Preservando a Complexidade Tecidual In Vivo em um Modelo do Sistema Nervoso Olfatório de Camundongos Utilizando Análise em Montagem Inteira para o Estudo da Regeneração Neural

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho completo para preservar a complexidade anatômica do sistema nervoso olfativo do camundongo. Aqui detalhamos todo o fluxo de trabalho, incluindo dissecação, preparação do tecido e obtenção de imagens. Este protocolo pode ser utilizado para estudar o sistema olfativo em condições normais ou anormais, incluindo suas condições naturais de reparação.

Resumo

Na era da imagem tridimensional (3D), a imuno-histoquímica convencional tem sido reconhecida como altamente limitada em estudos de patologia e anatomia humana complexa. Ao analisar apenas cortes finos, estruturas maiores e aspectos essenciais da arquitetura tecidual podem perder detalhes contextuais críticos, levando a interpretações incompletas ou enganosas. Embora seções bidimensionais (2D) tenham contribuído para uma compreensão básica da histoarquitetura, elas são insuficientes para capturar a realidade verdadeiramente tridimensional dos tecidos biológicos.

Um número crescente de estudos em múltiplas regiões anatômicas agora adota técnicas que isolam unidades anatômicas intactas — preparações em montagem plana, montagem inteira ou em face — combinadas com microscopia fluorescente de alta resolução. Essas abordagens oferecem uma visualização e interpretação mais abrangentes da organização estrutural. Isso é particularmente significativo no sistema nervoso olfativo, onde definir os mecanismos celulares complexos subjacentes à sua notável capacidade regenerativa exige um contexto de espessura total. Cortes finos correm o risco de omitir características fisiopatológicas fundamentais que permanecem pouco definidas.

Diante dessas limitações e da lacuna de conhecimento sobre as interações celulares que impulsionam a regeneração olfativa, o desenvolvimento de uma técnica refinada de montagem inteira, capaz de preservar a complexidade tecidual em toda a espessura, foi essencial. Mucosas olfativas inteiras foram isoladas como amostras de espessura total, acompanhadas por um protocolo otimizado de penetração de anticorpos. A imagem de alta resolução (EVIDENT SpinSR) e a reconstrução tridimensional permitiram a visualização precisa das interações celulares in vivo.

Introdução

O sistema nervoso olfativo (SNO) representa um modelo único e bem estabelecido para o estudo dos mecanismos de regeneração neural, pois mantém a capacidade exclusiva de renovação neuronal ao longo da vida¹. No entanto, o potencial para a translação clínica dessa capacidade neuro-reparadora permanece limitado devido a lacunas significativas em nosso entendimento sobre o comportamento das células no sistema olfativo^2,3,4. As respostas celulares e a organização anatômica do SNO, incluindo neurônios olfativos primários, células envoltórias olfativas (CEO) e fibroblastos perineurais, foram descritas em diversos estudos com animais, baseados em cortes teciduais ultrafinos (<2 µm) combinados com modelos de lesão física grave aplicados ao SNO de roedores^1,2. Os animais nesses estudos geralmente eram sacrificados 10 dias após a lesão, fornecendo uma janela estreita sobre apenas um momento específico da remodelação extensa e mais complexa desse tecido durante a lesão neural². Esses estudos relataram que, após a morte axonal, as CEO e os fibroblastos persistiriam como canais contínuos ao longo do local da lesão.

Embora informativo, devido às muitas limitações explicadas acima, a abordagem utilizada forneceu uma visão conceitual de baixa resolução em um nível superficial do ONS, impedindo, em última instância, uma avaliação abrangente da organização celular real dentro do ONS intacto³. Como resultado, relações espaciais críticas podem ter sido negligenciadas.

A preservação da estrutura tecidual tridimensional é essencial para análises anatômicas e celulares precisas e tem sido aplicada com sucesso em múltiplos órgãos e patologias^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Abordagens em preparações inteiras têm sido utilizadas para mapear a organização neural na mucosa olfatória^13,14, entretanto, a visualização das interações celulares com uma estrutura completa de ONS, incluindo uma lâmina própria preservada, ainda não foi realizada.

Neste estudo, estabelecemos um fluxo de trabalho utilizando um modelo murino com processamento de tecido em montagem inteira, imunomarcação, imagem de alta resolução e reconstrução tridimensional, permitindo a análise detalhada da arquitetura do SNO. Este protocolo foi desenvolvido para preencher uma lacuna nos métodos publicados existentes, conservando e preservando a mucosa olfatória com espessura total, incluindo a lâmina própria, possibilitando o estudo das interações intercelulares. Notavelmente, esta metodologia aprimorada de coleta e processamento de tecido pode ser aplicada e combinada com diversos modelos do sistema olfativo.

Protocolo

Todos os experimentos que envolviam animais e células modificadas transgênicamente foram conduzidos com a aprovação do Comitê de Biossegurança da Griffith University (NLRD/003/2020_var3) e do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Griffith University (MHIQ/04/23/AEC), de acordo com as diretrizes do órgão regulador do Escritório de Tecnologia Genética da Commonwealth Australiana (OGTR).

OBSERVAÇÃO: Um total de 15 camundongos adultos de laboratório (8–9 semanas) de ambos os sexos foi utilizado no estudo. Especificamente, camundongos transgênicos S100β-DsRed, nos quais todas as CEPs expressam a proteína vermelha brilhante DsRed sob controle do promotor S100β. A proteína S100β faz parte de uma família maior de proteínas ligadoras de cálcio e é comumente expressa em células gliais do sistema nervoso central, como as CEPs. Esse modelo foi ideal para os objetivos desses experimentos, pois permitiu a localização fácil das populações celulares-alvo utilizando sinais de fluorescência endógenos. Os camundongos transgênicos S100β-DsRed foram previamente gerados, e demonstrou-se que o uso desses camundongos transgênicos proporciona detecção aprimorada das CEPs em comparação com a imunohistoquímica para análises de tecidos fixados^15,16,17,18.

1. Coleta de cabeças e fixação do tecido

1. Eutanasiar os animais com inalação crescente de CO₂ nos pontos temporais experimentais.
2. Garantir que a morte seja confirmada pela ausência dos reflexos corneano e de retirada dos membros, seguida por dislocação cervical, ou conforme o POP aprovado.
3. Remover toda a cabeça e as mandíbulas com tesoura.
4. Remover a pele do crânio e remover a cartilagem da ponta do nariz para expor a cavidade nasal e garantir a penetração eficiente do agente fixador.
   NOTA: Observou-se que esta etapa de cortar a parte mais frontal da cartilagem nasal do animal é crucial para permitir a fixação adequada do tecido dentro da cavidade nasal.
5. Lavar rapidamente as cabeças em PBS 1× para remover o excesso de sangue.
6. Fixar o tecido por imersão durante a noite (12–18 h) em paraformaldeído a 4%, por pelo menos 6 h (tempo suficiente para fixar o tecido de interesse) a 4 °C em rolo.
   CAUTELA: O paraformaldeído é um produto químico perigoso que libera vapores de formaldeído. É tóxico por inalação, contato com a pele e ingestão; causa irritação nos olhos, pele e vias respiratórias; e é suspeito de ser carcinogênico. Manipular apenas em capela de exaustão, utilizando EPI apropriado, incluindo luvas, jaleco laboratorial e proteção ocular. A eliminação segura de produtos químicos perigosos e resíduos biológicos gerados durante o protocolo deve ser realizada de acordo com as regulamentações institucionais e locais.
   ​NOTA: Durante as otimizações, observamos que 6 h foram suficientes para fixar o tecido de interesse; no entanto, mais de 12 h provavelmente causaria superfixação e degradação das estruturas mucosas.
7. Retirar as cabeças do agente fixador e lavá-las por 3 h em PBS 1× à temperatura ambiente (20–25 °C) em rolo.
8. Armazenar as cabeças em PBS fresco a 4 °C e coletar o tecido mucoso em preparação inteira dentro de 48 h

2. Coleta de tecido em montagem inteira

1. Realize o isolamento do tecido sob um microscópio.
2. Corte as cabeças ao meio usando um bisturi, seguindo a linha média sagital.
3. Expor o interior da cavidade nasalFigura 1). Identifique as regiões anatômicas e colete o tecido mucoso que reveste toda a seção anatômica (Figura 1B).
4. Usando um cortador de osso, quebre e remova suavemente o osso septal que recobre parte da cavidade mucosa.
   OBSERVAÇÃO: Veja Figura 2A; Esta etapa é crucial para expor a cavidade côncava sob o osso, onde os feixes de axônios atravessam a parede dorsal (Figura 1B).
5. Uma vez exposta esta área, use pinça curva para remover suavemente e retirar o tecido da parede dorsal côncava. Levante o tecido do osso subjacente e desprenda cuidadosamente a mucosa olfatória remanescente para coletar a preparação intacta em montagem inteira.
   OBSERVAÇÃO: era necessária extrema cautela nesta etapa para evitar rasgar o tecido.
6. Coletar o tecido de interesse de ambas as narinas, direita e esquerda: a mucosa recobre o septo, as paredes dorsais esquerda e direita, e a placa cribriforme da cavidade nasal (Figura 1A, B). Coletar tecido de ambas as narinas, incluindo o septo, paredes dorsais e placa cribiforme, para isolar a região anatômica que contém as estruturas olfativas primárias (Figura 2C).
7. Lave os tecidos coletados em PBS 1× e remova quaisquer tecidos indesejados, incluindo fragmentos ósseos. Armazene os tecidos a 4 °C em PBS 1× para análise futura de imunohistoquímica.
   OBSERVAÇÃO: Se o tecido for submetido a armazenamento de longo prazo, recomenda-se armazená-lo em uma solução de PBS 1× e azida sódica 0,001% (P/V), a 4 °C.

3. Protocolo de coloração otimizado

OBSERVAÇÃO: Protocolos de coloração comumente utilizados são geralmente otimizados para seções de espessura fina a média (por exemplo, até 50 µm). Portanto, o protocolo precisou ser adaptado para o tecido muito mais espesso.
​Observou-se que uma etapa crucial envolvia manter o tecido flutuando no interior de tubos Eppendorf durante todo o processo de coloração e colocar os tubos em um rolo enquanto os reagentes penetravam. Assim, as etapas de coloração não foram realizadas com o tecido sobre uma lâmina de imagem. O tecido foi primeiramente corado enquanto flutuava e posteriormente montado sobre lâminas de imagem. Esses detalhes garantiram que o tecido não se dobrasse e que os reagentes e anticorpos pudessem penetrar em toda a região.

1. Remova os tecidos do armazenamento e coloque-os em um tubo Eppendorf, com solução bloqueadora (a solução utilizada será específica para a coloração).
   ​NOTA: Solução bloqueadora: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 em PBS. Outro ajuste importante foi o tempo ao qual o tecido foi submetido a cada coquetel de reagentes e anticorpos.
2. Mantenha o tecido na solução bloqueadora por 3 h à temperatura ambiente em rotação.
   NOTA: Observou-se que não foi necessário aumentar a concentração dos anticorpos e reagentes de coloração selecionados (Tabela 1) se o tempo de exposição a eles foi aumentado em comparação com a abordagem padrão de imuno-histoquímica em cortes finos. Isso também minimizou o uso de reagentes de anticorpos caros. As incubações são realizadas em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com a trava da tampa removida para que possa girar em um rolo. O volume do reagente foi de 500 µL.
3. Incube por 72 h a 4 °C com os anticorpos primários em rotação.
4. Lave o tecido duas vezes (1,5 h cada lavagem) usando PBS 1× à temperatura ambiente em rotação.
5. Incube o tecido com o anticorpo secundário (envolto em folha de alumínio) e corante para núcleos por um mínimo de 4 h à temperatura ambiente em rotação, e depois transfira para incubação noturna (12–18 h) a 4 °C em rotação.
6. Lave o tecido duas vezes (1,5 h cada vez) usando PBS 1× à temperatura ambiente em rotação.

4. Preparação da lâmina

1. Remova suavemente o tecido do tubo Eppendorf
2. Em um microscópio, coloque o tecido em uma lâmina e certifique-se de que não haja dobras no tecido.
   NOTA: É possível identificar, sob o microscópio e sem qualquer fluorescência, a orientação do tecido. O lado da lâmina própria do tecido mucoso deve ser colocado sobre a lâmina, com o epitélio voltado para o vidro da lâmina e a lâmina própria voltada para a lamínula. A lâmina própria pode ser identificada pela presença de feixes espessos de nervos, visíveis mesmo sem coloração. Manter essa orientação, com a lâmina própria voltada para o lado da lamínula e o lado do epitélio apoiado sobre o vidro da lâmina, facilitará tanto o processo de coloração quanto o de obtenção de imagens.
3. Cubra as lâminas com meio de montagem fluorescente e selar as lâminas.
4. As lâminas podem ser armazenadas a 4 °C após secagem durante a noite (12–18 h) no escuro e à temperatura ambiente

5. Aquisição de Imagem e Pós-processamento

1. Aquisição de imagens imunofluorescentes de baixa ampliação
   1. Realize a costura automática durante a aquisição de imagens usando mistura alfa linear.
      ​NOTA: O número de quadros no z-stack deve ser ajustado de acordo com a espessura do espécime para garantir cobertura completa do volume tecidual.
   2. Capture campos adjacentes de visão com 15% de sobreposição. Adquira imagens em mosaico usando um padrão de aquisição em zigue-zague.
   3. Ajuste o número total de seções ópticas de acordo com a espessura do tecido.
   4. Defina a calibração da imagem para 215,594 nm/pixel nos eixos X e Y. Adquira imagens como z-stacks usando um tamanho de passo z de 0,8 µm.
   5. Coloque o tecido montado em preparação total sobre a platina do microscópio confocal. Adquira imagens gerais usando uma objetiva de 30x (NA 1,04).
2. Aquisição de imagens imunofluorescentes de alta ampliação.
   1. Adquira imagens detalhadas usando uma objetiva de 60× (NA 1,5). Defina a calibração da imagem para 107,923 nm/pixel nos eixos X e Y. Adquira imagens em z-stack usando um tamanho de passo z de 0,41 µm.
   2. Ajuste o número total de seções ópticas de acordo com a espessura do tecido. E capture imagens de um único campo de visão.
      ​NOTA: Não é necessária costura de imagens para aquisições em 60×, pois cada conjunto de dados consiste em um único campo de visão.
3. Aquisição de imagens de referência histológica
   1. Image seções murinas de cabeça em plano médio-sagital coradas com HE usando um microscópio de digitalização de lâminas sob iluminação de campo claro.
   2. Adquira imagens usando uma objetiva de 40× (NA 0,95) e uma ampliação da câmera de 0,63x, resultando em uma ampliação efetiva de 25,2×.
   3. Confirme uma calibração de pixel de 136,905 nm/pixel nos eixos X e Y. E adquira a imagem como um único plano focal.
   4. Costure automaticamente imagens em mosaico usando um padrão de aquisição em zigue-zague e mistura alfa linear.
4. Aquisição de imagens de referência imunofluorescentes gerais
   1. Adquira imagens imunofluorescentes complementares de visão geral usando uma objetiva de 10x.
   2. Capture o espécime como um único corte z usando 0% de sobreposição de ladrilhos durante a aquisição da imagem.
   3. Defina a calibração da imagem para 647,249 nm/pixel nos eixos X e Y. E, gere uma imagem geral que englobe toda a região anatômica de interesse.
5. Processamento de imagens e geração das figuras finais.
   1. Exporte os conjuntos de dados de imagens adquiridos para um software de análise de imagens. Gere projeções de intensidade máxima (MIPs) a partir dos conjuntos de dados em z-stack.
   2. Selecione regiões de interesse (ROIs) para análises subsequentes e preparação de figuras.
   3. Combine imagens imunofluorescentes gerais com imagens correspondentes de HE para gerar figuras de referência anatômica. Em seguida, verifique o alinhamento e a correspondência anatômica entre os conjuntos de dados de fluorescência e histológicos antes da preparação das figuras.
      NOTA: Toda costura de imagens deve ser realizada automaticamente durante a aquisição de imagens usando configurações predeterminadas do microscópio e não deve exigir processamento adicional. No nosso caso, a renderização 3D foi gerada usando o software Imaris: o plugin de renderização de superfície, baseado na intensidade de limiar para cada canal adquirido, foi utilizado para produzir a reconstrução 3D. Por fim, as imagens finais foram compiladas no Adobe Illustrator.

Resultados

Nossa abordagem em preparação inteira apresentada aqui permitiu o isolamento e a preservação da mucosa olfatória em sua totalidade. Em nosso caso, nosso foco foi compreender as alterações celulares e anatômicas em escalas macro (visão anatômica completa) e micro (nível celular).

A abordagem em preparação inteira permite coletar tanto os compartimentos epiteliais quanto a lâmina própria e preservar as relações espaciais entre feixes de axônios, células envoltórias olfativas (OECs) e fibroblastos – nossas células de interesse. Essa abordagem possibilitou a obtenção de grandes conjuntos de dados contínuos que capturaram toda a espessura e a ampla área superficial do tecido mucoso (Figura 3) e nos permitiu registrar detalhes da complexa estrutura celular e das interações (Figura 3), bem como suas alterações entre condições intactas (n = 3) (Figura 3A, B) e danificadas (n = 12) (Figura 3C, D).

Ao combinar este procedimento otimizado de manipulação e coloração de tecidos com microscopia confocal de alta resolução, foi possível obter imagens de regiões mucosas mais amplas com grande detalhe preciso em nível celular em toda a profundidade do tecido. A aquisição de pilhas Z em múltiplas regiões adjacentes permitiu a reconstrução de domínios anatômicos estendidos sem comprometer a resolução ou a integridade do sinal (Figura 4A–F). Devido aos detalhes celulares de alta resolução, também foi possível utilizar as pilhas Z adquiridas em toda a espessura do tecido (Figura 4G) para gerar imagens renderizadas (Figura 4H) com o objetivo de compreender melhor a microarquitetura do tecido.

A determinação confiável da orientação do tecido antes da montagem e da aquisição de imagens foi consistentemente alcançada sem a necessidade de marcação fluorescente. O lado da lâmina própria foi facilmente identificável em microscopia de campo claro pela presença de feixes nervosos espessos, claramente distinguíveis da camada epitelial. A padronização da orientação da amostra posicionando a lâmina própria adjacente à lamínula e a superfície epitelial contra a lâmina de vidro melhorou a consistência das imagens entre as amostras e facilitou a reconstrução tridimensional subsequente. A penetração do anticorpo pode ser determinada pela análise do sinal associado observado ao longo da espessura do tecido. Geralmente, isso é evidente pela ausência de sinal ou por um sinal que diminui progressivamente ao se aprofundar no tecido.

A renderização tridimensional realizada no Imaris permitiu a visualização clara de redes celulares complexas e da organização axonal dentro da mucosa intacta. A renderização baseada em superfície, aplicada por meio de limiarização de intensidade específica por canal, gerou representações tridimensionais precisas da arquitetura tecidual, preservando detalhes estruturais finos.

Para coloração e visualização, os resultados esperados incluiriam uma visualização clara do sinal de coloração alvo, sem perda anormal do sinal ou deterioração do mesmo ao longo da espessura dos tecidos. A incapacidade de visualizar um alvo previamente conhecido sob microscopia deve ser considerada um resultado insatisfatório.

Figura 1. Representação da região anatômica com sobreposição do tecido da mucosa em preparação total. (A–C). Vista sagital do interior da narina esquerda (coloração com hematoxilina e eosina, HE) do camundongo (A) com sobreposição da coloração em preparação total da mucosa da mesma região (para orientação anatômica) (B), mostrando a orientação e posição dos feixes de axônios em verde e os núcleos celulares em azul. Esta técnica permitiu a preservação de toda a estrutura anatômica: é possível distinguir claramente os feixes de axônios do nervo olfatório primário (ON) e acessório (nervos vomeronasais, VNN), bem como acompanhar seu trajeto desde o septo até o bulbo olfatório (OB), através da placa cribriforme (B, C). O tecido exibido aqui foi corado com Hoechst para os núcleos (azul) e β-III-Tubulina para os feixes de axônios (verde). Imagens representativas de n = 15 preparações independentes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2. Visões macroscópica e esquemática do sistema olfativo. (A) Utilizando um cortador ósseo, seguindo a linha pontilhada vermelha, o osso septal é removido (região amarela). (B) Após a exposição da cavidade nasal côncava subjacente (marrom), todo o tecido mucoso que se expande dessa região até a mucosa respiratória e olfativa pode ser coletado. (C) Representação gráfica para ilustrar a continuidade dessas estruturas, estendendo-se do epitélio olfativo até o bulbo olfativo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3. Vista ampliada da área anatômica obtida com um protocolo de coleta e coloração em montagem inteira. (A–D). Imagens representativas de mucosas saudáveis e danificadas são mostradas. De cima para baixo, mucosa íntegra de tecido saudável (n = 3) e mucosa danificada (n = 12). No tecido saudável (A), as CEPs com suas morfologias bipolares alongadas (A, esquerda) envolvem os feixes de axônios (A, meio), e os fibroblastos formam a camada externa dessas estruturas semelhantes a túneis (A, direita, seta branca). As três ROI selecionadas refletem esses detalhes (B). Na mucosa danificada, as CEPs exibem morfologias tanto bipolares quanto arredondadas (C, D, esquerda, setas brancas). Os feixes de axônios parecem menos uniformes e sólidos (C, D, meio, setas brancas). Os fibroblastos aparecem amplamente distribuídos por toda a região (C, D, direita, setas brancas). Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4. Imagem fluorescente tridimensional de preparações inteiras da mucosa. (A–H). Imagens de baixa ampliação das células (A–F) e uma imagem de alta ampliação (G) foram obtidas a partir de pilhas de imagens de múltiplas regiões consecutivas utilizando um microscópio SpinSR. As células envoltórias olfativas (OECs) são mostradas em vermelho, fibroblastos em magenta, axônios em verde e núcleos em azul. As setas indicam diferentes morfologias das OECs (A) e uma camada externa de fibroblastos ao redor dos feixes de axônios (B e C). D–F apresentam setas destacando semelhanças nas estruturas saudáveis dos fibroblastos. Essas imagens destacaram a organização espacial dos componentes celulares, que foram então reconstruídos utilizando o software Imaris (H). Barra de escala = 50 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Reagente	Alvo	Diluição	Condições de incubação	Razão
Anticorpo primário
β-III-Tubulin (Rabbit)	Axônios	1:300	Por 72 h a 4 °C, em rolo	para permitir penetração total na espessura
PDGFR-β (Rat)	Fibroblastos	1:100
Anticorpo secundário
Alexa 488	Anticorpos primários de coelho	1:250	Envolvido em folha de alumínio, por no mínimo 4 h à temperatura ambiente em rolo, seguido de incubação noturna a 4 °C em rolo.	A folha de alumínio evita o desbotamento pela luz; a duração, temperatura e agitação induzida pelo rolo permitem boa penetração
Alexa 647	Anticorpos primários de rato	1:500
Núcleos
Hoechst	Núcleos celulares	1:2500

Tabela 1: Lista de anticorpos com diluições otimizadas para este protocolo. Esta tabela lista os reagentes de marcação com seus alvos, diluições e justificativa para as condições de incubação.

Discussão

As últimas décadas assistiram lentamente ao início da era tridimensional, com o surgimento de diversas abordagens inovadoras no campo científico. Por exemplo, abordagens de reconstrução tridimensional, viabilizadas pelo desenvolvimento de métodos complexos de imagem em montagem inteira combinados a microscópios fluorescentes de alta resolução, facilitaram uma melhor compreensão de várias arquiteturas histológicas de tecidos completos. Essas abordagens de visualização tridimensional têm sido utilizadas para definir diversas estruturas do corpo humano, como vasos, glândulas e tumores comuns^4,5,6,7,8,9. Além disso, foram coletadas informações sobre as diferenças entre estruturas patológicas e normais, por exemplo, em cérebros inteiros de camundongos^10,11,12. Essa abordagem tem sido reconhecida como um passo crucial rumo a uma melhor compreensão dos diversos sistemas biológicos, facilitando uma compreensão mais profunda dos circuitos celulares, de sua organização espacial estrutural e funcional e de sua contribuição potencial para patologias humanas.

Uma desvantagem das diferentes combinações de reconstrução tridimensional de tecidos e imagem é que a maioria das abordagens envolve etapas de clareamento tecidual. Embora este método seja útil para muitos tecidos, não é apropriado para todos os tipos de tecido^8,9,19. De fato, os procedimentos de clareamento envolvem várias etapas de lavagem, que potencialmente poderiam danificar epítopos alvo e influenciar sinais endógenos²⁰.

As abordagens descritas acima foram utilizadas para definir muitas estruturas celulares importantes em diferentes sistemas. No entanto, o sistema olfativo e suas estruturas de interesse possuem uma presença mínima de componentes ósseos a partir dos quais poderiam ser facilmente isolados; portanto, abordagens de montagem inteira que não incluem etapas de clareamento têm sido testadas nos últimos anos^13,14.

Esses estudos reconheceram a importância de definir melhor a organização das estruturas neuronais no sistema olfativo. Assim, seu foco principal foi fornecer um mapa topográfico claro da distribuição dos neurônios sensoriais olfativos com base na expressão de diferentes marcadores¹⁴, bem como revelar novas descobertas sobre seus cílios peculiares¹³.

A técnica de montagem inteira desenvolvida e apresentada aqui permite a coleta e preservação do tecido mucoso em sua totalidade, abrindo a possibilidade de obter informações cruciais sobre a estrutura anatômica e fisiológica desse ambiente, com foco específico, no nosso caso, na relação entre células envoltórias olfativas, fibroblastos e feixes de axônios. O acoplamento dessa técnica refinada de isolamento e coloração com imagens confocais de alta resolução permitiu a obtenção de grandes imagens que refletem a estrutura de toda a região-alvo e suas células residentes. Especificamente, nossa técnica aprimorada oferece duas vantagens distintas: toda a mucosa é colhida e processada, incluindo a arquitetura da lâmina própria¹³, e o método mais suave de preparação do tecido ajuda a preservar a anatomia em macroescala, bem como as interações intercelulares (como células envoltórias olfativas, axônios e fibroblastos), em comparação com outros protocolos de montagem plana¹⁴. É por isso também que este protocolo não inclui validação frente à coloração de cortes finos.

Como mencionado acima, as técnicas de montagem inteira geralmente envolvem longos períodos de processamento de tecidos e o uso de reagentes específicos e caros. Este método foi desenvolvido com foco no processamento mínimo de tecidos, a fim de reduzir tanto o tempo quanto o risco de danificar estruturas celulares importantes. O método otimizado representa, portanto, um processo rápido que pode ser realizado utilizando reagentes comumente empregados em imunohistoquímica em cortes finos, oferecendo uma alternativa válida às abordagens que exigem tempos mais longos de processamento e que não são apropriadas para estruturas sem ossos, como o tecido mucoso.

A aquisição de imagens e o pós-processamento podem ser realizados usando qualquer plataforma de microscopia confocal capaz de adquirir z-stacks de alta resolução a partir de amostras de tecido espessas, com penetração a laser suficiente para imagens através das mucosas de interesse (consulte a seção de métodos para obter mais detalhes sobre nossas configurações de aquisição e processamento de imagens).

Com modificações apropriadas, acreditamos que este protocolo possa ser adaptado e aplicado a outros modelos comuns de roedores. Com algumas modificações específicas para o tecido, este método pode ser aplicado em diversos contextos diferentes, incluindo o estudo de tecidos mucosos e submucosos do trato respiratório e gastrointestinal (TGI); a investigação da organização tecidual e das interações multissistêmicas no sistema nervoso; a análise de processos inflamatórios e dos tecidos linfoides associados à mucosa (MALTs); bem como a exploração de diferentes eixos multissistêmicos, como o eixo intestino-cérebro.

A principal vantagem deste protocolo reside nos aperfeiçoamentos metodológicos que permitem a obtenção de imagens tridimensionais de alta qualidade, preservando a integridade do tecido, mas também garantindo uma abordagem relativamente rápida em comparação com outras metodologias de preparação em montagem inteira previamente testadas na área.

A implementação bem-sucedida desta abordagem dependia fortemente de um profundo conhecimento anatômico do tecido de interesse. De fato, no nosso caso, conhecer a localização esperada dos feixes de axônios foi essencial para minimizar a invasividade do procedimento de coleta assim que o interior do crânio foi exposto. Esse conhecimento anatômico foi crucial para conseguir localizar rapidamente a região e o tecido de interesse e preservar a estrutura geral da mucosa, destacando como o processamento bem-sucedido do tecido está intrinsecamente ligado a uma estratégia de coleta fundamentada, e não apenas a etapas de pós-processamento.

Como mencionado na seção de métodos em várias observações, múltiplos ajustes técnicos foram fundamentais para o desenvolvimento e a otimização deste método. Manter o tecido flutuando livremente dentro de tubos Eppendorf durante todo o processo de coloração, combinado com rotação contínua durante a incubação com reagentes e anticorpos, representou um passo crucial em comparação com protocolos mais estáticos de montagem inteira e de cortes finos. Essa aprimoramento impediu o dobramento do tecido e ao mesmo tempo garantiu uma penetração homogênea dos reagentes em toda a amostra, melhorando assim a consistência da coloração sem necessidade de etapas desnecessárias de clareamento. Além disso, a otimização cuidadosa da duração da incubação para cada coquetel de reagentes e anticorpos mostrou-se essencial. Este último passo pode precisar de ajustes adicionais dependendo do tipo de anticorpo escolhido.

Juntos, esses fatores específicos resultaram em maior reprodutibilidade, ao mesmo tempo que reduziram o tempo total de processamento e o manuseio mais rigoroso das amostras.

Outro passo metodológico importante foi a capacidade de determinar com confiança a orientação do tecido antes da montagem e da aquisição de imagens, sem a necessidade de marcação fluorescente. O lado da lâmina própria do tecido mucoso pôde ser facilmente identificado em microscopia de campo claro pela presença de feixes nervosos espessos, claramente distinguíveis do tecido epitelial circundante. A padronização da orientação da amostra, posicionando a lâmina própria voltada para o lado do lamínula e a camada epitelial apoiada sobre a lâmina de vidro, mostrou-se eficaz para facilitar a qualidade da aquisição de imagens. Esse aperfeiçoamento simples, mas eficaz, melhorou a consistência do imageamento entre as amostras e contribuiu para a qualidade das reconstruções tridimensionais obtidas.

Existem algumas limitações a considerar, no entanto. Este protocolo não foi testado em muitas linhagens comuns de camundongos nem em outras espécies de roedores. Da mesma forma, as otimizações foram realizadas sob condições experimentais específicas, conforme descrito acima e apenas com os painéis de anticorpos listados. Embora o protocolo deva funcionar com a maioria das linhagens de camundongos e ratos, diversos anticorpos diferentes e quaisquer modelos experimentais que permitam a coleta de mucosas em espessura total, pode ser necessária uma otimização cuidadosa adicional. Outra limitação notável é que uma única seção em preparação integral pode ser marcada apenas com um painel de anticorpos, ao contrário dos tecidos em seções finas, em que cada seção pode ser marcada com um painel de anticorpos individual e, portanto, múltiplos painéis diferentes de anticorpos podem ser testados em tecidos em seções finas.

No geral, essas inovações metodológicas demonstram como ajustes relativamente simples no manuseio de tecidos, nas condições de coloração e na orientação das amostras podem melhorar substancialmente os resultados de imagens em preparações inteiras. Ao evitar etapas extensas de processamento e clareamento tecidual, esta abordagem oferece uma alternativa prática e adaptável para o estudo de tecidos delicados e sem ossos, permitindo ainda a obtenção de dados tridimensionais detalhados e em larga escala.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina Sérica Bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Imunohistoquímica
Adobe Illustrator		versão 28.5
Anticorpo anti-beta III Tubulina - Marcador Neuronal	Abcam	ab18207
Anticorpo anti-PDGFR beta [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimida H 33342 tri-hidrocloreto	Sigma Aldrich	14533
LÂMINA DE COBERTURA 24X50MM N.º 1,5 100 UN	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Imunohistoquímica
Anticorpo Secundário de Jumento anti-IgG de Coelho (H+L), Altamente Cruzado e Adsorvido, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Cortador de Osso Dumont nº 15A - Revestido com Epóxi	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Dissecção de tecido
Pinceta Dumont nº 7 - Biologia/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Dissecção de tecido
Anticorpo Secundário de Cabra anti-IgG de Rato (H+L), Cruzado e Adsorvido, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Software Imaris	Imaris	versão 9.5.0	Imagem
Tesoura de Dissecação Mayo	ProSciTech	420SS	Dissecção de tecido
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Processamento de Tecido
Solução Salina Tamponada com Fosfato, Comprimidos de PBS Estéril (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Processamento de Tecido
Meio de Montagem Antidesbotamento ProLong Glass	Thermo Fisher Scientific	P36980	Imunohistoquímica
Lâmina de bisturi nº 23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Dissecção de tecido
Empunhadura de bisturi nº 4	ProSciTech	T134	Dissecção de tecido
Azida de Sódio	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Processamento de Tecido
Sacarose	Chem-Supply	57-50-1	Processamento de Tecido
Lâminas Microscópicas Adesivas TOMO	ProSciTech	GEMS63705-09	Imunohistoquímica
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Imunohistoquímica