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Artigo de método

Preservando a Complexidade Tecidual In Vivo em um Modelo do Sistema Nervoso Olfatório de Camundongos Utilizando Análise em Montagem Inteira para o Estudo da Regeneração Neural

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DOI:

10.3791/72036

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18 de agosto de 2026

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1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho completo para preservar a complexidade anatômica do sistema nervoso olfativo do camundongo. Aqui detalhamos todo o fluxo de trabalho, incluindo dissecação, preparação do tecido e obtenção de imagens. Este protocolo pode ser utilizado para estudar o sistema olfativo em condições normais ou anormais, incluindo suas condições naturais de reparação.

Resumo

Na era da imagem tridimensional (3D), a imuno-histoquímica convencional tem sido reconhecida como altamente limitada em estudos de patologia e anatomia humana complexa. Ao analisar apenas cortes finos, estruturas maiores e aspectos essenciais da arquitetura tecidual podem perder detalhes contextuais críticos, levando a interpretações incompletas ou enganosas. Embora seções bidimensionais (2D) tenham contribuído para uma compreensão básica da histoarquitetura, elas são insuficientes para capturar a realidade verdadeiramente tridimensional dos tecidos biológicos.

Um número crescente de estudos em múltiplas regiões anatômicas agora adota técnicas que isolam unidades anatômicas intactas — preparações em montagem plana, montagem inteira ou em face — combinadas com microscopia fluorescente de alta resolução. Essas abordagens oferecem uma visualização e interpretação mais abrangentes da organização estrutural. Isso é particularmente significativo no sistema nervoso olfativo, onde definir os mecanismos celulares complexos subjacentes à sua notável capacidade regenerativa exige um contexto de espessura total. Cortes finos correm o risco de omitir características fisiopatológicas fundamentais que permanecem pouco definidas.

Diante dessas limitações e da lacuna de conhecimento sobre as interações celulares que impulsionam a regeneração olfativa, o desenvolvimento de uma técnica refinada de montagem inteira, capaz de preservar a complexidade tecidual em toda a espessura, foi essencial. Mucosas olfativas inteiras foram isoladas como amostras de espessura total, acompanhadas por um protocolo otimizado de penetração de anticorpos. A imagem de alta resolução (EVIDENT SpinSR) e a reconstrução tridimensional permitiram a visualização precisa das interações celulares in vivo.

Introdução

O sistema nervoso olfativo (SNO) representa um modelo único e bem estabelecido para o estudo dos mecanismos de regeneração neural, pois mantém a capacidade exclusiva de renovação neuronal ao longo da vida1. No entanto, o potencial para a translação clínica dessa capacidade neuro-reparadora permanece limitado devido a lacunas significativas em nosso entendimento sobre o comportamento das células no sistema olfativo2,3,4. As respostas celulares e a organização anatômica do SNO, incluindo neurônios olfativos primários, células envoltórias olfativas (CEO) e fibroblastos perineurais, foram descritas em diversos estudos com animais, baseados em cortes teciduais ultrafinos (<2 µm) combinados com modelos de lesão física grave aplicados ao SNO de roedores1,2. Os animais nesses estudos geralmente eram sacrificados 10 dias após a lesão, fornecendo uma janela estreita sobre apenas um momento específico da remodelação extensa e mais complexa desse tecido durante a lesão neural2. Esses estudos relataram que, após a morte axonal, as CEO e os fibroblastos persistiriam como canais contínuos ao longo do local da lesão.

Embora informativo, devido às muitas limitações explicadas acima, a abordagem utilizada forneceu uma visão conceitual de baixa resolução em um nível superficial do ONS, impedindo, em última instância, uma avaliação abrangente da organização celular real dentro do ONS intacto3. Como resultado, relações espaciais críticas podem ter sido negligenciadas.

A preservação da estrutura tecidual tridimensional é essencial para análises anatômicas e celulares precisas e tem sido aplicada com sucesso em múltiplos órgãos e patologias4,5,6,7,8,9,10,11,12. Abordagens em preparações inteiras têm sido utilizadas para mapear a organização neural na mucosa olfatória13,14, entretanto, a visualização das interações celulares com uma estrutura completa de ONS, incluindo uma lâmina própria preservada, ainda não foi realizada.

Neste estudo, estabelecemos um fluxo de trabalho utilizando um modelo murino com processamento de tecido em montagem inteira, imunomarcação, imagem de alta resolução e reconstrução tridimensional, permitindo a análise detalhada da arquitetura do SNO. Este protocolo foi desenvolvido para preencher uma lacuna nos métodos publicados existentes, conservando e preservando a mucosa olfatória com espessura total, incluindo a lâmina própria, possibilitando o estudo das interações intercelulares. Notavelmente, esta metodologia aprimorada de coleta e processamento de tecido pode ser aplicada e combinada com diversos modelos do sistema olfativo.

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Protocolo

Todos os experimentos que envolviam animais e células modificadas transgênicamente foram conduzidos com a aprovação do Comitê de Biossegurança da Griffith University (NLRD/003/2020_var3) e do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Griffith University (MHIQ/04/23/AEC), de acordo com as diretrizes do órgão regulador do Escritório de Tecnologia Genética da Commonwealth Australiana (OGTR).

OBSERVAÇÃO: Um total de 15 camundongos adultos de laboratório (8–9 semanas) de ambos os sexos foi utilizado no estudo. Especificamente, camundongos transgênicos S100β-DsRed, nos quais todas as CEPs expressam a proteína vermelha brilhante DsRed sob controle do promotor S100β. A proteína S100β faz parte de uma família maior de proteínas ligadoras de cálcio e é comumente expressa em células gliais do sistema nervoso central, como as CEPs. Esse modelo foi ideal para os objetivos desses experimentos, pois permitiu a localização fácil das populações celulares-alvo utilizando sinais de fluorescência endógenos. Os camundongos transgênicos S100β-DsRed foram previamente gerados, e demonstrou-se que o uso desses camundongos transgênicos proporciona detecção aprimorada das CEPs em comparação com a imunohistoquímica para análises de tecidos fixados15,16,17,18.

1. Coleta de cabeças e fixação do tecido

  1. Eutanasiar os animais com inalação crescente de CO2 nos pontos temporais experimentais.
  2. Garantir que a morte seja confirmada pela ausência dos reflexos corneano e de retirada dos membros, seguida por dislocação cervical, ou conforme o POP aprovado.
  3. Remover toda a cabeça e as mandíbulas com tesoura.
  4. Remover a pele do crânio e remover a cartilagem da ponta do nariz para expor a cavidade nasal e garantir a penetração eficiente do agente fixador.
    NOTA: Observou-se que esta etapa de cortar a parte mais frontal da cartilagem nasal do animal é crucial para permitir a fixação adequada do tecido dentro da cavidade nasal.
  5. Lavar rapidamente as cabeças em PBS 1× para remover o excesso de sangue.
  6. Fixar o tecido por imersão durante a noite (12–18 h) em paraformaldeído a 4%, por pelo menos 6 h (tempo suficiente para fixar o tecido de interesse) a 4 °C em rolo.
    CAUTELA: O paraformaldeído é um produto químico perigoso que libera vapores de formaldeído. É tóxico por inalação, contato com a pele e ingestão; causa irritação nos olhos, pele e vias respiratórias; e é suspeito de ser carcinogênico. Manipular apenas em capela de exaustão, utilizando EPI apropriado, incluindo luvas, jaleco laboratorial e proteção ocular. A eliminação segura de produtos químicos perigosos e resíduos biológicos gerados durante o protocolo deve ser realizada de acordo com as regulamentações institucionais e locais.
    ​NOTA: Durante as otimizações, observamos que 6 h foram suficientes para fixar o tecido de interesse; no entanto, mais de 12 h provavelmente causaria superfixação e degradação das estruturas mucosas.
  7. Retirar as cabeças do agente fixador e lavá-las por 3 h em PBS 1× à temperatura ambiente (20–25 °C) em rolo.
  8. Armazenar as cabeças em PBS fresco a 4 °C e coletar o tecido mucoso em preparação inteira dentro de 48 h

2. Coleta de tecido em montagem inteira

  1. Realize o isolamento do tecido sob um microscópio.
  2. Corte as cabeças ao meio usando um bisturi, seguindo a linha média sagital.
  3. Expor o interior da cavidade nasalFigura 1). Identifique as regiões anatômicas e colete o tecido mucoso que reveste toda a seção anatômica (Figura 1B).
  4. Usando um cortador de osso, quebre e remova suavemente o osso septal que recobre parte da cavidade mucosa.
    OBSERVAÇÃO: Veja Figura 2A; Esta etapa é crucial para expor a cavidade côncava sob o osso, onde os feixes de axônios atravessam a parede dorsal (Figura 1B).
  5. Uma vez exposta esta área, use pinça curva para remover suavemente e retirar o tecido da parede dorsal côncava. Levante o tecido do osso subjacente e desprenda cuidadosamente a mucosa olfatória remanescente para coletar a preparação intacta em montagem inteira.
    OBSERVAÇÃO: era necessária extrema cautela nesta etapa para evitar rasgar o tecido.
  6. Coletar o tecido de interesse de ambas as narinas, direita e esquerda: a mucosa recobre o septo, as paredes dorsais esquerda e direita, e a placa cribriforme da cavidade nasal (Figura 1A, B). Coletar tecido de ambas as narinas, incluindo o septo, paredes dorsais e placa cribiforme, para isolar a região anatômica que contém as estruturas olfativas primárias (Figura 2C).
  7. Lave os tecidos coletados em PBS 1× e remova quaisquer tecidos indesejados, incluindo fragmentos ósseos. Armazene os tecidos a 4 °C em PBS 1× para análise futura de imunohistoquímica.
    OBSERVAÇÃO: Se o tecido for submetido a armazenamento de longo prazo, recomenda-se armazená-lo em uma solução de PBS 1× e azida sódica 0,001% (P/V), a 4 °C.

3. Protocolo de coloração otimizado

OBSERVAÇÃO: Protocolos de coloração comumente utilizados são geralmente otimizados para seções de espessura fina a média (por exemplo, até 50 µm). Portanto, o protocolo precisou ser adaptado para o tecido muito mais espesso.
​Observou-se que uma etapa crucial envolvia manter o tecido flutuando no interior de tubos Eppendorf durante todo o processo de coloração e colocar os tubos em um rolo enquanto os reagentes penetravam. Assim, as etapas de coloração não foram realizadas com o tecido sobre uma lâmina de imagem. O tecido foi primeiramente corado enquanto flutuava e posteriormente montado sobre lâminas de imagem. Esses detalhes garantiram que o tecido não se dobrasse e que os reagentes e anticorpos pudessem penetrar em toda a região.

  1. Remova os tecidos do armazenamento e coloque-os em um tubo Eppendorf, com solução bloqueadora (a solução utilizada será específica para a coloração).
    ​NOTA: Solução bloqueadora: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 em PBS. Outro ajuste importante foi o tempo ao qual o tecido foi submetido a cada coquetel de reagentes e anticorpos.
  2. Mantenha o tecido na solução bloqueadora por 3 h à temperatura ambiente em rotação.
    NOTA: Observou-se que não foi necessário aumentar a concentração dos anticorpos e reagentes de coloração selecionados (Tabela 1) se o tempo de exposição a eles foi aumentado em comparação com a abordagem padrão de imuno-histoquímica em cortes finos. Isso também minimizou o uso de reagentes de anticorpos caros. As incubações são realizadas em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com a trava da tampa removida para que possa girar em um rolo. O volume do reagente foi de 500 µL.
  3. Incube por 72 h a 4 °C com os anticorpos primários em rotação.
  4. Lave o tecido duas vezes (1,5 h cada lavagem) usando PBS 1× à temperatura ambiente em rotação.
  5. Incube o tecido com o anticorpo secundário (envolto em folha de alumínio) e corante para núcleos por um mínimo de 4 h à temperatura ambiente em rotação, e depois transfira para incubação noturna (12–18 h) a 4 °C em rotação.
  6. Lave o tecido duas vezes (1,5 h cada vez) usando PBS 1× à temperatura ambiente em rotação.

4. Preparação da lâmina

  1. Remova suavemente o tecido do tubo Eppendorf
  2. Em um microscópio, coloque o tecido em uma lâmina e certifique-se de que não haja dobras no tecido.
    NOTA: É possível identificar, sob o microscópio e sem qualquer fluorescência, a orientação do tecido. O lado da lâmina própria do tecido mucoso deve ser colocado sobre a lâmina, com o epitélio voltado para o vidro da lâmina e a lâmina própria voltada para a lamínula. A lâmina própria pode ser identificada pela presença de feixes espessos de nervos, visíveis mesmo sem coloração. Manter essa orientação, com a lâmina própria voltada para o lado da lamínula e o lado do epitélio apoiado sobre o vidro da lâmina, facilitará tanto o processo de coloração quanto o de obtenção de imagens.
  3. Cubra as lâminas com meio de montagem fluorescente e selar as lâminas.
  4. As lâminas podem ser armazenadas a 4 °C após secagem durante a noite (12–18 h) no escuro e à temperatura ambiente

5. Aquisição de Imagem e Pós-processamento

  1. Aquisição de imagens imunofluorescentes de baixa ampliação
    1. Realize a costura automática durante a aquisição de imagens usando mistura alfa linear.
      ​NOTA: O número de quadros no z-stack deve ser ajustado de acordo com a espessura do espécime para garantir cobertura completa do volume tecidual.
    2. Capture campos adjacentes de visão com 15% de sobreposição. Adquira imagens em mosaico usando um padrão de aquisição em zigue-zague.
    3. Ajuste o número total de seções ópticas de acordo com a espessura do tecido.
    4. Defina a calibração da imagem para 215,594 nm/pixel nos eixos X e Y. Adquira imagens como z-stacks usando um tamanho de passo z de 0,8 µm.
    5. Coloque o tecido montado em preparação total sobre a platina do microscópio confocal. Adquira imagens gerais usando uma objetiva de 30x (NA 1,04).
  2. Aquisição de imagens imunofluorescentes de alta ampliação.
    1. Adquira imagens detalhadas usando uma objetiva de 60× (NA 1,5). Defina a calibração da imagem para 107,923 nm/pixel nos eixos X e Y. Adquira imagens em z-stack usando um tamanho de passo z de 0,41 µm.
    2. Ajuste o número total de seções ópticas de acordo com a espessura do tecido. E capture imagens de um único campo de visão.
      ​NOTA: Não é necessária costura de imagens para aquisições em 60×, pois cada conjunto de dados consiste em um único campo de visão.
  3. Aquisição de imagens de referência histológica
    1. Image seções murinas de cabeça em plano médio-sagital coradas com HE usando um microscópio de digitalização de lâminas sob iluminação de campo claro.
    2. Adquira imagens usando uma objetiva de 40× (NA 0,95) e uma ampliação da câmera de 0,63x, resultando em uma ampliação efetiva de 25,2×.
    3. Confirme uma calibração de pixel de 136,905 nm/pixel nos eixos X e Y. E adquira a imagem como um único plano focal.
    4. Costure automaticamente imagens em mosaico usando um padrão de aquisição em zigue-zague e mistura alfa linear.
  4. Aquisição de imagens de referência imunofluorescentes gerais
    1. Adquira imagens imunofluorescentes complementares de visão geral usando uma objetiva de 10x.
    2. Capture o espécime como um único corte z usando 0% de sobreposição de ladrilhos durante a aquisição da imagem.
    3. Defina a calibração da imagem para 647,249 nm/pixel nos eixos X e Y. E, gere uma imagem geral que englobe toda a região anatômica de interesse.
  5. Processamento de imagens e geração das figuras finais.
    1. Exporte os conjuntos de dados de imagens adquiridos para um software de análise de imagens. Gere projeções de intensidade máxima (MIPs) a partir dos conjuntos de dados em z-stack.
    2. Selecione regiões de interesse (ROIs) para análises subsequentes e preparação de figuras.
    3. Combine imagens imunofluorescentes gerais com imagens correspondentes de HE para gerar figuras de referência anatômica. Em seguida, verifique o alinhamento e a correspondência anatômica entre os conjuntos de dados de fluorescência e histológicos antes da preparação das figuras.
      NOTA: Toda costura de imagens deve ser realizada automaticamente durante a aquisição de imagens usando configurações predeterminadas do microscópio e não deve exigir processamento adicional. No nosso caso, a renderização 3D foi gerada usando o software Imaris: o plugin de renderização de superfície, baseado na intensidade de limiar para cada canal adquirido, foi utilizado para produzir a reconstrução 3D. Por fim, as imagens finais foram compiladas no Adobe Illustrator.

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Resultados

Nossa abordagem em preparação inteira apresentada aqui permitiu o isolamento e a preservação da mucosa olfatória em sua totalidade. Em nosso caso, nosso foco foi compreender as alterações celulares e anatômicas em escalas macro (visão anatômica completa) e micro (nível celular).

A abordagem em preparação inteira permite coletar tanto os compartimentos epiteliais quanto a lâmina própria e preservar as relações espaciais entre feixes de axônios, células envoltórias olfatórias (OECs) e fibroblast...

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Discussão

As últimas décadas assistiram lentamente ao início da era tridimensional, com o surgimento de diversas abordagens inovadoras no campo científico. Por exemplo, abordagens de reconstrução tridimensional, viabilizadas pelo desenvolvimento de métodos complexos de imagem em montagem inteira combinados a microscópios fluorescentes de alta resolução, facilitaram uma melhor compreensão de várias arquiteturas histológicas de tecidos completos. Essas abordagens de visualização tridimensional têm sido utilizadas para definir divers...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Clem Jones Foundation, pela Perry Cross Spinal Research Foundation e pela Motor Accident Insurance Commission para JSTJ e RR, por uma bolsa da National Injury Insurance Scheme Queensland para RR e por uma bolsa da Perry Cross Spinal Research Foundation para FO. Parte deste projeto foi apoiada pela “Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS)” e pela Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS)” concedidas a FO.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Albumina Sérica Bovina (BSA)Sigma-AldrichA3294-50GImunohistoquímica
Adobe Illustratorversão 28.5
Anticorpo anti-beta III Tubulina - Marcador NeuronalAbcamab18207
Anticorpo anti-PDGFR beta [APB5]Abcamab91066
bisBenzimida H 33342 tri-hidrocloretoSigma Aldrich14533
LÂMINA DE COBERTURA 24X50MM N.º 1,5 100 UNBio-strategyEPBRCS245015GPImunohistoquímica
Anticorpo Secundário de Jumento anti-IgG de Coelho (H+L), Altamente Cruzado e Adsorvido, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Cortador de Osso Dumont nº 15A - Revestido com EpóxiDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02Dissecção de tecido
Pinceta Dumont nº 7 - Biologia/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10Dissecção de tecido
Anticorpo Secundário de Cabra anti-IgG de Rato (H+L), Cruzado e Adsorvido, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Software ImarisImarisversão 9.5.0Imagem
Tesoura de Dissecação MayoProSciTech420SSDissecção de tecido
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148-500GProcessamento de Tecido
Solução Salina Tamponada com Fosfato, Comprimidos de PBS Estéril (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014Processamento de Tecido
Meio de Montagem Antidesbotamento ProLong GlassThermo Fisher ScientificP36980Imunohistoquímica
Lâmina de bisturi nº 23Scalpel Blades Swann MortonCOS240BDissecção de tecido
Empunhadura de bisturi nº 4ProSciTechT134Dissecção de tecido
Azida de SódioSigma-AldrichS2002-25GProcessamento de Tecido
SacaroseChem-Supply57-50-1Processamento de Tecido
Lâminas Microscópicas Adesivas TOMOProSciTechGEMS63705-09Imunohistoquímica
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLImunohistoquímica

Referências

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Imagiologia TridimensionalTecido de Espessura TotalMicroscopia de Alta ResoluçãoPenetração de AnticorposReconstrução 3DMucosa Olfatória

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