizol. Misture e deixe em temperatura ambiente por 15 minutos.
2. Adicione 200 μL de clorofórmio, misture por inversão e deixe em temperatura ambiente por 5 minutos. Centrifuge a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C.
3. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo. Adicione o mesmo volume de isopropanol, misture e deixe a –20 °C por 35 minutos. Centrifuge a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Descarte o supernadante.
4. Lave o precipitado com etanol a 75%, centrifuge a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e repita a lavagem uma vez.
5. Precipitado seco ao ar em temperatura ambiente. Dissolva em água sem RNase.
6. Mede a concentração e pureza do RNA (razão A260/A280 1,8–2,1). Avalie a integridade por eletroforese em gel de agarose a 1% (bandas 28S e 18S claras, faixa 5S fraca ou ausente).
7. Preparar a reação de transcrição reversa (20 μL): 800 ng de RNA total, 1 μL de Primer Aleatório (0,1 μg/μL), 10 μL 2× Mistura de Reação TS, 1 μL de Mistura de Enzimas TransScript RT/RI, 1 μL removedor de gDNA e água sem RNase até volume.
8. Incube a 25 °C por 10 minutos, depois 85 °C por 5 segundos para sintetizar o cDNA da primeira fita. Dilua o cDNA 1:1 com água livre de RNase.
9. Preparar a reação qPCR (10 μL): 5 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0,3 μL primer direto (10 μM), primer reverso de 0,3 μL (10 μM), molde de cDNA de 1 μL, água livre de RNase até volume. Corri em triplicado.
   NOTA: Primers: Orexin-A-F: 5'-CGCCAGAAGGTGTTCCT-3'; Orexin-A-R: 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (comprimento do produto 88 pb); β-Actina-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actina-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (comprimento do produto 150 pb).
10. Executar o programa qPCR: 95 °C por 30 s (pré-desnaturação); 40 ciclos de 95 °C por 5 s (desnaturação) e 60 °C por 30 s (recozimento e extensão).
11. Verifique as curvas de amplificação e fusão. Administre 5 μL de produto em gel de agarose a 2% para confirmar a especificidade.
12. Calcule a expressão relativa do mRNA da Orexina-A usando o método 2^⁻ΔΔCt com β-Actina como controle interno.

11. Análise estatística

1. Use o SPSS 26.0 para análise de dados. Expresse todos os dados como média ± desvio padrão. Para comparações entre dois grupos, use o teste t de amostras independentes se os dados forem normalmente distribuídos; caso contrário, use o teste Mann-Whitney U.
2. Para comparações entre múltiplos grupos, utilize ANOVA unidirecional com teste pós-hoc de LSD para variâncias homogêneas ou o teste de Tamhane para variâncias heterogêneas. Se os dados não forem normalmente distribuídos, use o teste H de Kruskal-Wallis. Considere P < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

A Tabela 1 mostra que, em comparação com o grupo A, a latência do sono nos grupos B, C e D foi significativamente prolongada, e a duração do sono foi significativamente reduzida após a modelagem, indicando que o modelo primário do rato insônia foi estabelecido com sucesso. Os achados das Tabelas 2 e 3 oferecem suporte preliminar para o efeito terapêutico da Tuina no tratamento da insônia. O Teste de Campo Aberto (OFT) é um dos paradigmas mais clássicos e comumente usados na neurociência comportamental para avaliar comportamentos semelhantes à ansiedade em^{roedores 15}. Estudos mostraram que a preferência pela área dos quatro cantos é um indicador sensível para medir comportamentos semelhantes à ansiedade, e pode ser mais discriminatória do que o indicador da área central em níveis moderados a baixos de ansiedade. Os ratos modelo insônia apresentaram comportamentos significativos semelhantes à ansiedade e^{mudanças 16,17} no comportamento exploratório, enquanto a intervenção Tuina aliviou efetivamente os comportamentos semelhantes à ansiedade nesses ratos. Os resultados de biologia molecular apresentados nas Tabelas 4, 5 e Figura 1 demonstram ainda que a Tuina regula efetivamente a superexpressão de Orexin-A no hipotálamo de ratos-modelo de insônia.

Figura 1: Resultados de coloração imunohistoquímica da Orexin-A no hipotálamo de ratos de cada grupo (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Neurônios positivos para Orexina-A foram observados no tecido hipotálmico do rato, aparecendo como sinais granulares marrom-escuros. A pontuação de intensidade da coloração foi de 3 pontos, a porcentagem de células positivas foi de 40% (ficando na faixa de 26%–50%, marcando 2 pontos), e a pontuação total foi de 6 pontos, dentro da faixa de alta expressão. (B) O número de neurônios positivos para Orexina-A no tecido hipotálmico do rato aumentou significativamente em comparação com o grupo normal, com uma distribuição mais densa de células positivas. A pontuação de intensidade da coloração foi de 3 pontos (marrom escuro), a porcentagem de células positivas chegou a 80% (ficando na faixa de 76%–100%, marcando 4 pontos), e a pontuação total foi de 12 pontos, dentro da faixa de alta expressão. (C) O número de neurônios positivos para Orexin-A no tecido hipotalâmico do rato foi reduzido em comparação ao grupo modelo. A pontuação de intensidade da coloração foi de 3 pontos (marrom escuro), a porcentagem de células positivas foi de 75% (entre 51% e 75%, com pontuação de 3 pontos), e a pontuação total foi de 9 pontos, dentro da faixa de alta expressão. (D) O número de neurônios positivos para Orexin-A no tecido hipotalâmico do rato também foi reduzido em comparação ao grupo modelo. A pontuação de intensidade da coloração foi de 3 pontos (marrom escuro), a porcentagem de células positivas foi de 60% (ficando na faixa de 51%–75%, marcando 3 pontos), e a pontuação total foi de 9 pontos, que se enquadra na faixa de alta expressão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Grupo	Latência do sono / min	Duração do sono / min
A	4.13 ± 1.80	49,75 ± 38,46
B	6,31 ± 2,80*	22.13 ± 11.41*
C	6,33 ± 2,60*	24,93 ± 14,43*
D	6,53 ± 1,90*	24,73 ± 17,59*

Tabela 1: Comparação dos testes de sono induzidos por pentobarbital sódio entre grupos após a modelagem. * indica P < 0,05 em comparação com o grupo controle.

Grupo	Frequência de Criação	Tempo(s) de Imobilidade	Tempo(s) de Locomoção	Distância de Locomoção (m)	Horário na Zona Central (S)	Distância na Zona Central (m)	Tempo na Zona de Canto	Distância na Zona de Canto (m)	Tempo na Zona de Canto	Distância na Zona Lateral (m)
A	1.875 ± 0.835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103.000 ± 28.582	6.315 ± 3.893	56.600 ± 27.772	6.705 ± 3.666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
Valor T	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
Valor p	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Tabela 2: Análise da influência de cada nível de indicador entre o grupo controle (A) e o grupo modelo (B).* indica P < 0,05 em comparação com o grupo controle.

Grupo	Frequência de Criação	Tempo(s) de Imobilidade	Tempo(s) de Locomoção	Distância de Locomoção (m)	Horário na Zona Central (S)	Distância na Zona Central (m)	Tempo na Zona de Canto	Distância na Zona de Canto (m)	Tempo na Zona de Canto	Distância na Zona Lateral (m)
B	5.875 ± 2.295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5.823 ± 1.422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6.357 ± 0.627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6.667 ± 1.633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5.744 ± 1.291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

Tabela 3: Análise da influência de cada nível indicador entre o grupo modelo (B), grupo Tuina (C) e grupo antagonista (D). ^△P < 0,05 em comparação com o grupo de modelos (B); ^▲P < 0,05 comparado ao grupo de Tuina (C).

Grupo	Orexin-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2,392 ± 0,998▲
D	3,227 ± 1,703▲

Tabela 4: Níveis de expressão de mRNA da Orexina-A no tecido hipotálmico. ^△P < 0,05 em comparação com o grupo controle (A); ^▲P < 0,05 em comparação com o grupo de modelos(B).

Grupo	Orexin-A
	Intensidade da Coloração	Percentual de células positivas	Pontuação Percentual	Pontuação
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Tabela 5: Escores de coloração imunohistoquímica de Orexin-A no hipotálamo de ratos de cada grupo. Critérios de pontuação da intensidade da coloração: 0 = coloração negativa (incolor), 1 = amarelo claro, 2 = marrom claro, 3 = marrom escuro. Critérios de pontuação percentual de células positivas: 0 = 0%, 1 = 1%–25%, 2 = 26%–50%, 3 = 51%–75%, 4 = 76%–100%. Pontuação total = pontuação de intensidade da mancha × percentual. As pontuações totais de 1–5 foram definidas como de baixa expressão, e as de 6–12 foram definidas como de alta expressão.

Discussão

Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia do Tuina em um modelo primário de ratos de insônia e explorar seu potencial mecanismo relacionado ao sistema de orexinas hipotalâmicas. Os achados atuais demonstram que um protocolo padronizado de Tuina melhorou significativamente a latência e a duração do sono, aliviou comportamentos semelhantes à ansiedade e efetivamente reduziu a superexpressão de Orexin-A tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína no hipotálamo. Notavelmente, o efeito do Tuina foi comparável ao do antagonista do receptor de orexina MK-4305, sugerindo que a modulação do sistema de orexinas pode ser um mecanismo fundamental pelo qual o Tuina alivia a insônia.

Comparado às intervenções farmacológicas, o Tuina, como terapia externa não invasiva, oferece vantagens em segurança, efeitos colaterais mínimos e adesão ao paciente^12,18. Seus benefícios terapêuticos para a insônia são apoiados por evidências clínicas que mostram melhorias na qualidade do sono e no estado^{psicológico 18,19}. O mecanismo é multifacetado, envolvendo a regulação do eixo hipotálmico-hipófise-adrenal, homeostase do sistema nervoso autônomo e neurotransmissores-chave como 5-HT^18,20. Os resultados ampliam essa compreensão ao identificar o sistema de orexinas como um alvo específico. Os neurônios da orexina são motores centrais da vigília, e sua hiperexcitabilidade está ligada à instabilidade do sono 21,22,23. A regulação descendente da orexina-A observada após o Tuina parece ser consistente com o efeito do novo antagonista do duplo receptor de orexina para insônia, destacando uma possível via convergente entre intervenções farmacológicas e não^{farmacológicas 24,25}.

Embora este estudo se baseie em nosso trabalho previamente publicado sobre Tuina abdominal e o regulamento²⁵ da orexina-A, o manuscrito atual representa uma extensão substancial e um refinamento metodológico além do relatório original. Especificamente, este estudo expande o tamanho da amostra para 64 ratos para aumentar o poder estatístico e introduz uma bateria abrangente de avaliações comportamentais, incluindo o teste de campo aberto e os testes de sono induzidos por pentobarbital, para avaliar sistematicamente a arquitetura do sono e comportamentos semelhantes à ansiedade, que não foram abordados no estudo anterior. Diferentemente do trabalho anterior, que focou fortemente no estresse oxidativo e nos neurotransmissores clássicos, este artigo prioriza a validação funcional do sistema de orexinas por meio de resultados comportamentais integrados e ensaios moleculares, servindo como uma investigação mecanicista independente que complementa, em vez de replicar, os achados anteriores.

O desenho experimental seguiu a teoria da MTC ao focar no abdômen e em pontos de acupuntura específicos como Guanyuan (CV 4), que acredita-se tonificar o Qi primordial e regular a função visceral, dentro de um caminho de manipulação em malha^{fechada 26,27}. Os parâmetros (frequência, duração, curso) foram padronizados com base em trabalhos preliminares para garantir consistência e reprodutibilidade, um aspecto crucial para estudos mecanicistas com^{animais 12}.

No entanto, esse protocolo tem limitações. Primeiro, a intervenção foi aplicada em um único ponto de tempo após a modelagem. Estudos futuros devem investigar diferentes durações e frequências de intervenções para estabelecer uma relação ótima de "dose-resposta" para Tuina. Segundo, este estudo é um desenho de pesquisa observacional. Embora tenha sido encontrada uma correlação entre Tuina e a redução da expressão de Orexin-A e a melhora comportamental, ainda não está claro se essa associação é um efeito direto ou indireto do Tuina ou de outros fatores. Pesquisas futuras podem usar estratégias experimentais como nocaute gênico, inibição quimiogenética ou bloqueio de antagonistas para verificar melhor se o Tuina melhora o comportamento da insônia ao regular a expressão da Orexin-A, elucidando assim seu mecanismo causal. Por fim, este estudo não estabeleceu uma operação simulada ou grupo controle de intervenção placebo. No entanto, este estudo levou isso em consideração durante o desenho, e todos os grupos de animais receberam o mesmo nível de operações de agarrão e fixação, que, em certa medida, controlaram a influência de fatores de estresse não específicos. Além disso, a frequência, intensidade e caminho de ação do programa Tuina neste estudo foram padronizados com base em experimentos preliminares para garantir consistência e reprodutibilidade da intervenção. Pesquisas futuras devem focar no desenvolvimento de métodos de controle mais rigorosos, como o uso de simulação sem contato ou estimulação tátil mínima, para esclarecer os efeitos específicos das operações Tuina.

Passos principais críticos para o sucesso deste protocolo incluem: primeiro, controle rigoroso da temperatura da água e das dimensões das plataformas no método modificado do ambiente hídrico múltiplo de plataformas; segundo, titulação pré-experimental da dose sub-limiar de sódio pentobarbital sódico; terceiro, padronização dos parâmetros de manipulação do Tuina (frequência de 5–7 ciclos/min, manipulação anti-horária e depois no sentido horário por 5 minutos cada) e treinamento do operador; e quarto, congelamento rápido do tecido hipotalâmico em nitrogênio líquido seguido de manuseio sem RNase para garantir a estabilidade do mRNA da Orexin-A.

Possíveis modificações incluem: primeiro, o desenvolvimento de um dispositivo mecânico automatizado Tuina para reduzir a variabilidade entre operadores; segundo, o uso da telemetria EEG/EMG para substituir o teste do sono pentobarbital de sódio, permitindo o monitoramento contínuo do estágio do sono; e terceiro, a combinação de abordagens quimiogenéticas ou optogenéticas para verificar a necessidade dos neurônios de orexina na mediação dos efeitos do Tuina.

A reprodutibilidade desse protocolo é fundamentada em: trajetórias e parâmetros operacionais detalhados, uso de um medicamento controle positivo, detecção em dimensão dupla tanto em níveis de proteína quanto de mRNA, e rigorosos relatórios estatísticos. Sua usabilidade prática se reflete nos seguintes aspectos: baixos requisitos de equipamentos para testes comportamentais sem a necessidade de sistemas de telemetria caros; um ciclo experimental total de apenas 8 dias para modelagem e 14 dias para intervenção Tuina, concluído em até 4 semanas, o que se alinha bem com os ciclos de financiamento e cronogramas laboratoriais da maioria dos projetos de pesquisa rotineiros, facilitando a coleta rápida de dados e validação metodológica. Além disso, o protocolo de manipulação de Tuina é claramente quantificado em termos de trajetória operacional (CV15 → CV4 → GB26 bilateral → retorno ao CV15), frequência (5–7 ciclos/min), sequência direcional (sentido anti-horário seguido pelo sentido horário) e duração (10 min por sessão). Essas especificações permitem que diferentes operadores dominem a técnica após um breve treinamento, reduzindo assim o risco de baixa reprodutibilidade causada por diferenças individuais comumente observadas em estudos de manipulação manual.

Durante a implementação deste protocolo, vários problemas comuns podem surgir, e medidas adequadas de solução de problemas são recomendadas. Primeiro, ratos podem cair da plataforma durante o procedimento modificado do ambiente aquático múltiplo da plataforma. Isso geralmente é causado por uma superfície da plataforma excessivamente escorregadia. A solução é rugar levemente a superfície da plataforma com lixa fina para aumentar o atrito. Além disso, cada recipiente deve abrigar apenas um rato para evitar perturbações mútuas. Segundo, o teste do sono com pentobarbital sódico pode não mostrar diferenças significativas entre os grupos. A solução é re-titular a dose mínima sub-limiar em incrementos de 5 mg/kg durante experimentos piloto usando uma coorte separada de animais (3–4 por grupo). As injeções devem ser realizadas no mesmo horário todos os dias (preferencialmente entre 9:00 e 11:00 da manhã) para minimizar a variação circadiana. Terceiro, ratos podem lutar ou vocalizar durante a manipulação de Tuina, o que normalmente indica força excessiva ou contenção inadequada. O operador deve reduzir a força aplicada até que o rato permaneça calmo sem lutar. Treinamento prévio com um boneco sensível à pressão é recomendado para padronizar a aplicação da força. O rato deve ser posicionado deitado com os quatro membros fixados de forma suave, mas segura, garantindo total exposição do abdômen. Quarto, grande variabilidade na porcentagem de células positivas para Orexina-A dentro do mesmo grupo experimental frequentemente surge de planos de seção inconsistentes no hipotálamo, viés subjetivo de contagem ou variação de lote para lote na coloração. A solução recomendada é padronizar o nível anatômico consultando um atlas cerebral de rato (por exemplo, Paxinos & Watson), coletando seções coronais do bregma –1,8 mm a –3,3 mm para análise hipotalâmica. Dois observadores independentes cegos à alocação de grupos devem realizar a contagem das células, e o valor médio deve ser utilizado. Todas as amostras para uma determinada medida de resultado devem ser coradas no mesmo lote, e a análise semi-automatizada de limiares usando ImageJ é incentivada para reduzir a subjetividade do observador.

Em conclusão, este estudo estabeleceu um protocolo padronizado de intervenção Tuina e um sistema de avaliação multinível em um modelo primário de insônia. Ela fornece evidências convincentes de que o Tuina melhora os comportamentos de insônia, potencialmente por meio de um mecanismo que envolve a supressão da superexpressão hipotalâmica de Orexin-A. Esse arcabouço metodológico não apenas oferece um paradigma reprodutível para investigar os mecanismos centrais do Tuina, mas também fornece uma referência para estudos mecanicistas de outras intervenções não farmacológicas para distúrbios do sono.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	Síntese de cDNA
Acetilcolina (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	Reagente ELISA
Lâminas de microscópio de adesão	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Montagem de seção de tecido
Agarosa	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Eletroforese em gel
Etanol anidro	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Desidratação de tecido
Diluente de anticorpo	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	Diluição de anticorpo primário
Cesta	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Suporte para lâminas
Pó de citrato	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	Preparação de tampão de recuperação de antígeno
Lâmina de cobertura	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Microscopia
Kit de cromógeno DAB	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	Detecção cromogênica
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	Tratamento livre de RNase
Dopamina (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	Reagente ELISA
Célula de eletroforese	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Eletroforese em gel
Fonte de alimentação de eletroforese	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Eletroforese em gel
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	Reagente qPCR
Ácido gama-aminobutírico (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	Reagente ELISA de neurotransmissor
Sistema de imagem de gel	Shanghai Tanon	2500	Documentação de gel
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Bloqueio de peroxidase endógena
Solução de coloração com hematoxilina	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Contra-coloração
Centrífuga refrigerada de alta velocidade	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	Centrifugação de amostra
Histamina (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	Reagente ELISA
Forno de secagem a ar quente	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DHG series	Secagem de amostras
Câmara de umidade para coloração IHC	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	Câmara de incubação úmida
Kit de coloração para imunohistoquímica	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	Coloração IHC
Incubadora	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	Incubação com temperatura controlada
Fogareiro de indução	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	Fonte de aquecimento
Leitor de microplacas	Bio-Rad, China	xMark	Medição de absorbância
Microscópio	Nikon	E200	Imagem microscópica
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	Reagente experimental
Bálsamo neutro	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	Meio de montagem
Norepinefrina (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	Reagente ELISA
Quantificador de ácidos nucleicos e proteínas	Beijing Kaiao	K5500	Quantificação de ácidos nucleicos
Orexina A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	Reagente ELISA
Ciclador térmico PCR	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	Amplificação PCR
Soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	Tampão de lavagem
Pipeta	Eppendorf, Germany	Dragon lab	Manuseio de líquido
Panela de pressão	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	Recuperação de antígeno
Kit de quantificação de proteínas	TransGen Biotech	DQ111-01	Kit de ensaio de proteína BCA
Anticorpo policlonal anti-HCRT (Orexin-A) de coelho	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	Anticorpo primário
Instrumento de PCR em tempo real	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	Análise qPCR
Geladeira	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	Armazenamento de amostras
Serotonina (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	Reagente ELISA
Frasco de coloração	Genérico	N/A	Recipiente para coloração de lâminas
Caneta super imunohistoquímica	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	Caneta de barreira hidrofóbica
Marcador de DNA Trans2K	TransGen Biotech	BM101	Escada de DNA
TRIzol Reagent	Ambion	15596026	Extração de RNA
Misturador Vortex	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	Misturador de laboratório
Xileno	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Deparaffinização