Farmacologia em Rede e Pesquisa Experimental do β-Sitosterol no Tratamento de Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica via Receptor Glucocorticoide

Resumo

β-sitosterol aliviou a DPOC e potencializou a eficácia da dexametasona, com o receptor glucocorticoide mediando esse efeito. Além disso, o β-sitosterol reduziu inflamação, estresse oxidativo e senescência celular tanto em células epiteliais brônquicas estimuladas por CSE quanto em camundongos com DPOC induzidos pela fumaça do cigarro.

Resumo

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é um distúrbio respiratório prevalente caracterizado por inflamação persistente, estresse oxidativo e declínio progressivo da função pulmonar. O potencial terapêutico do β-sitosterol na DPOC ainda não está claro. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos protetores do β-sitosterol contra a DPOC e elucidar seu mecanismo subjacente. A triagem em banco de dados identificou o receptor de glucocorticoide (GR) como um potencial alvo do β-sitosterol. Foram estabelecidos um modelo de camundongos para DPOC induzido pela fumaça de cigarro e um modelo de células BEAS-2B estimulado por extrato de fumaça de cigarro (CSE). Função pulmonar, marcadores relacionados a lesão pulmonar, inflamação, estresse oxidativo e senescência celular foram avaliados usando (RT-qPCR), ensaios fluorescentes de sonda DFH-DA e kits de detecção de senescência. Os efeitos do β-sitosterol isoladamente ou em combinação com dexametasona (DEX) também foram avaliados. β-sitosterol melhorou significativamente a função pulmonar, normalizou marcadores relacionados a lesão pulmonar e atenuou inflamação, estresse oxidativo e senescência celular tanto em células BEAS-2B estimuladas por CSE quanto em camundongos expostos à fumaça de cigarro. Esses efeitos protetores foram acompanhados por aumento na expressão da RG. Além disso, o β-sitosterol aumentou a resposta à DEX e o tratamento combinado com β-sitosterol e DEX produziram melhorias maiores na função pulmonar, marcadores de lesão pulmonar, inflamação, níveis de espécies reativas de oxigênio e senescência celular do que o tratamento por DEX isoladamente. Coletivamente, esses achados sugerem que o β-sitosterol alivia as alterações patológicas associadas à DPOC, ao menos em parte, ao aumentar a expressão da GR e aumentar a eficácia terapêutica da DEX, destacando seu potencial como estratégia adjuvante no tratamento da DPOC.

Introdução

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma doença respiratória progressiva caracterizada por inflamação persistente das vias aéreas, danos alveolares e obstrução irreversível do fluxo de ar que prejudica a função respiratória e reduz a qualidade^{de vida 1}. Sua prevalência aumenta significativamente com a idade, e o risco para pessoas com sessenta e cinco anos ou mais é cerca de cinco vezes maior que para pessoas com menos de^{quarenta e 2} anos. Essa tendência demográfica está associada ao aumento da incidência de doenças, mortalidade e deficiência³. Projeções epidemiológicas indicam que, até 2030, a DPOC pode se tornar a quarta principal causa de morte no mundo, respondendo por cerca de 5% de todas as mortes^(4,5,6). Atualmente, os fatores de risco identificados incluem suscetibilidade genética, displasia pulmonar, exposição a partículas, bronquite crônica e infecção^{respiratória 7}.

Entre os fatores de risco, a fumaça do cigarro é o fator patogênico mais importante da^{DPOC 8}. Ele contém milhares de substâncias químicas que podem causar danos ao epitelio brônquico, promover a infiltração de células inflamatórias e levar à remodelação do tecido pulmonar⁹. A exposição prolongada pode induzir lesão epitelial persistente e irreversível, promover a liberação de um grande número de quimiocinas pró-inflamatórias, aumentar significativamente a produção (ROS) e induzir a apoptose celular¹⁰. Muitos estudos mostraram que os níveis elevados de quimiocinas pró-inflamatórias como interleucina-8 (IL-8) e fator de necrose tumoral α (TNF-α), juntamente com a produção excessiva de ROS e senescência celular, estão intimamente relacionados à gravidade da^{DPOC 11,12}. Isso destaca a necessidade de agentes que possam modular de forma eficaz e segura esses principais fatores patogênicos para exercer efeitos protetores e terapêuticos na DPOC.

Os fitoesteróis são compostos bioativos naturais presentes de forma onipresente nas membranas celulares das plantas. Entre eles, o β-sitosterol é o mais abundante e está amplamente distribuído em alimentos vegetais ricos em lipídios, como vegetais, nozes, sementes e azeite^{de oliva} 13,14,15,16. Estudos confirmaram que a administração de β-sitosterol em doses de até 1000 mg/kg em ratos e camundongos não está associada à citotoxicidade ou^{genotoxicidade 17}. Além disso, pesquisas mostraram que o β-sitosterol apresenta propriedades antioxidantes por meio de seus efeitos sobre enzimas antioxidantes e receptores de estrogênio^{humanos 18}.

β-sitosterol apresenta um amplo espectro de atividades farmacológicas, incluindo^{anti-inflamatórios 19}, antipiréticos²⁰,^{analgésicos 21} e efeitos^{antidiabéticos 13}. Também demonstrou potencial terapêutico em vários modelos de doença, como colite e inflamação^{intestinal 22}, e possui propriedades antiateroscleróticas²³ e^{imunomoduladoras 24}. Além disso, possui um perfil de segurança favorável. Dadas essas características, o β-sitosterol atraiu considerável interesse como potencial candidato a medicamento. No entanto, seu papel exato e os mecanismos subjacentes na DPOC permanecem em grande parte incertos.

Portanto, o presente estudo teve como objetivo investigar os potenciais efeitos terapêuticos e os mecanismos subjacentes do β-sitosterol na DPOC. Especificamente, um modelo de lesão de células BEAS-2B induzido por extrato de fumaça de cigarro (CSE) foi usado para avaliar se o β-sitosterol poderia aliviar efetivamente danos celulares mediados por CSE, identificando assim uma nova molécula candidata para estratégias terapêuticas de DPOC.

Protocolo

O estudo foi realizado de acordo com as diretrizes de Farmacologia Básica e Clínica & Toxicologia para estudos experimentais^{e clínicos 25}. Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Segundo Hospital Afiliado, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang (Aprovação nº 20230102), e todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética Animal. O estudo foi conduzido em conformidade com as diretrizes da ARRIVE.

Triagem de componentes-chave e alvos via farmacologia de rede

Componentes ativos de Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., e Adenophora stricta Miq. foram recuperados do Banco de Dados de Farmacologia dos Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; acessado em 12 de março de 2024). Os compostos candidatos foram avaliados segundo os seguintes critérios ADME: biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30%, semelhança com fármacos (DL) ≥ 0,18 e permeabilidade ao Caco-2 ≥ −0,4²⁵. Compostos que atenderam aos três critérios foram mantidos como ingredientes ativos candidatos para análises subsequentes.

A estrutura canônica do Sistema Simplificado de Entrada de Linha de Entrada Molecular (SMILES) do β-sitosterol foi obtida do PubChem (acessado em 18 de março de 2024) e importada no SwissTargetPrediction (acessado em 21 de março de 2024) para previsão de alvos. Homo sapiens foi selecionado como espécie-alvo. Os alvos potenciais foram previstos com base na similaridade estrutural 2D e 3D entre β-sitosterol e ligandos conhecidos no banco de dados. Alvos previstos com probabilidade maior que 0 foram mantidos, e entradas duplicadas foram removidas.

Genes associados à DPOC foram recuperados do Banco de Dados de Alvos Terapêuticos (TTD; acessado em 25 de março de 2024) e do Banco de Dados de Toxicogenômica Comparativa (CTD; acessado em 28 de março de 2024) usando a palavra-chave "doença pulmonar obstrutiva crônica". Após a remoção dos genes duplicados, os genes associados à DPOC foram intersectados com os alvos previstos de β-sitosterol para identificar alvos candidatos potencialmente envolvidos nos efeitos terapêuticos do β-sitosterol contra a DPOC.

Acoplamento molecular de β-sitosterol e GR

A estrutura tridimensional do β-sitosterol no formato SDF foi recuperada do banco de dados PubChem (acessado em 2 de junho de 2026), enquanto a estrutura cristalina do receptor glucocorticoide (GR) foi obtida do Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; acessado em 3 de junho de 2026). Após a preparação padrão das estruturas do ligante e receptor, o acoplamento molecular foi realizado usando a plataforma online CB-Dock2 (acessado em 3 de junho de 2026). Os arquivos preparados de ligantes e receptores foram carregados para a plataforma, e os cálculos de acoplamento foram realizados usando os parâmetros padrão.

Análise de enriquecimento funcional da Ontologia Gênica (GO) e da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)

Todos os genes-alvo previstos do β-sitosterol foram submetidos a análises de enriquecimento funcional GO e enriquecimento da via KEGG. Os resultados do enriquecimento, incluindo processos biológicos significativamente enriquecidos, componentes celulares, funções moleculares e vias de sinalização, foram organizados e armazenados no Arquivo Suplementar 1 para análise bioinformática subsequente.

Modelagem e agrupamento animal

O tamanho da amostra foi definido em seis animais por grupo com base em um estudo anterior que realizou uma análise de potência a priori usando software G*Power (α = 0,05, potência = 0,80) e demonstrou que n = 6 era suficiente para detectar diferenças biologicamente relevantes sob condições experimentais^{comparáveis 26}. Machos C57BL/6 camundongos de 6 a 8 semanas (20 ± 2 g) foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos: grupo controle, grupo modelo de DPOC, grupo DPOC + dexametasona (DEX), grupo DPOC + β-sitosterol e grupo DPOC + DEX + β-sitosterol. Os camundongos foram alojados em condições laboratoriais padrão (25 °C, ciclo claro/escuro de 12 horas) com acesso livre a comida e água padrão, e foram permitidos para se aclimatar por 1 semana antes da experimentação.

Para o estabelecimento modelo de DPOC, os camundongos foram colocados em uma câmara de exposição ao cigarro de corpo inteiro (63 cm × 55 cm × 45 cm) e expostos à fumaça convencional do cigarro por 12 semanas. Cada cigarro continha 10 mg de alcatrão, 0,9 mg de nicotina e 10 mg de monóxido de carbono. A exposição à fumaça foi realizada duas vezes ao dia (5 dias por semana) às 9h30 e às 15h, com fumaça gerada por 18 cigarros entregues na câmara por 90 minutos por²⁷ sessões de 27.

Para avaliar os efeitos terapêuticos das intervenções, a administração de medicamentos foi iniciada após 8 semanas de exposição à fumaça de cigarro e continuou pelas 4 semanas restantes. A partir da 9ª semana, camundongos dos respectivos grupos de tratamento receberam administração diária intragástrica de DEX (1 mg/kg)²⁸ ou β-sitosterol (50 mg/kg)^29,30 1 hora antes da exposição à fumaça do cigarro. Estudos farmacocinéticos anteriores relataram uma biodisponibilidade oral de aproximadamente 4% para β-sitosterol em^{roedores 31}. Além disso, vários estudos com camundongos utilizaram doses que variam de 20 a 50 mg/^{kg 32}. Portanto, foi selecionada uma dose de 50 mg/kg para garantir exposição sistêmica adequada, mantendo-se dentro da faixa comumente usada em estudos pré-clínicos.

Os camundongos do grupo controle foram expostos ao ar filtrado da sala, enquanto os camundongos dos grupos modelo e de tratamento receberam um volume equivalente de soro fisiológico normal como veículo. Ao final do período experimental, os camundongos foram profundamente anestesiados com isoflurano até a perda do reflexo pedal e eutanasiados por exsanguinação via coleta de sangue da aorta abdominal. A cavidade torácica foi imediatamente aberta, e os tecidos pulmonares bilaterais intactos foram cuidadosamente excisados, enxaguados com soro salino fosfatado tamponado gelado (PBS) e colocados sobre gelo. Para a coleta do líquido de lavagem broncoalveolar (BALF), a traqueia foi canulada e lavada com PBS frio e estéril, que foi suavemente instilado e retirado repetidamente para coletar o fluido de lavagem. Tecidos pulmonares e amostras de BALF foram mantidos no gelo e posteriormente processados para análises a jusante.

Cultura celular BEAS-2B

Células epiteliais bronquiais humanas BEAS-2B foram mantidas no Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) da Dulbecco, contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina abaixo de 5% de CO₂ a 37 °C.

Preparação de CSE e exposição a células BEAS-2B

As células BEAS-2B foram lavadas com soro salino tamponado com fosfato e semeadas em placas de 24 poços em triplicado com uma densidade de 5 × 10⁴ células por poço. Após 12 horas de cultura, as células atingiram aproximadamente 60% de confluência e foram então expostas à CSE. O CSE foi preparado de forma refrescante, conforme descrito anteriormente, com modificações^{menores no 33}. Brevemente, um cigarro comercial não filtrado era continuamente queimado, e a fumaça comum era bolhada em 10 mL de meio sem soro usando uma bomba de vácuo a uma vazão constante de 1,05 L/min (aproximadamente −11 kPa pressão negativa) por aproximadamente 5 minutos até que o cigarro estivesse completamente queimado. A solução obtida foi inicialmente submetida a pré-filtração para remover grandes impurezas particuladas, depois esterilizada por meio de um filtro microporoso estéril de 0,22 μm para eliminar partículas residuais; a solução resultante foi definida como 100% CSE. Todo o CSE recém-preparado era usado para tratamento celular imediatamente após filtração, sem armazenamento. As células foram estimuladas com meio contendo 2,5% de CSE. Após 24 horas de tratamento com CSE, os supernadantes da cultura foram coletados e armazenados a -40 °C para análise^{subsequente 34}.

Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (RT-qPCR)

O RNA total foi extraído das células BEAS-2B usando um kit de extração total de RNA e transcrito reversamente em cDNA usando um kit de transcrição reversa, conforme as instruções do fabricante. Posteriormente, o RT-qPCR foi realizado usando um sistema de detecção de PCR em tempo real e uma mistura master qPCR baseada em SYBR Green. Todos os experimentos RT-qPCR foram realizados com três réplicas biológicas e três réplicas técnicas por amostra para garantir a confiabilidade dos dados.

Cada reação qPCR foi realizada em um volume total de 20 μL, contendo 10 μL de mistura master SYBR Green qPCR, 0,4 μL de primer direto, 0,4 μL de primer reverso, 2 μL de molde de cDNA diluído e 7,2 μL de água livre de RNase. As condições de amplificação foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 10 s e recozimento/extensão a 60 °C por 30 s. Os níveis relativos de expressão gênica foram calculados usando o método 2^−ΔΔCt, com o GAPDH atuando como gene de referência interno. As sequências de primers utilizadas neste estudo são mencionadas na Tabela Suplementar 1.

Análise de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ROS)

A produção intracelular de ROS em células BEAS-2B foi avaliada usando o diacetato fluorogênico de sonda 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA) e analisada por citometria de fluxo. Durante a aquisição de citometria em fluxo, foi aplicada uma estratégia padrão de espalhamento frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC) para excluir detritos celulares e selecionar células individuais intactas. Um total de 10.000 eventos celulares válidos foram adquiridos para cada amostra. Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram ajustados em 488 nm e 525 nm, respectivamente. Dados citométricos de escoamento foram posteriormente analisados para quantificar a intensidade de fluorescência intracelular do ROS.

Determinação do nível de Malondialdeído (MDA)

O conteúdo intracelular de MDA foi medido usando um kit de ensaio de peroxidação lipídica conforme as instruções do fabricante. Brevemente, células BEAS-2B tratadas foram colhidas e lisadas, depois centrifugadas a baixa temperatura para coletar o sobrenadante. A reação colorimétrica do ácido tiobarbitúbico (TBA) foi então realizada, e a absorção foi medida a 532 nm usando um leitor de microplacas. Os níveis relativos de MDA foram calculados de acordo com a curva padrão.

Avaliação da senescência celular

A senescência celular foi avaliada usando um ensaio de detecção de senescência baseado na atividade associada à senescência β-galactosidase (SA-β-gal). Células SA-β-gal-positivas foram quantificadas por citometria de fluxo. Paralelamente, os níveis de expressão de mRNA dos marcadores associados à senescência p53 e p21 foram determinados por RT-qPCR.

Ensaio de proliferação celular

A proliferação celular foi avaliada usando um kit de ensaio de viabilidade celular colorimétrica. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplaca.

Ensaio de knockdown da GR

A transfecção celular foi realizada usando um reagente de transfecção à base de lipídios. Os seguintes oligonucleotídeos foram transfectados: RNA pequeno interferente direcionado ao receptor de glucocorticoides (si-GR) e RNA interferente pequeno controle negativo (si-NC). Sequências candidatas de siRNA direcionadas à RG foram projetadas usando a plataforma online de bioinformática siDirect 2.0. Após a transfecção, as células foram cultivadas por 48 horas, e todos os siRNAs foram usados em uma concentração final de 50 nM. A eficiência do knockdown foi verificada medindo a expressão do mRNA da GR usando RT-qPCR.

Grupos de controle de veículos foram incluídos tanto em experimentos de tratamento com β-sitosterol quanto em experimentos de transfecção. Para a intervenção com β-sitosterol, células tratadas apenas com solvente do veículo serviram como grupo controle do veículo (denotado como CSE+0). A análise estatística confirmou que não foram observadas diferenças significativas entre os grupos controle do veículo e controle em branco.

Análise estatística

Todos os resultados quantitativos foram expressos como média ± desvio padrão de três experimentos in vitro biologicamente independentes. As análises estatísticas foram realizadas usando software de análise estatística. O teste de Shapiro–Wilk foi usado para examinar a normalidade da distribuição do conjunto de dados antes dos testes estatísticos; A correção pós-hoc de Bonferroni foi adotada para ajustar os valores de P para comparações múltiplas após análise de variância (ANOVA). As comparações entre dois grupos foram avaliadas por um teste t de Student não pareado, enquanto ANOVA unidirecional ou bidirecional foi empregada para comparações multigrupos. Um valor p ≤ 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

β-sitosterol era um produto natural potencial para tratar a DPOC

Devido aos efeitos curativos relatados de Fritillaria cirrhosa D. Don, flor seca de Lonicera japonica Thunb., raiz seca de Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., e Adenophora stricta Miq. no tratamento de doenças^pulmonares 35,36,37,38, este estudo utilizou o banco de dados TCMSP para identificar sistematicamente os componentes ativos dessas ervas da Medicina Tradicional Chinesa (MTC). β-sitosterol foi identificado como um ingrediente ativo importante compartilhado por essas ervas da MTC (Figura 1A). Para explorar sistematicamente o mecanismo molecular subjacente do β-sitosterol, suas informações estruturais SMILES foram recuperadas do banco de dados PubChem e importadas para o banco de dados SwissTargetPrediction para previsão de alvos; todos os alvos previstos com probabilidade preditiva acima de 0 foram mantidos para análises subsequentes. A rede de interação ingrediente-alvo resultante entre β-sitosterol e seus alvos candidatos foi visualizada e apresentada na Figura 1B. Um total de 43 genes-alvo putativos do β-sitosterol foram previstos usando o banco de dados SwissTargetPrediction. Posteriormente, análises de enriquecimento funcional GO e enriquecimento da via KEGG foram realizadas nos genes-alvo do β-sitosterol, e todos os conjuntos completos de enriquecimento foram arquivados no Arquivo Suplementar 1. Notavelmente, os processos metabólicos dos esteroides foram identificados como um dos caminhos mais enriquecidos significativamente. A literatura acumulada demonstrou a estreita correlação entre metabolismo aberrante de corticosteroides e resistência a glicocorticoides na^{DPOC 39}. Além disso, a RG foi distintamente enriquecida dentro de agrupamentos funcionais relacionados ao metabolismo dos esteroides. Essa descoberta fornece suporte bioinformático fundamental para nossos experimentos celulares subsequentes que investigam o mecanismo pelo qual o β-sitosterol melhora a sensibilidade à DEX e altera os níveis de expressão da GR.

Os genes relacionados à DPOC foram recuperados dos bancos de dados de DTT e DCT. Análise subsequente de interseção de Venn (Figura 1C) revelou dois genes sobrepostos entre alvos de β-sitosterol e genes relacionados à DPOC derivados da DTD, outros dois genes sobrepostos entre alvos de β-sitosterol e genes relacionados à DPOC derivados da DTC, e cinco genes de DPOC compartilhados entre os conjuntos de dados de DTT e DCT. No fim das contas, a RG foi o único gene comum a todos os três conjuntos de dados e foi definida como o alvo central do β-sitosterol contra a DPOC. Dados numéricos detalhados da análise de Venn estão listados no Arquivo Suplementar 2. Para uma verificação adicional da afinidade de ligação, foi realizada a acoplagem molecular de β-sitosterol com GR (Figura 1D). Bolsões de ligação com pontuações de Vina inferiores a −7,0 kcal/mol foram consideradas como apresentando afinidade de ligação favorável. As pontuações de Vina dos bolsões C1 e C5 foram −8,8 e −7,2 kcal/mol, respectivamente, indicando uma forte interação prevista entre β-sitosterol e GR.

β-sitosterol protegeu as células BEAS-2B contra danos ao CSE, que podem estar associados à expressão elevada da GR

β-sitosterol mostrou um efeito protetor significativo no modelo de lesão das células BEAS-2B induzida por CSE. O grupo CSE + 0 foi projetado como um controle veicular recebendo CSE mais um volume igual de solvente medicamentoso sem β-sitosterol. Como esperado, não foi encontrada diferença significativa entre os grupos CSE e CSE + 0. O composto inibiu a produção induzida pelo CSE de TNF-α e IL-6 de forma dependente da concentração (Figura 2A). Também reduziu os níveis intracelulares de ROS (Figura 2B). β-sitosterol também diminuiu significativamente o conteúdo de MDA (Figura 2C), suprimiu a senescência celular induzida por CSE (Figura 2D) e reduziu os marcadores relacionados à senescência p53 e p21 (Figura 2E). Esses efeitos foram acompanhados por expressão aumentada do mRNA da GR (Figura 2F), sugerindo que sua função protetora pode estar intimamente ligada à regulação para cima transcricional da GR. Dentro da faixa de concentração testada, o β-sitosterol não exerceu citotoxicidade óbvia na viabilidade das células BEAS-2B (Figura 2G), indicando tolerância celular favorável a esse composto. Considerando que 20 μg/mL (aproximadamente 48,2 μM) apresentavam os efeitos inibitórios mais potentes, essa dose foi selecionada para experimentos subsequentes. Embora não tenha sido observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos de 10 μg/mL e 20 μg/mL quanto à supressão de citocinas pró-inflamatórias, 20 μg/mL β-sitosterol apresentou uma leve tendência de queda nos níveis de fatores inflamatórios. Além disso, comparado a 10 μg/mL, 20 μg/mL alcançou eficácia superior na inibição do acúmulo de ROS e MDA induzidos por CSE, redução da senescência celular e aumento da expressão de mRNA da GR. Isso apoiou a seleção de 20 μg/mL como concentração ótima de trabalho para ensaios de resgate subsequentes.

Os resultados da RT-qPCR (Figura 2H) confirmaram o sucesso do knockdown da RG. Os níveis de mRNA da GR no grupo si-GR foram reduzidos em aproximadamente 78% em comparação ao controle si-NC, verificando a eficiência do silenciamento da GR para ensaios de resgate subsequentes. Após a redução da GR, os efeitos inibitórios do β-sitosterol sobre fatores inflamatórios e ROS foram significativamente revertidos (Figuras 2I, J). Da mesma forma, a atenuação da senescência celular pelo β-sitosterol também foi abrogada (Figura 2K). Em conjunto, esses resultados mostraram que o β-sitosterol desempenhou um papel protetor contra lesões induzidas por ECS nas células epiteliais brônquicas por meio de mecanismos anti-inflamatórios, antioxidantes e anti-envelhecimento mediados pela RG.

β-sitosterol aumentou os efeitos terapêuticos da DEX na função pulmonar e inflamação em um modelo murino de DPOC

Em um modelo murino de DPOC estabelecido por exposição à fumaça de cigarro, o tratamento com β-sitosterol, DEX ou sua combinação exerceu efeitos protetores evidentes. Comparações estatísticas entre múltiplos grupos foram analisadas usando ANOVA unidirecional, seguidas pelo teste pós-hoc de Tukey. Cinco estilos distintos de símbolos foram aplicados para distinguir coortes experimentais: círculos para o grupo Controle, triângulos para o grupo Modelo, asteriscos para o grupo Modelo + DEX, quadrados para o grupo Modelo + β-sitosterol e losangos para o grupo Modelo + DEX + β-sitosterol. Cada colchete horizontal representa uma comparação estatística entre dois grupos experimentais interligados.

Comparados ao grupo controle, camundongos do grupo modelo de DPOC apresentaram reduções significativas no volume expiratório forçado em 0,1 s (FEV₀.₁), capacidade vital forçada (FVC), fluxo expiratório máximo (PEF) e na razão FEV₀.₁/FVC. Como mostrado na Figura 3A–D, uma relação FEV₀.₁/FVC abaixo de 70% verificou o estabelecimento bem-sucedido do modelo de DPOC. A administração de DEX ou β-sitosterol sozinha reverteu significativamente essas prejuízos da função pulmonar em relação a camundongos modelo, e o tratamento combinado levou a melhorias adicionais em relação à administração de agente único. Além disso, uma alteração da razão MMP-9/TIMP-1 é um marcador molecular característico da remodelação das vias aéreas, e a expressão elevada de MUC5AC representa hipersecreção excessiva^{de muco 40,41}. Detectamos ainda os níveis de mRNA de MMP-9, TIMP-1 e o marcador mucoso MUC5AC, e calculamos a razão MMP-9/TIMP-1 (Figuras 3E, F). O grupo modelo apresentou uma razão MMP-9/TIMP-1 marcadamente aumentada e expressão elevada de MUC5AC. DEX ou β-sitosterol sozinhos reduziram efetivamente ambos os parâmetros, e o tratamento combinado alcançou eficácia inibitória superior em comparação com a monoterapia.

Os camundongos modelo para DPOC apresentaram elevações pronunciadas nos níveis de BALF de TNF-α e IL-6, além de aumento no conteúdo de ROS pulmonar em relação aos camundongos controle. DEX ou β-sitosterol sozinho reduziu significativamente tanto os níveis de citocinas inflamatórias quanto o estresse oxidativo, e o tratamento combinado produziu efeitos inibitórios mais fortes (Figura 3G, H). Além disso, a expressão pulmonar de mRNA da GR foi notavelmente reduzida nos camundongos modelo de DPOC. A DEX ou β-sitosterol sozinha aumentou significativamente a expressão da GR, e o tratamento combinado elevou ainda mais os níveis de GR (Figura 3I).

Coletivamente, esses achados indicaram que o β-sitosterol protegeu contra alterações patológicas relacionadas à DPOC em camundongos ao manter a função pulmonar, inibir a inflamação, aliviar o estresse oxidativo e elevar a expressão da RG. Além disso, a administração combinada de β-sitosterol fortaleceu a eficácia protetora da DEX nesse modelo.

Eficácia terapêutica melhorada por DEX com β-sitosterol, potencialmente por meio da regulação da via GR no modelo de células BEAS-2B induzidas por CSE

No modelo de células BEAS-2B induzido por CSE, a monoterapia DEX reduziu significativamente a expressão de mRNA das citocinas pró-inflamatórias, reduziu os níveis intracelulares de ROS e MDA, e reduziu a proporção de células senescentes, bem como a expressão dos marcadores de senescência p53 e p21. Esses resultados confirmam as atividades anti-inflamatórias, antioxidantes e anti-senescentes da DEX. Notavelmente, a coadministração de β-sitosterol aumentou ainda mais os efeitos protetores da DEX, resultando em uma supressão mais forte da inflamação, estresse oxidativo e senescência celular em comparação com a monoterapia DEX. Após a redução da RG (si-GR) no grupo de co-tratamento DEX + β-sitosterol, a resposta celular à terapia combinada foi marcadamente atenuada. Como mostrado na Figura 4A–E, a inibição co-mediada por DEX e β-sitosterol da inflamação, estresse oxidativo e senescência foi significativamente invertida, indicando que a deficiência de GR enfraqueceu os efeitos benéficos do β-sitosterol na eficácia da DEX.

Coletivamente, esses achados demonstraram que o β-sitosterol aumentou a eficácia da DEX, possivelmente regulando processos relacionados à RG, aumentando assim os efeitos protetores da DEX contra lesão das células brônquicas induzidas por ECS.

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

Todos os dados brutos que apoiam os achados deste estudo são fornecidos nos materiais suplementares (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2).

Figura 1: Papel fundamental do β-sitosterol na terapia para DPOC. (A) Componentes ativos em Fritillaria cirrhosa D. Don, flor seca de Lonicera japonica Thunb. e raiz seca de Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. e Adenophora stricta Miq. foram triadas pelo banco de dados TCMSP. (B) Os alvos potenciais do β-sitosterol. (C) Análise de interseção de alvos a jusante de β-sitosterol e genes relacionados à DPOC. (D) Análise de acoplamento molecular entre β-sitosterol e proteína GR. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Envolvimento da GR na proteção relacionada ao β-sitosterol contra lesão celular induzida por CSE. (A) Modulação dependente de concentração de mediadores inflamatórios induzidos por CSE (TNF-α, IL-6) por β-sitosterol. (B) Efeitos da dose de β-sitosterol no nível de ROS em células expostas a CSE. (C) Efeitos do β-sitosterol no conteúdo de MDA aumentado por CSE. (D) A influência do β-sitosterol na senescência celular promovida por CSE. (E) Modulação de p53 e p21 relacionados à senescência por β-sitosterol sob estimulação do CSE. (F) Regulação dependente da concentração de β-sitosterol da expressão da GR sob estimulação do CSE. (G) Viabilidade celular do β-sitosterol em concentrações testadas em células BEAS-2B. (H)Detecção por RT-qPCR da expressão de mRNA da GR para verificar a eficiência de knockdown após a transfecção de siRNA direcionada pela GR. (I) Associação regulatória entre GR e β-sitosterol contra fatores inflamatórios induzidos pela CSE. (J) Associação regulatória entre GR e β-sitosterol contra o acúmulo de ROS induzido por CSE. (K) Associação regulatória entre GR e β-sitosterol contra a senescência celular induzida por CSE. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; NS, não significativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Efeitos do β-sitosterol combinado com DEX na função pulmonar, inflamação, estresse oxidativo e expressão de GR em camundongos modelo de DPOC. (A) Alterações no volume expiratório forçado em 0,1 s (FEV₀.₁) em camundongos com DPOC. (B) Alterações na capacidade vital forçada (CVF) em camundongos com DPOC. (C) Efeitos sobre o fluxo expiratório máximo (PEF) em camundongos com DPOC. (D) Relação FEV₀.₁/FVC em modelos de camundongos para DPOC. (E) Razão relativa de mRNA de MMP-9/TIMP-1 refletindo a remodelação das vias aéreas. (F) A expressão relativa de mRNA de MUC5AC indica hipersecreção de muco nos tecidos pulmonares de camundongo. (G) Níveis de TNF-α e IL-6 no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF). (H)Produção de ROS no tecido pulmonar de camundongos com DPOC. (I) Expressão relativa de mRNA da RG no tecido pulmonar de camundongo. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Efeito do β-sitosterol na resistência à DEX mediada por GR em células BEAS-2B induzidas por CSE. (A) Expressão relativa de mRNA dos fatores inflamatórios (TNF-α, IL-6) em cada grupo. (B) Nível ROS em cada grupo. (C)Conteúdo de MDA em cada grupo experimental. (D) Porcentagem de células BEAS-2B senescentes em cada grupo. (E) Níveis relativos de mRNA dos marcadores associados à senescência p53 e p21. **p < 0,01; p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela suplementar 1: Sequências de primers usadas para análise RT-qPCR. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Conjuntos completos de dados de análise de enriquecimento GO e KEGG para os genes-alvo β-sitosterol. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Resultados numéricos detalhados da análise de Venn identificando os alvos sobrepostos entre β-sitosterol e DPOC. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A DPOC impõe uma carga global substancial de doenças e continua sendo um grande desafio para a saúde^{mundial 1}. O manejo atual da DPOC abrange tanto intervenções farmacológicas quanto não^{farmacológicas 42}. Entre os tratamentos farmacológicos, os glicocorticosteroides (GCs) são amplamente usados em distúrbios inflamatórios crônicos. Eles atuam ligando-se à GR e recrutando a histona desacetilase 2 em complexos transcricionais para reverter a acetilação^{da histona 43}. No entanto, múltiplos estudos demonstraram redução da sensibilidade à GC em pacientes com^{DPOC 44,45}, e investigações forneceram evidências de resistência à GC nesta^{doença 46}. Esses achados indicam que superar a resistência ao GC é um desafio clínico significativo, destacando a necessidade de novos agentes terapêuticos. Portanto, identificar opções terapêuticas mais eficazes para a DPOC é de grande importância.

Estudos anteriores demonstraram que o γ-sitosterol exerce um efeito antiproliferativo sobre as células epiteliais brônquicas na^{DPOC 47}. Como γ-sitosterol e β-sitosterol são ambos componentes bioativos comuns dos fitoesteróis, o presente estudo amplia o entendimento atual das ações dos fitosteróis na DPOC e destaca o potencial valor protetor do β-sitosterol na patogênese da doença. Nossos achados revelaram que o β-sitosterol inibiu significativamente a liberação de fatores inflamatórios, reduziu o estresse oxidativo e suprimiu a senescência celular. Isso é consistente com relatos anteriores que mostraram que o β-sitosterol suprime efetivamente a regulação para cima de mediadores inflamatórios induzidos por lipopolissacarídeos, como IL-6, sintase induzível de óxido nítrico e TNF-α⁴⁸. Esses achados confirmam sua atividade anti-inflamatória e apoiam sua consistência entre diferentes modelos inflamatórios.

As GCs inaladas são agentes anti-inflamatórios eficazes para controlar a inflamação das vias aéreas. Eles atuam principalmente ligando-se e ativando o GR⁴⁹. No entanto, uma característica patológica chave da DPOC é a redução da sensibilidade das células aos efeitos anti-inflamatórios dos^{GCs 44}. A regulação para baixo ou comprometimento funcional da RG é considerada um dos principais mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da resistência à GC em pacientes com^{DPOC 50}. Estudos anteriores mostraram que certos medicamentos podem aumentar a sensibilidade à GC. Por exemplo, a combinação de azitromicina e budesonida produz um efeito inibitório significativamente maior na produção de IL-4 e CXCL8 do que qualquer um dos agentes^{isoladamente 51}.

Notavelmente, o presente estudo constatou que, tanto em modelos de camundongos com DPOC expostos à fumaça de cigarro quanto em modelos de células BEAS-2B induzidas por CSE, a combinação de β-sitosterol com DEX produziu efeitos inibitórios significativamente mais fortes sobre fatores inflamatórios, estresse oxidativo e senescência celular do que a DEX isolada. Essa combinação também aumentou significativamente a eficácia protetora da DEX contra alterações patológicas relacionadas à DPOC e lesão das células epiteliais brônquicas em camundongos. Esse resultado sugere que o β-sitosterol pode melhorar a sensibilidade das células epiteliais brônquicas à DEX, fornecendo uma abordagem inovadora para tratar a insensibilidade ou resistência à GC em alguns pacientes com DPOC. Consistente com os resultados quantitativos da PCR in vitro , o β-sitosterol eleva os níveis de mRNA da GR de forma dependente da concentração, em vez de atuar diretamente como agonista ou antagonista da RG. A eficiência verificada da redução da SI-GR e os subsequentes ensaios de resgate funcional confirmam ainda mais que o β-sitosterol melhora a resposta da GC celular ao aumentar os níveis totais intracelulares de GR, em vez de ativar diretamente a GR, gerando assim efeitos terapêuticos aprimorados quando combinados com DEX, um agonista canônico da RG. Assim, mudanças na expressão da RG podem estar relacionadas à ação do β-sitosterol, o que é consistente com observações anteriores de redução significativa da RG e sua isoforma ativa GRα em células musculares lisas das vias aéreas em pacientes^{com DPOC 52}. Importante, experimentos de knockdown da RG revelaram ainda mais o papel central desse receptor na citoproteção mediada por β-sitosterol, indicando que algumas das funções biológicas do β-sitosterol dependem da integridade da via da RG.

Em conjunto, o presente estudo revela não apenas que a RG pode atuar como um mediador-chave do β-sitosterol na intervenção para DPOC, mas também oferece uma nova abordagem potencial para superar o desafio clínico da resistência à DEX, lançando uma base experimental para o desenvolvimento de terapias auxiliares naturais que visem a via da RG.

No entanto, o presente estudo apresentava várias limitações. Primeiro, a função pulmonar foi avaliada apenas para confirmar o estabelecimento bem-sucedido do modelo murino de DPOC, e a coloração de hematoxilina-eosina (HE) e Masson não foram realizadas para verificar mais detalhadamente características patológicas típicas, incluindo enfisema, remodelação das vias aéreas e hipersecreção de muco. Como todas as amostras pulmonares fixas foram consumidas em experimentos anteriores, a reconstrução do modelo de camundongos de DPOC induzida por fumaça de cigarro de 12 semanas não foi viável dentro do período disponível do estudo. Para abordar parcialmente essa limitação, a razão MMP-9/TIMP-1 e os níveis de expressão do mRNA MUC5AC foram quantificados usando amostras preservadas de RNA pulmonar. Segundo, apenas uma dose combinada única de β-sitosterol e DEX foi avaliada in vivo, e efeitos dose-resposta ou sinérgicos não foram sistematicamente investigados. Estudos adicionais incorporando múltiplas combinações de doses são necessários para caracterizar potenciais interações sinérgicas. Terceiro, devido a restrições experimentais e custos de pesquisa, apenas seis camundongos foram incluídos em cada grupo. O tamanho relativamente pequeno da amostra pode ter aumentado a suscetibilidade à variabilidade entre animais e limitado a robustez estatística dos achados. Estudos futuros com amostras maiores são necessários para validar ainda mais os resultados atuais. Quarto, linhas celulares estáveis resistentes à DX não foram estabelecidas; portanto, a capacidade do β-sitosterol de reverter a resistência estabelecida aos glicocorticoides não pôde ser avaliada diretamente. Estudos adicionais usando modelos validados resistentes a glicocorticoides são necessários para investigar mais a fundo esse possível mecanismo.

Em conclusão, esses achados sugerem que a sinalização da RG pode estar envolvida nos efeitos protetores do β-sitosterol contra lesões induzidas por ECS em células BEAS-2B, incluindo a inibição da liberação de fatores inflamatórios, estresse oxidativo e senescência celular, bem como melhorias na função pulmonar e nos biomarcadores de lesão pulmonar. Além disso, o β-sitosterol aumentou a sensibilidade terapêutica dessas células à DEX. Coletivamente, esses achados identificam o β-sitosterol como uma molécula candidata natural potencial que pode contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a DPOC.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BEAS-2B human bronchial epithelial cells	SunnCell, China	SC-0218	Linha celular epitelial brônquica humana para estudo in vitro
C57BL/6 mice	Vital River Laboratories, China	213	Modelo animal para experimento in vivo de DPOC
CB-DOCK2	China	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	para simulação de acoplamento molecular entre ligante e proteína receptora
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Detecção de viabilidade e proliferação celular
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, USA	C10851	Detecção de senescência celular
Cigarettes	Hongta, China	Não fornecido	Cigarro usado para exposição à fumaça e preparação de CSE
CTD	USA	https://ctdbase.org/	para recuperar genes relacionados à DPOC
DCFH-DA fluorescent probe	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Detecção do nível de ROS intracelular
Dexamethasone (DEX)	Yeasen, China	40323ES03	Glucocorticóide para intervenção combinada
DMEM/F12 medium	Gibco, USA	11330032	Meio basal para cultura de células BEAS-2B
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10270106	Suplemento para meio de cultura celular
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Análise estatística de dados e desenho de gráficos
Isoflurane	RWD Life Science, China	R510-22-10	Anestésico inalado para eutanásia animal
Lipid Peroxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Detecção do conteúdo de malondialdeído (MDA) intracelular
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Reagente de transfecção para entrega de siRNA
Multimode microplate reader	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Detecção de valor de absorbância e fluorescência
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, USA	B80912	Análise de ROS e células senescências
Penicillin/streptomycin	HyClone, USA	SV30010	Antibióticos para prevenção de contaminação bacteriana
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Amplificação de PCR quantitativa fluorescente
PrimeScript™ RT reagent Kit	Takara, Japan	RR037Q	Transcrição reversa para síntese de cDNA
PubChem database	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	para adquirir a sequência SMILES canônico e baixar informações estruturais 3D SDF do beta-sitosterol
QuantStudio Dx PCR Instrument	Thermo Fisher, USA	4479889	Detecção de RT-qPCR em tempo real
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	para obter o arquivo de estrutura 3D do cristal GR
RNA/Protein Isolation Kit	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Extração total de RNA de célula e tecido pulmonar
si-GR	Designed in silico via siDirect 2.1	Síntese personalizada	Guide: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passageiro: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown para GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	usado como controle de transfecção negativo para ensaios celulares e in vivo
SwissTargetPrediction database	Switzerland	http://swisstargetprediction.ch/	para previsão in silico de potenciais alvos proteicos relacionados a medicamentos
TCMSP database	China	https://www.tcmsp-e.com/	para triagem de ingredientes herbais e previsão de alvos
TTD	Singapore	https://db.idrblab.net/ttd/	para coleta de genes de doenças associadas à DPOC validados
Whole-body smoke exposure chamber	Teague Enterprise, USA	TE-2	Estabelecimento do modelo de DPOC induzida por fumo de cigarro
β-sitosterol	ChemicalBook, China	83-46-5	Fitosteroide ativo para tratamento medicamentoso