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Artigo de método

Cardioides Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos como Modelo para Avaliar a Entrega de Oligonucleotídeos

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⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

11 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo possibilita a geração de cardioióides auto-organizáveis à base de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas para avaliação microscópica da captação de oligonucleotídeos marcados fluorescente.

Resumo

Terapêuticas baseadas em oligonucleotídeos representam uma classe de medicamentos em rápido progresso com potencial significativo para tratar doenças cardiovasculares; No entanto, alcançar uma entrega eficiente ao tecido cardíaco continua sendo um desafio crítico e não resolvido. Um obstáculo chave é a disponibilidade limitada de modelos humanos in vitro robustos e fisiologicamente relevantes, capazes de apoiar a avaliação quantitativa da captação celular de oligonucleotídeos e da distribuição intracelular. Um protocolo detalhado e passo a passo é apresentado para gerar cardioides 3D auto-organizativos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e aplicá-los como plataforma para avaliar a absorção de oligonucleotídeos marcados fluorescentemente. O protocolo orienta os usuários através da diferenciação cardíaca dirigida em cultura em suspensão, modulando temporalmente a sinalização Wnt/β-catenina, permitindo a especificação sequencial dos iPSCs através dos estágios progenitores do mesoderma, mesoderma cardíaco e cardiomiócitos. Nessas condições, as células se auto-montam espontaneamente em estruturas tridimensionais batentes, contendo cavidades, que expressam marcadores canônicos de cardiomiócito. Os cardióides resultantes fornecem uma plataforma escalável e experimentalmente manejável para avaliação baseada em imagem da eficiência da absorção de oligonucleotídeos, apoiando o desenvolvimento e otimização de estratégias de administração para aplicações cardíacas.

Introdução

Terapêuticas baseadas em oligonucleotídeos, principalmente oligonucleotídeos antissenso (ASOs) e pequenos RNAs interferentes (siRNAs), estão rapidamente emergindo como uma abordagem transformadora e altamente específica para o tratamento de uma ampla gama de doenças, incluindo condições hereditárias e adquiridas 1,2,3. Essas modalidades possibilitam a modulação direta da expressão gênica no nível de mRNA por meio da ligação específica da sequência a transcritos-alvo, possibilitando o silenciamento gênico ou a correção de emenda de genes associados a doenças que muitas vezes são inacessíveis às terapias convencionais de pequenasmoléculas 4,5. Assim, as terapias genéticas baseadas em oligonucleotídeos fornecem uma plataforma versátil para direcionar diversos mecanismos patogênicos em múltiplas áreas de doença, incluindo distúrbioscardiovasculares 6. Até o momento, vários terapêuticos baseados em oligonucleotídeos, incluindo ASOs, siRNAs e agentes de troca de empalmas, foram aprovados para usoclínico 7. Apesar desse progresso, sua eficácia terapêutica tanto em ambientes pré-clínicos quanto clínicos permanece limitada pela entrega intracelularineficiente 8. Estimativas atuais indicam que menos de 1% dos oligonucleotídeos internalizados escapam dos compartimentos endossmais para alcançar o citossol e engajar seu RNA-alvo, limitando assim a atividadefuncional 9,10. Essa limitação é particularmente pronunciada no tecido cardíaco, onde a captação e o tráfico intracelular são pouco compreendidos.

Historicamente, a avaliação pré-clínica de terapias cardiovasculares tem dependido fortemente de modelos animais, que continuam sendo indispensáveis para avaliar farmacocinética, biodistribuição, eficácia e segurança in vivo. No entanto, diferenças importantes entre espécies na fisiologia cardíaca, regulação gênica e respostas celulares frequentemente limitam sua capacidade de prever com precisão a eficácia terapêutica e a toxicidade em humanos. Essas limitações impulsionaram o desenvolvimento de modelos in vitro baseados em humanos, com maior relevância fisiológica. Entre elas, a tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC) revolucionou a modelagem de doenças cardiovasculares ao fornecer uma fonte praticamente ilimitada de células que podem ser diferenciadas em linhagens cardiovasculares. Os cardiomiócitos derivados de iPSC (iPSC-CMs) humanos recapitulam muitas das propriedades moleculares, estruturais e funcionais do miocárdio humano e tornaram-se uma plataforma amplamente adotada para investigar mecanismos de doenças, respostas a medicamentos e modalidades terapêuticasemergentes 11. No entanto, culturas bidimensionais convencionais de iPSC-CMs humanos apresentam limitações importantes. A maioria dos protocolos de diferenciação gera cardiomiócitos que se assemelham a células fetais em vez de adultas, exibindo propriedades estruturais, eletrofisiológicas, metabólicas e contráteisimaturas 12.

Além disso, as culturas monocamada carecem da arquitetura tecidular tridimensional (3D), das interações multicelulares e da composição da matriz extracelular que influenciam a função cardiomiócita in vivo. Para enfrentar esses desafios, modelos cardíacos 3D cada vez mais sofisticados foramdesenvolvidos 13. Entre eles, tecidos cardíacos engenheirados (EHTs), gerados pela incorporação de iPSC-CMs em andaimes de biomateriais e pela aplicação de estimulação mecânica e elétrica, promovem a maturação estrutural e funcional enquanto reproduzem mais de perto o ambiente biomecânico do miocárdionativo 13. Embora os EHTs ofereçam plataformas altamente relevantes fisiologicamente para modelagem de doenças e testes de medicamentos, sua geração normalmente requer expertise especializada em bioengenharia e equipamentos dedicados. No outro extremo do espectro, os cortes de tecido cardíaco ex vivo preservam de forma mais fiel a arquitetura nativa do tecido e a composição celular, mas dependem do acesso ao tecido cardíaco primário, têm viabilidade limitada em cultura e não são facilmente escaláveis.

Mais recentemente, organoides cardíacos surgiram como sistemas modelo 3D acessíveis que recapitulam aspectos-chave da organização e função do tecidocardíaco 14. Os cardióides são organoides cardíacos auto-assemblantes compostos predominantemente por cardiomiócitos que passam por especificação intrínseca, padrão espacial e morfogênese para formar estruturas semelhantes a câmaras contendocavidades 15,16. Métodos para formar cardióides normalmente dependem de uma ativação inicial da sinalização Wnt para induzir a especificação do mesoderma, seguida por inibição subsequente para promover o comprometimento da linhagem cardíaca. Os cardióides podem ser gerados em culturas estáticas ou em suspensão agitada, que apoiam a produção escalável e aprimoram a auto-organização dos tecidos 15,16,17,18,19. Organoides cardíacos mais complexos, multilinhagem, incorporando tipos celulares endoteliais, epicárdicos ou outros, aumentam ainda mais a relevância fisiológica, mas exigem protocolos de diferenciação mais elaborados, períodos de cultivo mais longos e otimizaçãoextensa 13,14.

Um protocolo simples, reproduzível e eficiente é apresentado para gerar cardioides auto-organizáveis à base de cardiomiócitos a partir de iPSCs humanos e aplicá-los para avaliar a captação de oligonucleotídeos marcados fluorescentemente. O protocolo deve ser valioso para pesquisadores que buscam otimizar a química dos oligonucleotídeos e as estratégias de administração para aplicações cardiovasculares. Todos os materiais utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

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Protocolo

1. Cultura e preparação de iPSCs para diferenciação

ATENÇÃO: Realize todo manuseio aberto de células e meios em um gabinete de biossegurança certificado Classe II. Use jaleco e luvas. Descontamine superfícies de trabalho e resíduos líquidos com um desinfetante apropriado.

  1. Mantenha iPSCs.
    1. Revestir as placas de cultura com uma matriz basal-membrana apropriada, conforme as instruções do fabricante.
    2. Alimente os iPSCs com um meio de células-tronco pluripotente definido, livre de alimentadores, e substitua o meio a cada 24 horas.
    3. Mantenha as culturas abaixo da superconfluência e das células de passagem quando atingirem 70–80% de confluência.
      NOTA: Certifique-se de que os iPSCs mantenham uma morfologia de alta qualidade e indiferenciada e sejam confirmados como livres de micoplasma antes de iniciar a diferenciação.
  2. Passagem pré-diferenciação.
    1. Descongelar iPSCs e expandir células por pelo menos duas passagens antes de iniciar a diferenciação cardíaca.
    2. Células de passagem usando um método de dissociação sem enzimas, PBS-EDTA, compatível com manutenção de iPSC.
      PONTO DE PAUSA: Mantenha iPSCs em cultura até atingirem 70–80% de confluência e mantenham a morfologia típica sem sinais de diferenciação espontânea.

2. Preparação de agregados iPSC em placas de micropoços

  1. Dissocie iPSCs para uma suspensão de célula única.
    1. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1 mL de 1× PBS.
    2. Adicione a solução de descolamento celular (Accutase) a 500 μL por poço de uma placa de 6 poços e incube a 37 °C por 5–7 minutos.
    3. Adicione 1,5 mL de meio de lavagem por poço e resuspenda suavemente para gerar uma suspensão de célula única.
    4. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL e centrifuge a 200 × g por 3 minutos em temperatura ambiente.
    5. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em meio iPSC livre de alimentação, suplementado com inibidor de ROCK (10 μM finais).
      NOTA: Ajuste o tempo de incubação da dissociação para cada linha de iPSC verificando o descolamento em 5 minutos e estendendo em pequenos incrementos, se necessário.
  2. Conte as células e prepare a densidade do revestimento.
    1. Conte células viáveis usando um método padrão de contagem de células.
    2. Prepare uma suspensão de célula única a 0,9 × 106 células/mL para cada poço de uma placa de agregação de micropoços de 800 μm (formato de 24 poços, ~300 micropoços/poço).
      NOTA: Otimize o número de células por poço, pois o tamanho agregado ou a eficiência de diferenciação variam entre linhas iPSC.
  3. Prima a placa do micropoço e remova as bolhas.
    1. Adicione 500 μL de meio iPSC livre de alimentadores contendo inibidor de ROCK (10 μM finais) em cada poço.
    2. Centrifuge a placa do micropoço a 300 × g por 3 minutos em temperatura ambiente para remover bolhas de ar dos micropoços.
      CRÍTICO: Remover completamente todas as bolhas para permitir uma deposição celular uniforme no fundo de cada micropoço e apoiar a formação eficiente de agregados.
  4. Semear iPSCs em micropoços.
    1. Adicione 1,0 mL da suspensão de célula única preparada (0,9 × 106 células/mL) a cada poço, correspondendo a 0,9 × 106 células por poço.
    2. Ressuspenda suavemente dentro do poço de 3 a 5 vezes usando um P1000 e evite introduzir bolhas de ar.
    3. Centrifuge a placa a 200 × g por 3 minutos em temperatura ambiente para colocar as células nos micropoços.
    4. Verifique ao microscópio que as células tenham se depositado nos micropoços antes de colocar a placa a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas.
      CRÍTICO: Manuseie a placa com cuidado após a centrifugação. Não agite nem agite a placa, pois isso pode fazer as células se levantarem dos micropoços.

3. Expansão de agregados iPSC em micropoços

  1. Aspire cuidadosamente e substitua o meio sem perturbar ou desalojar os agregados.
    1. Incline a placa e aspire lentamente aproximadamente 1,0 mL de meio de cada poço usando uma pipeta P1000, garantindo que os agregados permaneçam assentados nos micropoços.
    2. Aspire lentamente os ~500 μL restantes do meio usando uma pipeta P1000.
    3. Adicione 1,5 mL de meio iPSC sem alimentador em cada poço, dispensando-o lentamente pela lateral do poço usando uma pipeta sorológica.
    4. Incube a 37 °C, 5% de CO₂ e repita a troca de meio diariamente.
      CRÍTICO: Dispense o meio na parede do poço e evite o fluxo direto sobre agregados.

4. Diferenciação cardíaca de agregados de iPSC (Dia 0 a Dia 12)

  1. Indução de mesoderma (Dia 0).
    1. Remova o meio usando o método de aspiração suave descrito nos Passos 3.1.1–3.1.2.
    2. Adicione 1,5 mL por poço de meio basal suplementado com 2% de B27 menos insulina e o ativador da via Wnt/β-catenina (CHIR99021, concentração final: 11 μM).
      NOTA: Prepare uma solução de 10 mM de CHIR99021, um inibidor de pequenas moléculas da glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3). Para alcançar uma concentração final de 11 μM, adicione 1,65 μL da solução original a 1,5 mL de meio.
  2. Mudança de médio após indução (Dia 1).
    1. Após 24 horas após a adição de CHIR99021, aspire suavemente o meio de cada poço.
    2. Adicione 1,5 mL por poço de meio basal fresco suplementado com 2% de B27 menos insulina, e então incube por 48 horas.
      CRÍTICO: Siga estritamente o tempo dos passos de modulação Wnt, pois desvios podem comprometer a eficiência da diferenciação.
      NOTA: Alguma morte celular é esperada após a exposição ao ativador da via Wnt/β-catenina. Se for observada perda generalizada de agregados, considere reduzir a concentração do ativador em experimentos futuros.
  3. Internamento cardíaco via inibição do WNT (Dia 3).
    1. Prepare o meio condicionado transferindo 760 μL de meio gasto de cada poço para um tubo cônico estéril de 50 mL.
    2. Para cada poço, adicione 760 μL de meio basal fresco suplementado com 2% de B27 menos insulina ao tubo contendo o meio condicionado em pool, e misture suavemente.
    3. Adicione o inibidor da via Wnt, IWP4, ao meio misto até uma concentração final de 5 μM e invista suavemente o tubo várias vezes para misturar.
    4. Aspire cuidadosamente o meio restante de cada poço e depois adicione 1,5 mL por poço de meio condicionado suplementado com IWP4.
    5. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas.
      NOTA: Prepare uma solução de 1 mM do inibidor da via Wnt IWP4. Para alcançar uma concentração final de 5 μM, adicione 7,6 μL da solução original por 1,52 mL de meio total (760 μL meio condicionado + 760 μL meio basal fresco) para cada poço.
  4. Mudança de meio em micropoços (Dia 5).
    1. Substitua o meio usando a abordagem de aspiração suave descrita nos Passos 3.1.1–3.1.2.
    2. Adicione 1,5 mL de meio basal suplementado com 2% de B27 menos insulina em cada poço, depois incube a 37 °C com 5% de CO₂ por 48 horas.
  5. Transfira agregados dos micropoços para placas de 6 poços (Dia 7).
    1. Aspire cuidadosamente o meio de cada poço usando o método de aspiração suave descrito nos Passos 3.1.1–3.1.2.
    2. Adicione 1,0 mL de meio basal suplementado com 2% de B27 com insulina em cada poço da placa do micropoço. Usando uma pipeta P1000, pipetee suavemente o meio para cima e para baixo cinco vezes enquanto move a ponta da pipeta em movimento circular pela superfície do poço para desalojar os agregados nos micropoços e transferi-los para a suspensão.
    3. Transfira a suspensão agregada para um único poço de uma placa de cultura de 6 poços não tratada.
    4. Enxágue cada poço da placa de micropoço com 1,0 mL adicional de meio fresco duas a três vezes para recuperar quaisquer agregados restantes, transferindo cada enxágue para o mesmo poço da placa de 6 poços.
    5. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ por 72 horas.
      NOTA: A presença de células mortas e detritos celulares após a transferência de agregados é esperada. A maior parte dos detritos será removida durante a mudança subsequente do meio.
  6. Mudança média durante a cultura da suspensão (Dia 10).
    1. Agite suavemente a placa para desalojar quaisquer agregados frouxamente presos.
    2. Incline a placa para permitir que os agregados se depositem no fundo do poço pela gravidade.
    3. Aspire cuidadosamente o meio gasto sem perturbar ou aspirar os agregados.
    4. Adicione 2,0 mL de meio basal fresco suplementado com 2% de B27 com insulina em cada poço e incube a 37 °C com 5% de CO₂ por 48–72 horas.
      NOTA: Batidas espontâneas geralmente são observadas aproximadamente a partir do 10º dia.
      PONTO DE PAUSA: Os cardióides de batida podem ser mantidos em cultura em suspensão para maturação prolongada, substituindo o meio a cada 2–3 dias.

5. Caracterização microscópica de cardióides

NOTA: Este método fornece um fluxo de trabalho para a caracterização histológica dos cardióides usando criossecções. As seções resultantes podem ser usadas para uma variedade de análises histológicas, incluindo coloração de hematoxilina e eosina (H&E) para avaliar a arquitetura geral do tecido e marcação de imunofluorescência para avaliar a identidade dos cardiomiócitos.

  1. Fixação e criossecção.
    1. Fixe os cardióides em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 °C.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é tóxico e provavelmente um carcinógeno; Manuse-o em uma exaustão química enquanto usa o equipamento de proteção individual adequado. Colete todos os resíduos contendo paraformaldeído (fixadores e washes) em um recipiente claramente rotulado para aldeído/resíduos químicos perigosos, e os descarte de acordo com os procedimentos institucionais de resíduos perigosos.
      SEGURANÇA: Realize toda a fixação e manuseio do paraformaldeído em uma exaustão química enquanto usa o equipamento de proteção individual adequado.
    2. Lave três vezes com PBS e crioprotexe os cardióides fixos em 30% (p/v) de sacarose em PBS durante a noite a 4 °C.
    3. Insuflar os cardióides em gelatina, congelar e cortar criosseções de 10 μm de espessura em lâminas de microscópio. Armazene as seções a −20 °C até o uso.
  2. Imunomarcação.
    1. Descongele as seções por 15 minutos em temperatura ambiente.
    2. Lave as seções em PBS a 37 °C por 10 min, duas vezes.
    3. Circule a área de interesse em cada lâmina com uma caneta hidrofóbica para criar um poço que retenha as soluções de bloqueio e anticorpos.
    4. Reidrate as seções por 2–3 minutos em tampão de permeabilização (PB; PBS contendo 0,1% Tween-20) em um pote de Coplin.
    5. Remova as lâminas do PB, drene o excesso de solução e coloque as lâminas em uma câmara úmida.
      CRÍTICO: A partir desse ponto, é fundamental não deixar as seções secarem.
    6. Bloqueie as seções com 200–300 μL de PB contendo 5% de soro fetal bovino (FBS) por 90 minutos em temperatura ambiente em uma câmara úmida.
    7. Remova a solução bloqueante e incube as seções durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpo primário (anti-cMYBP-C; 1:50) diluído em solução bloqueante (PB contendo 1% de FBS).
    8. Lave as lâminas três vezes com manteiga de cabana e incube por 2 horas em temperatura ambiente com um anticorpo secundário fluorescente anti-camundongo verde (1:200), faloidina fluorescente vermelha distante (1:400) e DAPI (1 μg/mL).
    9. Lave três vezes em PB e monte com um meio antifade.
      ATENÇÃO: Recolha todas as soluções contendo corantes fluorescentes (anticorpos secundários, faloidina e soluções de coloração DAPI e as lavagens correspondentes) em um recipiente e descarte-as como resíduos químicos conforme as diretrizes institucionais.
  3. Aquisição de imagem.
    1. Adquira imagens confocais usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com um detector de matriz para imagem de superresolução usando objetivos de imersão em óleo de 10×× e 63/1,40.
    2. Excite o fluoróforo vermelho distante, o fluoróforo verde e a coloração nuclear usando linhas de laser de 639 nm, 488 nm e 405 nm com transmissão de laser de 4,0%, 4,0% e 1,0%, respectivamente.
    3. Adquirir seções ópticas individuais com tamanho de pixel de 0,0353 × 0,0353μm 2, varredura unidirecional, velocidade de varredura 6, zoom 1,7, média de linha 1 e tempo de permanência de pixels de 0,935 μs por pixel.
    4. Aplique processamento de imagem em superresolução com detector de matriz usando filtro automático de Wiener.

6. Ensaio de captação de oligonucleotídeos fluorescentes

  1. Prepare uma solução padrão do oligonucleotídeo marcado fluorescentemente conjugado ao ácido palmítico para aumentar a lipofilicidade.
    1. Reconstituir o oligonucleotídeo liofilizado marcado fluorescentemente em água sem nuclease para uma concentração final de 1 mM. Faça um vórtice breve e centrifuge a 3.000 × g por 30 segundos para coletar a solução no fundo do tubo.
    2. Prepare alíquotas descartáveis da solução de estoque de 1 mM e armazene a −20 °C protegidas da luz.
    3. No dia do experimento, adicione 1 μL do estoque de 1 mM a 1 mL de meio de cultura cardioide para obter uma concentração final de oligonucleotídeos de 1 μM. Misture por agitação suave da placa.
  2. Incube os cardióides com o oligonucleotídeo marcado fluorescentemente (concentração final de 1 μM) em meio sem soro a 37 °C com 5% de CO₂ por 24 horas.
  3. Lave os cardióides três vezes com soro salino tamponado com fosfato (PBS) para remover oligonucleotídeos extracelulares.
  4. Fixe os cardióides em paraformaldeído a 4% por 20 minutos em temperatura ambiente, lave três vezes com PBS e continue com a marcação fluorescente antes da imagem.
  5. Incubar cardioides fixos intactos durante a noite a 4 °C, protegidos da luz, em PBS contendo 5 μg/mL de aglutinina germinativa de trigo (WGA) conjugada com um fluoróforo verde e 1 μg/mL de DAPI. Lave três vezes em PBS e monte com um meio de montagem antidesvanecimento.
    ATENÇÃO: Colete todos os meios e lavagens contendo oligonucleotídeos e corantes fluorescentes, incluindo o meio de incubação marcado de oligonucleotídeos da etapa 6.2 e a solução de coloração WGA/DAPI, em um recipiente separado e descarte-os como resíduos químicos/bio-perigosos conforme as diretrizes institucionais.
  6. Adquira imagens confocais da captação e distribuição de oligonucleotídeos.
    1. Adquira imagens confocais usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com um detector de matriz para imagem de superresolução e um objetivo de imersão em água de 40×. Adquira imagens como pilhas z de 8 seções com tamanho de passo z de 2 μm, cobrindo uma profundidade total de 16 μm.
    2. Excite a coloração nuclear, o marcador de membrana e o oligonucleotídeo marcado fluorescentemente de vermelho distante usando linhas de laser de 405 nm, 488 nm e 639 nm com transmissão a laser de 0,9%, 0,2% e 3,0%, respectivamente.
    3. Adquira imagens com tamanho voxel de 0,0449 × 0,0449 × 2μm 3, varredura bidirecional, velocidade de varredura 5, média de linha 1 e tempo de permanência de 1,51 μs por pixel. Aplique processamento de imagem Airyscan/super-resolução usando filtro automático de Wiener.
    4. Mantenha todas as configurações de aquisição (potência do laser, ganho do detector, passo z e tamanho voxel) constantes em todas as posições z e em todas as amostras para permitir uma comparação válida do sinal de oligonucleotídeos entre condições.

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Resultados

A Figura 1 resume o fluxo de trabalho de diferenciação e ilustra as mudanças morfológicas características esperadas em cada etapa do protocolo, desde a agregação de iPSC até a formação de cardioides auto-organizados. A agregação de micropoços baseada em suspensão oferece uma abordagem simples e padronizada para a geração paralela de grandes quantidades de cardioides controlados por tamanho. A diferenciação bem-sucedida é caracterizada pela geração de agregad...

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Discussão

Terapêuticas baseadas em oligonucleotídeos emergiram como uma classe poderosa de modalidades de direcionamento gênico, apoiadas por décadas de avanços na química dos oligonucleotídeos que melhoraram a especificidade do alvo, a estabilidade metabólica e a tolerabilidadeimunogênica 7,8. Apesar do número crescente de terapias com RNA clinicamente aprovadas, sua aplicação mais ampla permanece limitada pela entrega intracelular

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros do Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape, especialmente Knud Jensen pelo design e síntese de oligonucleotídeos, e a Nikos S. Hatzakis e Tomas Kirchhausen por orientações valiosas sobre imagens quantitativas e análise de tráfico intracelular. Esse trabalho foi financiado pelo Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape (NNF23OC0081287). M.F. recebeu uma bolsa da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (2020.04836.BD). Agradecemos à GIMM Bioimaging e às Plataformas de Histopatologia GIMM (Lisboa, Portugal) pela assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Referências

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
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