Expressão da Proteína Leitora de m6A YTHDC2 no Câncer de Pulmão de Não Pequenas Células em uma Coorte Clínica Chinesa

Resumo

Este estudo avalia a expressão de YTHDC2 no câncer de pulmão de células não pequenas utilizando bioinformática e qRT-PCR. Embora análises de banco de dados sugiram subregulação e relevância prognóstica, a validação clínica não mostra diferença significativa. Os resultados destacam inconsistências, indicando precisão diagnóstica limitada e a necessidade de mais validação antes da aplicação clínica.

Resumo

O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, com biomarcadores limitados disponíveis para diagnóstico precoce e prognóstico. A modificação de RNA por N6-metiladenosina (m6A) e suas proteínas leitoras, como a YTHDC2, desempenham papéis fundamentais na regulação gênica e na tumorigênese. Este estudo tem como objetivo avaliar o perfil de expressão da YTHDC2 em tecidos de CPCNP utilizando bioinformática e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), analisar a relação entre a YTHDC2 e as características clínico-patológicas e explorar sua relevância clínica e biológica potencial para pesquisas futuras. Dados de expressão gênica e sobrevida provenientes de bancos de dados foram analisados quanto à precisão prognóstica. A expressão de YTHDC2 foi quantificada em tecidos de CPCNP de uma coorte clínica chinesa, e as características clínico-patológicas foram analisadas. As análises de bancos de dados públicos mostraram que a YTHDC2 estava subexpressa em tecidos de CPCNP (p < 0,05) e estava associada à sobrevida dos pacientes, embora seu desempenho prognóstico tenha sido fraco (AUC ≈ 0,5). A análise por qRT-PCR de 19 tecidos pareados de tumor e tecido normal adjacente não mostrou diferença estatisticamente significativa (p = 0,537) na expressão da YTHDC2 entre os tecidos tumorais e os adjacentes. Em conjunto, as análises de bancos de dados públicos sugerem que a YTHDC2 pode estar subexpressa e ter relevância prognóstica potencial no CPCNP, mas a validação clínica independente em nossa coorte não confirmou expressão diferencial significativa. Esses achados destacam uma heterogeneidade substancial entre conjuntos de dados em larga escala e coortes do mundo real, indicando que a YTHDC2 provavelmente não servirá como biomarcador diagnóstico ou prognóstico confiável isolado e poderá exigir integração com outros marcadores moleculares para aplicabilidade clínica.

Introdução

O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), que engloba o carcinoma de células escamosas e o adenocarcinoma, é o tipo mais frequentemente diagnosticado de câncer de pulmão e uma das principais causas de mortalidade global por câncer¹. As estatísticas globais sobre câncer mostram que o câncer de pulmão é uma das principais causas de morte por neoplasias². Os avanços recentes em diagnóstico, cirurgia, radioterapia e terapia direcionada molecular não melhoraram significativamente o prognóstico do CPCNP, pois o diagnóstico inicial geralmente ocorre em estágio avançado, e a doença é frequentemente assintomática nos estágios iniciais³. Isso ressalta a necessidade de novos biomarcadores para identificar, determinar o prognóstico e avaliar a eficácia do tratamento em pacientes com CPCNP.

m6A é a primeira modificação de RNA identificada e a mais abundante em eucariotos, estando implicada na estabilidade do RNA, tradução e transcrição⁴. As modificações m6A são dinâmicas e reversíveis, facilitadas por metiltransferases (escritores), desmetilases (apagadores) e proteínas de ligação específicas (leitores)⁵. Dentre essas, a YTHDC2, uma importante proteína leitora de m6A, modula a estabilidade do RNA e a taxa de tradução⁶. Estudos recentes indicam que a YTHDC2 está envolvida na regulação de múltiplos tipos de câncer, seja suprimindo o crescimento e invasão celular, seja induzindo a morte celular⁷. Também foram destacadas as relevâncias clínicas de outras proteínas leitoras de m6A, incluindo YTHDF1, YTHDF2 e YTHDC1, na progressão do câncer de pulmão, regulação imune e prognóstico, enfatizando a importância de avaliar sistematicamente cada leitor individual de m6A em coortes independentes de pacientes^8,9,10. No Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC), observam-se níveis significativamente baixos de YTHDC2, os quais estão associados a estágios tumorais avançados, metástase linfonodal e prognóstico desfavorável para os pacientes, indicando que ela poderia atuar como um fator antitumoral¹¹. Experimentos in vitro e in vivo também revelam que a alta expressão de YTHDC2 inibe a proliferação celular e a metástase no câncer de pulmão⁷.

Neste estudo, a regulação de YTHDC2 no CCRP foi investigada por meio de análises computacionais integradas e validação experimental por qRT-PCR. Também foi examinada a relação entre a expressão de YTHDC2 e as características clinicopatológicas e o prognóstico dos pacientes. Apesar do aumento de evidências provenientes de bases de dados públicas que sugerem a desregulação de YTHDC2 no CCRP, estudos publicados têm relatado achados inconsistentes quanto à magnitude e ao significado clínico dessa desregulação, e a validação independente em coortes clínicas bem caracterizadas do mundo real, particularmente em populações asiáticas, permanece limitada. Além disso, a maioria dos estudos anteriores baseou-se predominantemente em conjuntos de dados transcriptômicos públicos ou modelos experimentais, com relativamente poucos integrando descobertas de bioinformática com validação clínica independente. Ao combinar análises transcriptômicas públicas em larga escala com validação independente por qRT-PCR em uma coorte clínica chinesa, este estudo teve como objetivo avaliar a reprodutibilidade dos achados anteriores e preencher a lacuna translacional entre análises de bases de dados públicas e amostras clínicas do mundo real. Portanto, este estudo buscou avaliar sistematicamente a expressão de YTHDC2 utilizando abordagens integradas de bioinformática e validação clínica e avaliar sua possível relevância biológica e clínica no CCRP. Levantou-se a hipótese de que a expressão de YTHDC2 está desregulada no CCRP e de que a integração de análises de bioinformática com validação clínica independente forneceria uma avaliação mais confiável de seu significado diagnóstico e prognóstico do que cada abordagem isoladamente.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Hainan (número de aprovação HMC1984.24) e esteve em conformidade com a Declaração de Helsinque (revisada em 2013).

Assuntos do estudo

Foi conduzido um estudo com 50 pacientes com câncer de pulmão diagnosticados entre 2017 e 2024 no Hospital Central de Sanya, na província de Hainan, utilizando as Diretrizes Clínicas da Associação Médica da China para o Diagnóstico e Tratamento do Câncer de Pulmão (Edição 2024). A estadia CSCO (2024) foi alinhada com a 8ª Edição do AJCC para permitir comparabilidade entre estudos, conforme validado em coortes chineses¹², com revisão por dois oncologistas independentes para garantir consistência. O processo de seleção dos pacientes, disponibilidade de tecidos, avaliação da qualidade do RNA e inclusão final das amostras para análise de qRT-PCR são resumidos na Figura 1.

Dados do estudo

Este estudo utilizou bioinformática para analisar os níveis de expressão de YTHDC2 no CCRP e sua relação com características clínico-patológicas, oferecendo insights sobre mecanismos potenciais. As análises bioinformáticas foram realizadas exclusivamente com dados públicos de sequenciamento de RNA do The Cancer Genome Atlas (TCGA), incluindo amostras de adenocarcinoma pulmonar (LUAD), carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) e tecidos pulmonares normais correspondentes, obtidos por meio do GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). O conjunto de dados baixado incluiu dados de expressão de sequenciamento de RNA juntamente com variáveis clínicas disponíveis (identificador do paciente, identificador da amostra, idade, sexo, estágio patológico, status de sobrevida e tempo de sobrevida global) para os casos elegíveis de TCGA-LUAD e TCGA-LUSC. Amostras sem informações de expressão gênica ou de sobrevida foram excluídas das análises downstream de sobrevida e ROC. O conjunto de dados utilizado neste estudo está disponível como Arquivo Suplementar 1. Nenhum espécime clínico coletado no Hospital Central de Sanya foi utilizado nas análises bioinformáticas. Os procedimentos detalhados para as análises GEPIA, Kaplan–Meier Plotter e survivalROC são fornecidos na seção Análise bioinformática abaixo. O fluxo de trabalho completo de bioinformática, incluindo aquisição de dados, pré-processamento, análise de expressão gênica, análise de sobrevida e análise ROC, está resumido na Figura 2.

Critérios de inclusão e exclusão

Os critérios de inclusão e exclusão dos pacientes estão apresentados na Tabela 1. Uma análise de poder realizada com software de análise estatística de poder determinou que pelo menos 26 casos por grupo forneceriam poder de 80% para detectar um efeito de tamanho moderado (d = 0,8, α = 0,05, bicaudal). Embora o recrutamento inicial tivesse como meta 50 pares no grupo de câncer de pulmão, a análise final de qRT-PCR incluiu 30 amostras tumorais e 19 amostras de tecido adjacente normal após exclusões por qualidade do tecido ou do RNA. Essa redução no tamanho da amostra reflete as limitações clínicas do mundo real e destaca a importância da integridade do RNA e da disponibilidade do tecido em estudos translacionais. Com n = 19 nas comparações, o tamanho mínimo do efeito detectável é d = 1,0 (poder de 80%, α = 0,05). Assim, o experimento teve poder suficiente para detectar diferenças grandes, mas não pequenas a moderadas, na expressão de YTHDC2.

Amostras de tecido e PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)

Os diagnósticos patológicos foram determinados de forma duplamente cega por dois patologistas diferentes. A pureza tumoral foi estimada pelos patologistas (>70% de células malignas) e confirmada por meio do método ESTIMATE (TCGA). Tecidos normais adjacentes foram macrodissecados para minimizar a contaminação estromal. Os tipos histológicos de câncer de pulmão incluíram adenocarcinoma de pulmão e carcinoma de células escamosas, com 26 casos de adenocarcinoma de pulmão e 4 casos de carcinoma de células escamosas. A estadia clínica dos 50 pacientes com câncer de pulmão foi realizada de acordo com os critérios de estadiamento descritos nas “Diretrizes Clínicas da Associação Médica Chinesa para Câncer de Pulmão (Edição 2024)”. Espécimes de CPTNP confirmados patologicamente (n = 50) representaram distribuições clínicas típicas (ver Tabela 2). Dos 50 pacientes inicialmente incluídos, 30 amostras de tecido tumoral e 19 amostras pareadas de tecido normal adjacente atenderam aos critérios de qualidade do RNA. Como a análise estatística pareada exige espécimes pareados do mesmo paciente, a comparação da expressão entre tecido tumoral e tecido normal adjacente foi realizada utilizando os 19 pares disponíveis. Esses espécimes clínicos foram usados exclusivamente para validação experimental por qRT-PCR e analisados independentemente dos conjuntos de dados públicos do TCGA utilizados na análise bioinformática. Esses espécimes selecionados foram processados imediatamente após a confirmação patológica e manipulados em condições livres de RNase antes da extração de RNA. Este subconjunto reflete os casos em que foi possível obter tanto quantidade adequada de tecido quanto RNA total de alta qualidade (número de integridade do RNA, RIN >7,0). A concentração e pureza do RNA total foram medidas antes da transcrição reversa, e somente amostras com qualidade adequada de RNA (RIN >7,0) foram incluídas para análises posteriores. Quantidades iguais de RNA total foram transcritas reversamente em DNA complementar (cDNA) de acordo com o protocolo do fabricante antes da PCR quantitativa. Esse processo garantiu a validade dos dados de expressão gênica analisados. Os experimentos de qRT-PCR foram realizados em um termociclador de PCR em tempo real, utilizando um ensaio de PCR quantitativo baseado em sonda. Todas as reações foram realizadas em triplicata, juntamente com controles sem molde para assegurar a reprodutibilidade analítica. A amplificação por PCR foi realizada nas seguintes condições de ciclagem: uma etapa inicial de ativação/enzimática desnaturação a 95 °C por 10 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e pareamento/elongação a 60 °C por 60 s. Os sinais de fluorescência foram adquiridos ao final de cada ciclo de amplificação. Todos os reagentes e materiais descartáveis foram obtidos de fornecedores comerciais (ver Tabela de Materiais). As sequências dos iniciadores e sondas utilizadas na qRT-PCR estão indicadas na Tabela 3.

Análise bioinformática

Análise da expressão gênica de YTHDC2 no banco de dados GEPIA

O banco de dados GEPIA foi utilizado para analisar a expressão de YTHDC2 no CCRP. O servidor web do GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) foi acessado por meio de um navegador da internet. O módulo Expression DIY foi selecionado, o símbolo do gene "YTHDC2" foi inserido, os conjuntos de dados LUAD e LUSC foram selecionados, os parâmetros padrão de normalização foram mantidos e os gráficos de caixa de expressão diferencial foram gerados diretamente pela interface do GEPIA. A significância estatística foi definida como p < 0,05.

Banco de dados Kaplan-Meier plotter para análise de sobrevida de pacientes com câncer de pulmão

O estudo analisou a relação entre a expressão de YTHDC2 e o prognóstico em pacientes com câncer de pulmão utilizando o banco de dados Kaplan-Meier Plotter. Foi selecionado o conjunto de dados de câncer de pulmão, o símbolo do gene "YTHDC2" foi inserido, foi aplicada a opção de corte ideal pré-selecionada automaticamente e foram geradas curvas de Kaplan-Meier para sobrevida global e sobrevida pós-progressão utilizando as configurações padrão de análise. Os pacientes foram automaticamente estratificados em grupos de alta e baixa expressão utilizando o ponto de corte ótimo determinado pela plataforma Kaplan-Meier Plotter, e as razões de risco com os respectivos intervalos de confiança de 95% foram geradas usando as configurações padrão da plataforma.

Execução de pacotes R no software R para a plotagem de curvas ROC

Os dados de expressão de sequenciamento de RNA e as metainformações clínicas correspondentes para os casos elegíveis de TCGA-LUAD e TCGA-LUSC foram baixados do GDC Data Portal. Os conjuntos de dados baixados foram combinados por identificador do paciente e importados para o R para análises posteriores. O pacote survivalROC foi utilizado para gerar curvas ROC dependentes do tempo nos pontos de previsão de 1, 3 e 5 anos, e os valores correspondentes da área sob a curva (AUC) foram calculados para avaliar o desempenho prognóstico da expressão de YTHDC2. Apenas pacientes com dados disponíveis de expressão por RNA-seq e informações de sobrevida de TCGA-LUAD e TCGA-LUSC foram incluídos na análise de ROC de sobrevida. A coorte clínica local não foi utilizada para predição de sobrevida porque dados de acompanhamento de longo prazo não estavam disponíveis.

Expressão tecidual de YTHDC2 por qRT-PCR

Para analisar os níveis de expressão gênica, foi realizada qRT-PCR. Volumes iguais de cDNA foram adicionados a cada reação de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. A amplificação foi realizada utilizando um ensaio de PCR quantitativo baseado em sonda, e os dados de fluorescência foram coletados automaticamente ao final de cada ciclo de amplificação. Resumidamente, o processo de extração de RNA envolveu várias etapas, incluindo preparação da amostra, desparafinização, remoção do líquido residual, digestão com proteinase K, incubação, centrifugação, tratamento com DNase, adição de DNase I e precipitação com etanol. Em seguida, a amostra foi ligada a uma coluna de purificação de RNA baseada em sílica e centrifugada a 8.000 × g por 30 s. A coluna foi então lavada com tampão de lavagem 1, tampão de lavagem 2 e tampão de lavagem 2 diluído com etanol, e seca a 13.000 × g por 2 min. O RNA foi então eluído pela adição de 70 µL de Água Livre de RNase ao centro da membrana da coluna, seguido de centrifugação a 13.000 × g por 1 min. Cada par de primers demonstrou um único produto de amplificação, o qual foi confirmado por análise da curva de dissociação antes do cálculo da expressão gênica relativa. A eficiência dos primers (90–110%) foi validada utilizando curvas-padrão antes da análise das amostras. As análises de curva de dissociação confirmaram a presença de amplicons únicos e a ausência de dímeros de primer. A expressão relativa de YTHDC2 foi calculada pelo método 2^-ΔCt, no qual os valores de Ct foram normalizados ao gene de referência endógeno GAPDH. Como os valores de expressão foram apresentados como níveis de expressão normalizados em vez de variações em relação a uma amostra calibradora, os resultados são relatados como valores de 2^−ΔCt. O gene GAPDH foi selecionado como gene de referência porque sua expressão apresentou variabilidade mínima (CV < 5%) em comparação com as alternativas testadas (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), o que está de acordo com os critérios de seleção de genes de referência em estudos de m6A.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando software estatístico, incluindo a criação de gráficos e tabelas. Para analisar os dados quantitativos e categóricos sobre a expressão do gene YTHDC2 em pacientes com CCRP, o software R foi utilizado para análises bioinformáticas e geração de curvas ROC. As curvas ROC e a AUC foram usadas para avaliar o desempenho diagnóstico da expressão de YTHDC2 na predição de sobrevida. Para análises baseadas em regressão, as estimativas de efeito (razões de chances) com os respectivos intervalos de confiança de 95% foram relatadas quando aplicáveis. O teste de Wilcoxon para amostras pareadas foi utilizado para comparar a expressão de YTHDC2 entre amostras pareadas de tecido tumoral e tecido normal adjacente, enquanto a análise de correlação de Pearson foi usada para avaliar a associação entre a expressão de YTHDC2 e as características clínico-patológicas. Os coeficientes de correlação (r) e os valores de p correspondentes foram relatados. Como os dados de qRT-PCR consistiam em amostras pareadas de tecido tumoral e tecido normal adjacente provenientes dos mesmos pacientes e os dados de expressão gênica não apresentavam distribuição normal, o teste de Wilcoxon para amostras pareadas foi utilizado para comparar os níveis de expressão de YTHDC2 entre os tecidos pareados. Este teste não assume normalidade dos dados e é comumente usado para dados biológicos assimétricos. Todos os testes estatísticos foram bicaudais, e p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As variáveis contínuas foram avaliadas quanto à normalidade antes da análise. As variáveis contínuas são apresentadas como média ± desvio padrão ou mediana (intervalo interquartil), conforme apropriado.

Resultados

Expressão do gene YTHDC2 em tumores com base no banco de dados TCGA

Figura 3 ilustra a associação entre o CCRNP e o YTHDC2 ao examinar os níveis de expressão do YTHDC2 em diferentes tipos de câncer utilizando a ferramenta GDC no banco de dados TCGA.

Expressão do gene YTHDC2 no Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC) no banco de dados GEPIA

Foram obtidas 483 amostras de tecido de adenocarcinoma pulmonar, 347 amostras de tecido pulmonar normal, 486 amostras de tecido de carcinoma de células escamosas do pulmão e 338 amostras de tecido pulmonar normal a partir da triagem adicional dos níveis de expressão de YTHDC2 em adenocarcinoma pulmonar (LUAD) e carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) no banco de dados GEPIA. Por meio de análises estatísticas, verificou-se que tanto os tecidos de adenocarcinoma pulmonar quanto os de carcinoma de células escamosas do pulmão exibem níveis consideravelmente mais baixos de expressão de YTHDC2 em comparação com os tecidos pulmonares normais (p < 0,05), conforme ilustrado na Figura 4.

Análise GEPIA da expressão de YTHDC2 entre os estágios patológicos

O banco de dados GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) foi utilizado para gerar um gráfico por estágio com o objetivo de avaliar a expressão diferencial de YTHDC2 nos diferentes estágios do CCRP. Conforme mostrado na Figura 5, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na expressão de YTHDC2 entre os estágios patológicos do CCRP (p = 0.644).

Análise de Kaplan-Meier de YTHDC2 e sobrevida em câncer de pulmão

O banco de dados Kaplan-Meier Plotter foi utilizado para realizar uma análise de sobrevida de Kaplan-Meier do gene YTHDC2. De acordo com os resultados, pacientes com alta expressão de YTHDC2 apresentaram sobrevida geral (OS) significativamente maior do que aqueles com baixa expressão (p < 0,05). Conforme mostrado na Figura 6A (OS), pacientes com câncer de pulmão que expressaram níveis mais elevados de YTHDC2 tiveram um prognóstico melhor, e essa diferença foi estatisticamente significativa (p < 0,05). De acordo com a Figura 6B (PPS), o grupo com alta expressão de YTHDC2 apresentou um prognóstico melhor do que o grupo com baixa expressão no conjunto de dados de Sobrevida Pós-Progressão (PPS); a diferença foi estatisticamente significativa (p < 0,05).

Modelo de previsão da taxa de sobrevivência de YTHDC2

A análise de ROC dependente do tempo com base em dados de expressão de RNA-seq e sobrevida do TCGA revelou capacidade preditiva limitada da expressão de YTHDC2 isoladamente para a sobrevida em CCRP, com valores de AUC de 0,50 (IC 95%: 0,38–0,62), 0,51 (IC 95%: 0,39–0,63), 0,52 (IC 95%: 0,40–0,64) e 0,52 (IC 95%: 0,39–0,65) aos 1, 3, 5 e 8 anos, respectivamente (Figura 7). Todos os intervalos de confiança do AUC incluíram 0,5, indicando desempenho equivalente ao acaso. Esses achados indicam que a expressão de YTHDC2 isoladamente não possui poder discriminatório para predição de sobrevida e não deve ser considerada um biomarcador prognóstico independente. A integração com variáveis clínico-patológicas ou assinaturas multigênicas pode melhorar o desempenho preditivo.

Expressão de YTHDC2 em tecidos tumorais versus normais por qRT-PCR

A expressão gênica de YTHDC2 foi investigada em tecidos malignos e adjacentes normais de pacientes com CCRP utilizando qRT-PCR. A expressão normalizada de YTHDC2 (2^−ΔCt) foi de 3,24 ± 2,34 nos tecidos malignos e de 3,60 ± 1,70 nos tecidos normais próximos. Não houve diferença significativa na expressão de YTHDC2 entre 19 tecidos tumorais emparelhados de CCRP e seus tecidos normais adjacentes correspondentes (p = 0,537), conforme mostrado na Figura 8. Embora a análise bioinformática de grandes conjuntos de dados tenha sugerido uma subregulação significativa de YTHDC2 no CCRP, a qRT-PCR em nossa coorte não mostrou diferença significativa, destacando possíveis discrepâncias devido ao tamanho da coorte, heterogeneidade das amostras e variabilidade técnica. Além disso, a baixa AUC (0,5) indica que o YTHDC2 isolado apresenta precisão insuficiente para fins diagnósticos ou prognósticos.

Expressão de YTHDC2 e características clínico-patológicas no CCRP

Este estudo incluiu 50 indivíduos com CCRNP. Havia 32 pacientes do sexo masculino (64,00%) e 18 pacientes do sexo feminino (36,00%), com idade média de 63,10 ± 9,85 anos. As idades variaram de 37 a 86 anos. Entre os pacientes, 25 tinham histórico de tabagismo e 25 nunca fumaram. Foram observados nove casos de carcinoma de células escamosas (18,00%) e quarenta e um casos de adenocarcinoma pulmonar (82,0%). De acordo com a classificação clínica da CSCO, 22 pacientes estavam nos estágios III–IV (44,00%) e 28 nos estágios I–II (56,00%). Vinte e quatro pacientes não apresentavam metástases linfonodais, enquanto vinte e seis indivíduos (54,00%) apresentavam. Nove pacientes tinham cânceres pouco diferenciados (18,00%), enquanto 41 pacientes tinham tumores bem a moderadamente diferenciados (82,00%).

A associação entre características clínico-patológicas e níveis de expressão de YTHDC2 em tecidos de CCRP foi examinada. Foram observadas diferenças na expressão de YTHDC2 entre subtipos patológicos e de acordo com o status de metástase linfonodal (p < 0,05). No entanto, como apenas quatro amostras de carcinoma de células escamosas estavam disponíveis, a comparação entre subtipos patológicos deve ser interpretada com cautela e considerada exploratória. Conforme mostrado nas Figuras 9A,B, a expressão de YTHDC2 foi significativamente maior no carcinoma de células escamosas do que no adenocarcinoma pulmonar e significativamente maior em tecidos de CCRP com metástase linfonodal do que naqueles sem metástase linfonodal (5,70 ± 2,53 vs. 3,83 ± 0,91, p = 0,027). No entanto, como apenas quatro amostras de carcinoma de células escamosas foram incluídas, a comparação entre subtipos patológicos deve ser interpretada com cautela e considerada exploratória, aguardando validação em coortes maiores. A expressão mais elevada de YTHDC2 em pacientes com metástase linfonodal pode indicar uma associação potencial entre YTHDC2 e status metastático linfonodal; no entanto, esse achado deve ser interpretado com cautela devido ao tamanho limitado da amostra e requer validação em coortes independentes maiores. Por outro lado, idade, histórico de tabagismo, estágio clínico CSCO e diferenciação histológica não afetaram significativamente a expressão de YTHDC2 (p > 0,05). Informações adicionais estão incluídas na Tabela 4, Tabela 5 e Figura 9.

Regressão logística binária da metástase em linfonodos no CCRP

Conforme a análise de correlação, a expressão de YTHDC2 esteve significativamente associada à metástase em linfonodos (p < 0,05). Utilizando a metástase em linfonodos como variável dependente e idade, sexo, histórico de tabagismo, estágio tumoral, tipo histopatológico, nível de expressão de YTHDC2 e grau de diferenciação como variáveis independentes, foi realizada uma análise de regressão logística binária em pacientes com CCRP. Os resultados mostraram que a expressão de YTHDC2 em pacientes com CCRP esteve significativamente associada à metástase em linfonodos (p = 0,027, OR = 2,286, IC 95%: 1,101–4,748).

Nos dados clínicos gerais, o estadiamento tumoral de pacientes com CCRP foi estatisticamente significativo em relação à metástase linfonodal (p = 0,007, OR = 27, IC 95%: 2,504-291,186). No entanto, idade, sexo, histórico de tabagismo, tipo histopatológico e grau de diferenciação não apresentaram correlação significativa com metástase linfonodal no CCRP (p > 0,05), conforme mostrado na Tabela 6.

Disponibilidade de Dados: Os conjuntos de dados que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis no repositório Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). O repositório inclui metadados clínicos do TCGA, anotações das amostras, especificações de recuperação de dados e manifesto de análise utilizados nas análises de bioinformática. Dados adicionais estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente.

Figura 1: Diagrama de fluxo da seleção de pacientes e inclusão de tecidos para análise de qRT-PCR. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2. Fluxo de trabalho das análises bioinformáticas realizadas para avaliar a expressão e o significado prognóstico de YTHDC2 no CCRP Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Expressão do Gene YTHDC2 no Banco de Dados TCGA. Os níveis de expressão do gene YTHDC2 em adenocarcinoma pulmonar (LUAD) e carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) foram comparados com os de tecidos pulmonares normais utilizando dados de sequenciamento de RNA obtidos do The Cancer Genome Atlas (TCGA) por meio do portal de dados Genomic Data Commons (GDC) e analisados com a plataforma web GEPIA. Os dados foram analisados por meio da plataforma GEPIA. A significância estatística foi determinada com um valor de p < 0,05. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4: Expressão diferencial de YTHDC2 no Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC) com base na análise do banco de dados GEPIA. Os níveis de expressão de YTHDC2 em adenocarcinoma pulmonar (LUAD) e carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) foram comparados com os de tecidos pulmonares normais, utilizando dados dos projetos The Cancer Genome Atlas (TCGA) e Genotype-Tissue Expression (GTEx) por meio da plataforma GEPIA. Os gráficos de caixa representam níveis normalizados de expressão gênica. A significância estatística foi determinada com um valor de p < 0,05. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise de expressão por estágio de YTHDC2 no CCRP utilizando o banco de dados GEPIA. Os níveis de expressão de YTHDC2 foram analisados em diferentes estádios patológicos (I–IV) do CCRP utilizando a plataforma GEPIA. O gráfico por estádio ilustra a variação na expressão gênica ao longo dos estádios tumorais. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na expressão de YTHDC2 entre os estádios (p = 0.644). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise de sobrevida de Kaplan–Meier da expressão de YTHDC2 em pacientes com CBNP (Kaplan–Meier Plotter). (A) Sobrevida global (OS): curvas de sobrevida de Kaplan–Meier comparando a sobrevida global em pacientes com CBNP estratificados em grupos de alta (n = 140) e baixa (n = 364) expressão de YTHDC2, utilizando o ponto de corte ótimo (“auto-select best cutoff”) fornecido pela ferramenta Kaplan–Meier Plotter. O teste log-rank foi utilizado para avaliar a significância estatística (p = 0,0093); razão de risco (HR) = 0,61; intervalo de confiança de 95% (IC): 0,42–0,89. A expressão elevada de YTHDC2 está associada a uma sobrevida global significativamente melhor. (B) Sobrevida após progressão (PPS): curvas de sobrevida de Kaplan–Meier comparando a sobrevida após progressão em pacientes com CBNP estratificados em grupos de alta (n = 181) e baixa (n = 296) expressão de YTHDC2, utilizando o ponto de corte ótimo (“auto-select best cutoff”) fornecido pela ferramenta Kaplan–Meier Plotter. O teste log-rank foi utilizado para comparação estatística (p = 4,2 × 10⁻⁵); razão de risco (HR) = 0,63 (intervalo de confiança de 95%: 0,51–0,79). A alta expressão de YTHDC2 está associada a uma sobrevida após progressão significativamente maior. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 7: Modelo de predição da taxa de sobrevivência de YTHDC2. Curvas de característica operacional do receptor (ROC) avaliando a precisão preditiva de YTHDC2 para a sobrevida global em pacientes com TCGA-LUAD e TCGA-LUSC com dados disponíveis de expressão por RNA-seq e sobrevida nos pontos temporais de 1, 3, 5 e 8 anos. Valores de AUC: 1 ano = 0,50, 3 anos = 0,51, 5 anos = 0,52 e 8 anos = 0,52. A linha diagonal tracejada indica chance aleatória (AUC = 0,5). A análise foi realizada utilizando o pacote survival ROC no R. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 8: Expressão de YTHDC2 em tecidos tumorais de CPMN e tecidos normais adjacentes pareados, medida por qRT-PCR. A expressão relativa de YTHDC2 foi calculada utilizando o método 2^–ΔCt e normalizada em relação a GAPDH. Os valores de expressão representam níveis de expressão normalizados, e não variações em relação a uma amostra calibradora. A análise estatística foi realizada utilizando os 19 pares pareados de tecidos tumorais e normais adjacentes disponíveis para comparação pareada. Os dados são apresentados como observações pareadas individuais com média ± desvio padrão. As diferenças entre as amostras pareadas foram analisadas utilizando o teste de postos com sinal de Wilcoxon (p = 0,537). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 9: Associação entre a expressão de YTHDC2 e características clinicopatológicas em pacientes com CCRP. (A) Expressão de YTHDC2 em diferentes tipos histopatológicos, mostrando expressão mais alta no carcinoma de células escamosas do que no adenocarcinoma (p < 0,05). (B) Expressão de YTHDC2 de acordo com o estado de metástase nos linfonodos, demonstrando expressão mais alta em pacientes com metástase linfonodal do que naqueles sem metástase (p < 0,05). (C) Expressão de YTHDC2 em diferentes graus de diferenciação histológica, sem diferença estatisticamente significativa (p = 0,181). (D) Expressão de YTHDC2 nos estágios clínicos da CSCO, sem diferença estatisticamente significativa (p = 0,08). Os níveis de expressão de YTHDC2 foram medidos por PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e calculados utilizando o método 2^–ΔCt, normalizados em relação a GAPDH. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). As comparações estatísticas foram realizadas utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon. *p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

N.º	Critérios de inclusão	Critérios de exclusão
1	Idade ≥18 anos, independentemente do gênero.	Diagnóstico de outras neoplasias malignas.
2	Diagnóstico confirmado de CBNP de acordo com as Diretrizes Clínicas da Associação Médica Chinesa para Câncer de Pulmão (Edição 2024).	Presença de doenças respiratórias ou cardiovasculares crônicas (por exemplo, DPOC, cor pulmonale, insuficiência cardíaca).
3	Disponibilidade de dados clínicos completos, incluindo detalhes demográficos, marcadores séricos de tumor e imagens de tomografia computadorizada de tórax com contraste, com consentimento informado assinado.	Disfunção grave de órgãos, incluindo insuficiência renal (TFG <30 ml/min/1.73m²) ou cirrose hepática.
4	Pacientes sem tratamento prévio e sem terapias direcionadas ao tumor anteriormente.	Populações especiais, incluindo mulheres grávidas ou em lactação (confirmado por teste de β-hCG quando aplicável).
5	Disponibilidade de amostras adequadas de tecido tumoral e/ou adjacente, apropriadas para análise molecular.	Má qualidade da amostra, incluindo tecido insuficiente ou RNA degradado (confirmado pela análise do patologista).

Tabela 1: Critérios de inclusão e exclusão para pacientes com Câncer de Pulmão de Células não Pequenas (NSCLC) no estudo

Tipo de tecido	Amostras pareadas analisadas (n)	Expressão relativa (Média ± DP)
Tecido tumoral	19	3,24 ± 2,34
Tecido normal adjacente pareado	19	3,60 ± 1,70

Tabela 2: Expressão de YTHDC2 em Tecidos Pareados de Tumor de Câncer de Pulmão de Células não Pequenas (NSCLC) e Tecidos Normais Adjacentes. A expressão relativa de YTHDC2 foi medida utilizando o método 2^–ΔCt e normalizada em relação a GAPDH. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A comparação estatística dos 19 pares de tecidos tumorais e normais pareados foi realizada utilizando o teste de postos com sinal de Wilcoxon (p = 0,537).

Gene alvo	Primer/sonda	Sequência (5′→3′)
YTHDC2	Sentido (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Antissentido (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Sonda (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Sentido (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Antissentido (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Sonda (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tabela 3: Sequências de iniciadores e sondas utilizadas para PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). A expressão de YTHDC2 foi quantificada utilizando a química TaqMan, com GAPDH como controle interno.

Característica	Categoria	n	%
Tipo patológico	Adenocarcinoma	41	82
	Carcinoma de células escamosas	9	18
Estadiamento CSCO	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Metástase linfonodal	Não	24	48
	Sim	26	52
Grau de diferenciação	Baixa diferenciação	9	18
	Diferenciação moderada–alta	41	82
Idade	≥60 anos	36	72
	<60 anos	14	28
Gênero	Masculino	32	64
	Feminino	18	36
Histórico de tabagismo	Sim	25	50
	Não	25	50

Tabela 4: Características clínicas e patológicas de pacientes com Câncer de Pulmão de Células não Pequenas (CPCNP). Os dados são apresentados como números (n) e porcentagens (%) com base na população total do estudo (n = 50).

Característica clinicopatológica	Grupo	n	Expressão de YTHDC2 (Média ± DP)	Valor de p
Tipo de tecido	Tumor	30	3,24 ± 2,34	0,537
	Tecido normal adjacente	19	3,60 ± 1,70
Tipo patológico	Adenocarcinoma	26	4,13 ± 1,29	0,022*
	Carcinoma de células escamosas	4	7,50 ± 3,41
Estadiamento CSCO	I–II	22	4,29 ± 1,94	0,08
	III–IV	8	5,05 ± 1,51
Metástase linfonodal	Não	19	3,83 ± 0,91	0,027*
	Sim	11	5,70 ± 2,53
Diferenciação histológica	Moderadamente–bem diferenciado	25	4,33 ± 1,90	0,181
	Pouco diferenciado	5	5,18 ± 1,60
Idade	≥60 anos	20	4,62 ± 2,10	0,835
	<60 anos	10	4,16 ± 1,12
Histórico de tabagismo	Sim	12	4,62 ± 2,40	0,845
	Não	18	4,38 ± 1,40

Tabela 5: Associação entre a expressão de YTHDC2 e características clinicopatológicas em pacientes com CCRP. A expressão de YTHDC2 foi medida por qRT-PCR e calculada utilizando o método 2^–ΔCt, normalizado em relação a GAPDH. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). Os tamanhos dos grupos (n) representam o número de amostras válidas analisadas. As comparações estatísticas entre os grupos foram realizadas utilizando o teste de soma de postos de Wilcoxon. *p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Variável	β	Wald	valor-p	OR	IC 95%
Idade (≥60 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Gênero (Feminino vs Masculino)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Histórico de Tabagismo (Sim vs Não)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Estádio do Tumor (III–IV vs I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Diferenciação (Pobre vs Moderado–bom)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
Expressão de YTHDC2	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Tabela 6: Análise de regressão logística multivariada de fatores associados à metástase linfonodal em pacientes com CCRP. Foi realizada regressão logística binária utilizando a metástase linfonodal como variável dependente. As razões de chances (OR) com intervalos de confiança de 95% (IC) são apresentadas. Categorias de referência: idade (<60 anos), sexo (masculino), histórico de tabagismo (não), estágio tumoral (I–II) e diferenciação (moderada–bem diferenciado). *p < 0,05 indica significância estatística.

Discussão

YTHDC2, a maior proteína ligadora de N6-metiladenosina (m6A) da família YTH, é única por sua atividade de helicase de RNA dependente de ATP, o que a distingue como um regulador-chave do metabolismo do RNA¹³. Diferentemente de outros membros da família YTH, YTHDC2 é encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma, onde regula a tradução do mRNA e a estabilidade do RNA¹⁴. Estudos experimentais anteriores demonstraram que YTHDC2 suprime a progressão do adenocarcinoma pulmonar (LUAD) inibindo a expressão de mRNA de ADIRF e MRPL12, aumentando a apoptose e reduzindo a proliferação celular e a metástase^15,16. Estudos experimentais anteriores também sugeriram que YTHDC2 estabiliza lncRNAs, como ZNRD1-AS1, para suprimir a proliferação do LUAD e modular mRNAs modificados por m6A, como CYLD e SLC7A11, inibindo a via de sinalização NF-κB, a captação de cisteína e os processos antioxidantes, enquanto promove a ferroptose e a atividade antitumoral^17,18.

Neste estudo, a expressão e o significado clínico da proteína leitora m6A YTHDC2 no Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC) foram investigados por meio de uma abordagem integrativa que combina análises de bioinformática e validação experimental. Essa análise de bioinformática dos bancos de dados TCGA e GEPIA revelou uma significativa subexpressão de YTHDC2 nos tecidos tumorais de NSCLC em comparação com tecidos pulmonares normais, e uma expressão mais elevada de YTHDC2 esteve associada à melhora da sobrevida geral e da sobrevida pós-progressão, sugerindo um possível papel prognóstico. Curiosamente, nossos experimentos de qRT-PCR utilizando as 19 amostras pareadas disponíveis de tecido tumoral e tecido normal adjacente na coorte atual não demonstraram diferença estatisticamente significativa na expressão de YTHDC2 entre os tecidos tumorais e os tecidos normais adjacentes. Essa discordância destaca os desafios de traduzir achados provenientes de grandes conjuntos de dados públicos para coortes clínicas independentes e reforça a necessidade de interpretação cautelosa das análises in silico. Compreender as razões por trás dessas diferenças é fundamental para avaliar com precisão a utilidade de YTHDC2 como biomarcador e alvo terapêutico no NSCLC. O foco do presente estudo em YTHDC2 está alinhado à sua atividade única de helicase entre as proteínas leitoras da família YTH¹⁹, mas análises pan-câncer recentes revelam papéis dependentes do contexto para outros membros da família. Por exemplo, Li et al. demonstraram que YTHDF1/2 estão superexpressos na maioria dos cânceres (por exemplo, LIHC, LUAD) e se correlacionam com prognóstico desfavorável, enquanto YTHDC1/2 apresentam efeitos supressores de tumor em KIRC e BRCA²⁰. Notavelmente, o papel oncogênico de YTHDF1 por meio da ativação da via Wnt/β-catenina contrasta com a função anti-metastática de YTHDC2 no NSCLC, destacando a necessidade de estratégias de biomarcadores específicas para subtipos. Em comparação com marcadores prognósticos estabelecidos (por exemplo, PD-L1 para resposta à imunoterapia), o poder preditivo de YTHDC2 pode ser potencializado pela combinação com outros reguladores de m6A (por exemplo, METTL3, YTHDF1) ou genes de pontos de controle imunológico, conforme sugerido por análises de infiltração imune pan-câncer. Embora estudos anteriores sugiram que YTHDC2 regula a via NF-κB/CYLD¹², o presente estudo foi limitado pela ausência de validação ao nível proteico por meio de imuno-histoquímica ou Western blot, bem como pela falta de validação funcional. Trabalhos futuros devem combinar ensaios de silenciamento gênico com sequenciamento de m6A para mapear alvos diretos.

Análises anteriores revelaram que a expressão de YTHDC2 é reduzida em tecidos de CCRP e está associada a um prognóstico desfavorável²¹. A análise de Kaplan-Meier indicou maior sobrevida em pacientes com expressão mais elevada de YTHDC2, mas a análise da curva ROC sugeriu poder preditivo limitado para sobrevida²⁰. A análise ROC de sobrevida no presente estudo foi realizada utilizando dados de expressão e sobrevida de RNA-seq do TCGA, já que informações de acompanhamento de longo prazo não estavam disponíveis para nossa coorte clínica local. Importante, os baixos valores de AUC (~0,5) observados neste estudo sugerem que a expressão de YTHDC2 não possui sensibilidade e especificidade suficientes para uso clínico como biomarcador isolado²². Essa limitação está de acordo com evidências emergentes de que biomarcadores baseados em um único gene frequentemente são insuficientes para doenças complexas como o CCRP, nas quais abordagens multi-ômicas e painéis integrados de biomarcadores são cada vez mais necessários para alcançar desempenho preditivo clinicamente relevante. Expressão mais elevada de YTHDC2 foi observada em tecidos de CCRP com metástase em linfonodo, sugerindo uma possível associação entre a expressão de YTHDC2 e o status de metástase linfonodal na presente coorte. Embora diferenças na expressão de YTHDC2 também tenham sido observadas entre adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas, essa comparação deve ser interpretada com cautela, pois apenas 4 amostras de carcinoma de células escamosas estavam disponíveis para análise, limitando substancialmente o poder estatístico dessa comparação por subgrupo. Nenhuma diferença significativa foi observada em estágio clínico, grau de diferenciação, idade ou histórico de tabagismo, provavelmente devido a limitações do estudo, incluindo o tamanho da amostra e o delineamento unicêntrico. Embora a associação observada entre expressão reduzida de YTHDC2 e metástase linfonodal sugira um possível papel biológico no CCRP, seu baixo poder discriminatório (AUC ~0,5) e detecção inconsistente por qRT-PCR impedem seu uso como marcador clínico isolado. Estudos futuros devem investigar se a combinação de YTHDC2 com outras proteínas relacionadas à m6A melhora o valor preditivo.

As análises de bioinformática sugeriram que a expressão de YTHDC2 está reduzida no CCRP e pode estar associada a melhores desfechos para os pacientes. Embora a expressão reduzida também tenha sido observada em pacientes com metástase linfonodal e diferenças tenham sido notadas entre subtipos patológicos, esses achados em subgrupos devem ser interpretados com cautela devido ao tamanho limitado da amostra, particularmente no carcinoma de células escamosas. No entanto, esses achados não foram confirmados pela análise de qRT-PCR na nossa coorte clínica, o que possivelmente reflete diferenças nas características da coorte, no tamanho da amostra, na variabilidade técnica, na regulação pós-transcricional ou na ausência de validação ao nível proteico. Pesquisas futuras devem explorar os mecanismos do YTHDC2 em outros subtipos de câncer de pulmão por meio de experimentos in vitro e in vivo. Tais estudos podem esclarecer ainda mais o papel biológico do YTHDC2 e determinar se ele possui alguma utilidade clínica como parte de uma abordagem com múltiplos marcadores, em vez de atuar como biomarcador isolado.

Limitações

Este estudo possui várias limitações. Tratou-se de um estudo retrospectivo realizado em centro único e com tamanho amostral relativamente pequeno, o que pode limitar a generalização dos resultados. O uso de tecidos em parafina emblocados em formalina (FFPE) pode ter afetado a qualidade do RNA e a sensibilidade da qRT-PCR. Além disso, apenas a expressão do mRNA do YTHDC2 foi avaliada, e não foi realizada validação ao nível proteico por meio de imunohistoquímica (IHC) ou Western blotting. Como a expressão de mRNA nem sempre se correlaciona com a abundância proteica devido à regulação pós-transcricional, isso pode explicar parcialmente a discrepância entre nossos achados clínicos e as análises de bancos de dados públicos. O estudo também carecia de dados de acompanhamento de longo prazo, e as análises por subgrupos (por exemplo, carcinoma de células escamosas) tinham poder estatístico insuficiente.

Próximas direções

Pesquisas futuras devem explorar os mecanismos do YTHDC2 no CCRP por meio de experimentos in vitro e in vivo para compreender melhor seu papel funcional. São necessários estudos multicêntricos com tamanhos amostrais maiores para validar os achados e melhorar a generalização. Além disso, a integração do YTHDC2 com outros reguladores relacionados à m6A e variáveis clinicopatológicas pode aumentar sua utilidade preditiva e prognóstica. Estudos adicionais que incorporem abordagens de multi-ômica, incluindo transcriptômica, proteômica e epigenômica, são necessários para esclarecer os mecanismos biológicos subjacentes à desregulação do YTHDC2. A validação no nível proteico por imuno-histoquímica (IHC) ou Western blotting também deve ser realizada para avaliar a concordância entre a expressão de mRNA e proteína. A padronização dos procedimentos de processamento de amostras e técnicas de validação também será fundamental para garantir a reprodutibilidade e a aplicabilidade clínica.

Conclusão

Este estudo fornece uma avaliação exploratória da expressão de YTHDC2 no CCRP ao integrar análises de bioinformática com validação clínica por qRT-PCR. No entanto, sua detecção inconsistente entre plataformas analíticas e precisão diagnóstica limitada (AUC ≈0,5) atualmente impedem seu uso como biomarcador clínico isolado. Embora as análises de bioinformática sugiram significado prognóstico potencial, a validação clínica independente não sustenta sua confiabilidade para aplicação diagnóstica ou prognóstica. Esses achados devem ser interpretados com cautela e exigem validação em coortes multicêntricas maiores, com estudos em nível proteico e funcionais, antes que qualquer aplicação clínica possa ser considerada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Primers e Sondas Personalizados	Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China	Síntese personalizada	Sequências dos primers e sondas listadas na Tabela 6
DNase I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	Remoção de contaminação por DNA genômico
Algoritmo ESTIMATE	Yoshihara et al.	Pacote R (Versão 1.0.13)	Estimativa da pureza tumoral
Kit de Extração de RNA FFPE	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	Extração de RNA de tecido FFPE
Portal de Dados GDC	Instituto Nacional do Câncer (NCI), NIH, EUA	https://portal.gdc.cancer.gov	Download dos conjuntos de dados TCGA
Servidor Web GEPIA	Universidade de Pequim, China	http://gepia.cancer-pku.cn	Análise de expressão gênica
Plotador Kaplan–Meier	Universidade Semmelweis, Hungria	https://kmplot.com	Análise de sobrevida
Microcentrífuga	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha	5424 R	Procedimentos de purificação de RNA
Espectrofotômetro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	NanoDrop 2000/2000c	Quantificação de RNA
Mistura Mestra para qPCR com Sonda	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Amplificação de PCR quantitativa
Software Estatístico R	Fundação R para Computação Estatística, Viena, Áustria	Versão 4.4.1	Análises estatísticas e análise ROC
Sistema de PCR em Tempo Real	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA	CFX Opus 96	PCR quantitativa em tempo real
Kit de Transcrição Reversa	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	Síntese de cDNA
Coluna de Purificação de RNA	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure Mini Column I	Coluna de purificação de RNA com membrana de sílica
Água Livre de RNase	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Água Livre de RNase	Eluição de RNA
Estatística SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, EUA	IBM SPSS Statistics Versão 27.0	Análises estatísticas
Pacote survivalROC	CRAN (Fundação R para Computação Estatística)	Versão 1.0.3.1	Análise ROC dependente do tempo
Banco de dados TCGA	Instituto Nacional do Câncer (NCI), NIH, EUA	https://portal.gdc.cancer.gov	Banco de dados público de genômica do câncer
Tampão de Lavagem RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Tampão RW1	Tampão de lavagem para purificação de RNA
Tampão de Lavagem RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Tampão RW2	Tampão de lavagem para purificação de RNA