Criação confiável de um modelo de aneurisma aórtico abdominal murino usando sensibilização com elastina e elastase perivascular

Resumo

Esse protocolo oferece um método repetível e confiável para induzir aneurismas da aorta abdominal (AAA) em camundongos C57BL/6, utilizando sensibilização com elastina e aplicação de elastase perivascular, como um modelo AAA que incorpora um componente de sensibilização imunológica.

Resumo

A degradação da matriz lamelar elástica na parede da aorta abdominal é uma característica histopatológica dos aneurismas da aorta abdominal (AAA). Evidências crescentes indicam que a degradação da elastina e respostas imunes relacionadas ao hospedeiro estão na patogênese da AAA. A modelagem eficaz desses processos é importante para melhorar a compreensão e o tratamento dessa doença comum. Embora modelos anteriores de AAA tenham usado técnicas de desestabilização da elastina para indução de aneurisma, o uso único de elastase em muitos desses modelos não explica a resposta imune contínua contra elastina e seus produtos de degradação (EDP). Para modelar essa resposta imune contínua, desenvolvemos um modelo que sensibiliza camundongos C57BL/6 à EDP por meio da injeção subcutânea de EDP 7 dias antes da cirurgia de indução de aneurisma. A cirurgia de indução de aneurisma ocorre com exposição da aorta abdominal e aplicação de elastase tópica no compartimento periaórtico, com a intenção de expor elastina e EDP na aorta do camundongo. Com essas partes expostas, o animal deve desenvolver uma resposta imune contra esses antígenos aos quais estava previamente sensibilizado. A injeção repetida de EDP "booster" 7 dias depois serve para propagar essa resposta imunológica. Aqui, descrevemos o protocolo para a criação confiável de AAA em camundongos C57BL/6 por meio de múltiplas sensibilizações com EDP, seguida por cirurgia de indução AAA com aplicação de elastase perivascular. Esse modelo pode ser criado rapidamente e a custo moderado, induzindo >30% de dilatação aórtica em 82% dos camundongos por videomicrometria e 73% por medição por ultrassom, e >50% de dilatação em 64% por videomicrometria e 27% por ultrassom, conforme medido no dia 21 após a cirurgia de indução. Essa técnica também está associada a uma taxa de sobrevivência intraoperatória de 95%.

Introdução

O aneurisma da aorta abdominal (AAA) afeta >35 milhões de pessoas no mundo todo, e 4–8% dos homens entre 65 e 80 anos. A ruptura, a complicação mais devastadora da AAA, normalmente ocorre quando o estresse mecânico na parede do aneurisma excede a força do tecido aórtico, levando a uma hemorragia massiva e uma taxa geral de mortalidade de 80−90%^3,4. O manejo atual visa a prevenção, com rastreamento por ultrassom em indivíduos de alto risco e reparo cirúrgico quando o risco de ruptura excede o risco de reparo, tipicamente com 5,5 cm de diâmetro⁵. No entanto, a maioria dos AAA é assintomática, e muitos são diagnosticados^{incidentalmente 6}. Assim, devem ser feitos esforços para identificar pacientes de alto risco e desenvolver tratamentos não cirúrgicos para reduzir o crescimento do AAA e, portanto, o risco de ruptura.

Para desenvolver tratamentos médicos para AAA, a patogênese deve ser melhor compreendida. Vários modelos experimentais são atualmente utilizados, incluindo modelos de pequenos animais que utilizam a infusão 7 de angiotensina^II, xenoenxerto⁸, aplicação de cloreto de^{cálcio 9} e infusão¹⁰ e/ou aplicação tópica de elastase¹¹. Cada um desses modelos utiliza uma compreensão diferente da base patológica da AAA, e a maioria foi modificada, aprimorada ou combinada com outros métodos desde o início.

Importante destacar que a histologia AAA demonstra perda da matriz elastina lamelar normal, que também é observada no tecido pulmonar pulmonar obstrutivo^{crônico 12,13}. A degradação da elastina via atividade da metaloproteinase da matriz fornece uma ligação importante entre a patogênese AAA e o tabagismo, o fator de risco modificável mais importante para a formação de^{AAA 12,14}. Notavelmente, a redução da elastina aórtica, a ruptura das fibras de elastina e o aumento dos peptídeos circulantes de elastina são observados no AAA humano e estão associados ao aumento da distensibilidade da parede^{do AAA 15,16}. Portanto, estimular a degradação da elastina é crucial para criar um modelo AAA transferível. Modelos AAA existentes que dependem da degradação da elastina, embora eficazes, podem ser complicados por altas taxas de mortalidade animal, especialmente em modelos que utilizam canulação^{aórtica 17}, e pela formação inconsistente de aneurismas, especialmente em modelos que dependem exclusivamente da aplicação tópica^{de elastase 18}. Além disso, todos os modelos que dependem de cirurgias de indução estão sujeitos a curvas de aprendizado do operador e variações técnicas.

Para resolver esses problemas, utilizamos a resposta imune do hospedeiro para sensibilizar os animais à elastina por meio da injeção de produtos de degradação da elastina (EDP). Uma semana depois, ocorre a cirurgia de indução de aneurisma de forma padronizada, utilizando a aplicação periaórtica de elastase para criar partes EDP para o hospedeiro sensibilizado montar uma resposta imune. A subsequente sensibilização com "reforço" de EDP, uma semana após a cirurgia de indução, garante que a resposta imune do hospedeiro continue. A sensibilização imunológica repetitiva permite uma dilatação aórtica confiável. Utilizamos um modelo AAA murino devido ao menor custo, facilidade de manutenção, rápido desenvolvimento de doenças e consistência técnica.

Esse modelo não resulta de forma confiável em ruptura aórtica e, portanto, não é destinado ao estudo de fatores associados à ruptura AAA. No entanto, esse modelo produz de forma confiável dilatação progressiva da aorta até 21 dias após a cirurgia de indução. Assim, o modelo é mais adequado para estudar modalidades terapêuticas que podem reduzir ou reverter a dilatação da aorta à medida que o aneurisma se forma.

Protocolo

1. Imagem por ultrassom

1. Prepare o rato
   1. Coloque o rato na câmara de indução de anestesia.
   2. Administre isoflurano inalado a 1,8−2% e oxigênio até que o camundongo seja anestesiado. Certifique-se de que os recipientes de gás anestésico estejam conectados ao aparelho anestésico para reduzir a exposição do operador a anestésicos voláteis quando o isoflurano for utilizado.
   3. Coloque o rato em posição supina em um palco aquecido a 37 °C, com o nariz do rato colocado no cone do nariz anestésico.
   4. Fixe os membros traseiros no palco com fita adesiva de rotulagem.
   5. Aplique um agente depilante usando um aplicador com ponta de algodão no abdômen e espere 30 segundos.
   6. Remova os pelos abdominais usando uma gaze de algodão de 5 cm x 5 cm.
   7. Coloque gel de transmissão de ultrassom aquecido no abdômen do rato.
2. Coloque uma sonda de ultrassom de 38 MHz no abdômen e identifique o cinturão pélvico.
3. Identifique a aorta como uma estrutura tubular da linha média incompressível, com pressão moderada direcionada para trás aplicada através da sonda de ultrassom.
   NOTA: A veia cava inferior (VCI) aparecerá como uma estrutura luminal à direita do camundongo em relação à aorta e é compressível com pressão moderada direcionada para trás aplicada através da sonda de ultrassom.
4. Meça o diâmetro antero-posterior da aorta abdominal apenas cefálida até o ponto de bifurcação.
5. Mova a sonda proximalmente ao longo da aorta e identifique a veia renal esquerda que cruza à frente da aorta e entra na VCI.
6. Meça o diâmetro antero-posterior da aorta abdominal apenas caudada até o ponto em que a veia renal esquerda cruza anteriormente para a aorta abdominal.
7. Mova a sonda proximalmente e identifique o diafragma.
   NOTA: O diafragma pode ser identificado como uma faixa hiperecoica apenas cefálade ao fígado.
8. Meça o diâmetro antero-posterior da aorta abdominal apenas em cauda até o ponto em que ela entra no abdômen.
9. Coloque o rato em sua gaiola ou em uma cesta de recuperação forrada com toalhas e colocada em um palco aquecido a 37 °C.
10. Monitore o rato até que ele saia da anestesia.

2. Sensibilização inicial com elastina

1. Prepare os produtos de degradação da elastina (EDP) usando equipamentos de proteção individual, incluindo luvas, proteção ocular e máscaras faciais.
   1. Obtenha uma formulação de elastase pancreática murina em suspensão de PBS a 0,475 unidades/mL (4,75 unidades/mg de proteína).
   2. Tome 168 μL de elastase e adicione a 5 mg de elastina murina. Adicione mais 200 μL de soro 1X tamponado com fosfato (PBS) a essa mistura, depois pipete para misturar.
   3. Incube a mistura de elastase e elastina a 37 °C por 20 minutos com agitação suave intermitente.
   4. Adicione 632 μL de PBS frio 1X à mistura de elastase e elastina.
   5. Adicione 1 mL de adjuvante de Freund completo.
2. Coloque o rato na câmara de indução de anestesia.
3. Administre isoflurano inalado a 1,8−2% e oxigênio até que o camundongo seja anestesiado.
4. Coloque o rato em posição deitada em um palco aquecido a 37 °C, com o nariz do rato colocado no cone do nariz anestésico.
5. Injete 50 μL de EDP subcutâneo em cada flanco, totalizando 100 μL de EDP em cada camundongo.
6. Coloque o rato em uma cesta de recuperação forrada com toalhas e colocada em um palco aquecido a 37 °C.
7. Monitore o rato até que ele saia da anestesia.

3. Preparação para a cirurgia

1. Prepare as ferramentas cirúrgicas.
   1. Monte um kit cirúrgico com 2 pinças dentadas, 1 pinça reta afiada, 1 pinça angulada em ângulo agudo, 1 chave de agulha, tesoura, pelo menos 3 retratores magnéticos auto-retentíveis, 1 grampeador de pele e 1 tampa de garrafa de polipropileno.
   2. Adicione sutura trançada com ácido poliglicólico 4-0 ao kit de forma estéril imediatamente antes da cirurgia.
   3. NOTA: Tamanhos de pontos 3-0 ou 5-0 também são suficientes.
   4. Encha a tampa da garrafa de polipropileno com PBS 1X estéril aquecido.
      NOTA: Uma garrafa de PBS 1X estéril é mantida em um aquecedor a 37 °C para recarga.
2. Prepare a elastase.
   1. Diluir 27 μL de 5,1 mg/mL (≥4,0 unidades/mg de proteína) de elastase pancreática suína em 73 μL de 1X PBS para um volume final de 100 μL para cirurgia em 10 camundongos (10 μL/camundongo).
   2. Prepare a sala cirúrgica.
   3. Autoclave é um béquer de aplicadores com ponta de algodão, aplicadores de ponta de algodão com ponta afilada e gaze de 5 cm x 5 cm, e coloca-os ao lado das bandejas cirúrgicas antes da cirurgia.
   4. Coloque um palco cirúrgico magnético em uma almofada térmica ajustada a 37 °C no palco do microscópio. Coloque a almofada térmica no lugar no palco do microscópio, mas deixe o componente magnético solto para permitir o reposicionamento durante a cirurgia.
   5. Coloque uma almofada absorvente ou papel toalha sobre a bolsa térmica. Dobre uma gaze de 5 cm x 5 cm ao meio e coloque-a sob o cone do nariz da anestesia.
   6. Coloque um copo de 30 mL cheio de agente depilador, um copo de 30 mL cheio com iodo de povidona a 5%, um tubo de lubrificante ocular, fita cirúrgica, gaze não estéril de 5 cm x 5 cm, aplicadores de algodão não estéreis, cotonetes de álcool selados de 5 cm x 5 cm, um rolo de filme adesivo para serviço de alimentos e um borrifador com etanol a 70% próximo à área cirúrgica.
   7. Extraia 1,3 mg/mL de buprenorfina de liberação prolongada em uma seringa de 1 mL com volume de 75 μL por camundongo, para uma dose de 3,25 mg/kg em um camundongo de 30 g.
3. Prepare o rato para a cirurgia.
   1. Meça e registre o peso do rato em gramas.
   2. Coloque o rato na câmara de indução de anestesia.
   3. Administre isoflurano inalado a 1,8−2% e oxigênio até que o camundongo seja anestesiado.
   4. Coloque o rato em posição supina em um palco aquecido a 37 °C, com o nariz do rato colocado no cone do nariz anestésico.
   5. Injete 75 μL de buprenorfina por via subcutânea.
   6. Fixe os membros traseiros no palco com fita adesiva de rotulagem.
   7. Aplique um agente depilante usando um aplicador com ponta de algodão no abdômen e espere 30 segundos.
   8. Remova os pelos abdominais usando uma gaze de algodão de 5 cm x 5 cm.
   9. Aplique lubrificante ocular nos olhos do rato.
   10. Aplique povidona-iodo no abdômen do rato usando uma gaze de 5 cm x 5 cm e deixe secar.
   11. Limpe o abdômen usando os swabs de álcool de 5 cm x 5 cm. Reaplique povidona-iodo e deixe secar.
   12. Teste a anestesia beliscando o dedo do pé do rato e garantindo que não haja resposta.
   13. Coloque uma folha de filme adesivo para serviços alimentares sobre a fase cirúrgica.
   14. Borrife etanol 70% na fase cirúrgica e deixe secar.
   15. Lave as mãos e vista luvas cirúrgicas estéreis.

4. Procedimento cirúrgico (7 dias após a sensibilização inicial com elastina)

1. Expõe a aorta abdominal.
   1. Faça uma incisão na pele usando tesoura ou bisturi ao longo da linha média abdominal por ~3 cm, começando 0,5−1 cm cefálade até o pênis e estendendo-se até 0,5 cm caudado até o xifóide.
   2. Segure a pele usando pinças dentadas e puxe suavemente para identificar a linha alba, que aparecerá como um plano avascular entre os músculos retos.
   3. Usando tesoura, incisa a linha alba enquanto continua puxando a pele para cima. Tome cuidado para cortar apenas a linha alba, evitando estruturas intraabdominais.
   4. Coloque retratores magnéticos auto-retentíveis, com um retraindo o lado direito da parede abdominal, outro retraindo o lado esquerdo da parede abdominal e outro retraindo as estruturas na parte caudal da incisão, como a bexiga e as vesículas seminais.
   5. Usando aplicadores umedecidos com ponta de algodão, eviscere o intestino para longe de si e cubra com uma gaze úmida de 5 cm x 5 cm. Alternativamente, compacte o intestino usando uma gaze enrolada e umedecida de 5 cm no lado esquerdo do abdômen do rato.
      NOTA: Dependendo da anatomia do camundongo e da posição dos retratores, o intestino pode ser eviscerado ou compactado na direção oposta para visualização ideal.
   6. Identifique a VCI e a aorta abdominal na linha média posterior.
   7. Usando aplicadores com ponta de algodão, entre no retroperitônio abrindo suavemente o plano do tecido que cobre as estruturas vasculares posteriores.
      NOTA: Pressão direcionada para trás sobre o tecido de interesse, seguida de puxar as pontas dos aplicadores de algodão umas das outras, exerce graus maiores de tração. Para uma tração mais suave, gire as pontas dos aplicadores de algodão em direções opostas.
   8. Coloque os retratores laterais mais fundo para obter melhor tração e visualização da aorta.
   9. Continue usando aplicadores com ponta de algodão para separar suavemente a aorta abdominal do VCI e infrarrenal, evitando a liberação das fixações laterais da aorta neste estágio.
   10. Continue desenvolvendo o plano entre a VCI e a aorta até que um espaço triangular entre a aorta e a VCI se torne visível (Figura 1).
       NOTA: Esse passo normalmente é mais fácil de realizar apenas com caudad até a veia renal esquerda.
   11. Usando dissecação contundente ou pinças afiadas, libere as fixações laterais da aorta puxando a aorta para longe do tecido conjuntivo e da musculatura lombar à esquerda do camundongo.
   12. Coloque as pinças angulares e afiadas no espaço desenvolvido entre a aorta e a VCI, e abra e feche suavemente as pinças de forma repetida para abrir as fixações posteriores da aorta.
   13. Utilizando a mesma técnica de abertura e fechamento, desenvolva o plano posterior ao longo da aorta, trabalhando da cefálade para a caudal.
   14. Obtenha uma imagem em vídeo micrométrica de toda a aorta e salve-a para análise.
2. Aplique elastase perivascular.
   1. Usando uma pipeta, injete 10 μL de solução de elastase ao longo do comprimento da aorta exposta.
      NOTA: Ao dissecar apenas os tecidos medial e lateral à aorta, surgirá uma calha na qual a elastase se acumula.
   2. Coloque gazes umedecidas de 5 cm x 5 cm sobre o abdômen aberto e deixe a solução de elastase incubar por 10 minutos.
   3. Remova a tampa de gaze e irrigue o abdômen com PBS 1X estéril três vezes para remover a solução residual de elastase.
3. Feche o abdômen.
   1. Devolva os órgãos abdominais às suas posições originais. Observe e remova qualquer torção ou dobra intestinal.
   2. Usando pinças dentadas, descole o músculo reto e a fáscia da pele para formar um retalho de 0,25 cm.
   3. Feche a fáscia abdominal usando um ponto trançado de ácido poliglicólico 4-0 (ou similar) de forma simples e contínua, tomando cuidado para incorporar os cantos da incisão e percorrendo no máximo 2 mm entre as mordidas.
   4. Grampeie a pele sobrejacente usando 3−4 grampos.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Retire o rato da fase cirúrgica e coloque-o em uma cesta de recuperação forrada com toalhas e colocada em um palco aquecido a 37 °C.
2. Monitore o rato até que ele saia da anestesia.
3. Monitore o camundongo diariamente após a cirurgia por 4 dias, observando a saúde geral e o estado da incisão abdominal.
4. Após a cirurgia, realize um ultrassom repetido conforme descrito acima para monitorar o crescimento do aneurisma.
5. Remova os grampos uma semana após a cirurgia ou na hora do ultrassom da semana 1.

6. Sensibilização repetida com elastina (7 dias após a cirurgia de indução de aneurisma)

1. Realize os mesmos passos descritos acima para a sensibilização inicial à elastina preparando a solução EDP da mesma forma, com uma única substituição do adjuvante de Freund incompleto em vez do adjuvante de Freund completo.

7. Procedimentos de colheita de tecidos

1. Colhe tecidos no dia 21 pós-operatório para várias análises.
2. Prepare o rato da mesma forma que foi feita na cirurgia de indução.
3. Expor a aorta novamente da mesma forma que foi feita durante a cirurgia de indução, tomando cuidado para não danificar nenhum espécime a ser coletado para análises histológicas.
   NOTA: Neste ponto, o camundongo já terá desenvolvido cicatrizes adesivas, então pode ser necessário mais uso de dissecação cortante com pinças em vez de dissecação romba.
4. Obtenha imagens de micrometria em vídeo.
5. Realize uma punção cardíaca para coletar sangue para análise e eutanasiar o camundongo.
6. Perfunda o rato para análise enquanto usa equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas, proteção ocular e máscaras faciais.
   1. Se os tecidos forem designados para análise de citometria de fluxo (ou similar), perfunde o ventrículo esquerdo com 1X PBS sem dilatador vascular a 100−120 mm Hg para um volume de 8 mL.
   2. Se os tecidos forem designados para análise PCR, perfunda o ventrículo esquerdo com 1X PBS com dilatador vascular (0,1 mM de adenosina e 0,01 mM de nitroprussídeo de sódio), seguido de solução estabilizadora de RNA.
   3. Se os tecidos forem designados para análises histológicas, perfunde o ventrículo esquerdo com 1X PBS com um dilatador vascular, seguido de fosfato de formalina tamponado a 10%.
7. Colhe os tecidos desejados, tomando cuidado para não danificar estruturalmente nenhum tecido destinado à análise histológica. Marque a orientação com pontos ou agentes de marcação.

Resultados

Um total de 28 camundongos machos C57BL/6J passaram por esse protocolo cirúrgico, com uma mortalidade perioperatória por lesão de VCI (3,6%). Houve três mortalidades atrasadas adicionais, uma delas devido a hérnia incisional e as outras duas por razões desconhecidas, totalizando 85,7% de sobrevivência em 21 dias. O tempo médio entre a indução da anestesia e o fim da administração da anestesia foi de 46,4 ± 8,0 minutos. Os camundongos de cirurgia simulada passaram por um protocolo quase i...

Discussão

Desde que foi descrito pela primeira vez em ratos em 1990, o modelo AAA baseado em elastase foi modificado várias vezes e usado em vários^{animais 10,19,20,21,22,23}. Algumas das modificações incluem a canulação aórtica, que provavelmente aumentará a mortalidade e introduzirá um componente trau...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL Tuberculin Syringes	Becton Dickinson	309628
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-4
70% Isopropyl Alcohol Swabs	Cardinal Health	S-16183
Angled sharp forceps	Dumont	I I25 I-35
AutoClip 9mm (Skin stapler)	MikRon	427630
Betadine	Atlantis Consumer Healthcare	67618-155-16
Cotton gauze pad	Dynarex Corporation	3223
Cotton tipped applicator	Puritan Medical Products	25-806 2WC
Elastase from porcine pancreas (≥4.0 units/mg protein)	Sigma-Aldrich	E1250	Stored in aqueous solution at 4 °C
Elastase from mouse pancreas (4.75 units/mg protein)	Elastin Products Co., Inc.	MS838	Stored in aqueous solution (0.1 mg in 1 mL PBS)at 4 °C
Elastin	MP Biomedicals	101636	Stored in aqueous solution at 4 °C
Enersight Desktop Software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/
Ethiqa XR (extended release buprenorphine)	Fidelis	NDC 86084-100-30
Eye lubricant	OptixCare	Opx-4242
Flexacam i5 (Stereo)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/
Freund’s complete adjuvant	MP Biomedicals	642851	Stored in aqueous solution at 4 °C
Freund’s incomplete adjuvant	MP Biomedicals	642861	Stored in aqueous solution at 4 °C
Gloves (Sterile)	Encore	7824PF
Hypodermic Needles (23 G)	Becton Dickinson	305145
Hypodermic Needles (27 G)	Becton Dickinson	305109
Isospire (Isoflurane)	Dechra Veterinary	07-894-8943
Labeling Tape	Fisher Scientific	15959
Masks	Dukal Corp.	1540
Needle driver	Scanlan	6006-36
Omnicon F/air Anesthetic Gas Canister	A.M. Bickford Inc.	80120
Press'N Seal	Glad	12587704417
RC2 Rodent Circuit Controller	VetEquip Incorporated	922100
RNAlater Stabilization solution	ThermoFisher Scientific	AM7021
Scissors	Fine Science Tools	14005-12
Skin staples (clips)	MikRon	205016
Small Rodent Warmer Heater	Stoelting	53851
Small Rodent Warmer Stage	Stoelting	53812
Stereo Microscope M60	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/
Straight sharp forceps	Dumont	I I 25 I-30
SurgiSuite self-retaining magnetic retractor set and stage	Kent Scientific	13-005-180
Tahoe Portable Oxygen Concentrator	Vetland Medical	595-2300A
Toothed forceps	Fine Science Tools	11043-08, 11042-08
Vevo 2100 Ultrasound	FUJIFILM Visualsonics	EDU00496
Visorb polyglycolic acid suture	CP Medical	397A
VWR Absorbents	VWR	95057-860