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Ritmos Circadianos em uma Placa de Petri: Sincronizando Células mHypoE-42 do Hipotálamo de Camundongo para Análise da Expressão de Genes do Relógio Circadiano

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DOI:

10.3791/72039

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3 de setembro de 2026

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1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho prático e reprodutível para sincronizar células cultivadas, realizar coletas amostrais escalonadas em um período de 24–72 h sem coleta noturna e analisar a expressão de genes do relógio circadiano.

Resumo

Ritmos circadianos são oscilações endógenas de aproximadamente 24 h que regulam uma ampla gama de processos celulares e fisiológicos, incluindo expressão gênica, metabolismo e comportamento. Esses ritmos surgem de laços de retroalimentação transcricionais e traducionais interconectados que respondem a sinais temporais e ambientais. Como a regulação circadiana é altamente dinâmica, mesmo pequenas variações experimentais podem influenciar fase, amplitude e ritmicidade, tornando essenciais fluxos de trabalho experimentais padronizados para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis. O objetivo do presente protocolo é fornecer um fluxo de trabalho prático e reprodutível para sincronizar células cultivadas, realizar coletas seriadas ao longo do tempo e analisar a expressão de genes do relógio circadiano sob condições laboratoriais padrão. O protocolo descreve a sincronização baseada em choque sérico, coleta escalonada de amostras ao longo de 24–72 h para evitar coletas noturnas, extração de ácido ribonucleico, síntese de ácido desoxirribonucleico complementar, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real e análise de ritmo circadiano utilizando abordagens estatísticas apropriadas. O fluxo de trabalho também destaca considerações experimentais críticas, incluindo condições de sincronização, avaliação da qualidade das amostras, seleção de genes de referência e análise de dados, para melhorar a reprodutibilidade entre experimentos. Este método oferece uma abordagem acessível para investigar mecanismos moleculares circadianos e avaliar a expressão gênica rítmica em células cultivadas, facilitando estudos sobre regulação circadiana em modelos experimentais fisiológicos e relacionados a doenças.

Introdução

Os ritmos circadianos são ciclos endógenos com um período de aproximadamente 24 h que regulam uma ampla gama de processos fisiológicos, metabólicos e celulares1. Em sistemas de mamíferos, esses ritmos são coordenados por um relógio central localizado no núcleo supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo e por relógios moleculares auto-sustentados no nível celular. Esses relógios consistem em laços de retroalimentação transcricionais–traducionais entrelaçados que envolvem genes-relógio centrais, incluindo a proteína circadiana de ciclos de atividade motora kaput (Clock), helice básica-loop-hélice semelhante ao translocador nuclear do receptor de hidrocarbonetos arílicos 1 (Bmal1), período (Per) e criptocromo (Cry)2. Dado o papel central do relógio circadiano em diversos processos biológicos, modelos celulares in vitro tornaram-se ferramentas importantes para investigar os mecanismos moleculares da regulação temporal sob condições experimentais controladas.

O objetivo do presente protocolo é fornecer um fluxo de trabalho confiável, prático e reprodutível para sincronizar células cultivadas utilizando um protocolo de choque sérico, realizar coletas amostrais em curso temporal escalonado e analisar a expressão de genes do relógio circadiano, evitando a coleta de amostras durante a noite. Ao melhorar a viabilidade da coleta circadiana sem comprometer a qualidade dos dados, este fluxo de trabalho tem como finalidade facilitar estudos de processos biológicos rítmicos utilizando técnicas laboratoriais convencionais.

Estudos circadianos têm sido realizados em uma ampla variedade de modelos in vitro, incluindo linhagens celulares de câncer humano3, fibroblastos de rat-14, explantes de SCN 5 e organoides6. Embora a maioria das células de mamíferos possua relógios circadianos funcionais, a ausência de sinais sincronizadores, como a luz, leva rapidamente à dessincronização em cultura, limitando o estudo de ritmos circadianos in vitro7. Portanto, técnicas de sincronização são essenciais para investigar os mecanismos do relógio molecular e suas implicações na saúde e na doença.

Várias estratégias de sincronização foram desenvolvidas para células de mamíferos cultivadas. A sincronização baseada em glicocorticoides utilizando dexametasona está entre as abordagens mais amplamente utilizadas, pois redefinir robustamente os ritmos circadianos em muitos tipos celulares, ao mesmo tempo que reduz parte da variabilidade associada à estimulação com soro8. De forma semelhante, a ativação mediada por forskolina da sinalização do monofosfato de adenosina cíclico tem sido usada com sucesso para sincronizar relógios periféricos em modelos celulares selecionados9. Outras abordagens incluem tratamento com sinais transportados pelo sangue4, diferentes compostos químicos8,10, troca de meio3, choque térmico11, ciclos de oxigênio12 e estimulação mecânica13. Em conjunto, esses métodos avançaram substancialmente a pesquisa circadiana; no entanto, podem exigir equipamentos especializados, condições experimentais específicas ou otimização adicional, tornando importante validar a estratégia de sincronização escolhida para cada modelo biológico e aplicação experimental14.

O choque sérico é uma das abordagens de sincronização mais amplamente estabelecidas e consiste em expor células cultivadas a um estímulo de soro em alta concentração por um período curto4. Como o estímulo é transitório, a perturbação prolongada das vias de sinalização celular é minimizada4, reduzindo possíveis efeitos confundidores em análises posteriores. Consequentemente, o choque sérico é particularmente adequado para estudos de expressão gênica circadiana e função do relógio molecular. Além disso, o procedimento é simples de implementar e não requer equipamentos especializados, tornando-o acessível e facilmente reprodutível entre laboratórios. Uma limitação prática dos experimentos com choque sérico, no entanto, é a programação intensiva de coleta necessária para caracterizar com precisão a ritmicidade circadiana. A análise confiável de ritmos normalmente exige a coleta de amostras em intervalos regulares, geralmente a cada 2–6 h durante um ou mais ciclos circadianos (24–72 h)14, frequentemente exigindo coletas noturnas.

O fluxo de trabalho descrito aqui aborda esse desafio logístico ao escalonar a iniciação da sincronização em várias placas de cultura, permitindo assim a coleta completa de amostras circadianas durante o horário normal de trabalho e evitando a coleta de amostras durante a noite. Em vez de introduzir uma nova estratégia de sincronização, este protocolo fornece uma implementação detalhada e reprodutível de um método estabelecido de choque sérico, combinado com um cronograma prático de coleta de amostras e análise subsequente da expressão gênica. Este fluxo de trabalho é particularmente adequado para estudos de expressão gênica circadiana em células cultivadas, utilizando técnicas laboratoriais amplamente disponíveis. Ao adaptar o protocolo a outros modelos celulares, os parâmetros experimentais, incluindo densidade celular, condições de sincronização, intervalos de coleta e seleção de genes de referência, devem ser otimizados e validados para o tipo celular específico antes da implementação.

Protocolo

O protocolo a seguir descreve um método validado de sincronização para a linhagem celular hipotalâmica embrionária de camundongo mHypoE-42. Valide e otimize independentemente o protocolo de sincronização antes de aplicá-lo a outros tipos celulares cultivados. Veja Figura 1 para uma visão geral do fluxo de trabalho e Figura Suplementar 1 para o cronograma semanal de coleta de amostras. Consulte a Tabela de Materiais para obter todos os reagentes, equipamentos e instrumentos utilizados neste protocolo. Realize todos os procedimentos de cultura celular em uma cabine de segurança biológica certificada, utilizando reagentes e equipamentos estéreis.

Diagrama do processo de sincronização celular, método de choque sérico, linha do tempo, configuração experimental, intervalos CT.
Figura 1. Visão esquemática do protocolo de sincronização por choque sérico escalonado. Esquema que ilustra o fluxo de trabalho utilizado para sincronizar células mHypoE-42 por choque sérico em dois conjuntos experimentais escalonados. O desenho escalonado permite a coleta de amostras circadianas durante o horário normal de trabalho, evitando coletas noturnas. As amostras são posteriormente processadas para extração de RNA, reação de polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) e análise de ritmo circadiano. Criado com Biorender.com. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

1. Cultura celular

  1. Cultive células aderentes mHypoE-42 em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), com alta concentração de glicose (4500 mg/L), suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal (SBF) inativado pelo calor, 3,7 g/L de bicarbonato de sódio e 1% de solução antibiótica.
  2. Mantenha as células a 37°C em incubadora umidificada contendo 95% de ar e 5% de dióxido de carbono (CO2), utilizando frascos de cultura T75 com volume final de cultura de 10 mL.
    NOTA: Teste cada novo lote de SBF antes de iniciar os experimentos, pois os lotes de soro podem variar.
  3. Subcultive as células quando atingirem aproximadamente 80%–90% de confluência. Lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril 1× (pH 7,4), adicione 3 mL de solução de tripsina a 0,5% e incube por 3–5 min para destacar as células.
  4. Adicione pelo menos o dobro do volume de tripsina de meio de cultura completo contendo 10% (v/v) de SBF para neutralizar a tripsina.
  5. Dilua as células com meio de crescimento fresco em uma proporção de até 1:2.
    NOTA: Evite usar células que tenham passado por passagens excessivas (por exemplo, passagens superiores a 40 para células mHypoE-42). Pré-aqueça todas as soluções antes do uso. Teste regularmente os cultivos quanto à contaminação por micoplasma.
  6. Prossiga com os ensaios de sincronização 24 h após o semeamento das células em 2,0 × 105 células por poço, conforme descrito na Etapa 2. Mantenha os cultivos celulares de rotina com aproximadamente 80%–90% de confluência antes das passagens.

2. Sincronização da Linhagem Celular mHypoE-42

  1. Preparação das células
    1. Após a tripsinização, centrifugar as células a 700 × g por 5 min.
    2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de cultura fresco.
    3. Misturar a suspensão celular com corante azul de tripano na proporção de 1:1 (volume total de 20 μL) e determinar a concentração celular utilizando um hemocitômetro.
      NOTA: Descartar soluções contendo azul de tripano de acordo com as diretrizes institucionais de descarte de resíduos químicos. Não descartar o corante não utilizado na pia.
  2. Plaqueamento celular e delineamento experimental escalonado
    1. Plaquear 2,0 × 105 células por poço em placas de 6 poços ou em placas de cultura de 35 mm. Incubar as culturas a 37°C por 24 h.
      NOTA: Iniciar a sincronização por soro 24 h após o plaqueamento celular. Portanto, não é necessário um grau pré-definido de confluência antes da sincronização. Em vez disso, examinar as culturas microscopicamente para confirmar que as células estão totalmente aderidas e exibem morfologia apropriada antes de iniciar o procedimento de sincronização.
    2. Dividir aleatoriamente as placas de cultura em dois conjuntos experimentais. Utilizar o primeiro conjunto para gerar os pontos de tempo circadianos (CT) CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 e CT32. Utilizar o segundo conjunto para gerar CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 e CT48 (Figura 1; Figura Suplementar 1).
    3. Aumentar o número de poços ou placas conforme necessário para incluir réplicas técnicas.
      NOTA: Minimizar a variabilidade preparando todas as placas a partir da mesma suspensão celular, mantendo densidades de semeadura e condições de cultura idênticas e realizando a sincronização com os mesmos reagentes e condições experimentais. Ajustar o formato do recipiente de cultura e a densidade de plaqueamento conforme necessário para outros tipos celulares. Ao utilizar placas de 6 poços, combinar CTs coletados simultaneamente para otimizar o uso da placa.
  3. Sincronização
    1. Após 24 h, aspirar o meio do primeiro conjunto de placas e adicionar 1 mL de DMEM sem soro. Incubar por 12 h para induzir a privação de soro.
    2. Preparar imediatamente antes do uso uma solução de soro de cavalo a 50% (v/v) em DMEM com alta concentração de glicose.
    3. Aspirar o meio de privação do primeiro conjunto e expor as células a 1 mL da solução recém-preparada de soro de cavalo a 50% por 2 h.
    4. Simultaneamente, aspirar o meio do segundo conjunto de placas e substituí-lo por 1 mL de DMEM sem soro. Incubar por 12 h.
    5. Após o choque com soro de 2 h, aspirar o meio e adicionar 1 mL de DMEM com alta concentração de glicose suplementado com 10% (v/v) de FBS inativado pelo calor. Designar este ponto de tempo como CT0.
  4. Coleta de amostras
    1. Colocar as placas de cultura sobre gelo. Aspirar o meio, lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS 1× frio e estéril, descartar a solução de lavagem e lisar as células mecanicamente utilizando até 1 mL de reagente de lise.
      CAUTELA: O reagente de lise contém substâncias químicas perigosas. Realizar todos os procedimentos de manipulação em capela de exaustão química certificada, utilizando equipamento de proteção individual apropriado. Descartar os resíduos de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química.
    2. Transferir cada lisado para um tubo estéril e armazenar as amostras a −80°C até a extração de RNA.
    3. Repetir os Passos 2.4.1 e 2.4.2 para coletar amostras nos pontos CT4 e CT8.
    4. No CT8, repetir o Passo 2.3.2 para o segundo conjunto experimental a fim de sincronizar as demais células.
    5. Após 2 h de choque com soro, encerrar a sincronização do segundo conjunto experimental substituindo o meio por 1 mL de DMEM com alta concentração de glicose suplementado com 10% (v/v) de FBS inativado pelo calor.
    6. Coletar amostras alternadamente dos dois conjuntos experimentais para obter CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 e CT32. No dia seguinte, repetir o procedimento de coleta para obter CT36, CT40, CT44 e CT48.
      NOTA: A privação de soro e a sincronização foram iniciadas de acordo com a cronologia experimental após o plaqueamento celular, e não em um grau pré-definido de confluência. Confirmar que as células estão totalmente aderidas e exibem morfologia apropriada antes de iniciar a sincronização. Embora os CTs consecutivos difiram em 4 h, as coletas não são realizadas em intervalos de 4 h. Consultar Figura Suplementar 1 para obter o cronograma completo de coleta semanal.

3. Processamento da amostra: Extração de RNA

OBSERVAÇÃO: Os protocolos podem variar dependendo do contexto experimental e da aplicação. O fluxo de trabalho a seguir descreve um exemplo de procedimento eficaz para extração de RNA total, síntese de DNA complementar (cDNA) e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Extraia o RNA total utilizando um método combinado de lise com fenol e separação de fases, seguido por purificação com colunas de sílica em centrífuga.

  1. Preparação da amostra e separação de fases
    1. Descongele as amostras, re-homogeneíze os lisados e incube-os à temperatura ambiente por 5 min.
    2. Adicione 200 μL de clorofórmio para cada 1 mL de reagente de lise.
      CAUTELA: O clorofórmio é volátil e tóxico. Realize todos os procedimentos que envolvam clorofórmio em uma capela de exaustão química certificada, utilizando equipamento de proteção individual apropriado.
    3. Agite os tubos vigorosamente por 15 s e incube-os à temperatura ambiente por 3 min.
    4. Centrifugue as amostras a 12.000 × g por 15 min a 4°C. Deixe as amostras se separarem em três fases: uma fase inferior fenol-clorofórmio contendo proteínas, uma interfase branca contendo DNA e uma fase aquosa superior enriquecida em RNA.
    5. Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo estéril sem perturbar a interfase. Armazene a fase orgânica a 4°C, caso o isolamento subsequente de proteínas ou DNA seja planejado.
      NOTA: Realize o isolamento de proteínas ou DNA de acordo com o protocolo apropriado, caso essas biomoléculas devam ser recuperadas da fase orgânica.
  2. Purificação de RNA
    1. Adicione um volume igual de etanol 70% (preparado com água livre de RNase) à fase aquosa e vortexe duas vezes por 15 s para promover a ligação do RNA.
    2. Carregue a amostra em uma coluna de sílica em formato spin e purifique o RNA de acordo com o fluxo de trabalho de purificação em coluna.
    3. Digira o DNA genômico contaminante com DNase por 15 min à temperatura ambiente.
    4. Lave a coluna utilizando os tampões de lavagem fornecidos.
    5. Realize uma lavagem adicional com 100 μL de tampão de lavagem e centrifugue a 11.000 × g por 2 min para secar a membrana de sílica.
    6. Transfira a coluna spin para um tubo microcentrífugo limpo. Elua o RNA com 40–60 μL de água livre de RNase, aplicando a água diretamente no centro da membrana de sílica e centrifugando a 11.000 × g por 1 min.
      NOTA: Escolha o volume de eluição de acordo com o rendimento e concentração de RNA desejados. Um volume de eluição de 60 μL geralmente proporciona uma recuperação mais completa do RNA da membrana de sílica, mas resulta em uma solução de RNA mais diluída. Em contraste, um volume de eluição de 40 μL produz uma preparação de RNA mais concentrada, mas pode reduzir a recuperação total do RNA. Otimize o volume de eluição de acordo com as recomendações do fabricante e com os requisitos da aplicação a montante.
  3. Avaliação da qualidade do RNA
    1. Coloque as amostras de RNA no gelo e transfira 5 μL de cada amostra para um novo tubo microcentrífugo estéril para avaliação da qualidade.
    2. Avalie a integridade do RNA utilizando eletroforese em gel de agarose 1,5% ou eletroforese capilar. Confirme a presença de bandas distintas de RNA ribossomal 28S e 18S.
    3. Determine a concentração e pureza do RNA medindo a absorbância com um espectrofotômetro.
      NOTA: Descarte resíduos contendo fenol de acordo com as diretrizes institucionais para descarte de resíduos químicos. Não descarte resíduos químicos perigosos na pia. Para amostras de células cultivadas, as concentrações de RNA geralmente variam entre 200 e 1000 ng/μL e são adequadas para síntese de cDNA e qRT-PCR. Aceite amostras de RNA com razão A260/230 entre 2,0 e 2,2 e razão A260/280 de aproximadamente 2,0 (veja Supplementary Table 1).
  4. Armazenamento do RNA
    1. Armazene as amostras purificadas de RNA a −80°C até a síntese de cDNA.

4. Processamento da amostra: síntese de cDNA

OBSERVAÇÃO: Sintetize cDNA a partir de 1 μg de RNA total utilizando um kit de síntese de primeira fita de cDNA. Ajuste os volumes das reações e as condições de incubação de acordo com as instruções do fabricante.

  1. Transcrição reversa
    1. Deixe descongelar as amostras de RNA no gelo. Prepare uma reação de transcrição reversa de 20 μL contendo 1 μg de RNA total, 10 μL de Master Mix 2× (contendo inibidor de ribonuclease, hexameros aleatórios, iniciadores oligo(deoxitimidina), íons magnésio [Mg2+] e trifosfatos de desoxirribonucleotídeo), 2 μL de mistura enzimática (contendo transcriptase reversa) e água tratada com pirocarbonato de dietila até um volume final de 20 μL.
    2. Incube a reação em um termociclador por 10 min a 25°C para hibridização dos iniciadores, seguido por 30 min a 50°C para a síntese de cDNA. Inative a transcriptase reversa incubando a reação a 85°C por 5 min.
    3. Adicione 1 μL de RNase H e incube a reação por 20 min a 37°C para degradar a fita de RNA do híbrido RNA–DNA.
    4. Dilua a preparação de cDNA até 1:20 com água estéril, de acordo com os requisitos de otimização do ensaio, e armazene o cDNA diluído a −20°C até a análise por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).

5. Processamento da amostra: Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR)

OBSERVAÇÃO: Meça a expressão dos genes do relógio circadiano utilizando qRT-PCR. Consulte a Tabela Suplementar 2 para obter as sequências de iniciadores validadas, temperaturas de pareamento e concentrações de iniciadores.

  1. Otimização de ensaio
    1. Valide e otimize a concentração dos primers, a temperatura de annealing e a quantidade de cDNA utilizando amostras de cDNA em pool e uma curva padrão antes de analisar as amostras experimentais. Realize a otimização e validação do ensaio conforme descrito anteriormente.15,16.
  2. Preparação da reação
    1. Prepare cada um 10 μL reação de qRT-PCR combinando 5 μL de mistura mestre 2×, 0.4 μL cada um dos primers direto e reverso, 0.2 μL de água tratada com pirocarbonato de dietila e 4 μL de molde de cDNA em uma placa de PCR de 96 poços.
    2. Selle a placa com uma película ou manta de vedação opticamente transparente. Centrifugue a placa a 700 × g por até 5 min em 4°C para remover bolhas e coletar a mistura de reação no fundo de cada poço.
    3. Analise todas as amostras de cDNA para determinar a expressão dos genes-alvo Bmal1 e Per2.
    4. Analisar o gene de referência selecionado (B2m) utilizando a mesma diluição de cDNA para normalizar a expressão gênica entre as amostras.
  3. Ciclagem térmica
    1. Realize uma qRT-PCR utilizando as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial e ativação da DNA polimerase hot-start a 95°C por 2 min, seguido de 39 ciclos de 95°C por 5 s e 60°C por 30 s.
    2. Realize a análise de curva de dissociação aquecendo as reações a 95°C por 5 s, seguido por aumentos incrementais de 0.5°C para 95°C, mantendo por 5 s em cada incremento.
      OBSERVAÇÃO: Ajuste os tempos de permanência e as configurações da curva de dissociação de acordo com as recomendações da mistura mestra, quando necessário.
  4. Validação de genes de referência
    OBSERVAÇÃO: Em experimentos de sincronização com soro, avalie genes de referência candidatos, pois o tratamento com soro pode alterar a expressão de genes de referência17. Avalie a estabilidade da expressão utilizando métodos como o BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20, ou o método comparativo de ΔCt21. Selecione o(s) gene(s) mais estável(eis) para normalização. Neste estudo, β-actina (Actb) e β-2-microglobulina (B2m) foram avaliados utilizando o software RefFinder22, que integra múltiplos algoritmos de validação de genes de referência. B2m apresentou a maior estabilidade de expressão ao longo do curso temporal circadiano e foi, portanto, selecionado para normalização.
  5. Verificação do produto
    1. Verifique a especificidade da amplificação analisando os produtos da PCR por meio de eletroforese em gel de agarose a 2%.
      OBSERVAÇÃO: Determine a temperatura de pareamento ideal testando múltiplas temperaturas (por exemplo, 58 °C, 60°C, e 62°C). Selecione a temperatura que produz o menor valor de ciclo de quantificação (Cq) mantendo um único pico na curva de dissociação, sem evidência de formação de dímero de iniciadores.
      OBSERVAÇÃO: Aceite ensaios com eficiências de amplificação entre 90% e 110% e um coeficiente de determinação (R2) de 0,99 ou superior. Confirme que as temperaturas de desnaturação diferem em não mais que 0.5°C entre réplicas técnicas. Aceite apenas réplicas técnicas com diferença de Cq ≤0,5 para análise e utilize esses valores para calcular os níveis médios de expressão. Realize todas as reações em réplicas técnicas (por exemplo, triplicatas) e inclua um controle sem modelo e um controle sem transcriptase reversa.

6. Análise de Dados

  1. Análise da expressão gênica
    1. Calcule a média das réplicas técnicas para cada amostra antes da análise subsequente.
    2. Calcule o valor de ΔCq para cada amostra e ponto temporal usando a seguinte equação:
      ΔCq   = Cqgene alvo  -  Cqgene de referência
    3. Calcule o valor de ΔΔCq para cada amostra e ponto temporal usando a seguinte equação:
      ΔΔCq   = ΔCqamostra  -  ΔCqcontrole  
      NOTA: Para o cálculo de ΔΔCq, ΔCqcontrole foi definido como o valor médio de ΔCq obtido pela média de todas as amostras controle em todos os CTs.
    4. Avalie os parâmetros circadianos, incluindo a estatística estimadora da linha média do ritmo (MESOR), amplitude, pico e fase, utilizando o CircaCompare23. Realize a análise usando a aplicação online ou a implementação do pacote em R.
  2. Análise online com CircaCompare
    NOTA: A implementação online relata estimativas completas de parâmetros circadianos somente quando o conjunto de dados satisfaz os critérios estatísticos de ritmicidade. Quando a ritmicidade é fraca ou não estatisticamente significativa, use a implementação em R para obter estimativas de parâmetros para todos os conjuntos de dados.
    1. Prepare um arquivo de valores separados por vírgulas (.csv).
      1. Digite a variável de tempo (numérica; horas) na Coluna 1.
      2. Digite a variável de agrupamento (apenas dois grupos experimentais) na Coluna 2.
      3. Digite a variável de resultado (numérica; ΔΔCq) na Coluna 3.
    2. Carregue o arquivo .csv na aplicação online CircaCompare.
    3. Atribua as variáveis de tempo, grupo e resultado às colunas correspondentes.
    4. Selecione Executar para realizar a análise.
  3. Análise com CircaCompare em R
    1. Realize a análise usando a versão 4.5.1 do R e a versão 0.2.0 do pacote CircaCompare24.
    2. Instale os pacotes R necessários.
      1. Instale o pacote devtools (versão 2.5.2).
      2. Instale o pacote circacompare (versão 0.2.0).
      3. Instale o pacote ggplot2 (versão 4.0.3).
      4. Instale o pacote svglite (versão 2.2.2).
    3. Carregue o arquivo .csv de entrada.
    4. Execute a análise CircaCompare após definir alpha_threshold = 1.
      NOTA: Definir alpha_threshold = 1 relata estimativas de parâmetros circadianos para todas as oscilações ajustadas, independentemente da significância estatística. No entanto, apenas oscilações com valor de p < 0,05 devem ser interpretadas como rítmicas e estatisticamente significativas.
    5. Personalize o Arquivo Suplementar 1 antes de executar o script.
      1. Substitua “XXX.csv” pelo nome do arquivo de dados de entrada.
      2. Substitua “YYY.csv” pelo nome desejado para o arquivo de resultados.
      3. Substitua “ZZZ.svg” pelo nome desejado para o arquivo de gráfico.
      4. Ajuste os limites do eixo y (ylim) e quaisquer outros parâmetros de plotagem de acordo com o conjunto de dados.
    6. Consulte a Tabela Suplementar 3 para um exemplo de arquivo de entrada.

Resultados

A sincronização bem-sucedida é indicada pela ritmicidade circadiana estatisticamente significativa dos genes relógio analisados na condição controle (p < 0,05). Neste estudo, foram realizados três experimentos biológicos independentes, utilizando 0,1% de dimetilsulfóxido como controle negativo. Bmal1 e Per2 foram selecionados como marcadores circadianos representativos porque são componentes centrais do relógio circadiano molecular e exibem um padrão de expressão antifásico bem caracterizado. Os perfis representativos de expressão rítmica obtidos após a sincronização são mostrados na Figura 2. Os parâmetros circadianos correspondentes, incluindo ritmicidade, MESOR, amplitude e horário de pico, estão resumidos na Tabela 1, enquanto a comparação par a par entre Bmal1 e Per2 é apresentada na Tabela 2.

Gráfico da expressão circadiana de mRNA; níveis de Per2/Bmal1 ao longo de 24-48h; análise da expressão gênica rítmica.
Figura 2. Oscilações circadianas de Bmal1 e Per2 após sincronização por choque sérico. Perfis representativos de expressão circadiana de Bmal1 (azul escuro) e Per2 (azul claro) em células mHypoE-42 sincronizadas, medidos por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) entre 24 e 48 h após a sincronização. As curvas representam os modelos circadianos ajustados gerados utilizando o CircaCompare.Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

GeneRitmicidade
(p-value)		MESORAmplitudeHorário do pico
(h)
Bmal10.0205−0.29480.464820.4239
Per20.0071−0.3180.46299.4883
Bmal1 + Composto A0.1068———

Tabela 1: Parâmetros do ritmo circadiano estimados para Bmal1 e Per2 em condições basais e para Bmal1 após tratamento com o Composto A. A ritmicidade circadiana foi avaliada utilizando o CircaCompare. A tabela apresenta o valor de p para ritmicidade, a estatística média estimada do ritmo (MESOR), a amplitude e o horário de pico para cada condição. Os parâmetros circadianos não são relatados para Bmal1 após o tratamento com o Composto A porque a ritmicidade não foi estatisticamente significativa (p = 0,1068).

Estimativa da diferença de MESOR
(p-valor)		Estimativa da diferença de amplitude
(p-valor)		Estimativa da diferença de fase
(p-valor)		Período compartilhado
(h)
−0.0232 (p = 0.8904)−0.0019 (p = 0.9936)−10.9356 (p = 2,3155 × 10⁻6)24

Tabela 2: Comparação par a par dos parâmetros circadianos entre Bmal1 e Per2. Comparação par a par da estatística média estimada do ritmo (MESOR), amplitude e fase entre os perfis ajustados de expressão circadiana de Bmal1 e Per2, conforme estimado usando o CircaCompare. Os valores são apresentados como diferenças entre parâmetros com os respectivos valores de p. O período compartilhado foi fixado em 24 h durante o ajuste do modelo.

Em condições basais, tanto Bmal1 quanto Per2 exibiram ritmicidade estatisticamente significativa (Bmal1: p = 0,0205; Per2: p = 0,0071). A análise CircaCompare demonstrou ainda que os dois genes oscilam em fases opostas, com uma diferença de fase de −10,9356 h (p = 2,3155 × 10⁻6), compatível com a relação antifásica esperada dentro da rede molecular do relógio circadiano. As métricas de qualidade do RNA que sustentam a análise de expressão gênica subsequente estão fornecidas na Tabela Suplementar 1.

O protocolo também pode ser aplicado para comparar a ritmicidade circadiana entre condições experimentais, incluindo modelos de saudável versus doença ou grupos de controle versus tratamento. Como exemplo representativo, um contaminante ambiental emergente e disruptor endócrino previamente detectado no hipotálamo humano foi avaliado e é referido aqui como Composto A. Os resultados representativos são mostrados na Figura 3, e a análise correspondente da ritmicidade é resumida na Tabela 1.

Gráfico de expressão de RNA ao longo do tempo; mRNA (ΔΔCq) versus tempo; controle versus Composto A; análise de dados.
Figura 3. Efeito do Composto A na ritmicidade circadiana da expressão de Bmal1. Perfil representativo da expressão de Bmal1 em células mHypoE-42 sincronizadas após tratamento com o Composto A, medido por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). As curvas representam os modelos circadianos ajustados gerados usando o CircaCompare. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Após a exposição ao Composto A, Bmal1 não exibiu mais ritmicidade estatisticamente significativa (p = 0,1068). Nessas condições, o modelo circadiano ajustado não atendeu aos critérios estatísticos para ritmicidade. Consequentemente, parâmetros circadianos como MESOR, amplitude e horário de pico não são relatados, pois não são considerados biologicamente interpretáveis quando a ritmicidade não é estatisticamente significativa. Este exemplo ilustra como o fluxo de trabalho pode distinguir perfis de expressão rítmicos de não rítmicos e pode ser utilizado para avaliar possíveis alterações na expressão gênica circadiana sob diferentes condições experimentais. Para minimizar a variabilidade técnica potencial associada à estratégia de amostragem escalonada, todas as placas de cultura foram preparadas a partir da mesma suspensão celular, mantidas sob condições de cultivo idênticas e sincronizadas utilizando o mesmo fluxo de trabalho experimental, diferindo apenas no momento da sincronização.

Figura Suplementar 1. Cronograma semanal do protocolo de sincronização escalonada. Linha do tempo semanal representativa ilustrando o plaqueamento celular, privação de soro, sincronização por choque de soro, interrupção da sincronização e coleta de amostras circadianas para os dois conjuntos experimentais escalonados (Conjunto 1, roxo; Conjunto 2, verde). O delineamento escalonado permite a coleta dos pontos de tempo circadianos (CT) CT0–CT48 durante o horário normal de trabalho, evitando a coleta de amostras durante a noite. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1. Métricas de qualidade do RNA para todas as amostras biológicas incluídas no experimento de curso temporal circadiano. A pureza do RNA foi avaliada por meio das razões de absorvância A260/A280 e A260/A230, e a concentração de RNA foi determinada espectrofotometricamente antes da síntese de DNA complementar (cDNA). As amostras são identificadas pelo horário de coleta, grupo de tratamento e replicata biológica. Essas medições foram utilizadas para verificar a qualidade do RNA antes da análise posterior de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2. Sequências de iniciadores e condições de amplificação utilizadas para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). As sequências dos iniciadores oligonucleotídicos direto e reverso são apresentadas na orientação 5′-3′, juntamente com os respectivos números de acesso do NCBI, temperatura de pareamento e concentração dos iniciadores utilizados para amplificação de cada gene alvo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3. Conjunto de dados de exemplo para análise de ritmo circadiano usando o CircaCompare. Exemplo de conjunto de dados em formato de valores separados por vírgulas (CSV) formatado para análise com o CircaCompare. O conjunto de dados contém três variáveis obrigatórias: Tempo (h), Grupo e Resultado (ΔΔCq), correspondentes ao formato descrito no protocolo de Análise de Dados e utilizado como arquivo de entrada de exemplo para a estimativa de parâmetros circadianos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1. Exemplo de script R para análise de ritmo circadiano usando o CircaCompare. Exemplo de script R para análise de dados de expressão gênica circadiana utilizando o pacote CircaCompare (versão 0,2,0) em R (versão 4,5,1). O script importa o conjunto de dados de entrada, realiza a estimativa de parâmetros circadianos com um período de 24 h, exporta o resumo estatístico e gera um gráfico com qualidade para publicação. Antes do uso, substitua os nomes de arquivos fictícios (XXX.csv, YYY.csv e ZZZ.svg) pelos nomes desejados de arquivos de entrada e saída e ajuste os parâmetros de plotagem (por exemplo, ylim) conforme apropriado para o conjunto de dados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Os ritmos circadianos são ciclos endógenos de aproximadamente 24 h que regulam uma ampla gama de processos fisiológicos, metabólicos e celulares por meio de mecanismos moleculares conservados do relógio biológico1,2. Modelos de sincronização in vitro fornecem um ambiente experimental controlado para investigar esses mecanismos e tornaram-se ferramentas valiosas para estudar a regulação circadiana em condições normais e patológicas, incluindo exposição a contaminantes ambientais e outras perturbações experimentais25. O protocolo apresentado aqui descreve um fluxo de trabalho prático para sincronizar células cultivadas por choque sérico, coletar amostras em curso temporal usando uma estratégia de amostragem escalonada e quantificar a expressão gênica circadiana por qRT-PCR. Este fluxo de trabalho é particularmente adequado para estudos que exigem perfilagem da expressão gênica ao longo do tempo, minimizando ao mesmo tempo os desafios logísticos associados à coleta de amostras durante a noite. Vários passos críticos determinam o sucesso e a reprodutibilidade deste protocolo. O controle adequado da confluência celular, privação de soro, duração do choque sérico e condições de sincronização é essencial, pois uma sincronização inadequada pode resultar em ritmicidade fraca ou indetectável14. A densidade consistente de semeadura celular, a preparação de todas as placas experimentais a partir da mesma suspensão celular e as condições de cultivo idênticas entre os conjuntos experimentais escalonados reduzem ainda mais a variabilidade técnica. A qualidade do RNA, a síntese de cDNA, a validação de primers e a seleção de genes de referência estáveis também são determinantes importantes para resultados confiáveis de qRT-PCR. Como em qualquer protocolo de sincronização circadiana, a otimização desses parâmetros pode ser necessária ao adaptar o fluxo de trabalho a diferentes tipos celulares ou condições experimentais.

Embora o choque sérico seja um dos métodos de sincronização mais amplamente estabelecidos na biologia circadiana4,26, ele não é universalmente ideal para todas as aplicações experimentais. Abordagens alternativas de sincronização, incluindo tratamento com dexametasona, estimulação com forskolina, sincronização térmica e sistemas baseados em repórteres, podem ser mais apropriadas dependendo do modelo biológico e do objetivo da pesquisa14. Esses métodos devem ser considerados complementares e não concorrentes, pois cada um possui vantagens e limitações distintas. O choque sérico oferece um equilíbrio prático entre simplicidade experimental, acessibilidade e reprodutibilidade, sem exigir instrumentação especializada ou sistemas de repórteres geneticamente codificados. No entanto, os pesquisadores devem considerar cuidadosamente a influência potencial do estímulo de sincronização em seu sistema biológico e escolher a abordagem que melhor atenda à sua questão experimental. Protocolos de choque sérico que omitam a etapa de privação de soro também já foram descritos e podem representar alternativas adequadas em contextos experimentais específicos27. A flexibilidade deste protocolo permite diversas modificações e estratégias de solução de problemas. O delineamento de amostragem escalonada baseia-se em placas de cultura paralelas sincronizadas em momentos diferentes para gerar CTs complementares, evitando ao mesmo tempo a coleta de amostras durante a noite. Para minimizar a variabilidade entre placas, prepare todas as placas a partir da mesma suspensão celular, semeie-as com densidades idênticas, mantenha condições de cultura idênticas e realize a sincronização utilizando o mesmo fluxo experimental, diferindo apenas no momento da sincronização. Embora esta abordagem não consiga eliminar completamente a variação relacionada a lotes, ela minimiza a variabilidade técnica enquanto reduz substancialmente os desafios logísticos associados à coleta noturna de amostras, preservando a capacidade de detectar ritmos circadianos biologicamente significativos. Embora a estratégia de amostragem escalonada tenha sido projetada para minimizar a variabilidade técnica ao manter condições de cultura idênticas em todos os conjuntos experimentais, ela não foi comparada diretamente com um delineamento convencional de amostragem contínua no presente estudo. Estudos futuros podem avaliar mais amplamente a equivalência dessas abordagens em outros modelos experimentais. Ao adaptar este fluxo de trabalho a novos tipos celulares ou condições experimentais, otimize a eficiência de sincronização e avalie possíveis efeitos de lote durante a validação do protocolo. Dependendo do objetivo experimental, modifique o cronograma de sincronização ajustando os horários iniciais ou mantendo uma única cultura sincronizada com uma janela de amostragem reduzida. Estratégias de solução de problemas incluem a otimização da duração do choque sérico, verificação da viabilidade celular e confluência antes da sincronização, confirmação da qualidade do RNA antes da análise subsequente e ajuste dos intervalos de amostragem para melhorar a detecção de ritmos circadianos. O presente protocolo foi validado na linhagem celular hipotalâmica embrionária de camundongo mHypoE-42 e, portanto, deve ser otimizado e validado independentemente antes de sua aplicação a outros modelos celulares. Embora não tenha sido avaliado no presente estudo, este protocolo foi desenvolvido com base em otimizações anteriores realizadas em nosso laboratório com outras linhagens celulares (por exemplo, células N2a e fibroblastos humanos), o que sustenta sua possível aplicabilidade a diferentes modelos celulares. Da mesma forma, a estratégia de amostragem escalonada melhora substancialmente a viabilidade experimental ao permitir a coleta completa de dados circadianos durante o horário normal de trabalho; no entanto, os usuários devem manter condições experimentais idênticas em todas as placas de cultura para minimizar possíveis efeitos de lote. Quando devidamente otimizado, este fluxo de trabalho fornece uma abordagem acessível e reprodutível para investigar a expressão gênica circadiana e avaliar intervenções experimentais que alteram a função do relógio molecular em uma ampla gama de aplicações de pesquisa.

Apesar de suas vantagens práticas, este método apresenta várias limitações. A estratégia de amostragem escalonada fornece medições em pontos de tempo discretos, em vez de monitoramento contínuo, o que reduz a resolução temporal em comparação com ensaios de repórter baseados em fluorescência ou bioluminescência7. Consequentemente, a precisão na estimativa do período e a detecção de pequenas alterações de fase ou oscilações de baixa amplitude podem ser reduzidas. Além disso, o fluxo de trabalho baseado em placas torna-se cada vez mais trabalhoso à medida que aumenta o número de tratamentos ou condições experimentais, pois placas de cultura adicionais são necessárias para cada condição. Entre as metodologias existentes, este fluxo de trabalho oferece uma alternativa prática aos sistemas baseados em repórter, incluindo ensaios de luciferase acionados por caixas E (por exemplo, Bmal1-Luc e Per2-Luc), que permitem o monitoramento em tempo real da atividade circadiana em células vivas28,29. Embora os sistemas de repórter baseados em fluorescência e bioluminescência ofereçam alta resolução temporal e sejam particularmente úteis para triagem em alta escala de moduladores circadianos candidatos, eles exigem modificação genética estável, equipamentos especializados de detecção e condições ambientais rigorosamente controladas30, o que pode não estar disponível em todos os laboratórios. Além disso, os sistemas de repórter geralmente são restritos a construtos de repórter pré-definidos e podem exigir normalização em relação a sinais constitutivos ou à abundância celular, limitando a avaliação simultânea de múltiplos genes ou análises moleculares downstream. Em contraste, o fluxo de trabalho descrito aqui é compatível com múltiplas aplicações downstream, incluindo análise quantitativa de expressão gênica e ensaios baseados em proteínas, tornando-o uma abordagem acessível e versátil para laboratórios que investigam a regulação molecular circadiana.

Após a coleta das amostras e as análises subsequentes, a avaliação estatística apropriada é essencial para determinar se as oscilações observadas são estatisticamente significativas e biologicamente relevantes. Neste protocolo, o CircaCompare fornece uma estrutura robusta para estimar e comparar estatisticamente o MESOR, a amplitude e a fase, utilizando modelos de regressão baseados no cosinor23. Diferentemente de abordagens que avaliam apenas a ritmicidade, o CircaCompare permite comparações diretas em pares dos parâmetros circadianos entre grupos experimentais, facilitando a avaliação de efeitos de tratamentos, perturbações genéticas ou alterações associadas a doenças no comportamento circadiano. Este fluxo de trabalho analítico complementa o protocolo de sincronização ao fornecer medidas quantitativas padronizadas para interpretar mudanças na expressão gênica circadiana. Como demonstrado nos Resultados Representativos, a sincronização bem-sucedida foi indicada pelos padrões esperados de expressão oscilatória do RNA mensageiro (mRNA) de Bmal1 e Per2 após choque sérico (Figura 2). Em contraste, a exposição ao Composto A resultou na perda da ritmicidade estatisticamente significativa de Bmal1 (Figura 3), ilustrando a utilidade deste fluxo de trabalho para avaliar intervenções experimentais que alteram a expressão gênica circadiana. Uma consideração importante ao interpretar dados de expressão gênica circadiana é a variabilidade biológica entre experimentos independentes. Neste estudo, os resultados representativos foram obtidos a partir de réplicas biológicas independentes realizadas em diferentes dias e em diferentes passagens celulares. Consequentemente, um certo grau de variabilidade é esperado e reflete variação biológica, e não técnica. Por esse motivo, experimentos de sincronização devem incluir réplicas biológicas independentes e ser interpretados no contexto da variabilidade biológica esperada do modelo celular em estudo. Apesar dessa variabilidade, a ritmicidade estatisticamente significativa e a relação antifásica esperada entre Bmal1 e Per2 foram consistentemente observadas. Além disso, características circadianas, como amplitude da oscilação, fase, comprimento do período e taxa de amortecimento, variam entre modelos celulares. Portanto, o desempenho da sincronização deve ser avaliado no contexto do tipo celular específico em estudo, e não por meio de comparação direta com modelos não relacionados.

Este fluxo de trabalho é particularmente relevante para investigar o papel dos ritmos circadianos nos mecanismos de doenças e nas respostas terapêuticas. A desregulação da sincronização circadiana tem sido implicada em diversas condições patológicas, incluindo câncer, distúrbios metabólicos e doenças neurodegenerativas31,32. A capacidade de avaliar a expressão gênica rítmica ou a abundância proteica in vitro fornece uma estrutura prática para investigar esses processos e para avaliar os efeitos de intervenções farmacológicas no relógio molecular circadiano, que é cada vez mais reconhecido como um possível alvo terapêutico14,33. Por exemplo, este protocolo pode ser aplicado para examinar como moduladores candidatos influenciam a expressão gênica circadiana em modelos celulares relevantes para doenças, após otimização e validação adequadas. É importante destacar que o objetivo do presente trabalho não é defender o choque sérico como substituto de outros métodos de sincronização, nem sugerir sua superioridade em relação a abordagens alternativas. Em vez disso, este protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado e reprodutível para implementar uma estratégia de sincronização amplamente utilizada, coletar amostras circadianas durante o horário de trabalho habitual utilizando um delineamento de amostragem escalonado e analisar a expressão gênica rítmica com metodologias acessíveis de análise posterior. Prevemos que esta estrutura será particularmente útil para laboratórios que estejam iniciando experimentos circadianos ou que busquem um fluxo de trabalho prático, reprodutível e acessível para incorporar análises temporais em modelos celulares já existentes.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi cofinanciado pela União Europeia (UE) através da Facilidade de Recuperação e Resiliência e por fundos nacionais portugueses através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito dos projetos LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025) e UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025); pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Operacional Regional Centro 2030 no âmbito do projeto CENTRO2030-FEDER-02360200; e por fundos nacionais portugueses através da FCT no âmbito das bolsas 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD) e 2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura celular de 6 poçosNest Biotechnology15140122Placa de cultura celular
AgaroseNZYtechMB02702Avaliação da qualidade de RNA
Mistura antibiótica (penicilina/estreptomicina)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Suplemento para cultura celular
Kit de síntese de cDNA (primeiro filamento)NZYtechMB12502Transcrição reversa
ClorofórmioSigma-AldrichA5256701Reagente de separação de fases
DMEM, glicose alta (4500 mg/L de glicose, L-glutamina)Sigma-Aldrich26050088Meio de cultura celular
Tubos microcentrífugos EppendorfEppendorf30120086Armazenamento de amostras
Etanol (96%)Fisher Bioreagents15552393Purificação de RNA
Soro bovino fetal, inativado pelo calorGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Suplemento para cultura celular
Placa PCR de 96 poços com revestimento rígidoBio-Rad LaboratoriesHSP9601Placa para qRT-PCR
Soro de cavalo, inativado pelo calorGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Sincronização por choque sérico
Linhagem celular mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Linhagem celular hipotalâmica de camundongo embrionário
Primeres de oligonucleotídeosNZYtechMB12501Primeres para qRT-PCR
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Lavagem celular
qPCR Green Master Mix (2×)NZYtechMB22403Reagente para qRT-PCR
Sistema de detecção de PCR em tempo realBio-Rad LaboratoriesEP0030108116Instrumento para qRT-PCR
Kit de isolamento de RNANZYtech288306Purificação em coluna de sílica por centrifugação
Reagente de lise de RNANZYtechMB18502Reagente de extração de RNA baseado em fenol
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichMB22401Suplemento para meio de cultura celular
Placa de cultura estéril de 35 mmThermo Fisher Scientific121VPlaca de cultura celular
Ciclador térmico T100Bio-Rad Laboratories1861096Síntese de cDNA
Frasco de cultura de tecidos T75Corning430641URecipiente para cultura celular
Solução de azul de tripano (0,4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Contagem celular
Tripsina-EDTA (0,5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Dissociação celular

Referências

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