É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
Este estudo avalia a expressão de YTHDC2 no câncer de pulmão de células não pequenas utilizando bioinformática e qRT-PCR. Embora análises de banco de dados sugiram subregulação e relevância prognóstica, a validação clínica não mostra diferença significativa. Os resultados destacam inconsistências, indicando precisão diagnóstica limitada e a necessidade de mais validação antes da aplicação clínica.
O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) continua sendo uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, com biomarcadores limitados disponíveis para diagnóstico precoce e prognóstico. A modificação de RNA por N6-metiladenosina (m6A) e suas proteínas leitoras, como a YTHDC2, desempenham papéis fundamentais na regulação gênica e na tumorigênese. Este estudo tem como objetivo avaliar o perfil de expressão da YTHDC2 em tecidos de CPCNP utilizando bioinformática e PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), analisar a relação entre a YTHDC2 e as características clínico-patológicas e explorar sua relevância clínica e biológica potencial para pesquisas futuras. Dados de expressão gênica e sobrevida provenientes de bancos de dados foram analisados quanto à precisão prognóstica. A expressão de YTHDC2 foi quantificada em tecidos de CPCNP de uma coorte clínica chinesa, e as características clínico-patológicas foram analisadas. As análises de bancos de dados públicos mostraram que a YTHDC2 estava subexpressa em tecidos de CPCNP (p < 0,05) e estava associada à sobrevida dos pacientes, embora seu desempenho prognóstico tenha sido fraco (AUC ≈ 0,5). A análise por qRT-PCR de 19 tecidos pareados de tumor e tecido normal adjacente não mostrou diferença estatisticamente significativa (p = 0,537) na expressão da YTHDC2 entre os tecidos tumorais e os adjacentes. Em conjunto, as análises de bancos de dados públicos sugerem que a YTHDC2 pode estar subexpressa e ter relevância prognóstica potencial no CPCNP, mas a validação clínica independente em nossa coorte não confirmou expressão diferencial significativa. Esses achados destacam uma heterogeneidade substancial entre conjuntos de dados em larga escala e coortes do mundo real, indicando que a YTHDC2 provavelmente não servirá como biomarcador diagnóstico ou prognóstico confiável isolado e poderá exigir integração com outros marcadores moleculares para aplicabilidade clínica.
O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), que engloba o carcinoma de células escamosas e o adenocarcinoma, é o tipo mais frequentemente diagnosticado de câncer de pulmão e uma das principais causas de mortalidade global por câncer1. As estatísticas globais sobre câncer mostram que o câncer de pulmão é uma das principais causas de morte por neoplasias2. Os avanços recentes em diagnóstico, cirurgia, radioterapia e terapia direcionada molecular não melhoraram significativamente o prognóstico do CPCNP, pois o diagnóstico inicial geralmente ocorre em estágio avançado, e a doença é frequentemente assintomática nos estágios iniciais3. Isso ressalta a necessidade de novos biomarcadores para identificar, determinar o prognóstico e avaliar a eficácia do tratamento em pacientes com CPCNP.
m6A é a primeira modificação de RNA identificada e a mais abundante em eucariotos, estando implicada na estabilidade do RNA, tradução e transcrição4. As modificações m6A são dinâmicas e reversíveis, facilitadas por metiltransferases (escritores), desmetilases (apagadores) e proteínas de ligação específicas (leitores)5. Dentre essas, a YTHDC2, uma importante proteína leitora de m6A, modula a estabilidade do RNA e a taxa de tradução6. Estudos recentes indicam que a YTHDC2 está envolvida na regulação de múltiplos tipos de câncer, seja suprimindo o crescimento e invasão celular, seja induzindo a morte celular7. Também foram destacadas as relevâncias clínicas de outras proteínas leitoras de m6A, incluindo YTHDF1, YTHDF2 e YTHDC1, na progressão do câncer de pulmão, regulação imune e prognóstico, enfatizando a importância de avaliar sistematicamente cada leitor individual de m6A em coortes independentes de pacientes8,9,10. No Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC), observam-se níveis significativamente baixos de YTHDC2, os quais estão associados a estágios tumorais avançados, metástase linfonodal e prognóstico desfavorável para os pacientes, indicando que ela poderia atuar como um fator antitumoral11. Experimentos in vitro e in vivo também revelam que a alta expressão de YTHDC2 inibe a proliferação celular e a metástase no câncer de pulmão7.
Neste estudo, a regulação de YTHDC2 no CCRP foi investigada por meio de análises computacionais integradas e validação experimental por qRT-PCR. Também foi examinada a relação entre a expressão de YTHDC2 e as características clinicopatológicas e o prognóstico dos pacientes. Apesar do aumento de evidências provenientes de bases de dados públicas que sugerem a desregulação de YTHDC2 no CCRP, estudos publicados têm relatado achados inconsistentes quanto à magnitude e ao significado clínico dessa desregulação, e a validação independente em coortes clínicas bem caracterizadas do mundo real, particularmente em populações asiáticas, permanece limitada. Além disso, a maioria dos estudos anteriores baseou-se predominantemente em conjuntos de dados transcriptômicos públicos ou modelos experimentais, com relativamente poucos integrando descobertas de bioinformática com validação clínica independente. Ao combinar análises transcriptômicas públicas em larga escala com validação independente por qRT-PCR em uma coorte clínica chinesa, este estudo teve como objetivo avaliar a reprodutibilidade dos achados anteriores e preencher a lacuna translacional entre análises de bases de dados públicas e amostras clínicas do mundo real. Portanto, este estudo buscou avaliar sistematicamente a expressão de YTHDC2 utilizando abordagens integradas de bioinformática e validação clínica e avaliar sua possível relevância biológica e clínica no CCRP. Levantou-se a hipótese de que a expressão de YTHDC2 está desregulada no CCRP e de que a integração de análises de bioinformática com validação clínica independente forneceria uma avaliação mais confiável de seu significado diagnóstico e prognóstico do que cada abordagem isoladamente.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Hainan (número de aprovação HMC1984.24) e esteve em conformidade com a Declaração de Helsinque (revisada em 2013).
Assuntos do estudo
Foi conduzido um estudo com 50 pacientes com câncer de pulmão diagnosticados entre 2017 e 2024 no Hospital Central de Sanya, na província de Hainan, utilizando as Diretrizes Clínicas da Associação Médica da China para o Diagnóstico e Tratamento do Câncer de Pulmão (Edição 2024). A estadia CSCO (2024) foi alinhada com a 8ª Edição do AJCC para permitir comparabilidade entre estudos, conforme validado em coortes chineses12, com revisão por dois oncologistas independentes para garantir consistência. O processo de seleção dos pacientes, disponibilidade de tecidos, avaliação da qualidade do RNA e inclusão final das amostras para análise de qRT-PCR são resumidos na Figura 1.
Dados do estudo
Este estudo utilizou bioinformática para analisar os níveis de expressão de YTHDC2 no CCRP e sua relação com características clínico-patológicas, oferecendo insights sobre mecanismos potenciais. As análises bioinformáticas foram realizadas exclusivamente com dados públicos de sequenciamento de RNA do The Cancer Genome Atlas (TCGA), incluindo amostras de adenocarcinoma pulmonar (LUAD), carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) e tecidos pulmonares normais correspondentes, obtidos por meio do GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). O conjunto de dados baixado incluiu dados de expressão de sequenciamento de RNA juntamente com variáveis clínicas disponíveis (identificador do paciente, identificador da amostra, idade, sexo, estágio patológico, status de sobrevida e tempo de sobrevida global) para os casos elegíveis de TCGA-LUAD e TCGA-LUSC. Amostras sem informações de expressão gênica ou de sobrevida foram excluídas das análises downstream de sobrevida e ROC. O conjunto de dados utilizado neste estudo está disponível como Arquivo Suplementar 1. Nenhum espécime clínico coletado no Hospital Central de Sanya foi utilizado nas análises bioinformáticas. Os procedimentos detalhados para as análises GEPIA, Kaplan–Meier Plotter e survivalROC são fornecidos na seção Análise bioinformática abaixo. O fluxo de trabalho completo de bioinformática, incluindo aquisição de dados, pré-processamento, análise de expressão gênica, análise de sobrevida e análise ROC, está resumido na Figura 2.
Critérios de inclusão e exclusão
Os critérios de inclusão e exclusão dos pacientes estão apresentados na Tabela 1. Uma análise de poder realizada com software de análise estatística de poder determinou que pelo menos 26 casos por grupo forneceriam poder de 80% para detectar um efeito de tamanho moderado (d = 0,8, α = 0,05, bicaudal). Embora o recrutamento inicial tivesse como meta 50 pares no grupo de câncer de pulmão, a análise final de qRT-PCR incluiu 30 amostras tumorais e 19 amostras de tecido adjacente normal após exclusões por qualidade do tecido ou do RNA. Essa redução no tamanho da amostra reflete as limitações clínicas do mundo real e destaca a importância da integridade do RNA e da disponibilidade do tecido em estudos translacionais. Com n = 19 nas comparações, o tamanho mínimo do efeito detectável é d = 1,0 (poder de 80%, α = 0,05). Assim, o experimento teve poder suficiente para detectar diferenças grandes, mas não pequenas a moderadas, na expressão de YTHDC2.
Amostras de tecido e PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR)
Os diagnósticos patológicos foram determinados de forma duplamente cega por dois patologistas diferentes. A pureza tumoral foi estimada pelos patologistas (>70% de células malignas) e confirmada por meio do método ESTIMATE (TCGA). Tecidos normais adjacentes foram macrodissecados para minimizar a contaminação estromal. Os tipos histológicos de câncer de pulmão incluíram adenocarcinoma de pulmão e carcinoma de células escamosas, com 26 casos de adenocarcinoma de pulmão e 4 casos de carcinoma de células escamosas. A estadia clínica dos 50 pacientes com câncer de pulmão foi realizada de acordo com os critérios de estadiamento descritos nas “Diretrizes Clínicas da Associação Médica Chinesa para Câncer de Pulmão (Edição 2024)”. Espécimes de CPTNP confirmados patologicamente (n = 50) representaram distribuições clínicas típicas (ver Tabela 2). Dos 50 pacientes inicialmente incluídos, 30 amostras de tecido tumoral e 19 amostras pareadas de tecido normal adjacente atenderam aos critérios de qualidade do RNA. Como a análise estatística pareada exige espécimes pareados do mesmo paciente, a comparação da expressão entre tecido tumoral e tecido normal adjacente foi realizada utilizando os 19 pares disponíveis. Esses espécimes clínicos foram usados exclusivamente para validação experimental por qRT-PCR e analisados independentemente dos conjuntos de dados públicos do TCGA utilizados na análise bioinformática. Esses espécimes selecionados foram processados imediatamente após a confirmação patológica e manipulados em condições livres de RNase antes da extração de RNA. Este subconjunto reflete os casos em que foi possível obter tanto quantidade adequada de tecido quanto RNA total de alta qualidade (número de integridade do RNA, RIN >7,0). A concentração e pureza do RNA total foram medidas antes da transcrição reversa, e somente amostras com qualidade adequada de RNA (RIN >7,0) foram incluídas para análises posteriores. Quantidades iguais de RNA total foram transcritas reversamente em DNA complementar (cDNA) de acordo com o protocolo do fabricante antes da PCR quantitativa. Esse processo garantiu a validade dos dados de expressão gênica analisados. Os experimentos de qRT-PCR foram realizados em um termociclador de PCR em tempo real, utilizando um ensaio de PCR quantitativo baseado em sonda. Todas as reações foram realizadas em triplicata, juntamente com controles sem molde para assegurar a reprodutibilidade analítica. A amplificação por PCR foi realizada nas seguintes condições de ciclagem: uma etapa inicial de ativação/enzimática desnaturação a 95 °C por 10 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e pareamento/elongação a 60 °C por 60 s. Os sinais de fluorescência foram adquiridos ao final de cada ciclo de amplificação. Todos os reagentes e materiais descartáveis foram obtidos de fornecedores comerciais (ver Tabela de Materiais). As sequências dos iniciadores e sondas utilizadas na qRT-PCR estão indicadas na Tabela 3.
Análise bioinformática
Análise da expressão gênica de YTHDC2 no banco de dados GEPIA
O banco de dados GEPIA foi utilizado para analisar a expressão de YTHDC2 no CCRP. O servidor web do GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) foi acessado por meio de um navegador da internet. O módulo Expression DIY foi selecionado, o símbolo do gene "YTHDC2" foi inserido, os conjuntos de dados LUAD e LUSC foram selecionados, os parâmetros padrão de normalização foram mantidos e os gráficos de caixa de expressão diferencial foram gerados diretamente pela interface do GEPIA. A significância estatística foi definida como p < 0,05.
Banco de dados Kaplan-Meier plotter para análise de sobrevida de pacientes com câncer de pulmão
O estudo analisou a relação entre a expressão de YTHDC2 e o prognóstico em pacientes com câncer de pulmão utilizando o banco de dados Kaplan-Meier Plotter. Foi selecionado o conjunto de dados de câncer de pulmão, o símbolo do gene "YTHDC2" foi inserido, foi aplicada a opção de corte ideal pré-selecionada automaticamente e foram geradas curvas de Kaplan-Meier para sobrevida global e sobrevida pós-progressão utilizando as configurações padrão de análise. Os pacientes foram automaticamente estratificados em grupos de alta e baixa expressão utilizando o ponto de corte ótimo determinado pela plataforma Kaplan-Meier Plotter, e as razões de risco com os respectivos intervalos de confiança de 95% foram geradas usando as configurações padrão da plataforma.
Execução de pacotes R no software R para a plotagem de curvas ROC
Os dados de expressão de sequenciamento de RNA e as metainformações clínicas correspondentes para os casos elegíveis de TCGA-LUAD e TCGA-LUSC foram baixados do GDC Data Portal. Os conjuntos de dados baixados foram combinados por identificador do paciente e importados para o R para análises posteriores. O pacote survivalROC foi utilizado para gerar curvas ROC dependentes do tempo nos pontos de previsão de 1, 3 e 5 anos, e os valores correspondentes da área sob a curva (AUC) foram calculados para avaliar o desempenho prognóstico da expressão de YTHDC2. Apenas pacientes com dados disponíveis de expressão por RNA-seq e informações de sobrevida de TCGA-LUAD e TCGA-LUSC foram incluídos na análise de ROC de sobrevida. A coorte clínica local não foi utilizada para predição de sobrevida porque dados de acompanhamento de longo prazo não estavam disponíveis.
Expressão tecidual de YTHDC2 por qRT-PCR
Para analisar os níveis de expressão gênica, foi realizada qRT-PCR. Volumes iguais de cDNA foram adicionados a cada reação de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. A amplificação foi realizada utilizando um ensaio de PCR quantitativo baseado em sonda, e os dados de fluorescência foram coletados automaticamente ao final de cada ciclo de amplificação. Resumidamente, o processo de extração de RNA envolveu várias etapas, incluindo preparação da amostra, desparafinização, remoção do líquido residual, digestão com proteinase K, incubação, centrifugação, tratamento com DNase, adição de DNase I e precipitação com etanol. Em seguida, a amostra foi ligada a uma coluna de purificação de RNA baseada em sílica e centrifugada a 8.000 × g por 30 s. A coluna foi então lavada com tampão de lavagem 1, tampão de lavagem 2 e tampão de lavagem 2 diluído com etanol, e seca a 13.000 × g por 2 min. O RNA foi então eluído pela adição de 70 µL de Água Livre de RNase ao centro da membrana da coluna, seguido de centrifugação a 13.000 × g por 1 min. Cada par de primers demonstrou um único produto de amplificação, o qual foi confirmado por análise da curva de dissociação antes do cálculo da expressão gênica relativa. A eficiência dos primers (90–110%) foi validada utilizando curvas-padrão antes da análise das amostras. As análises de curva de dissociação confirmaram a presença de amplicons únicos e a ausência de dímeros de primer. A expressão relativa de YTHDC2 foi calculada pelo método 2-ΔCt, no qual os valores de Ct foram normalizados ao gene de referência endógeno GAPDH. Como os valores de expressão foram apresentados como níveis de expressão normalizados em vez de variações em relação a uma amostra calibradora, os resultados são relatados como valores de 2−ΔCt. O gene GAPDH foi selecionado como gene de referência porque sua expressão apresentou variabilidade mínima (CV < 5%) em comparação com as alternativas testadas (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), o que está de acordo com os critérios de seleção de genes de referência em estudos de m6A.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando software estatístico, incluindo a criação de gráficos e tabelas. Para analisar os dados quantitativos e categóricos sobre a expressão do gene YTHDC2 em pacientes com CCRP, o software R foi utilizado para análises bioinformáticas e geração de curvas ROC. As curvas ROC e a AUC foram usadas para avaliar o desempenho diagnóstico da expressão de YTHDC2 na predição de sobrevida. Para análises baseadas em regressão, as estimativas de efeito (razões de chances) com os respectivos intervalos de confiança de 95% foram relatadas quando aplicáveis. O teste de Wilcoxon para amostras pareadas foi utilizado para comparar a expressão de YTHDC2 entre amostras pareadas de tecido tumoral e tecido normal adjacente, enquanto a análise de correlação de Pearson foi usada para avaliar a associação entre a expressão de YTHDC2 e as características clínico-patológicas. Os coeficientes de correlação (r) e os valores de p correspondentes foram relatados. Como os dados de qRT-PCR consistiam em amostras pareadas de tecido tumoral e tecido normal adjacente provenientes dos mesmos pacientes e os dados de expressão gênica não apresentavam distribuição normal, o teste de Wilcoxon para amostras pareadas foi utilizado para comparar os níveis de expressão de YTHDC2 entre os tecidos pareados. Este teste não assume normalidade dos dados e é comumente usado para dados biológicos assimétricos. Todos os testes estatísticos foram bicaudais, e p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As variáveis contínuas foram avaliadas quanto à normalidade antes da análise. As variáveis contínuas são apresentadas como média ± desvio padrão ou mediana (intervalo interquartil), conforme apropriado.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Expressão do gene YTHDC2 em tumores com base no banco de dados TCGA
Figura 3 ilustra a associação entre o CCRNP e o YTHDC2 ao analisar os níveis de expressão do YTHDC2 em diferentes tipos de câncer utilizando a ferramenta GDC na base de dados do TCGA.
Expressão do gene YTHDC2 no Câncer de Pulmão de Células não Pequenas (NSCLC) no banco de dados GEPIA
Foram obtidas 483 amostra...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
YTHDC2, a maior proteína ligadora de N6-metiladenosina (m6A) da família YTH, é única por sua atividade de helicase de RNA dependente de ATP, o que a distingue como um regulador-chave do metabolismo do RNA13. Diferentemente de outros membros da família YTH, YTHDC2 é encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma, onde regula a tradução do mRNA e a estabilidade do RNA14. Estudos experimentais anteriores demonstraram que YTHDC2 suprime a progressão do adenocarcinoma pulmonar ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm interesses financeiros ou não financeiros relevantes a declarar.
Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Hainan (nº 821RC735).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Primers e Sondas Personalizados | Sangon Biotech Co., Ltd., Xangai, China | Síntese personalizada | Sequências dos primers e sondas listadas na Tabela 6 |
| DNase I | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | DNase I (HiPure FFPE RNA Kit) | Remoção de contaminação por DNA genômico |
| Algoritmo ESTIMATE | Yoshihara et al. | Pacote R (Versão 1.0.13) | Estimativa da pureza tumoral |
| Kit de Extração de RNA FFPE | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02) | Extração de RNA de tecido FFPE |
| Portal de Dados GDC | Instituto Nacional do Câncer (NCI), NIH, EUA | https://portal.gdc.cancer.gov | Download dos conjuntos de dados TCGA |
| Servidor Web GEPIA | Universidade de Pequim, China | http://gepia.cancer-pku.cn | Análise de expressão gênica |
| Plotador Kaplan–Meier | Universidade Semmelweis, Hungria | https://kmplot.com | Análise de sobrevida |
| Microcentrífuga | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha | 5424 R | Procedimentos de purificação de RNA |
| Espectrofotômetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | NanoDrop 2000/2000c | Quantificação de RNA |
| Mistura Mestra para qPCR com Sonda | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040) | Amplificação de PCR quantitativa |
| Software Estatístico R | Fundação R para Computação Estatística, Viena, Áustria | Versão 4.4.1 | Análises estatísticas e análise ROC |
| Sistema de PCR em Tempo Real | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA | CFX Opus 96 | PCR quantitativa em tempo real |
| Kit de Transcrição Reversa | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) | Síntese de cDNA |
| Coluna de Purificação de RNA | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | HiPure Mini Column I | Coluna de purificação de RNA com membrana de sílica |
| Água Livre de RNase | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Água Livre de RNase | Eluição de RNA |
| Estatística SPSS | IBM Corp., Armonk, NY, EUA | IBM SPSS Statistics Versão 27.0 | Análises estatísticas |
| Pacote survivalROC | CRAN (Fundação R para Computação Estatística) | Versão 1.0.3.1 | Análise ROC dependente do tempo |
| Banco de dados TCGA | Instituto Nacional do Câncer (NCI), NIH, EUA | https://portal.gdc.cancer.gov | Banco de dados público de genômica do câncer |
| Tampão de Lavagem RW1 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Tampão RW1 | Tampão de lavagem para purificação de RNA |
| Tampão de Lavagem RW2 | Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China | Tampão RW2 | Tampão de lavagem para purificação de RNA |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.