Protocolos para Criação Eficiente e Análise Funcional da Vespa Endoparasitoide Asobara japonica e seu hospedeiro Drosophila melanogaster

Summary

O objetivo deste protocolo é facilitar a análise funcional das interações parasitoide–hospedeiro em Asobara japonica e Drosophila melanogaster. Por meio de métodos otimizados de criação, um ensaio de infecção com oviposição única e knockdown gênico mediado por RNAi.

Abstract

Parasitismo é uma interação biológica na qual um organismo explora o corpo ou os recursos de outro (o hospedeiro), resultando em danos substanciais ou morte ao hospedeiro. Entre os animais parasitas, as vespas parasitoides são uma das linhagens mais ricas em espécies, representando quase 20% de todas as espécies de insetos. Em particular, as vespas endoparasitoides ovipositam diretamente no corpo do hospedeiro e utilizam uma diversidade de fatores venenosos para manipular o desenvolvimento, imunidade e fisiologia do hospedeiro. Em resposta ao ataque de vespas, os hospedeiros tentam eliminar ovos parasitoides por meio de mecanismos imunes inatos. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares pelos quais os componentes individuais do veneno modulam a biologia do hospedeiro e promovem o parasitismo bem-sucedido permanecem pouco compreendidos. Aqui, descrevemos um protocolo laboratorial padronizado para a criação da vespa endoparasitoide Asobara japonica e de seu hospedeiro Drosophila melanogaster. Estão disponíveis cepas partenogenéticas e sexuais de A. japonica, e a cepa partenogenética apresenta alta taxa de sucesso no parasitismo, permitindo a manutenção estável dos estoques laboratoriais para análise genômica e ensaios de parasitismo. Um ensaio de infecção por oviposição simples e um método de knockdown gênico baseado em RNA de fita dupla foram otimizados para análise funcional de genes de veneno. Juntos, esses protocolos fornecem uma estrutura experimental prática para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes às interações parasitoide-hospedeiro e facilitarão pesquisas futuras em biologia do desenvolvimento, imunologia e fisiologia.

Introduction

Parasitismo é um estilo de vida no qual um organismo explora os recursos nutricionais de outro e é amplamente distribuído entre táxons. Estima-se que até metade de todos os organismos conhecidos exibam parasitismo em seu ciclo^{de vida 1}. Entre os parasitas, as vespas parasitoides são um grupo particularmente diverso, representando aproximadamente 20% de todos os^{insetos 2}. Eles exploram uma ampla variedade de hospedeiros artrópodes, como insetos, aranhas e ácaros, e exibem notável diversidade em suas histórias de vida e estratégias^{parasitárias 3}. Essas características fazem das vespas parasitoides um dos grupos de insetos mais bem-sucedidos evolutiva e ecologicamente.

Interações entre parasitoides e seus hospedeiros foram amplamente estudadas como sistemas-modelo de "corridas armamentistas" evolutivas. Em particular, vespas endoparasitoides utilizam uma variedade diversa de fatores, incluindo venenos, vírus simbióticos e teratocitos ^4,5. Esses fatores manipulam a fisiologia e o desenvolvimento do hospedeiro, garantindo assim o desenvolvimento bem-sucedido dentro do hospedeiro. Apesar desses avanços, os mecanismos moleculares subjacentes ao parasitismo permanecem pouco compreendidos na maioria das espécies parasitoides. Uma das principais limitações é o pequeno tamanho corporal deles, que dificultou a identificação bioquímica dos componentes do veneno. Além disso, é tecnicamente desafiador manter parasitoides e seus hospedeiros com estágios de desenvolvimento sincronizados sob condições laboratoriais.

Avanços recentes em sequenciamento de próxima geração e outras tecnologias de mics agora possibilitam análises genômicas em todo o genoma, mesmo em espécies parasitoides muito pequenas. Essas abordagens abriram novas vias para investigar mecanismos moleculares antes inacessíveis, permitindo que as interações parasitoide e hospedeiro sejam estudadas com resolução sem precedentes. Nesse contexto, nosso laboratório foca em Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), uma espécie originalmente identificada no^{Japão 6,7,8}. A. japonica inclui uma cepa partenogenética thelytokous, na qual as fêmeas produzem descendentes sem acasalamento. Esse recurso nos permite coletar quantidades substanciais de DNA genômico geneticamente uniforme para sequenciamento do genoma^{inteiro 9}. Além disso, essa espécie parasita uma ampla gama de espécies de Drosophila, incluindo o organismo-modelo D. melanogaster,  que oferece grandes vantagens experimentais devido às suas condições de criação bem estabelecidas e estágios de desenvolvimento precisamente definidos, permitindo ensaios de infecção reprodutíveis e controle preciso do desenvolvimento^{parasitoide 10}.

Durante o parasitismo de A. japonica, uma vespa fêmea injeta veneno junto com um único ovo em uma larva de mosca, dentro da qual uma larva de vespa cresce junto com seu hospedeiro. Notavelmente, A. japonica apresenta alta taxa de sucesso de parasitismo no hospedeiro D. melanogaster, tornando esse par parasitoide-hospedeiro um modelo experimental poderoso. Aqui, descrevemos protocolos para criação estável, um ensaio de infecção por ovoposição simples e um método de knockdown gênico baseado em RNA dupla fita (dsRNA) em A. japonica. Esses protocolos fornecem uma estrutura confiável para dissecar mecanismos moleculares subjacentes às interações parasitoide-hospedeiro.

Protocol

Uma visão geral esquemática do método de criação sincronizada para D. melanogaster e A. japonica é apresentada na Figura 1.

1. Criação da mosca-das-frutas hospedeira Drosophila melanogaster em laboratório

1. Mantenha todos os animais experimentais em 25 °C e umidade relativa de 50-60% sob um ciclo de 12:12 horas de luz/escuro. Use a cepa selvagem Oregon-R (OR) como hospedeira para A. japonica (Figura 2A).
2. Transfira as moscas adultas para um novo frasco alimentar contendo meio padrão de farinha de milho, fermentação e ágar (0,55% de ágar, Tabela 1). Rotule o frasco com a data de transferência e o nome da cepa "OR".
3. Elimine essas moscas adultas um dia após a transferência para evitar um número excessivo de ovos na comida. Certifique-se de que as larvas da prole estejam se alimentando na superfície do alimento.
   NOTA: Como orientação, mantenha aproximadamente 200-250 ovos por frasco de alimento (φ30×100 mm). Densidades maiores de ovos podem reduzir o sucesso do parasitismo e aumentar a variação no desenvolvimento do hospedeiro e da vespa.
4. Quatro dias após o Passo 1.2, transfira uma colher de larvas de mosca (4 dias após a postura dos ovos, dAEL) para um novo frasco de alimento. Mantenha essas larvas sem exposição a parasitoides pela próxima geração. Esse procedimento também ajuda a controlar a densidade larval do hospedeiro em um frasco.

2. Criação da vespa endoparasitoide Asobara japonica em laboratório

1. Use uma cepa partenogenética Tokyo (TK) e uma cepa sexual Iriomote-jima (IR) (Figura 2B). A primeira é composta por fêmeas, enquanto a segunda é composta por fêmeas e machos. Os machos nascem dois a quatro dias antes do que as fêmeas. Portanto, confirme a presença das fêmeas por meio de seus ovipositores antes da transferência.
2. Transfira de 10 a 20 vespas adultas diretamente do frasco de estoque para o frasco contendo larvas de mosca a 4 dAEL. Rotule o frasco com a data de transferência e o nome da cepa "TK" ou "IR". Mantenha as vespas nas mesmas condições do Passo 1.1.
3. Permita que vespas adultas oviponham nas larvas de mosca. Elimine essas vespas um a dois dias depois para evitar superparasitismo, que pode levar à morte do hospedeiro. Remova moscas adultas eclosionadas que escaparam do parasitismo 10 ou mais dias após o Passo 2.2.
4. Duas semanas após o Passo 2.2, as vespas adultas começam a se fechar do caso pupal da mosca hospedeira. Transfira essas vespas adultas recém-fechadas para um novo frasco com papel filtrante contendo 25% de glicose e 50 mM de solução de vitamina C. Os pedaços de papel de filtro devem ser esterilizados a 130 °C por 2 horas. Fornecer a solução em papel de filtro promove comportamentos de oviposição e prolonga a vida das vespas adultas. Nossa abordagem para usar vitamina C para melhorar a oviposição foi inspirada por observações de estudos com Drosophila ¹¹.

3. Ensaio de Infecção por Oviposição Única

1. Sincronize o estágio de desenvolvimento das larvas de mosca usadas no experimento de infecção.
   1. Coloque as moscas adultas em um tubo de 50 mL contendo uma placa de ágar com suco de uva (ágar a 3%) espalhada com pasta fresca de levedura e deixe-as depositar ovos por 24 horas.
   2. Reúna as larvas recém-eclodidas do primeiro estágio na placa de ágar de suco de uva e transfira-as para um pequeno frasco (12 mL) contendo 2-3 g de pasta alimentar para moscas (comida para moscas misturada com a quantidade adequada de água). 20 a 30 larvas são colocadas no frasco. As larvas de mosca são deixadas crescer a 25 °C.
2. No momento apropriado, prepare uma placa de Petri de 4 cm contendo uma camada fina e uniformemente distribuída de pasta alimentar para moscas, cobrindo uma área de aproximadamente 1,5-2,0 cm de diâmetro (doravante chamada de arena de ensaio de infecção). Além da arena do ensaio de infecção, prepare um novo frasco pequeno (12 mL) contendo a quantidade adequada de pasta alimentar para moscas. Este frasco é usado para criar as larvas hospedeiras após o ensaio de infecção.
3. Colete larvas em fases e transfira-as para um recipiente contendo água desionizada (resistividade = 15 MΩ·cm, 25 °C). Enxágue as larvas no recipiente com uma agitação suave para remover o alimento residual do corpo.
4. Após o enxágue, remova suavemente o excesso de umidade das larvas usando lenços de papel sem fiapos, pois o excesso de água interfere no comportamento de oviposição da vespa na área do ensaio de infecção. Depois, transfira as larvas para a arena. Essa etapa aumenta a atividade larvaria durante o experimento de infecção.
5. Anestesiar vespas adultas com gás CO₂ a uma vazão de 5 L·^min-1 e pressão de 0,2 MPa. Em seguida, coloque delicadamente aproximadamente três vespas fêmeas na área de ensaio de infecção. Feche a tampa do prato e deixe que eles se recuperem na pasta alimentar para moscas.
6. Observe o comportamento de oviposição dessas vespas sob um estereoscópio (ajuste de zoom: 10× a 15×).
   NOTA: Quando uma vespa toca o corpo larval de uma mosca em movimento, ela rapidamente insere seu ovipositor no corpo da mosca e injeta componentes do veneno. Embora a larva de mosca se contorça e agite o corpo, ela imediatamente fica paralisada. Subsequentemente, a vespa vibra seu abdômen e deposita um ovo no corpo larval hospedeiro, após o que o ovipositor é retirado. Esse comportamento de oviposição é chamado de infecção.
7. Após a infecção, abra a tampa e transfira a larva infectada para o novo pequeno frasco contendo pasta alimentar preparada no Passo 3.2. Para padronizar o momento da infecção, realize o experimento de infecção em até 15 minutos.
8. Rotule o pequeno frasco com informações experimentais, como data, nome da amostra, tempo de infecção e número de indivíduos. Esses frascos são tapados e depois colocados em um recipiente úmido e mantidos a 25 °C.

4. Geração de vespas de interferência de RNA (RNAi) por injeção de dsRNA

1. Sintetize dsRNAs de 400 bp ou mais para knockdown gênico mediado por dsRNA (interferência de RNA, RNAi) usando um sistema de síntese de dsRNA baseado em transcrição in vitro . As amostras de dsRNA devem ser mantidas entre -20 e -80 °C até o uso. Os protocolos detalhados são os descritos anteriormente⁹.
2. Prepare uma placa de Petri de 5,5 cm contendo 2% de ágar para posicionar corpos de vespas. Preencha dois terços de cada recipiente com ágar para criar uma camada espessa de placa de ágar para injeção.
3. Coloque um lenço de papel sem fiapos umedecido com água sobre a tampa de uma panela plástica.
4. Recolha as pupas da mosca hospedeira 7 dias após a infecção (dpi) do frasco e coloque-as sobre os lenços de papel sem fiapos preparados no Passo 4.3. Adicionar uma gota de água à parede do frasco ajuda a desprender as cápsulas das pupas da mosca do hospedeiro do frasco.
5. Sob o estereomicroscópio (ajuste de zoom: 20×), remova a pupa da mosca hospedeira e exponha o corpo da vespa com pinças. A 7 dpi, a maioria das vespas está no estágio pupal, no qual as partes da cabeça, tórax e abdômen são distinguíveis. O corpo de uma vespa é imóvel.
6. Coloque os corpos das vespas recuperadas sobre a placa de ágar preparada no Passo 4.2, alinhando seus eixos corporais na mesma orientação. Organize 20-30 corpos de vespas com o lado dorsal para cima em uma a duas linhas. Remova o excesso de umidade da placa de ágar usando um lenço de papel sem fiapos para evitar que as vespas escorreguem.
7. Seguindo as instruções do fabricante, instale o aparelho de injeção e o estereoscópio (Figura 3A). Use um sistema de microinjeção equipado com uma agulha capilar de vidro que permite controle preciso do volume e da velocidade da injeção. Coloque a placa de ágar em que as cabeças da vespa estejam orientadas em direção à ponta da agulha de injeção. O volume de injeção é de 50 nL·^wasp-1 e a velocidade de injeção é de 50 nL·^seg-1 no injetor.
8. Prepare agulhas capilares de vidro usando um puxador de agulhas. A forma do capilar de vidro é ajustável com a temperatura do aquecedor.
9. Coloque a agulha capilar de vidro sobre o moedor de agulhas em um ângulo de 30-35°. Moa a agulha até que o comprimento da ponta atinja 0,04 mm (quatro divisões na retícula ocular, Figura 3B).
10. Pouco antes da injeção, descongele o dsRNA. A concentração de dsRNA é de 0,25-1 μg·^μL-1. Para visualização, a solução de dsRNA é colorida com um corante azul (sal diassódico Erioglaucina, 2% peso·^volume-1). Usando uma ponta de microloader pipeta, preencha o capilar de vidro com solução de dsRNA com corante azul. 4 μL são suficientes para injetar 30 corpos de vespas. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro da solução.
    NOTA: Após carregar a solução de dsRNA, toque suavemente a lateral da agulha com uma unha para remover quaisquer bolhas de ar presas. Bolhas residuais de ar podem obstruir o fluxo da solução e interferir na injeção bem-sucedida.
11. Usando uma seringa de 1 mL e uma agulha, preencha a parte livre do capilar de vidro com óleo mineral, garantindo que não restem bolhas de ar dentro do capilar.
12. Prenda a agulha capilar de vidro contendo a solução de dsRNA e óleo mineral no suporte da agulha e depois a fixe no dispositivo de injeção.
13. Ajuste a posição da placa de ágar e da agulha capilar de vidro no injetor, de modo que a agulha de vidro fique posicionada em um ângulo de 30-45° em relação aos corpos das vespas (Figura 3A).
14. Insira a agulha capilar de vidro no lado dorsal do corpo da vespa, com o lado levemente lateral em relação à linha média dorsal. Microinjete a solução de dsRNA dentro do corpo. A solução de dsRNA injetada é visível com o corante  azul (Figura 3C).
15. Após a injeção, coloque as placas de ágar em um recipiente úmido (70-80% de umidade relativa) e mantenha-as em uma incubadora a 25 °C por uma semana, até que as vespas adultas nascam. Corpos de vespas feridas devem ser removidos da placa de ágar para evitar contaminação bacteriana.
    PONTO DE PAUSA: No Passo 4.6, as pupas da vespa podem ser mantidas na placa de ágar por várias horas antes da injeção. Agulhas podem ser preparadas com antecedência (Passos 4.8 e 4.9); porém, eles tendem a entupir com o tempo. Agulhas recém-preparadas geralmente proporcionam um desempenho de injeção mais confiável.

Results

As linhagens assexuadas e sexuais de Asobara japonica
A. japonica está amplamente distribuída por todo o Japão. Cepas partenogenéticas Thelytokous predominam nas ilhas principais, enquanto cepas sexuais arrhenotokous são encontradas nas ilhas subtropicais, incluindo as ilhas Amami-Oshima e Iriomote-jima ^8,12. Nas linhagens sexuais, os machos emergem alguns dias antes que as fêmeas, de modo que o momento da transferência dos adultos é distinto entre essas linhagens. A partenogênese de Thelytokous em A. japonica é induzida pela infecção com Wolbachia, uma bactéria endossimbiótica^{transmitida maternamente 13}. A eliminação de Wolbachia por tratamento antibiótico resulta na produção de machos ^9,14, e o transplante de Wolbachia em cepas sexuais induz partenogênese¹⁵. Tanto as linhagens assexuadas quanto as sexuais de A. japonica apresentam alto sucesso com parasitismo em múltiplas espécies de Drosophila. Por exemplo, podem parasitar D. suzukii, uma praga de frutas economicamente importante, e são considerados potenciais agentes de controle biológico na^{agricultura 16}. Entre as cepas disponíveis, usamos principalmente a cepa TK infectada por Wolbachia em nossos experimentos. A cepa TK apresenta maior atividade parasitária em larvas hospedeiras em comparação com a cepa^{IR 14}, tornando-a adequada para análises.

O sucesso do parasitismo depende das condições de criação
A taxa de sucesso do parasitismo de A. japonica é geralmente alta, mas é fortemente afetada pela condição de criação das moscas hospedeiras. Em condições pobres em nutrientes, o período de crescimento das larvas de mosca é prolongado e o momento da pupariação é^{atrasado 17}. Nessas condições, as vespas podem falhar em utilizar adequadamente os recursos do hospedeiro e em não sincronizar seu desenvolvimento com o dos hospedeiros. Para examinar essa possibilidade, criamos moscas e vespas sob condições normais de levedura (1×) e pobre levedura (0,1×). Em seguida, avaliamos o sucesso do parasitismo e o momento do desenvolvimento (Figuras 2C, 2D). O sucesso do parasitismo foi calculado como a proporção de vespas adultas emergidas para larvas hospedeiras.

Em condições normais de levedura, a taxa de sucesso do parasitismo foi de 81,7% no ensaio de infecção por oviposição única (Figura 2C, à esquerda; Tabela 2). Quando o teor de levedura foi reduzido para 10% (condição pobre em leveduras), a taxa de sucesso do parasitismo diminuiu para 35,0% (Figura 2C, à direita; Tabela 2). Essa redução pode ser explicada pelo fato de que aproximadamente 50% das larvas hospedeiras morreram após infecção. Esses resultados sugerem que a alocação de recursos entre hospedeiro e parasitoide é interrompida em condições pobres em nutrientes.

Notavelmente, o momento da eclosão da vespa não foi atrasado na mesma medida em condições pobres em leveduras quanto em condições normais de levedura. Enquanto o momento da eclosão das moscas foi atrasado em até 9 dias, o momento da eclosão da vespa foi adiado apenas em 4-5 dias. Esse resultado sugere que a disponibilidade de nutrientes afeta principalmente o desenvolvimento do hospedeiro. O momento da eclosão é consistente tanto em moscas quanto em vespas sob condições normais de levedura, mas não em condições pobres em leveduras, sugerindo que o desenvolvimento sincronizado entre parasitoides e hospedeiros depende da disponibilidade de nutrientes.

Abordagem baseada em RNAi para análise funcional de genes de veneno
Embora análises transcriptômicas e proteômicas da glândula venenosa identifiquem numerosas moléculas candidatas, ainda não está claro quais delas são necessárias para o sucesso do parasitismo. Para determinar os papéis fisiológicos dessas moléculas candidatas, são necessárias análises funcionais in vivo usando abordagens de knockdown gênico.

Recentemente, relatamos que o parasitismo de A. japonica induz apoptose, autofagia e parada mitótica nos discos imaginários das larvas de D. melanogaster , resultando em degradação severa do tecido, um fenômeno denominado degradação imaginal do disco (IDD⁾¹⁰. Para identificar as moléculas responsáveis pela IDD, realizamos uma triagem de RNAi dos genes candidatos identificados a partir de análises transcriptômicas, proteômicas e genômicas comparativas. Como resultado, dois genes, fator de degradação do disco imaginal (IDDF)-1 e IDDF-2 , foram identificados. Tanto IDDF-1 quanto IDDF-2 contêm o Domínio da Função Desconhecida 4803 (DUF4803). Notavelmente, após nosso relatório inicial, um estudo independente identificou múltiplas proteínas venenosas de A. japonica (denominadas Degradação Induzida por Veneno, VID) associadas à IDD, todas as quais também possuem o domínio^{DUF4803 18}.

Com base nesses resultados, otimizamos ainda mais o protocolo RNAi para melhorar a reprodutibilidade e a eficiência. Em particular, o uso do Nanoject III permitiu controle preciso do volume e da velocidade da injeção, resultando em resultados de knockdown mais consistentes.

Para avaliar a eficiência do protocolo otimizado de RNAi, realizamos o knockdown do IDDF-1. Em vespas adultas eclosas, o nível de expressão de IDDF-1 foi significativamente reduzido em comparação com o controle (Figura 3D). Para validação funcional, realizamos ensaios de infecção por oviposição única usando essas vespas RNAi e larvas de moscas hospedeiras expressando o repórter de apoptose GC3Ai na região¹⁹ da bolsa da asa. Um sinal GC3Ai foi detectado na bolsa da asa após a infecção com as vespas de controle (RNAi GFP ). Em contraste, o sinal GC3Ai foi significativamente reduzido após a infecção com vespas de RNAi IDDF-1 (Figura 3E, 3F). Esses resultados são consistentes com achados anteriores, confirmando que a função do IDDF-1 é efetivamente suprimida pelo RNAi.

Figura 1. Visão geral esquemática dos procedimentos de criação de D. melanogaster e A. japonica. 
Procedimentos por etapas são apresentados de acordo com os estágios de desenvolvimento de D. melanogaster. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Parasitismo por Asobara japonica. (A) Esquema da relação de desenvolvimento entre D. melanogaster e seu parasitoide A. japonica. Uma vespa fêmea deposita venenos e um único ovo em uma larva de mosca. Após a eclosão, a larva da vespa se desenvolve em paralelo à larva hospedeira, que posteriormente se puparia. Após a pupariação, a vespa consome todo o corpo da mosca e eventualmente se eclode do caso pupal da mosca. (B) Vespas adultas da cepa assexuada (esquerda) e da cepa sexual (direita) de A. japonica. Barra de escamas, 1 mm. (C) Taxa de emergência de moscas ou vespas em condições normais (1×) e pobres em leveduras (0,1×). Ensaios de infecção com ovoposição única foram realizados usando larvas de mosca hospedeira 4 dias após a postura de ovos (dAEL). n = 267 (1×, moscas), 120 (0,1×, moscas), 85 (1×, vespas) e 80 (0,1×, vespas), respectivamente. (D) Momento de eclosão de moscas e vespas sob as duas condições nutricionais mostradas em (C). A proporção de adultos para pupas é indicada. n = 250, 107, 61 e 41, respectivamente. A seta preta indica o momento da infecção por vespas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Procedimento otimizado de RNAi usando Nanoject III. (A) Montagem do aparelho de microinjeção sob um estereomicroscópio. A agulha capilar de vidro foi posicionada em um ângulo de 30-45° em relação à placa de ágar. (B) A ponta da agulha capilar de vidro era afiada usando uma moedora de agulhas. (C) Uma solução tingida de azul era microinjetada no corpo de uma vespa usando uma agulha capilar de vidro. O lado anterior da vespa é indicado por A na imagem. P, posterior. Barra de escala, 1 mm. (D) Os níveis de expressão de IDDF-1 em vespas de RNAi GFP e RNAi IDDF-1 foram quantificados usando o método delta-delta C_t . Os níveis de expressão foram normalizados para RpL32-Aj. Os dados representam a média ± DS com pontos individuais (n = 5). P < 0,005 (teste t do aluno). (E e F) Sinais GC3Ai nos discos das asas de larvas não infectadas e larvas hospedeiras 6 horas após a infecção (hpi) após a infecção com controle (RNAi GFP )  ou vespas RNAi IDDF-1 . Os discos das asas são contornados com linhas pontilhadas brancas baseadas na coloração DAPI dos núcleos (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). A razão entre a área positiva do GC3Ai e a área da bolsa da asa foi quantificada. P < 0,005 (ANOVA unidirecional seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey). n = 11 réplicas biológicas por grupo. Barra de escala, 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componentes	Valor
Água	1 L
Agar	5,5 g
Levedura	40 g
Farinha de milho	90 g
Glicose	100 g
Ácido propiônico	3 mL
10% de butil p-hidroxibenzoato em 70% de EtOH	3,5 mL

Tabela 1: Componentes do meio padrão de farinha de milho, fermento-ágar (alimento para moscas).

Tipo alimentar	Condição	# de indivíduos totais	# de indivíduos eclosos ou mortos				Taxa de emergência de moscas ou vespas (%)
			Voar	Wasp	Letal pupal	Larvas letais
1×	Não infectados	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica infectada	120	0	98	9	13	81.66666667
0,1×	Não infectados	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica infectada	80	0	28	13	39	35

Tabela 2: Número de indivíduos e taxas de emergência em condições normais (1x) e pobres em leveduras (0,1x).

Nome de base	Sequência (1,75m>1,90m)	Propósito
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	Clonagem de CDS
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTCGGCAAATT	Clonagem de CDS, template de dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Template de dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTCCCGGCAAATT	Template de dsRNA
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTTTAG	Template de dsRNA
※ Esses primers e moldes de dsRNA são relatados em Kamiyama et al. 2022.
※ gene007424 significa IDDF-1.

Tabela 3: Sequências de primers e modelos de dsRNA usados neste estudo.

Discussion

Neste estudo, estabelecemos uma plataforma experimental versátil para investigar as interações parasitoides-hospedeiros em nível molecular. Ao otimizar as condições de criação, um ensaio de infecção por oviposição única e o protocolo RNAi, fornecemos um sistema robusto para estudos funcionais de fatores derivados de parasitoides. Esta plataforma facilitará estudos futuros voltados a descobrir os mecanismos pelos quais vespas parasitoides manipulam o desenvolvimento do hospedeiro e também pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias biológicas de controle de pragas.

A cepa TK infectada por Wolbachia de A. japonica fornece um sistema experimental altamente reprodutível para análise de parasitismo. Em muitos estudos parasitoides-hospedeiro, os resultados experimentais são frequentemente variáveis, com a sobrevivência do hospedeiro e o sucesso parasitoide dependendo sensível das condições ambientais e fisiológicas. Em contraste, a cepa TK apresenta consistentemente alto sucesso parasitista, criando efetivamente uma condição "dominante parasitoide" na qual o desfecho da infecção é amplamente uniforme. Além disso, como uma cepa partenogenética, reduz a variação experimental entre indivíduos devido ao seu fundo genético uniforme. Essa reprodutibilidade permite um rastreamento confiável do processo de parasitismo e facilita análises quantitativas das respostas do hospedeiro e fatores derivados de parasitoides.

Além disso, a reprodução do thelytokous facilita muito as análises genômicas ao permitir a geração de DNA genômico altamente homogêneo, o que é fundamental para a montagem genômica^{de alta qualidade 9}. Embora tais cepas partenogenéticas não estejam disponíveis em todas as espécies parasitoides, nossos resultados destacam o potencial do thelytoky induzido por Wolbachia como estratégia para melhorar os recursos genômicos. Estabelecer linhagens infectadas por Wolbachia em outras espécies parasitoides pode, portanto, ser uma abordagem poderosa para expandir os recursos genômicos e acelerar estudos moleculares comparativos entre parasitoides.

Os resultados do parasitismo são fortemente influenciados pelas condições nutricionais do hospedeiro, indicando que as condições de criação são um fator crítico para o sucesso dos parasitoides. Como o sucesso do parasitismo depende da coordenação temporal precisa com o desenvolvimento do hospedeiro e da vespa, condições nutricionais descontroladas provavelmente interrompem esse processo e reduzem a reprodutibilidade. Portanto, uma padronização cuidadosa das condições de criação do hospedeiro é essencial para estabelecer um sistema experimental confiável para estudar as interações parasitoides-hospedeiros. Além disso, os frascos do estoque de moscas devem ser mantidos separados dos frascos de vespas, pois a presença de vespas reduz os comportamentos de oviposição^{das moscas 20,21}.

Para possibilitar a avaliação quantitativa das interações parasitoide-hospedeiro, elaboramos um ensaio de infecção por oviposição única, no qual um único ovo é depositado em cada hospedeiro. Este ensaio contrasta com os ensaios convencionais de infecção em massa, que frequentemente envolvem múltiplos eventos de oviposição que levam a danos excessivos ao hospedeiro e mortalidade. Para promover a oviposição eficiente dentro de uma janela de tempo limitada (~15 min.), adultos de vespas recém-fechadas foram pré-condicionados com uma solução de glicose e vitamina C, melhorando assim a eficiência da oviposição e a reprodutibilidade geral.

Além disso, otimizamos o protocolo RNAi para análise da função gênica em vespas parasitoides. Ao usar o sistema de microinjeção, alcançamos controle preciso do volume de injeção e melhoramos a consistência da eficiência do knockdown. A validação funcional usando IDDF-1 confirmou que esse método suprime efetivamente a expressão gênica e produz resultados fenotípicos reprodutíveis. Considerando que estudos transcriptômicos e proteômicos continuam a identificar grandes números de fatores venenosos candidatos, a disponibilidade de uma plataforma funcional de triagem será essencial para determinar seus papéis biológicos.

Uma limitação desse protocolo de RNAi é que ele não é adequado para analisar genes que funcionam nos estágios iniciais do desenvolvimento das vespas, pois é tecnicamente desafiador injetar dsRNA em ovos de vespas presentes dentro dos corpos hospedeiros. Para superar isso, estabelecer um sistema de criação ex vivo pode fornecer uma abordagem^{útil 22.} Alternativamente, abordagens de nocaute gênico usando Direct Parent (DIPA)-CRISPR podem fornecer uma estratégia complementar, na qual reagentes são injetados em fêmeas adultas para gerar descendentes editados pelo^{genoma 23}. De fato, essa abordagem conseguiu gerar indivíduos de nocaute gênico no ectoparasitoide pupal Nasonia vitripennis, injetando reagentes em fêmeas adultas ou indivíduos no estágio^{pupal tardio 24}. Juntamente com nosso método de knockdown gênico baseado em RNAi, essas abordagens facilitarão análises mais abrangentes das funções gênicas envolvidas no processo de parasitismo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Infection assay
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	dsRNA injection
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Rearing
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infection assay
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA injection
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA injection
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Rearing
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infection assay
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Image analysis
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Rearing
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Nuclei staining, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infection assay
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	dsRNA injection
Fiji	NA	https://fiji.sc	Image analysis
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Rearing
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Rearing
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Rearing
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Dissection
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Sample storage
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Sample storage
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infection assay
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	Rearing
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA synthesis
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Rearing
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA synthesis
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	dsRNA injection
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA injection
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA injection
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA injection
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	dsRNA synthesis
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Rearing
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infection assay, dsRNA injection.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infection assay
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infection assay
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Rearing
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA injection
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infection assay
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA injection
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA synthesis
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA synthesis, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Rearing
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infection assay
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Rearing