Ensaios simples e acessíveis para eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans: Formatos Adaptáveis para Testes de Drogas

Resumo

Este estudo apresenta uma plataforma flexível e padronizada de ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans , que integra múltiplos formatos experimentais. A abordagem aprimora a reprodutibilidade, escalabilidade e acessibilidade, permitindo uma avaliação robusta dos efeitos dos medicamentos e processos de desenvolvimento, mantendo-se econômica e facilmente adaptável tanto para aplicações de pesquisa quanto para ambientes educacionais.

Resumo

Ensaios de eclosão de ovos (EHA) são amplamente utilizados para avaliar os efeitos de compostos químicos nos estágios iniciais de desenvolvimento dos nematóides, especialmente em pesquisas antihelmínticas. No entanto, as metodologias existentes variam substancialmente em formato, complexidade e reprodutibilidade, e frequentemente são apresentadas como protocolos fixos em vez de estruturas experimentais adaptáveis. Neste estudo, estabelecemos uma plataforma simples, acessível e flexível para ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans , integrando e comparando diretamente três configurações experimentais: (i) incubação controlada em tubos de microcentrífuga seguida de semeadura em placas de ágar, (ii) exposição direta em placas de ágar contendo fármacos, e (iii) ensaios líquidos baseados em múltiplos poços. Dois compostos representativos foram usados para ilustrar o ensaio: um que inibe a eclosão dos ovos e outro que não tem efeito detectável. Cada configuração oferece vantagens distintas em termos de controle experimental, taxa de transferência e acessibilidade. A abordagem baseada em tubo de microcentrífuga permite um controle preciso da exposição a medicamentos e apoia análises farmacológicas quantitativas. Ensaios baseados em ágar oferecem uma alternativa simplificada e de baixo custo, adequada para exposição contínua e ambientes educacionais. Formatos multipoço permitem triagem escalável e padronizada, consistente com pipelines modernos de descoberta de medicamentos. Ao comparar diretamente esses formatos, mostramos como as escolhas metodológicas influenciam a reprodutibilidade do ensaio, a dinâmica da exposição a medicamentos e a interpretação biológica, especialmente em relação a fatores específicos de cada estágio, como o papel protetor da casca do ovo e a variação do desenvolvimento na expressão molecular do alvo. No geral, este trabalho estabelece os ensaios de eclosão de ovos em C. elegans como uma plataforma versátil e escalável, adaptável a diversas aplicações, incluindo triagem antihelmíntica, avaliação toxicológica, estudos de desenvolvimento e laboratórios de ensino, facilitando assim o uso mais amplo e racional dessa metodologia.

Introdução

Os ensaios de eclosão de ovos (EHA) há muito tempo são estabelecidos como uma metodologia fundamental em nematologia para avaliar a atividade ovicida e os efeitos iniciais do desenvolvimento de compostos químicos. Originalmente desenvolvidos para nematoides parasitas, esses ensaios quantificam a inibição da embrionação ou emergência larval sob condições in vitro controladas, fornecendo desfechos robustos e biologicamente relevantes, como a porcentagem de eclosão ou análise concentração-resposta (por exemplo, EC₅₀ ou IC₅₀)1,2,3,4,5,6,7.....

Protocolo

1. Cepas e cultura de Caenorhabditis elegans

1. Utilize a cepa selvagem N2 (Bristol) e/ou a cepa transgênica PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) para desenvolver e validar a metodologia^25,26. PD4251 expressa GFP, facilitando visualização e aplicações potenciais de imagem quando necessário, enquanto mostra respostas de eclosão e desenvolvimento indistinguíveis das observadas na cepa tipo selvagem N2 sob as condições experimentais usadas neste^{estudo 27}.
2. Obtenha cepas (por exemplo, cepa selvagem N2) do Cen....

Resultados

A TCA produziu uma inibição clara dependente da concentração da eclosão dos ovos em todos os formatos experimentais, como mostrado na Figura 1. Curvas representativas concentração-resposta são apresentadas para cada configuração de ensaio: tubos microcentrífugas (Figura 1A), exposição direta em placas de ágar (Figura 1B) e placas multipoço (Figura 1C).

Discussão

Este estudo apresenta uma plataforma simples e adaptável para ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans, estruturados em torno de três formatos experimentais complementares que diferem em controle, dinâmica de exposição e escalabilidade. Em vez de definir um único protocolo ótimo, nossos resultados apoiam a visão de que os ensaios de eclosão de ovos devem ser considerados uma estrutura metodológica flexível adaptável a objetivos experimentais específicos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bacteriological Agar	Britania	B0101406	deve ser preparado fresco (1,7 gr em 100 mL H2O)
Bleach solution	N/A	N/A	1,2 % (v/v) NaOH e 0,5 M NaOH
Centrifuge	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Centrifuge	BiofugePICO para tubo eppendorf	Heraeus 75003235
Digital camera	ToupCam	TP605100A	Câmera digital industrial. Comprimento focal ajustável USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalil Acetate	SIGMA	No.CAS: 115-95-7	deve ser preparado fresco
Lysogeny broth (LB) medium	N/A	N/A	10 g Bacto-triptona, 5 g extrato de levedura, 10 g NaCl para 1 L de água destilada
M9 Buffer	N/A	N/A	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 para 1 L de água destilada
Mini Rotator	BioSan	Bio RS-24
Nematode Growth Medium (NGM)	N/A	N/A	3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g  Bacto-Peptona para 1 L de água destilada. Esterilizado por autoclavagem. Suplementado com 1 mL de colesterol (5 mg/mL),  1 mL de CaCl2 (1 M), 25 mL de tampão de fosfato de potássio (1 M, pH 6,0) e 1 mL  MgSO4 (1 M)
Petri Dish (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Petri Dish (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	Apenas para uso laboratorial, Poliestireno.
Pipette	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Versão 12.0
Stereomicroscope	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Estereomicroscópio trinocular (10x–40x magnificação total; iluminação incidente e transmitida por LED)
Sucrose	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) sacarose
Tissue culture plate 96 well	Biofil	TCP 012096	Poliestireno, Tampa de Baixa Evaporação.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Transcinnamaldehyde (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Deve ser preparado fresco