Cardioides Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos como Modelo para Avaliar a Entrega de Oligonucleotídeos

Resumo

Esse protocolo possibilita a geração de cardioióides auto-organizáveis à base de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas para avaliação microscópica da captação de oligonucleotídeos marcados fluorescente.

Resumo

Terapêuticas baseadas em oligonucleotídeos representam uma classe de medicamentos em rápido progresso com potencial significativo para tratar doenças cardiovasculares; No entanto, alcançar uma entrega eficiente ao tecido cardíaco continua sendo um desafio crítico e não resolvido. Um obstáculo chave é a disponibilidade limitada de modelos humanos in vitro robustos e fisiologicamente relevantes, capazes de apoiar a avaliação quantitativa da captação celular de oligonucleotídeos e da distribuição intracelular. Um protocolo detalhado e passo a passo é apresentado para gerar cardioides 3D auto-organizativos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e aplicá-los como plataforma para avaliar a absorção de oligonucleotídeos marcados fluorescentemente. O protocolo orienta os usuários através da diferenciação cardíaca dirigida em cultura em suspensão, modulando temporalmente a sinalização Wnt/β-catenina, permitindo a especificação sequencial dos iPSCs através dos estágios progenitores do mesoderma, mesoderma cardíaco e cardiomiócitos. Nessas condições, as células se auto-montam espontaneamente em estruturas tridimensionais batentes, contendo cavidades, que expressam marcadores canônicos de cardiomiócito. Os cardióides resultantes fornecem uma plataforma escalável e experimentalmente manejável para avaliação baseada em imagem da eficiência da absorção de oligonucleotídeos, apoiando o desenvolvimento e otimização de estratégias de administração para aplicações cardíacas.

Introdução

Terapêuticas baseadas em oligonucleotídeos, principalmente oligonucleotídeos antissenso (ASOs) e pequenos RNAs interferentes (siRNAs), estão rapidamente emergindo como uma abordagem transformadora e altamente específica para o tratamento de uma ampla gama de doenças, incluindo condições hereditárias e ^{adquiridas 1,2,3}. Essas modalidades possibilitam a modulação direta da expressão gênica no nível de mRNA por meio da ligação específica da sequência a transcritos-alvo, possibilitando o silenciamento gênico ou a correção de emenda de genes associados a doenças que muitas vezes são inacessíveis às terapias convencionais de pequenas^{moléculas 4,5}. Assim, as terapias genéticas baseadas em oligonucleotídeos fornecem uma plataforma versátil para direcionar diversos mecanismos patogênicos em múltiplas áreas de doença, incluindo distúrbios^{cardiovasculares 6}. Até o momento, vários terapêuticos baseados em oligonucleotídeos, incluindo ASOs, siRNAs e agentes de troca de empalmas, foram aprovados para uso^{clínico 7}. Apesar desse progresso, sua eficácia terapêutica tanto em ambientes pré-clínicos quanto clínicos permanece limitada pela entrega intracelular^{ineficiente 8}. Estimativas atuais indicam que menos de 1% dos oligonucleotídeos internalizados escapam dos compartimentos endossmais para alcançar o citossol e engajar seu RNA-alvo, limitando assim a atividade^{funcional 9,10}. Essa limitação é particularmente pronunciada no tecido cardíaco, onde a captação e o tráfico intracelular são pouco compreendidos.

Historicamente, a avaliação pré-clínica de terapias cardiovasculares tem dependido fortemente de modelos animais, que continuam sendo indispensáveis para avaliar farmacocinética, biodistribuição, eficácia e segurança in vivo. No entanto, diferenças importantes entre espécies na fisiologia cardíaca, regulação gênica e respostas celulares frequentemente limitam sua capacidade de prever com precisão a eficácia terapêutica e a toxicidade em humanos. Essas limitações impulsionaram o desenvolvimento de modelos in vitro baseados em humanos, com maior relevância fisiológica. Entre elas, a tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC) revolucionou a modelagem de doenças cardiovasculares ao fornecer uma fonte praticamente ilimitada de células que podem ser diferenciadas em linhagens cardiovasculares. Os cardiomiócitos derivados de iPSC (iPSC-CMs) humanos recapitulam muitas das propriedades moleculares, estruturais e funcionais do miocárdio humano e tornaram-se uma plataforma amplamente adotada para investigar mecanismos de doenças, respostas a medicamentos e modalidades terapêuticas^{emergentes 11}. No entanto, culturas bidimensionais convencionais de iPSC-CMs humanos apresentam limitações importantes. A maioria dos protocolos de diferenciação gera cardiomiócitos que se assemelham a células fetais em vez de adultas, exibindo propriedades estruturais, eletrofisiológicas, metabólicas e contráteis^{imaturas 12}.

Além disso, as culturas monocamada carecem da arquitetura tecidular tridimensional (3D), das interações multicelulares e da composição da matriz extracelular que influenciam a função cardiomiócita in vivo. Para enfrentar esses desafios, modelos cardíacos 3D cada vez mais sofisticados foram^{desenvolvidos 13}. Entre eles, tecidos cardíacos engenheirados (EHTs), gerados pela incorporação de iPSC-CMs em andaimes de biomateriais e pela aplicação de estimulação mecânica e elétrica, promovem a maturação estrutural e funcional enquanto reproduzem mais de perto o ambiente biomecânico do miocárdio^{nativo 13}. Embora os EHTs ofereçam plataformas altamente relevantes fisiologicamente para modelagem de doenças e testes de medicamentos, sua geração normalmente requer expertise especializada em bioengenharia e equipamentos dedicados. No outro extremo do espectro, os cortes de tecido cardíaco ex vivo preservam de forma mais fiel a arquitetura nativa do tecido e a composição celular, mas dependem do acesso ao tecido cardíaco primário, têm viabilidade limitada em cultura e não são facilmente escaláveis.

Mais recentemente, organoides cardíacos surgiram como sistemas modelo 3D acessíveis que recapitulam aspectos-chave da organização e função do tecido^{cardíaco 14}. Os cardióides são organoides cardíacos auto-assemblantes compostos predominantemente por cardiomiócitos que passam por especificação intrínseca, padrão espacial e morfogênese para formar estruturas semelhantes a câmaras contendo^{cavidades 15,16}. Métodos para formar cardióides normalmente dependem de uma ativação inicial da sinalização Wnt para induzir a especificação do mesoderma, seguida por inibição subsequente para promover o comprometimento da linhagem cardíaca. Os cardióides podem ser gerados em culturas estáticas ou em suspensão agitada, que apoiam a produção escalável e aprimoram a auto-organização dos tecidos 15,16,17,18,19. Organoides cardíacos mais complexos, multilinhagem, incorporando tipos celulares endoteliais, epicárdicos ou outros, aumentam ainda mais a relevância fisiológica, mas exigem protocolos de diferenciação mais elaborados, períodos de cultivo mais longos e otimização^{extensa 13,14}.

Um protocolo simples, reproduzível e eficiente é apresentado para gerar cardioides auto-organizáveis à base de cardiomiócitos a partir de iPSCs humanos e aplicá-los para avaliar a captação de oligonucleotídeos marcados fluorescentemente. O protocolo deve ser valioso para pesquisadores que buscam otimizar a química dos oligonucleotídeos e as estratégias de administração para aplicações cardiovasculares. Todos os materiais utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

Protocolo

1. Cultura e preparação de iPSCs para diferenciação

ATENÇÃO: Realize todo manuseio aberto de células e meios em um gabinete de biossegurança certificado Classe II. Use jaleco e luvas. Descontamine superfícies de trabalho e resíduos líquidos com um desinfetante apropriado.

1. Mantenha iPSCs.
   1. Revestir as placas de cultura com uma matriz basal-membrana apropriada, conforme as instruções do fabricante.
   2. Alimente os iPSCs com um meio de células-tronco pluripotente definido, livre de alimentadores, e substitua o meio a cada 24 horas.
   3. Mantenha as culturas abaixo da superconfluência e das células de passagem quando atingirem 70–80% de confluência.
      NOTA: Certifique-se de que os iPSCs mantenham uma morfologia de alta qualidade e indiferenciada e sejam confirmados como livres de micoplasma antes de iniciar a diferenciação.
2. Passagem pré-diferenciação.
   1. Descongelar iPSCs e expandir células por pelo menos duas passagens antes de iniciar a diferenciação cardíaca.
   2. Células de passagem usando um método de dissociação sem enzimas, PBS-EDTA, compatível com manutenção de iPSC.
      PONTO DE PAUSA: Mantenha iPSCs em cultura até atingirem 70–80% de confluência e mantenham a morfologia típica sem sinais de diferenciação espontânea.

2. Preparação de agregados iPSC em placas de micropoços

1. Dissocie iPSCs para uma suspensão de célula única.
   1. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1 mL de 1× PBS.
   2. Adicione a solução de descolamento celular (Accutase) a 500 μL por poço de uma placa de 6 poços e incube a 37 °C por 5–7 minutos.
   3. Adicione 1,5 mL de meio de lavagem por poço e resuspenda suavemente para gerar uma suspensão de célula única.
   4. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 200 × g por 3 minutos em temperatura ambiente.
   5. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em meio iPSC livre de alimentação, suplementado com inibidor de ROCK (10 μM finais).
      NOTA: Ajuste o tempo de incubação da dissociação para cada linha de iPSC verificando o descolamento em 5 minutos e estendendo em pequenos incrementos, se necessário.
2. Conte as células e prepare a densidade do revestimento.
   1. Conte células viáveis usando um método padrão de contagem de células.
   2. Prepare uma suspensão de célula única a 0,9 × 10⁶ células/mL para cada poço de uma placa de agregação de micropoços de 800 μm (formato de 24 poços, ~300 micropoços/poço).
      NOTA: Otimize o número de células por poço, pois o tamanho agregado ou a eficiência de diferenciação variam entre linhas iPSC.
3. Prima a placa do micropoço e remova as bolhas.
   1. Adicione 500 μL de meio iPSC livre de alimentadores contendo inibidor de ROCK (10 μM finais) em cada poço.
   2. Centrifuge a placa do micropoço a 300 × g por 3 minutos em temperatura ambiente para remover bolhas de ar dos micropoços.
      CRÍTICO: Remover completamente todas as bolhas para permitir uma deposição celular uniforme no fundo de cada micropoço e apoiar a formação eficiente de agregados.
4. Semear iPSCs em micropoços.
   1. Adicione 1,0 mL da suspensão de célula única preparada (0,9 × 10⁶ células/mL) a cada poço, correspondendo a 0,9 × 10⁶ células por poço.
   2. Ressuspenda suavemente dentro do poço de 3 a 5 vezes usando um P1000 e evite introduzir bolhas de ar.
   3. Centrifuge a placa a 200 × g por 3 minutos em temperatura ambiente para colocar as células nos micropoços.
   4. Verifique ao microscópio que as células tenham se depositado nos micropoços antes de colocar a placa a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas.
      CRÍTICO: Manuseie a placa com cuidado após a centrifugação. Não agite nem agite a placa, pois isso pode fazer as células se levantarem dos micropoços.

3. Expansão de agregados iPSC em micropoços

1. Aspire cuidadosamente e substitua o meio sem perturbar ou desalojar os agregados.
   1. Incline a placa e aspire lentamente aproximadamente 1,0 mL de meio de cada poço usando uma pipeta P1000, garantindo que os agregados permaneçam assentados nos micropoços.
   2. Aspire lentamente os ~500 μL restantes do meio usando uma pipeta P1000.
   3. Adicione 1,5 mL de meio iPSC sem alimentador em cada poço, dispensando-o lentamente pela lateral do poço usando uma pipeta sorológica.
   4. Incube a 37 °C, 5% de CO₂ e repita a troca de meio diariamente.
      CRÍTICO: Dispense o meio na parede do poço e evite o fluxo direto sobre agregados.

4. Diferenciação cardíaca de agregados de iPSC (Dia 0 a Dia 12)

1. Indução de mesoderma (Dia 0).
   1. Remova o meio usando o método de aspiração suave descrito nos Passos 3.1.1–3.1.2.
   2. Adicione 1,5 mL por poço de meio basal suplementado com 2% de B27 menos insulina e o ativador da via Wnt/β-catenina (CHIR99021, concentração final: 11 μM).
      NOTA: Prepare uma solução de 10 mM de CHIR99021, um inibidor de pequenas moléculas da glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3). Para alcançar uma concentração final de 11 μM, adicione 1,65 μL da solução original a 1,5 mL de meio.
2. Mudança de médio após indução (Dia 1).
   1. Após 24 horas após a adição de CHIR99021, aspire suavemente o meio de cada poço.
   2. Adicione 1,5 mL por poço de meio basal fresco suplementado com 2% de B27 menos insulina, e então incube por 48 horas.
      CRÍTICO: Siga estritamente o tempo dos passos de modulação Wnt, pois desvios podem comprometer a eficiência da diferenciação.
      NOTA: Alguma morte celular é esperada após a exposição ao ativador da via Wnt/β-catenina. Se for observada perda generalizada de agregados, considere reduzir a concentração do ativador em experimentos futuros.
3. Internamento cardíaco via inibição do WNT (Dia 3).
   1. Prepare o meio condicionado transferindo 760 μL de meio gasto de cada poço para um tubo cônico estéril de 50 mL.
   2. Para cada poço, adicione 760 μL de meio basal fresco suplementado com 2% de B27 menos insulina ao tubo contendo o meio condicionado em pool, e misture suavemente.
   3. Adicione o inibidor da via Wnt, IWP4, ao meio misto até uma concentração final de 5 μM e invista suavemente o tubo várias vezes para misturar.
   4. Aspire cuidadosamente o meio restante de cada poço e depois adicione 1,5 mL por poço de meio condicionado suplementado com IWP4.
   5. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas.
      NOTA: Prepare uma solução de 1 mM do inibidor da via Wnt IWP4. Para alcançar uma concentração final de 5 μM, adicione 7,6 μL da solução original por 1,52 mL de meio total (760 μL meio condicionado + 760 μL meio basal fresco) para cada poço.
4. Mudança de meio em micropoços (Dia 5).
   1. Substitua o meio usando a abordagem de aspiração suave descrita nos Passos 3.1.1–3.1.2.
   2. Adicione 1,5 mL de meio basal suplementado com 2% de B27 menos insulina em cada poço, depois incube a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas.
5. Transfira agregados dos micropoços para placas de 6 poços (Dia 7).
   1. Aspire cuidadosamente o meio de cada poço usando o método de aspiração suave descrito nos Passos 3.1.1–3.1.2.
   2. Adicione 1,0 mL de meio basal suplementado com 2% de B27 com insulina em cada poço da placa do micropoço. Usando uma pipeta P1000, pipetee suavemente o meio para cima e para baixo cinco vezes enquanto move a ponta da pipeta em movimento circular pela superfície do poço para desalojar os agregados nos micropoços e transferi-los para a suspensão.
   3. Transfira a suspensão agregada para um único poço de uma placa de cultura de 6 poços não tratada.
   4. Enxágue cada poço da placa de micropoço com 1,0 mL adicional de meio fresco duas a três vezes para recuperar quaisquer agregados restantes, transferindo cada enxágue para o mesmo poço da placa de 6 poços.
   5. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 72 horas.
      NOTA: A presença de células mortas e detritos celulares após a transferência de agregados é esperada. A maior parte dos detritos será removida durante a mudança subsequente do meio.
6. Mudança média durante a cultura da suspensão (Dia 10).
   1. Agite suavemente a placa para desalojar quaisquer agregados frouxamente presos.
   2. Incline a placa para permitir que os agregados se depositem no fundo do poço pela gravidade.
   3. Aspire cuidadosamente o meio gasto sem perturbar ou aspirar os agregados.
   4. Adicione 2,0 mL de meio basal fresco suplementado com 2% de B27 com insulina em cada poço e incube a 37 °C com 5% de CO₂ por 48–72 horas.
      NOTA: Batidas espontâneas geralmente são observadas aproximadamente a partir do 10º dia.
      PONTO DE PAUSA: Os cardióides de batida podem ser mantidos em cultura em suspensão para maturação prolongada, substituindo o meio a cada 2–3 dias.

5. Caracterização microscópica de cardióides

NOTA: Este método fornece um fluxo de trabalho para a caracterização histológica dos cardióides usando criossecções. As seções resultantes podem ser usadas para uma variedade de análises histológicas, incluindo coloração de hematoxilina e eosina (H&E) para avaliar a arquitetura geral do tecido e marcação de imunofluorescência para avaliar a identidade dos cardiomiócitos.

1. Fixação e criossecção.
   1. Fixe os cardióides em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 °C.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e provavelmente um carcinógeno; Manuse-o em uma exaustão química enquanto usa o equipamento de proteção individual adequado. Colete todos os resíduos contendo paraformaldeído (fixadores e washes) em um recipiente claramente rotulado para aldeído/resíduos químicos perigosos, e os descarte de acordo com os procedimentos institucionais de resíduos perigosos.
      SEGURANÇA: Realize toda a fixação e manuseio do paraformaldeído em uma exaustão química enquanto usa o equipamento de proteção individual adequado.
   2. Lave três vezes com PBS e crioprotexe os cardióides fixos em 30% (p/v) de sacarose em PBS durante a noite a 4 °C.
   3. Insuflar os cardióides em gelatina, congelar e cortar criosseções de 10 μm de espessura em lâminas de microscópio. Armazene as seções a −20 °C até o uso.
2. Imunomarcação.
   1. Descongele as seções por 15 minutos em temperatura ambiente.
   2. Lave as seções em PBS a 37 °C por 10 min, duas vezes.
   3. Circule a área de interesse em cada lâmina com uma caneta hidrofóbica para criar um poço que retenha as soluções de bloqueio e anticorpos.
   4. Reidrate as seções por 2–3 minutos em tampão de permeabilização (PB; PBS contendo 0,1% Tween-20) em um pote de Coplin.
   5. Remova as lâminas do PB, drene o excesso de solução e coloque as lâminas em uma câmara úmida.
      CRÍTICO: A partir desse ponto, é fundamental não deixar as seções secarem.
   6. Bloqueie as seções com 200–300 μL de PB contendo 5% de soro fetal bovino (FBS) por 90 minutos em temperatura ambiente em uma câmara úmida.
   7. Remova a solução bloqueante e incube as seções durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpo primário (anti-cMYBP-C; 1:50) diluído em solução bloqueante (PB contendo 1% de FBS).
   8. Lave as lâminas três vezes com manteiga de cabana e incube por 2 horas em temperatura ambiente com um anticorpo secundário fluorescente anti-camundongo verde (1:200), faloidina fluorescente vermelha distante (1:400) e DAPI (1 μg/mL).
   9. Lave três vezes em PB e monte com um meio antifade.
      ATENÇÃO: Recolha todas as soluções contendo corantes fluorescentes (anticorpos secundários, faloidina e soluções de coloração DAPI e as lavagens correspondentes) em um recipiente e descarte-as como resíduos químicos conforme as diretrizes institucionais.
3. Aquisição de imagem.
   1. Adquira imagens confocais usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com um detector de matriz para imagem de superresolução usando objetivos de imersão em óleo de 10×× e 63/1,40.
   2. Excite o fluoróforo vermelho distante, o fluoróforo verde e a coloração nuclear usando linhas de laser de 639 nm, 488 nm e 405 nm com transmissão de laser de 4,0%, 4,0% e 1,0%, respectivamente.
   3. Adquirir seções ópticas individuais com tamanho de pixel de 0,0353 × 0,0353^{μm 2}, varredura unidirecional, velocidade de varredura 6, zoom 1,7, média de linha 1 e tempo de permanência de pixels de 0,935 μs por pixel.
   4. Aplique processamento de imagem em superresolução com detector de matriz usando filtro automático de Wiener.

6. Ensaio de captação de oligonucleotídeos fluorescentes

1. Prepare uma solução padrão do oligonucleotídeo marcado fluorescentemente conjugado ao ácido palmítico para aumentar a lipofilicidade.
   1. Reconstituir o oligonucleotídeo liofilizado marcado fluorescentemente em água sem nuclease para uma concentração final de 1 mM. Faça um vórtice breve e centrifuge a 3.000 × g por 30 segundos para coletar a solução no fundo do tubo.
   2. Prepare alíquotas descartáveis da solução de estoque de 1 mM e armazene a −20 °C protegidas da luz.
   3. No dia do experimento, adicione 1 μL do estoque de 1 mM a 1 mL de meio de cultura cardioide para obter uma concentração final de oligonucleotídeos de 1 μM. Misture por agitação suave da placa.
2. Incube os cardióides com o oligonucleotídeo marcado fluorescentemente (concentração final de 1 μM) em meio sem soro a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas.
3. Lave os cardióides três vezes com soro salino tamponado com fosfato (PBS) para remover oligonucleotídeos extracelulares.
4. Fixe os cardióides em paraformaldeído a 4% por 20 minutos em temperatura ambiente, lave três vezes com PBS e continue com a marcação fluorescente antes da imagem.
5. Incubar cardioides fixos intactos durante a noite a 4 °C, protegidos da luz, em PBS contendo 5 μg/mL de aglutinina germinativa de trigo (WGA) conjugada com um fluoróforo verde e 1 μg/mL de DAPI. Lave três vezes em PBS e monte com um meio de montagem antidesvanecimento.
   ATENÇÃO: Colete todos os meios e lavagens contendo oligonucleotídeos e corantes fluorescentes, incluindo o meio de incubação marcado de oligonucleotídeos da etapa 6.2 e a solução de coloração WGA/DAPI, em um recipiente separado e descarte-os como resíduos químicos/bio-perigosos conforme as diretrizes institucionais.
6. Adquira imagens confocais da captação e distribuição de oligonucleotídeos.
   1. Adquira imagens confocais usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com um detector de matriz para imagem de superresolução e um objetivo de imersão em água de 40×. Adquira imagens como pilhas z de 8 seções com tamanho de passo z de 2 μm, cobrindo uma profundidade total de 16 μm.
   2. Excite a coloração nuclear, o marcador de membrana e o oligonucleotídeo marcado fluorescentemente de vermelho distante usando linhas de laser de 405 nm, 488 nm e 639 nm com transmissão a laser de 0,9%, 0,2% e 3,0%, respectivamente.
   3. Adquira imagens com tamanho voxel de 0,0449 × 0,0449 × 2^{μm 3}, varredura bidirecional, velocidade de varredura 5, média de linha 1 e tempo de permanência de 1,51 μs por pixel. Aplique processamento de imagem Airyscan/super-resolução usando filtro automático de Wiener.
   4. Mantenha todas as configurações de aquisição (potência do laser, ganho do detector, passo z e tamanho voxel) constantes em todas as posições z e em todas as amostras para permitir uma comparação válida do sinal de oligonucleotídeos entre condições.

Resultados

A Figura 1 resume o fluxo de trabalho de diferenciação e ilustra as mudanças morfológicas características esperadas em cada etapa do protocolo, desde a agregação de iPSC até a formação de cardioides auto-organizados. A agregação de micropoços baseada em suspensão oferece uma abordagem simples e padronizada para a geração paralela de grandes quantidades de cardioides controlados por tamanho. A diferenciação bem-sucedida é caracterizada pela geração de agregados de tamanho uniforme, seguida pelo desenvolvimento de cavidades internas e o início de batidas espontâneas, tipicamente a partir do 10º dia. Juntas, essas características morfológicas fornecem pontos práticos de controle de qualidade para avaliar a eficiência e reprodutibilidade da geração de cardióides.

A arquitetura cardioide e a organização dos tecidos podem ser avaliadas por análise histológica das criosseções. Como mostrado na Figura 2, a coloração por hematoxilina e eosina (H&E) em cardioides diferenciados com sucesso revela tecidos tridimensionais bem organizados contendo uma ou mais cavidades internas cercadas por camadas celulares compactas, consistentes com organização em forma de câmara. Cardioides bem-sucedidos normalmente não apresentam regiões necróticas e fragmentação estrutural mínima. Em contraste, diferenciações subótimas frequentemente produzem estruturas irregulares ou colapsadas, sem cavidades discerníveis, indicando uma auto-organização tecidular comprometida.

A diferenciação de cardiomiócitos pode ser avaliada adicionalmente por coloração imunofluorescente das criosseções. Como ilustrado na Figura 3A–B, cardioides bem-sucedidos exibem expressão ampla do marcador sarcomêrico cMYBP-C, organizado em estrias periódicas altamente ordenadas características dos sarcómeros. Essas estruturas estriadas estão amplamente distribuídas por todo o tecido e frequentemente alinhadas ao longo do eixo longitudinal dos cardiomiócitos, refletindo uma diferenciação cardíaca eficiente. Em contraste, cardioides subótimos apresentam coloração sarcomérica fraca, irregular ou regionalmente restrita, frequentemente confinada a regiões periféricas, com áreas extensas sem sinal detectável, indicando diferenciação ineficiente dos cardiomiócitos.

A captação de oligonucleotídeos marcados com fluorescência pode ser avaliada tanto por imagem de células vivas quanto por microscopia confocal de cardióides fixos. Como mostrado na Figura 4, a captação bem-sucedida é caracterizada por fluorescência intracelular associada a oligonucleotídeos facilmente detectável, distribuída como pontos discretos, consistentes com localização endossômica. A WGA delimita as membranas celulares e a DAPI contracolore núcleos, permitindo a confirmação da localização intracelular dos oligonucleotídeos. Além de fornecer visualização qualitativa da captação de oligonucleotídeos, os stacks de imagens adquiridos podem ser usados para análises quantitativas, incluindo intensidade de fluorescência por puncto, número de pontos por célula e a porcentagem de células positivas para oligonucleotídeos. Como mostrado na Figura 5A–C, a imagem em Z-stack permite ainda mais a avaliação da distribuição de oligonucleotídeos em todo o tecido tridimensional, com fluorescência detectada em múltiplas seções ópticas que se estendem da superfície para o interior do cardióide, indicando penetração eficaz no tecido.

Figura 1: Fluxo de trabalho para a geração de cardioides derivados de iPSC em humanos. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) são agregadas em placas micropoços (Day−2) e submetidas à diferenciação cardíaca dirigida por meio da modulação temporal da sinalização Wnt. A indução do mesoderme é iniciada no Dia 0 com tratamento com o ativador da via Wnt CHIR99021 em meio basal suplementado com B27 menos insulina, seguida pela remoção do ativador no Dia 1. A especificação cardíaca é induzida no terceiro dia pelo tratamento com o inibidor da via Wnt IWP4, que é removido no 5º dia. No Dia 7, os agregados são transferidos para placas de 6 poços e mantidos em meio basal suplementado com insulina contendo B27. Até o 14º dia, os cardioides auto-organizáveis já estão estabelecidos e são adequados para aplicações posteriores, incluindo ensaios de captação de oligonucleotídeos. Esta imagem foi criada pelos autores usando o Biorender, e a licença de direitos autorais necessária está anexada. Imagens representativas de campo claro adquiridas nos pontos indicados ilustram a progressão morfológica esperada de agregados iPSC de tamanho uniforme para cardioides cavitados e auto-organizados. Barra de escala = 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Caracterização histológica de cardióides derivados de iPSC em humanos. Criosseções representativas coloridas com hematoxilina e eosina (H&E) dos cardióides do dia 14 mostrando cavidades internas cercadas por camadas celulares compactas, consistentes com organização tecidular em forma de câmara. As imagens foram obtidas usando um microscópio de imagem. A quantificação dos resultados de diferenciação mostrou que 94,0 ± 2,6% dos cardióides apresentaram batimentos espontâneos e 60,3 ± 20,6% apresentavam uma ou mais cavidades internas visíveis. Os dados são apresentados como média ± DS a partir de três diferenciações independentes, com aproximadamente 115 cardióides analisados por diferenciação. Barra da escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização por imunofluorescência da diferenciação de cardiomiócitos. Criosseções representativas dos cardióides do dia 14. (A) Coloração DAPI mostrando a distribuição dos núcleos celulares. (B) Imagem de imunofluorescência mostrando núcleos marcados com DAPI (azul) e sarcômeros marcados com um anticorpo contra a proteína C de ligação à miosina cardíaca (cMYBP-C, verde), demonstrando estruturas sarscomericas organizadas em cardiomiócitos diferenciados. As imagens foram obtidas por microscopia de fluorescência confocal por varredura a laser usando um objetivo seco 10×/0,30 (à esquerda) e um objetivo de imersão em óleo 63×/1,40 (à direita). Barras de escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem da captação de oligonucleotídeos por cardioides. Imagens confocais mostrando a localização intracelular de oligonucleotídeos antissenso marcados fluorescentemente (ASOs, amarelo) nos cardióides do Dia 14. As membranas celulares são marcadas com aglutinina fluorescente do germe de trigo (WGA, magenta), e os núcleos são corados com DAPI (azul). A fluorescência associada à ASO é detectada como pontos intracelulares discretos (setas). Os painéis inferiores mostram cardioides controle negativos que não foram incubados com ASOs fluorescentes. As imagens nos painéis direitos correspondem a vistas de maior ampliação das regiões em caixa nos painéis esquerdos. Imagens representativas foram obtidas por microscopia confocal de varredura a laser com imagens de superresolução com detector de matriz, utilizando um objetivo de imersão em água de 40×. Barras de escala = 10 μm (esquerda) e 5 μm (direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Avaliação da penetração de oligonucleotídeos em todo o corpo cardioide. (A) Esquema ilustrando a aquisição de seções ópticas em profundidades crescentes dentro do cardióide. Esta imagem foi criada pelos autores usando o Biorender, e a licença de direitos autorais necessária está anexada. (B) Imagens confocais representativas mostrando a distribuição de ASOs marcados fluorescentemente nas posições z de 0 μm, 6 μm e 10 μm em relação à superfície do tecido. As configurações de imagem eram mantidas constantes em todas as posições z. Barra de escala = 10 μm. (C) A quantificação da porcentagem de células contendo pelo menos um sinal pontuado associado ao ASO em cada profundidade de imagem mostrou captação comparável de oligonucleotídeos em todo o tecido, com 83,1 ± 2,5%, 84,9 ± 4,5% e 84,0 ± 4,5% de células ASO positivas em 0 μm, 6 μm e 10 μm, respectivamente. Os dados são apresentados como média ± DS de três cardióides, com três seções ópticas analisadas por cardioide e um total de 1.305 células quantificadas. Imagens representativas foram obtidas por microscopia confocal de varredura a laser com imagens de superresolução com detector de matriz, utilizando um objetivo de imersão em água de 40×. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Vídeo 1: Sequência de time-lapse. Um vídeo adquirido a 40 quadros por segundo demonstra atividade contrátil espontânea em cardioides. A imagem foi realizada usando um microscópio de campo amplo equipado com uma câmera sCMOS. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

Terapêuticas baseadas em oligonucleotídeos emergiram como uma classe poderosa de modalidades de direcionamento gênico, apoiadas por décadas de avanços na química dos oligonucleotídeos que melhoraram a especificidade do alvo, a estabilidade metabólica e a tolerabilidade^{imunogênica 7,8}. Apesar do número crescente de terapias com RNA clinicamente aprovadas, sua aplicação mais ampla permanece limitada pela entrega intracelular^{ineficiente 7,8}. Devido ao seu tamanho, carga e hidrofilicidade, os oligonucleotídeos não conseguem difundir passivamente através da membrana plasmática e são, em vez disso, internalizados por vias^{endocíticas 9,10}. Após a absorção, a grande maioria (~99%) dos oligonucleotídeos internalizados permanece sequestrada nos compartimentos endossômicos ^9,10. O tráfico endossômico ocorre por um processo de maturação desde endossomos iniciais até tardias e, por fim, lisossomos; No entanto, os compartimentos precisos de onde os oligonucleotídeos escapam para o citossol permanecem incompletamente compreendidos e podem envolver múltiplas populações endossômicas⁹. Essa liberação citosólica limitada representa uma barreira crítica limitante de taxa e ressalta a necessidade de sistemas experimentais fisiologicamente relevantes que permitam avaliação quantitativa da captação de oligonucleotídeos, tráfego intracelular e escape^{endossômico 20}.

O protocolo descrito aqui foi desenvolvido para atender a essa necessidade, combinando cardioides derivados de iPSC humanos com leituras baseadas em imagem da captação de oligonucleotídeos. A robustez desse sistema depende de várias etapas críticas que influenciam diretamente a reprodutibilidade e os resultados experimentais. Primeiro, a qualidade das culturas iniciais de iPSC é um fator chave para o sucesso da diferenciação cardíaca. Os autores recomendam a análise periódica de cariótipos para garantir estabilidade genômica a longo prazo e avaliação rotineira da morfologia, integridade e dinâmica de crescimento das colônias. Culturas de alta qualidade são caracterizadas por colônias compactas e bem definidas, com bordas suaves, diferenciação espontânea mínima e proliferação consistente. Culturas que apresentam bordas irregulares de colônia, morfologia celular heterogênea ou áreas de diferenciação devem ser descartadas e substituídas por estoques congelados de baixa passagem antes de iniciar a diferenciação.

Um segundo passo crítico é a formação controlada de agregados iPSC usando placas de micropoço, que promove a geração de estruturas tridimensionais uniformes, definidas por tamanho, essenciais para a diferenciação cardíaca^{reprodutível 21}. A agregação baseada em micropoços gera corpos embrioides com diâmetros definidos (idealmente 200–230 μm), padronizando assim as interações célula-célula e a exposição a gradientes de morfógeno durante a modulação temporal da sinalização Wnt. Em nossa experiência, esse tamanho é consistentemente alcançado pela semeadura de aproximadamente 3.000 células por micropoço individual (Passo 2.2), uma condição que foi empiricamente otimizada e validada em múltiplas linhas iPSC humanas, incluindo linhas comercialmente disponíveis e linhas reprogramadas internamente. No entanto, como as taxas de proliferação de iPSC podem variar, a densidade ideal de semeadura pode exigir ajuste para manter o tamanho desejado do agregado. A falha no controle desses parâmetros pode levar a estruturas heterogêneas, redução da viabilidade e eficiência de diferenciação prejudicada.

A análise histológica, como mostrada na Figura 2, oferece uma avaliação conveniente de controle de qualidade da formação do cardioide. Em particular, a ausência de cavidades internas ou a presença de estruturas colapsadas ou fragmentadas pode indicar formação de agregados subótima ou controle temporal inadequado da sinalização Wnt durante as etapas de diferenciação (Etapas 4.1–4.3). Em algumas diferenciações não bem-sucedidas, populações celulares não contráteis surgem dentro ou ao redor dos cardióides. Essas células normalmente aparecem amareladas na microscopia de campo claro e tendem a se fixar em placas de cultura de baixa adesão, enquanto os cardióides ricos em cardiomiócitos geralmente são cinzas, permanecem como estruturas tridimensionais compactas e não se fixam facilmente. Se uma proporção substancial dos agregados apresentar esse fenótipo aderente e não contrátil, a diferenciação deve ser considerada subótima. Nesse caso, a solução de problemas deve começar revisando a morfologia da colônia iPSC antes da diferenciação, confirmando o tamanho agregado entre o Dia −1 e o Dia 0 e, se necessário, reotimizando a densidade de semeadura e as concentrações de CHIR99021 e IWP4 para a linha específica de iPSC.

Batidas espontâneas baixas ou ausentes entre os dias 10–12 geralmente refletem indução ineficiente do mesoderme ou especificação cardíaca, mais comumente devido à concentração ou timing inadequados do modulador Wnt, ou à morte celular excessiva após CHIR99021 tratamento (Passo 4.2). Em nossa experiência, a titulação CHIR99021 dentro de uma faixa de 9–13 μM para cada linha iPSC e a verificação da concentração e atividade das soluções stock pode melhorar substancialmente a eficiência da diferenciação. A análise de imunofluorescência da organização das proteínas sarscomericas, conforme mostrado na Figura 3, oferece uma avaliação conveniente de controle de qualidade da diferenciação de cardiomiócitos. Coloração fraca ou fragmentada de proteínas sarcoméricas, especialmente quando restrita às regiões periféricas do cardióide, geralmente indica diferenciação incompleta ou heterogênea dos cardiomiócitos. Nesses casos, recomenda-se estender o período de maturação em suspensão e cultura (Passo 4.6 e Ponto de Pausa) antes da fixação e verificar as condições de fixação e coloração por anticorpos.

Embora esse modelo cardioide forneça um microambiente cardíaco humano tridimensional que melhora substancialmente as culturas convencionais de cardiomiócitos bidimensionais, ele não recapitula totalmente a complexidade do coração humano adulto. Os cardióides representam um estágio inicial do desenvolvimento cardíaco humano, com os cardiomiócitos mantendo um fenótipo¹⁴ imaturo, semelhante ao fetal. Além disso, os tecidos carecem de perfusão vascular, inervação, células imunes residentes e a arquitetura específica de câmara completa do miocárdio maduro. Consequentemente, embora essa plataforma seja bem adequada para investigar a captação celular e a distribuição intracelular de oligonucleotídeos sob condições experimentais controladas, deve-se ter cautela ao extrapolar a cinética de absorção e os mecanismos de entrega diretamente para o ambiente in vivo . A incorporação futura de tipos celulares cardíacos adicionais, redes vasculares e estratégias de maturação de tecidos deve aumentar ainda mais a relevância fisiológica dessa plataforma.

A avaliação confiável da captação de oligonucleotídeos pelos cardióides descritos neste protocolo requer otimização e padronização da concentração de ASO, tempo de incubação e configurações de aquisição de imagem, conforme mostrado nas Figuras 4 e 5. A escolha do fluoróforo é particularmente importante, pois os corantes diferem em brilho, fotostabilidade e sensibilidade aos efeitos ambientais. Neste estudo, usamos Janelia Fluor 646 (JF646)²², um fluoróforo de silício-rodamina de vermelho profundo com alta luminosidade e fotostabilidade que proporciona detecção robusta de sinais enquanto minimiza a autofluorescência tecidual em amostras tridimensionais. Essas propriedades o tornam bem adequado para captação de oligonucleotídeos por imagem em cardióides vivos ou fixos. Notavelmente, a conjugação de fluoróforos pode influenciar o comportamento dos oligonucleotídeos, incluindo captação e tráfego, e por isso deve ser validada para cada sistema experimental.

Em sua forma atual, este protocolo fornece avaliação qualitativa e quantitativa da absorção de oligonucleotídeos. A imagem confocal de pontos intracelulares associados a ASO permite a visualização da localização de oligonucleotídeos em cardióides, enquanto a eficiência da captação é quantificada determinando manualmente a porcentagem de células ASO-positivas usando o plugin Cell Counter em Fiji/ImageJ. Embora essa abordagem seja adequada para as análises de débito moderado apresentadas aqui, a análise manual de imagens é trabalhosa e pode estar sujeita a viés do observador, especialmente quando aplicada a grandes conjuntos de dados. Avanços recentes em aprendizado profundo auto-supervisionado para microscopia tridimensional oferecem oportunidades promissoras para superar essas limitações. A análise de imagens baseada em IA pode segmentar, identificar e rastrear com precisão estruturas subcelulares heterogêneas em ambientes tridimensionais complexos, possibilitando a quantificação automatizada da captação de oligonucleotídeos e do tráfego intracelular, incluindo a dinâmica endossômica²³. A incorporação dessas abordagens em futuras implementações do protocolo deve melhorar a taxa de transferência, a reprodutibilidade e a precisão analítica.

Olhando para o futuro, a integração de cardioides derivados de iPSC humanos com imagens quantitativas, análise de imagens baseada em aprendizado de máquina e metodologias de partícula única oferece uma estrutura poderosa para investigar os mecanismos que regem a entrega de oligonucleotídeos no tecido cardíaco humano. Combinar modelos cardíacos tridimensionais fisiologicamente relevantes com ferramentas analíticas avançadas capazes de resolver a organização e dinâmica subcelular permitirá a caracterização quantitativa abrangente da captação de oligonucleotídeos, do tráfego intracelular e, com ensaios complementares apropriados, da fuga endossômica. Espera-se que essas abordagens integradas facilitem a identificação sistemática de fatores que determinam a eficiência da entrega, apoiem a otimização racional das químicas e veículos de entrega de oligonucleotídeos, e forneçam uma plataforma escalável para avaliar terapias emergentes com oligonucleotídeos no contexto de doenças cardiovasculares.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021