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Artigo de investigação

Farmacologia em Rede e Pesquisa Experimental do β-Sitosterol no Tratamento de Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica via Receptor Glucocorticoide

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DOI:

10.3791/72018

⸱

7 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1Bishan Hospital of Chongqing Medical University, Bishan Hospital of Chongqing, 2Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Geriatrics Department, The Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine, 4Department of Traditional Chinese Medicine, Nanjing Yuhua Hospital

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

β-sitosterol aliviou a DPOC e potencializou a eficácia da dexametasona, com o receptor glucocorticoide mediando esse efeito. Além disso, o β-sitosterol reduziu inflamação, estresse oxidativo e senescência celular tanto em células epiteliais brônquicas estimuladas por CSE quanto em camundongos com DPOC induzidos pela fumaça do cigarro.

Resumo

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é um distúrbio respiratório prevalente caracterizado por inflamação persistente, estresse oxidativo e declínio progressivo da função pulmonar. O potencial terapêutico do β-sitosterol na DPOC ainda não está claro. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos protetores do β-sitosterol contra a DPOC e elucidar seu mecanismo subjacente. A triagem em banco de dados identificou o receptor de glucocorticoide (GR) como um potencial alvo do β-sitosterol. Foram estabelecidos um modelo de camundongos para DPOC induzido pela fumaça de cigarro e um modelo de células BEAS-2B estimulado por extrato de fumaça de cigarro (CSE). Função pulmonar, marcadores relacionados a lesão pulmonar, inflamação, estresse oxidativo e senescência celular foram avaliados usando (RT-qPCR), ensaios fluorescentes de sonda DFH-DA e kits de detecção de senescência. Os efeitos do β-sitosterol isoladamente ou em combinação com dexametasona (DEX) também foram avaliados. β-sitosterol melhorou significativamente a função pulmonar, normalizou marcadores relacionados a lesão pulmonar e atenuou inflamação, estresse oxidativo e senescência celular tanto em células BEAS-2B estimuladas por CSE quanto em camundongos expostos à fumaça de cigarro. Esses efeitos protetores foram acompanhados por aumento na expressão da RG. Além disso, o β-sitosterol aumentou a resposta à DEX e o tratamento combinado com β-sitosterol e DEX produziram melhorias maiores na função pulmonar, marcadores de lesão pulmonar, inflamação, níveis de espécies reativas de oxigênio e senescência celular do que o tratamento por DEX isoladamente. Coletivamente, esses achados sugerem que o β-sitosterol alivia as alterações patológicas associadas à DPOC, ao menos em parte, ao aumentar a expressão da GR e aumentar a eficácia terapêutica da DEX, destacando seu potencial como estratégia adjuvante no tratamento da DPOC.

Introdução

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma doença respiratória progressiva caracterizada por inflamação persistente das vias aéreas, danos alveolares e obstrução irreversível do fluxo de ar que prejudica a função respiratória e reduz a qualidadede vida 1. Sua prevalência aumenta significativamente com a idade, e o risco para pessoas com sessenta e cinco anos ou mais é cerca de cinco vezes maior que para pessoas com menos dequarenta e 2 anos. Essa tendência demográfica está associada ao aumento da incidência de doenças, mortalidade e deficiência3. Projeções epidemiológicas indicam que, até 2030, a DPOC pode se tornar a quarta principal causa de morte no mundo, respondendo por cerca de 5% de todas as mortes(4,5,6). Atualmente, os fatores de risco identificados incluem suscetibilidade genética, displasia pulmonar, exposição a partículas, bronquite crônica e infecçãorespiratória 7.

Entre os fatores de risco, a fumaça do cigarro é o fator patogênico mais importante daDPOC 8. Ele contém milhares de substâncias químicas que podem causar danos ao epitelio brônquico, promover a infiltração de células inflamatórias e levar à remodelação do tecido pulmonar9. A exposição prolongada pode induzir lesão epitelial persistente e irreversível, promover a liberação de um grande número de quimiocinas pró-inflamatórias, aumentar significativamente a produção (ROS) e induzir a apoptose celular10. Muitos estudos mostraram que os níveis elevados de quimiocinas pró-inflamatórias como interleucina-8 (IL-8) e fator de necrose tumoral α (TNF-α), juntamente com a produção excessiva de ROS e senescência celular, estão intimamente relacionados à gravidade daDPOC 11,12. Isso destaca a necessidade de agentes que possam modular de forma eficaz e segura esses principais fatores patogênicos para exercer efeitos protetores e terapêuticos na DPOC.

Os fitoesteróis são compostos bioativos naturais presentes de forma onipresente nas membranas celulares das plantas. Entre eles, o β-sitosterol é o mais abundante e está amplamente distribuído em alimentos vegetais ricos em lipídios, como vegetais, nozes, sementes e azeitede oliva 13,14,15,16. Estudos confirmaram que a administração de β-sitosterol em doses de até 1000 mg/kg em ratos e camundongos não está associada à citotoxicidade ougenotoxicidade 17. Além disso, pesquisas mostraram que o β-sitosterol apresenta propriedades antioxidantes por meio de seus efeitos sobre enzimas antioxidantes e receptores de estrogêniohumanos 18.

β-sitosterol apresenta um amplo espectro de atividades farmacológicas, incluindoanti-inflamatórios 19, antipiréticos20,analgésicos 21 e efeitosantidiabéticos 13. Também demonstrou potencial terapêutico em vários modelos de doença, como colite e inflamaçãointestinal 22, e possui propriedades antiateroscleróticas23 eimunomoduladoras 24. Além disso, possui um perfil de segurança favorável. Dadas essas características, o β-sitosterol atraiu considerável interesse como potencial candidato a medicamento. No entanto, seu papel exato e os mecanismos subjacentes na DPOC permanecem em grande parte incertos.

Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar os potenciais efeitos terapêuticos e os mecanismos subjacentes do β-sitosterol na DPOC. Especificamente, um modelo de lesão de células BEAS-2B induzido por extrato de fumaça de cigarro (CSE) foi usado para avaliar se o β-sitosterol poderia aliviar efetivamente danos celulares mediados por CSE, identificando assim uma nova molécula candidata para estratégias terapêuticas de DPOC.

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Protocolo

O estudo foi realizado de acordo com as diretrizes de Farmacologia Básica e Clínica & Toxicologia para estudos experimentaise clínicos 25. Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Segundo Hospital Afiliado, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang (Aprovação nº 20230102), e todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal. O estudo foi conduzido em conformidade com as diretrizes da ARRIVE.

Triagem de componentes-chave e alvos via farmacologia de rede

Componentes ativos de Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., e Adenophora stricta Miq. foram recuperados do Banco de Dados de Farmacologia dos Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; acessado em 12 de março de 2024). Os compostos candidatos foram avaliados segundo os seguintes critérios ADME: biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30%, semelhança com fármacos (DL) ≥ 0,18 e permeabilidade ao Caco-2 ≥ −0,425. Compostos que atenderam aos três critérios foram mantidos como ingredientes ativos candidatos para análises subsequentes.

A estrutura canônica do Sistema Simplificado de Entrada de Linha de Entrada Molecular (SMILES) do β-sitosterol foi obtida do PubChem (acessado em 18 de março de 2024) e importada no SwissTargetPrediction (acessado em 21 de março de 2024) para previsão de alvos. Homo sapiens foi selecionado como espécie-alvo. Os alvos potenciais foram previstos com base na similaridade estrutural 2D e 3D entre β-sitosterol e ligandos conhecidos no banco de dados. Alvos previstos com probabilidade maior que 0 foram mantidos, e entradas duplicadas foram removidas.

Genes associados à DPOC foram recuperados do Banco de Dados de Alvos Terapêuticos (TTD; acessado em 25 de março de 2024) e do Banco de Dados de Toxicogenômica Comparativa (CTD; acessado em 28 de março de 2024) usando a palavra-chave "doença pulmonar obstrutiva crônica". Após a remoção dos genes duplicados, os genes associados à DPOC foram intersectados com os alvos previstos de β-sitosterol para identificar alvos candidatos potencialmente envolvidos nos efeitos terapêuticos do β-sitosterol contra a DPOC.

Acoplamento molecular de β-sitosterol e GR

A estrutura tridimensional do β-sitosterol no formato SDF foi recuperada do banco de dados PubChem (acessado em 2 de junho de 2026), enquanto a estrutura cristalina do receptor glucocorticoide (GR) foi obtida do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; acessado em 3 de junho de 2026). Após a preparação padrão das estruturas do ligante e receptor, o acoplamento molecular foi realizado usando a plataforma online CB-Dock2 (acessado em 3 de junho de 2026). Os arquivos preparados de ligantes e receptores foram carregados para a plataforma, e os cálculos de acoplamento foram realizados usando os parâmetros padrão.

Análise de enriquecimento funcional da Ontologia Gênica (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)

Todos os genes-alvo previstos do β-sitosterol foram submetidos a análises de enriquecimento funcional GO e enriquecimento da via KEGG. Os resultados do enriquecimento, incluindo processos biológicos significativamente enriquecidos, componentes celulares, funções moleculares e vias de sinalização, foram organizados e armazenados no Arquivo Suplementar 1 para análise bioinformática subsequente.

Modelagem e agrupamento animal

O tamanho da amostra foi definido em seis animais por grupo com base em um estudo anterior que realizou uma análise de potência a priori usando software G*Power (α = 0,05, potência = 0,80) e demonstrou que n = 6 era suficiente para detectar diferenças biologicamente relevantes sob condições experimentaiscomparáveis 26. Machos C57BL/6 camundongos de 6 a 8 semanas (20 ± 2 g) foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos: grupo controle, grupo modelo de DPOC, grupo DPOC + dexametasona (DEX), grupo DPOC + β-sitosterol e grupo DPOC + DEX + β-sitosterol. Os camundongos foram alojados em condições laboratoriais padrão (25 °C, ciclo claro/escuro de 12 horas) com acesso livre a comida e água padrão, e foram permitidos para se aclimatar por 1 semana antes da experimentação.

Para o estabelecimento modelo de DPOC, os camundongos foram colocados em uma câmara de exposição ao cigarro de corpo inteiro (63 cm × 55 cm × 45 cm) e expostos à fumaça convencional do cigarro por 12 semanas. Cada cigarro continha 10 mg de alcatrão, 0,9 mg de nicotina e 10 mg de monóxido de carbono. A exposição à fumaça foi realizada duas vezes ao dia (5 dias por semana) às 9h30 e às 15h, com fumaça gerada por 18 cigarros entregues na câmara por 90 minutos por27 sessões de 27.

Para avaliar os efeitos terapêuticos das intervenções, a administração de medicamentos foi iniciada após 8 semanas de exposição à fumaça de cigarro e continuou pelas 4 semanas restantes. A partir da 9ª semana, camundongos dos respectivos grupos de tratamento receberam administração diária intragástrica de DEX (1 mg/kg)28 ou β-sitosterol (50 mg/kg)29,30 1 hora antes da exposição à fumaça do cigarro. Estudos farmacocinéticos anteriores relataram uma biodisponibilidade oral de aproximadamente 4% para β-sitosterol emroedores 31. Além disso, vários estudos com camundongos utilizaram doses que variam de 20 a 50 mg/kg 32. Portanto, foi selecionada uma dose de 50 mg/kg para garantir exposição sistêmica adequada, mantendo-se dentro da faixa comumente usada em estudos pré-clínicos.

Os camundongos do grupo controle foram expostos ao ar filtrado da sala, enquanto os camundongos dos grupos modelo e de tratamento receberam um volume equivalente de soro fisiológico normal como veículo. Ao final do período experimental, os camundongos foram profundamente anestesiados com isoflurano até a perda do reflexo pedal e eutanasiados por exsanguinação via coleta de sangue da aorta abdominal. A cavidade torácica foi imediatamente aberta, e os tecidos pulmonares bilaterais intactos foram cuidadosamente excisados, enxaguados com soro salino fosfatado tamponado gelado (PBS) e colocados sobre gelo. Para a coleta do líquido de lavagem broncoalveolar (BALF), a traqueia foi canulada e lavada com PBS frio e estéril, que foi suavemente instilado e retirado repetidamente para coletar o fluido de lavagem. Tecidos pulmonares e amostras de BALF foram mantidos no gelo e posteriormente processados para análises a jusante.

Cultura celular BEAS-2B

Células epiteliais bronquiais humanas BEAS-2B foram mantidas no Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) da Dulbecco, contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina abaixo de 5% de CO₂ a 37 °C.

Preparação de CSE e exposição a células BEAS-2B

As células BEAS-2B foram lavadas com soro salino tamponado com fosfato e semeadas em placas de 24 poços em triplicado com uma densidade de 5 × 104 células por poço. Após 12 horas de cultura, as células atingiram aproximadamente 60% de confluência e foram então expostas à CSE. O CSE foi preparado de forma refrescante, conforme descrito anteriormente, com modificaçõesmenores no 33. Brevemente, um cigarro comercial não filtrado era continuamente queimado, e a fumaça comum era bolhada em 10 mL de meio sem soro usando uma bomba de vácuo a uma vazão constante de 1,05 L/min (aproximadamente −11 kPa pressão negativa) por aproximadamente 5 minutos até que o cigarro estivesse completamente queimado. A solução obtida foi inicialmente submetida a pré-filtração para remover grandes impurezas particuladas, depois esterilizada por meio de um filtro microporoso estéril de 0,22 μm para eliminar partículas residuais; a solução resultante foi definida como 100% CSE. Todo o CSE recém-preparado era usado para tratamento celular imediatamente após filtração, sem armazenamento. As células foram estimuladas com meio contendo 2,5% de CSE. Após 24 horas de tratamento com CSE, os supernadantes da cultura foram coletados e armazenados a -40 °C para análisesubsequente 34.

Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (RT-qPCR)

O RNA total foi extraído das células BEAS-2B usando um kit de extração total de RNA e transcrito reversamente em cDNA usando um kit de transcrição reversa, conforme as instruções do fabricante. Posteriormente, o RT-qPCR foi realizado usando um sistema de detecção de PCR em tempo real e uma mistura master qPCR baseada em SYBR Green. Todos os experimentos RT-qPCR foram realizados com três réplicas biológicas e três réplicas técnicas por amostra para garantir a confiabilidade dos dados.

Cada reação qPCR foi realizada em um volume total de 20 μL, contendo 10 μL de mistura master SYBR Green qPCR, 0,4 μL de primer direto, 0,4 μL de primer reverso, 2 μL de molde de cDNA diluído e 7,2 μL de água livre de RNase. As condições de amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 s e recozimento/extensão a 60 °C por 30 s. Os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando o método 2−ΔΔCt, com o GAPDH atuando como gene de referência interno. As sequências de primers utilizadas neste estudo são mencionadas na Tabela Suplementar 1.

Análise de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ROS)

A produção intracelular de ROS em células BEAS-2B foi avaliada usando o diacetato fluorogênico de sonda 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) e analisada por citometria de fluxo. Durante a aquisição de citometria em fluxo, foi aplicada uma estratégia padrão de espalhamento frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC) para excluir detritos celulares e selecionar células individuais intactas. Um total de 10.000 eventos celulares válidos foram adquiridos para cada amostra. Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram ajustados em 488 nm e 525 nm, respectivamente. Dados citométricos de escoamento foram posteriormente analisados para quantificar a intensidade de fluorescência intracelular do ROS.

Determinação do nível de Malondialdeído (MDA)

O conteúdo intracelular de MDA foi medido usando um kit de ensaio de peroxidação lipídica conforme as instruções do fabricante. Brevemente, células BEAS-2B tratadas foram colhidas e lisadas, depois centrifugadas a baixa temperatura para coletar o sobrenadante. A reação colorimétrica do ácido tiobarbitúbico (TBA) foi então realizada, e a absorção foi medida a 532 nm usando um leitor de microplacas. Os níveis relativos de MDA foram calculados de acordo com a curva padrão.

Avaliação da senescência celular

A senescência celular foi avaliada usando um ensaio de detecção de senescência baseado na atividade associada à senescência β-galactosidase (SA-β-gal). Células SA-β-gal-positivas foram quantificadas por citometria de fluxo. Paralelamente, os níveis de expressão de mRNA dos marcadores associados à senescência p53 e p21 foram determinados por RT-qPCR.

Ensaio de proliferação celular

A proliferação celular foi avaliada usando um kit de ensaio de viabilidade celular colorimétrica. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplaca.

Ensaio de knockdown da GR

A transfecção celular foi realizada usando um reagente de transfecção à base de lipídios. Os seguintes oligonucleotídeos foram transfectados: RNA pequeno interferente direcionado ao receptor de glucocorticoides (si-GR) e RNA interferente pequeno controle negativo (si-NC). Sequências candidatas de siRNA direcionadas à RG foram projetadas usando a plataforma online de bioinformática siDirect 2.0. Após a transfecção, as células foram cultivadas por 48 horas, e todos os siRNAs foram usados em uma concentração final de 50 nM. A eficiência do knockdown foi verificada medindo a expressão do mRNA da GR usando RT-qPCR.

Grupos de controle de veículos foram incluídos tanto em experimentos de tratamento com β-sitosterol quanto em experimentos de transfecção. Para a intervenção com β-sitosterol, células tratadas apenas com solvente do veículo serviram como grupo controle do veículo (denotado como CSE+0). A análise estatística confirmou que não foram observadas diferenças significativas entre os grupos controle do veículo e controle em branco.

Análise estatística

Todos os resultados quantitativos foram expressos como média ± desvio padrão de três experimentos in vitro biologicamente independentes. As análises estatísticas foram realizadas usando software de análise estatística. O teste de Shapiro–Wilk foi usado para examinar a normalidade da distribuição do conjunto de dados antes dos testes estatísticos; A correção pós-hoc de Bonferroni foi adotada para ajustar os valores de P para comparações múltiplas após análise de variância (ANOVA). As comparações entre dois grupos foram avaliadas por um teste t de Student não pareado, enquanto ANOVA unidirecional ou bidirecional foi empregada para comparações multigrupos. Um valor p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

β-sitosterol era um produto natural potencial para tratar a DPOC

Devido aos efeitos curativos relatados de Fritillaria cirrhosa D. Don, flor seca de Lonicera japonica Thunb., raiz seca de Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., e Adenophora stricta Miq. no tratamento de doençaspulmonares 35,36,37,38, este estudo utilizou o banco de dados TCMSP para identificar sistematicamente os compo...

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Discussão

A DPOC impõe uma carga global substancial de doenças e continua sendo um grande desafio para a saúdemundial 1. O manejo atual da DPOC abrange tanto intervenções farmacológicas quanto nãofarmacológicas 42. Entre os tratamentos farmacológicos, os glicocorticosteroides (GCs) são amplamente usados em distúrbios inflamatórios crônicos. Eles atuam ligando-se à GR e recrutando a histona desacetilase 2 em complexos transcricionais para reverter a a...

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Divulgações

O(s) Autor(es) declaram(ões) que não há conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores não têm agradecimentos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BEAS-2B human bronchial epithelial cellsSunnCell, ChinaSC-0218Linha celular epitelial brônquica humana para estudo in vitro
C57BL/6 miceVital River Laboratories, China213Modelo animal para experimento in vivo de DPOC
CB-DOCK2Chinahttps://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.phppara simulação de acoplamento molecular entre ligante e proteína receptora
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Beyotime Biotechnology, ChinaC0038Detecção de viabilidade e proliferação celular
CellEvent™ Senescence Green Detection KitThermo Fisher, USAC10851Detecção de senescência celular
CigarettesHongta, ChinaNão fornecidoCigarro usado para exposição à fumaça e preparação de CSE
CTDUSAhttps://ctdbase.org/para recuperar genes relacionados à DPOC
DCFH-DA fluorescent probeSigma-Aldrich, USAD6883-50MGDetecção do nível de ROS intracelular
Dexamethasone (DEX)Yeasen, China40323ES03Glucocorticóide para intervenção combinada
DMEM/F12 mediumGibco, USA11330032Meio basal para cultura de células BEAS-2B
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, USA10270106Suplemento para meio de cultura celular
GraphPad Prism GraphPad Software, USA9.3.1Análise estatística de dados e desenho de gráficos
IsofluraneRWD Life Science, ChinaR510-22-10Anestésico inalado para eutanásia animal
Lipid Peroxidation MDA Assay KitBeyotime Biotechnology, ChinaS0131SDetecção do conteúdo de malondialdeído (MDA) intracelular
Lipofectamine 2000Thermo Fisher, USA11668030Reagente de transfecção para entrega de siRNA
Multimode microplate readerThermo Fisher, USAVL0000D0Detecção de valor de absorbância e fluorescência
Navios EX Flow CytometerBeckman Coulter, USAB80912Análise de ROS e células senescências
Penicillin/streptomycinHyClone, USASV30010Antibióticos para prevenção de contaminação bacteriana
Power SYBR™ Green Master MixThermo Fisher, USA4367659Amplificação de PCR quantitativa fluorescente
PrimeScript™ RT reagent KitTakara, JapanRR037QTranscrição reversa para síntese de cDNA
PubChem databaseUSAhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/para adquirir a sequência SMILES canônico e baixar informações estruturais 3D SDF do beta-sitosterol
QuantStudio Dx PCR InstrumentThermo Fisher, USA4479889Detecção de RT-qPCR em tempo real
RCSB PDBUSAhttps://www.rcsb.org/para obter o arquivo de estrutura 3D do cristal GR
RNA/Protein Isolation KitBeyotime Biotechnology, ChinaR0018SExtração total de RNA de célula e tecido pulmonar
si-GRDesigned in silico via siDirect 2.1Síntese personalizadaGuide: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passageiro: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown para GR
si-NCThermo Fisher, USA4390843usado como controle de transfecção negativo para ensaios celulares e in vivo
SwissTargetPrediction databaseSwitzerlandhttp://swisstargetprediction.ch/para previsão in silico de potenciais alvos proteicos relacionados a medicamentos
TCMSP databaseChinahttps://www.tcmsp-e.com/para triagem de ingredientes herbais e previsão de alvos
TTDSingaporehttps://db.idrblab.net/ttd/para coleta de genes de doenças associadas à DPOC validados
Whole-body smoke exposure chamberTeague Enterprise, USATE-2Estabelecimento do modelo de DPOC induzida por fumo de cigarro
β-sitosterolChemicalBook, China83-46-5Fitosteroide ativo para tratamento medicamentoso

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