É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Ritmos Circadianos em uma Placa de Petri: Sincronizando Células mHypoE-42 do Hipotálamo de Camundongo para Análise da Expressão de Genes do Relógio Circadiano

237 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/72039

⸱

3 de setembro de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNC-UC-Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 2CiBB-Centre for Innovative Biomedicine and Biotechnology, University of Coimbra, 3Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, 4Gene Therapy Center of Excellence (GeneT), University of Coimbra, 5Institute for Interdisciplinary Research (IIIUC), University of Coimbra

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho prático e reprodutível para sincronizar células cultivadas, realizar coletas amostrais escalonadas em um período de 24–72 h sem coleta noturna e analisar a expressão de genes do relógio circadiano.

Resumo

Ritmos circadianos são oscilações endógenas de aproximadamente 24 h que regulam uma ampla gama de processos celulares e fisiológicos, incluindo expressão gênica, metabolismo e comportamento. Esses ritmos surgem de laços de retroalimentação transcricionais e traducionais interconectados que respondem a sinais temporais e ambientais. Como a regulação circadiana é altamente dinâmica, mesmo pequenas variações experimentais podem influenciar fase, amplitude e ritmicidade, tornando essenciais fluxos de trabalho experimentais padronizados para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis. O objetivo do presente protocolo é fornecer um fluxo de trabalho prático e reprodutível para sincronizar células cultivadas, realizar coletas seriadas ao longo do tempo e analisar a expressão de genes do relógio circadiano sob condições laboratoriais padrão. O protocolo descreve a sincronização baseada em choque sérico, coleta escalonada de amostras ao longo de 24–72 h para evitar coletas noturnas, extração de ácido ribonucleico, síntese de ácido desoxirribonucleico complementar, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real e análise de ritmo circadiano utilizando abordagens estatísticas apropriadas. O fluxo de trabalho também destaca considerações experimentais críticas, incluindo condições de sincronização, avaliação da qualidade das amostras, seleção de genes de referência e análise de dados, para melhorar a reprodutibilidade entre experimentos. Este método oferece uma abordagem acessível para investigar mecanismos moleculares circadianos e avaliar a expressão gênica rítmica em células cultivadas, facilitando estudos sobre regulação circadiana em modelos experimentais fisiológicos e relacionados a doenças.

Introdução

Os ritmos circadianos são ciclos endógenos com um período de aproximadamente 24 h que regulam uma ampla gama de processos fisiológicos, metabólicos e celulares1. Em sistemas de mamíferos, esses ritmos são coordenados por um relógio central localizado no núcleo supraquiasmático (NSQ) do hipotálamo e por relógios moleculares auto-sustentados no nível celular. Esses relógios consistem em laços de retroalimentação transcricionais–traducionais entrelaçados que envolvem genes-relógio centrais, incluindo a proteína circadiana de ciclos de atividade motora kaput (Clock), helice básica-loop-hélice semelhante ao translocador nuclear do receptor de hidrocarbonetos arílicos 1 (Bmal1), período (Per) e criptocromo (Cry)2. Dado o papel central do relógio circadiano em diversos processos biológicos, modelos celulares in vitro tornaram-se ferramentas importantes para investigar os mecanismos moleculares da regulação temporal sob condições experimentais controladas.

O objetivo do presente protocolo é fornecer um fluxo de trabalho confiável, prático e reprodutível para sincronizar células cultivadas utilizando um protocolo de choque sérico, realizar coletas amostrais em curso temporal escalonado e analisar a expressão de genes do relógio circadiano, evitando a coleta de amostras durante a noite. Ao melhorar a viabilidade da coleta circadiana sem comprometer a qualidade dos dados, este fluxo de trabalho tem como finalidade facilitar estudos de processos biológicos rítmicos utilizando técnicas laboratoriais convencionais.

Estudos circadianos têm sido realizados em uma ampla variedade de modelos in vitro, incluindo linhagens celulares de câncer humano3, fibroblastos de rat-14, explantes de SCN 5 e organoides6. Embora a maioria das células de mamíferos possua relógios circadianos funcionais, a ausência de sinais sincronizadores, como a luz, leva rapidamente à dessincronização em cultura, limitando o estudo de ritmos circadianos in vitro7. Portanto, técnicas de sincronização são essenciais para investigar os mecanismos do relógio molecular e suas implicações na saúde e na doença.

Várias estratégias de sincronização foram desenvolvidas para células de mamíferos cultivadas. A sincronização baseada em glicocorticoides utilizando dexametasona está entre as abordagens mais amplamente utilizadas, pois redefinir robustamente os ritmos circadianos em muitos tipos celulares, ao mesmo tempo que reduz parte da variabilidade associada à estimulação com soro8. De forma semelhante, a ativação mediada por forskolina da sinalização do monofosfato de adenosina cíclico tem sido usada com sucesso para sincronizar relógios periféricos em modelos celulares selecionados9. Outras abordagens incluem tratamento com sinais transportados pelo sangue4, diferentes compostos químicos8,10, troca de meio3, choque térmico11, ciclos de oxigênio12 e estimulação mecânica13. Em conjunto, esses métodos avançaram substancialmente a pesquisa circadiana; no entanto, podem exigir equipamentos especializados, condições experimentais específicas ou otimização adicional, tornando importante validar a estratégia de sincronização escolhida para cada modelo biológico e aplicação experimental14.

O choque sérico é uma das abordagens de sincronização mais amplamente estabelecidas e consiste em expor células cultivadas a um estímulo de soro em alta concentração por um período curto4. Como o estímulo é transitório, a perturbação prolongada das vias de sinalização celular é minimizada4, reduzindo possíveis efeitos confundidores em análises posteriores. Consequentemente, o choque sérico é particularmente adequado para estudos de expressão gênica circadiana e função do relógio molecular. Além disso, o procedimento é simples de implementar e não requer equipamentos especializados, tornando-o acessível e facilmente reprodutível entre laboratórios. Uma limitação prática dos experimentos com choque sérico, no entanto, é a programação intensiva de coleta necessária para caracterizar com precisão a ritmicidade circadiana. A análise confiável de ritmos normalmente exige a coleta de amostras em intervalos regulares, geralmente a cada 2–6 h durante um ou mais ciclos circadianos (24–72 h)14, frequentemente exigindo coletas noturnas.

O fluxo de trabalho descrito aqui aborda esse desafio logístico ao escalonar a iniciação da sincronização em várias placas de cultura, permitindo assim a coleta completa de amostras circadianas durante o horário normal de trabalho e evitando a coleta de amostras durante a noite. Em vez de introduzir uma nova estratégia de sincronização, este protocolo fornece uma implementação detalhada e reprodutível de um método estabelecido de choque sérico, combinado com um cronograma prático de coleta de amostras e análise subsequente da expressão gênica. Este fluxo de trabalho é particularmente adequado para estudos de expressão gênica circadiana em células cultivadas, utilizando técnicas laboratoriais amplamente disponíveis. Ao adaptar o protocolo a outros modelos celulares, os parâmetros experimentais, incluindo densidade celular, condições de sincronização, intervalos de coleta e seleção de genes de referência, devem ser otimizados e validados para o tipo celular específico antes da implementação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O protocolo a seguir descreve um método validado de sincronização para a linhagem celular hipotalâmica embrionária de camundongo mHypoE-42. Valide e otimize independentemente o protocolo de sincronização antes de aplicá-lo a outros tipos celulares cultivados. Veja Figura 1 para uma visão geral do fluxo de trabalho e Figura Suplementar 1 para o cronograma semanal de coleta de amostras. Consulte a Tabela de Materiais para obter todos os reagentes, equipamentos e instrumentos utilizados neste protocolo. Realize todos os procedimentos de cultura celular em uma cabine de segurança biológica certificada, utilizando reagentes e equipamentos estéreis.

Diagrama do processo de sincronização celular, método de choque sérico, linha do tempo, configuração experimental, intervalos CT.
Figura 1. Visão esquemática do protocolo de sincronização por choque sérico escalonado. Esquema que ilustra o fluxo de trabalho utilizado para sincronizar células mHypoE-42 por choque sérico em dois conjuntos experimentais escalonados. O desenho escalonado permite a coleta de amostras circadianas durante o horário normal de trabalho, evitando coletas noturnas. As amostras são posteriormente processadas para extração de RNA, reação de polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR) e análise de ritmo circadiano. Criado com Biorender.com. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

1. Cultura celular

  1. Cultive células aderentes mHypoE-42 em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), com alta concentração de glicose (4500 mg/L), suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal (SBF) inativado pelo calor, 3,7 g/L de bicarbonato de sódio e 1% de solução antibiótica.
  2. Mantenha as células a 37°C em incubadora umidificada contendo 95% de ar e 5% de dióxido de carbono (CO2), utilizando frascos de cultura T75 com volume final de cultura de 10 mL.
    NOTA: Teste cada novo lote de SBF antes de iniciar os experimentos, pois os lotes de soro podem variar.
  3. Subcultive as células quando atingirem aproximadamente 80%–90% de confluência. Lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril 1× (pH 7,4), adicione 3 mL de solução de tripsina a 0,5% e incube por 3–5 min para destacar as células.
  4. Adicione pelo menos o dobro do volume de tripsina de meio de cultura completo contendo 10% (v/v) de SBF para neutralizar a tripsina.
  5. Dilua as células com meio de crescimento fresco em uma proporção de até 1:2.
    NOTA: Evite usar células que tenham passado por passagens excessivas (por exemplo, passagens superiores a 40 para células mHypoE-42). Pré-aqueça todas as soluções antes do uso. Teste regularmente os cultivos quanto à contaminação por micoplasma.
  6. Prossiga com os ensaios de sincronização 24 h após o semeamento das células em 2,0 × 105 células por poço, conforme descrito na Etapa 2. Mantenha os cultivos celulares de rotina com aproximadamente 80%–90% de confluência antes das passagens.

2. Sincronização da Linhagem Celular mHypoE-42

  1. Preparação das células
    1. Após a tripsinização, centrifugar as células a 700 × g por 5 min.
    2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 10 mL de meio de cultura fresco.
    3. Misturar a suspensão celular com corante azul de tripano na proporção de 1:1 (volume total de 20 μL) e determinar a concentração celular utilizando um hemocitômetro.
      NOTA: Descartar soluções contendo azul de tripano de acordo com as diretrizes institucionais de descarte de resíduos químicos. Não descartar o corante não utilizado na pia.
  2. Plaqueamento celular e delineamento experimental escalonado
    1. Plaquear 2,0 × 105 células por poço em placas de 6 poços ou em placas de cultura de 35 mm. Incubar as culturas a 37°C por 24 h.
      NOTA: Iniciar a sincronização por soro 24 h após o plaqueamento celular. Portanto, não é necessário um grau pré-definido de confluência antes da sincronização. Em vez disso, examinar as culturas microscopicamente para confirmar que as células estão totalmente aderidas e exibem morfologia apropriada antes de iniciar o procedimento de sincronização.
    2. Dividir aleatoriamente as placas de cultura em dois conjuntos experimentais. Utilizar o primeiro conjunto para gerar os pontos de tempo circadianos (CT) CT0, CT4, CT8, CT24, CT28 e CT32. Utilizar o segundo conjunto para gerar CT12, CT16, CT20, CT36, CT40, CT44 e CT48 (Figura 1; Figura Suplementar 1).
    3. Aumentar o número de poços ou placas conforme necessário para incluir réplicas técnicas.
      NOTA: Minimizar a variabilidade preparando todas as placas a partir da mesma suspensão celular, mantendo densidades de semeadura e condições de cultura idênticas e realizando a sincronização com os mesmos reagentes e condições experimentais. Ajustar o formato do recipiente de cultura e a densidade de plaqueamento conforme necessário para outros tipos celulares. Ao utilizar placas de 6 poços, combinar CTs coletados simultaneamente para otimizar o uso da placa.
  3. Sincronização
    1. Após 24 h, aspirar o meio do primeiro conjunto de placas e adicionar 1 mL de DMEM sem soro. Incubar por 12 h para induzir a privação de soro.
    2. Preparar imediatamente antes do uso uma solução de soro de cavalo a 50% (v/v) em DMEM com alta concentração de glicose.
    3. Aspirar o meio de privação do primeiro conjunto e expor as células a 1 mL da solução recém-preparada de soro de cavalo a 50% por 2 h.
    4. Simultaneamente, aspirar o meio do segundo conjunto de placas e substituí-lo por 1 mL de DMEM sem soro. Incubar por 12 h.
    5. Após o choque com soro de 2 h, aspirar o meio e adicionar 1 mL de DMEM com alta concentração de glicose suplementado com 10% (v/v) de FBS inativado pelo calor. Designar este ponto de tempo como CT0.
  4. Coleta de amostras
    1. Colocar as placas de cultura sobre gelo. Aspirar o meio, lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS 1× frio e estéril, descartar a solução de lavagem e lisar as células mecanicamente utilizando até 1 mL de reagente de lise.
      CAUTELA: O reagente de lise contém substâncias químicas perigosas. Realizar todos os procedimentos de manipulação em capela de exaustão química certificada, utilizando equipamento de proteção individual apropriado. Descartar os resíduos de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química.
    2. Transferir cada lisado para um tubo estéril e armazenar as amostras a −80°C até a extração de RNA.
    3. Repetir os Passos 2.4.1 e 2.4.2 para coletar amostras nos pontos CT4 e CT8.
    4. No CT8, repetir o Passo 2.3.2 para o segundo conjunto experimental a fim de sincronizar as demais células.
    5. Após 2 h de choque com soro, encerrar a sincronização do segundo conjunto experimental substituindo o meio por 1 mL de DMEM com alta concentração de glicose suplementado com 10% (v/v) de FBS inativado pelo calor.
    6. Coletar amostras alternadamente dos dois conjuntos experimentais para obter CT12, CT24, CT16, CT28, CT20 e CT32. No dia seguinte, repetir o procedimento de coleta para obter CT36, CT40, CT44 e CT48.
      NOTA: A privação de soro e a sincronização foram iniciadas de acordo com a cronologia experimental após o plaqueamento celular, e não em um grau pré-definido de confluência. Confirmar que as células estão totalmente aderidas e exibem morfologia apropriada antes de iniciar a sincronização. Embora os CTs consecutivos difiram em 4 h, as coletas não são realizadas em intervalos de 4 h. Consultar Figura Suplementar 1 para obter o cronograma completo de coleta semanal.

3. Processamento da amostra: Extração de RNA

OBSERVAÇÃO: Os protocolos podem variar dependendo do contexto experimental e da aplicação. O fluxo de trabalho a seguir descreve um exemplo de procedimento eficaz para extração de RNA total, síntese de DNA complementar (cDNA) e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Extraia o RNA total utilizando um método combinado de lise com fenol e separação de fases, seguido por purificação com colunas de sílica em centrífuga.

  1. Preparação da amostra e separação de fases
    1. Descongele as amostras, re-homogeneíze os lisados e incube-os à temperatura ambiente por 5 min.
    2. Adicione 200 μL de clorofórmio para cada 1 mL de reagente de lise.
      CAUTELA: O clorofórmio é volátil e tóxico. Realize todos os procedimentos que envolvam clorofórmio em uma capela de exaustão química certificada, utilizando equipamento de proteção individual apropriado.
    3. Agite os tubos vigorosamente por 15 s e incube-os à temperatura ambiente por 3 min.
    4. Centrifugue as amostras a 12.000 × g por 15 min a 4°C. Deixe as amostras se separarem em três fases: uma fase inferior fenol-clorofórmio contendo proteínas, uma interfase branca contendo DNA e uma fase aquosa superior enriquecida em RNA.
    5. Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo estéril sem perturbar a interfase. Armazene a fase orgânica a 4°C, caso o isolamento subsequente de proteínas ou DNA seja planejado.
      NOTA: Realize o isolamento de proteínas ou DNA de acordo com o protocolo apropriado, caso essas biomoléculas devam ser recuperadas da fase orgânica.
  2. Purificação de RNA
    1. Adicione um volume igual de etanol 70% (preparado com água livre de RNase) à fase aquosa e vortexe duas vezes por 15 s para promover a ligação do RNA.
    2. Carregue a amostra em uma coluna de sílica em formato spin e purifique o RNA de acordo com o fluxo de trabalho de purificação em coluna.
    3. Digira o DNA genômico contaminante com DNase por 15 min à temperatura ambiente.
    4. Lave a coluna utilizando os tampões de lavagem fornecidos.
    5. Realize uma lavagem adicional com 100 μL de tampão de lavagem e centrifugue a 11.000 × g por 2 min para secar a membrana de sílica.
    6. Transfira a coluna spin para um tubo microcentrífugo limpo. Elua o RNA com 40–60 μL de água livre de RNase, aplicando a água diretamente no centro da membrana de sílica e centrifugando a 11.000 × g por 1 min.
      NOTA: Escolha o volume de eluição de acordo com o rendimento e concentração de RNA desejados. Um volume de eluição de 60 μL geralmente proporciona uma recuperação mais completa do RNA da membrana de sílica, mas resulta em uma solução de RNA mais diluída. Em contraste, um volume de eluição de 40 μL produz uma preparação de RNA mais concentrada, mas pode reduzir a recuperação total do RNA. Otimize o volume de eluição de acordo com as recomendações do fabricante e com os requisitos da aplicação a montante.
  3. Avaliação da qualidade do RNA
    1. Coloque as amostras de RNA no gelo e transfira 5 μL de cada amostra para um novo tubo microcentrífugo estéril para avaliação da qualidade.
    2. Avalie a integridade do RNA utilizando eletroforese em gel de agarose 1,5% ou eletroforese capilar. Confirme a presença de bandas distintas de RNA ribossomal 28S e 18S.
    3. Determine a concentração e pureza do RNA medindo a absorbância com um espectrofotômetro.
      NOTA: Descarte resíduos contendo fenol de acordo com as diretrizes institucionais para descarte de resíduos químicos. Não descarte resíduos químicos perigosos na pia. Para amostras de células cultivadas, as concentrações de RNA geralmente variam entre 200 e 1000 ng/μL e são adequadas para síntese de cDNA e qRT-PCR. Aceite amostras de RNA com razão A260/230 entre 2,0 e 2,2 e razão A260/280 de aproximadamente 2,0 (veja Supplementary Table 1).
  4. Armazenamento do RNA
    1. Armazene as amostras purificadas de RNA a −80°C até a síntese de cDNA.

4. Processamento da amostra: síntese de cDNA

OBSERVAÇÃO: Sintetize cDNA a partir de 1 μg de RNA total utilizando um kit de síntese de primeira fita de cDNA. Ajuste os volumes das reações e as condições de incubação de acordo com as instruções do fabricante.

  1. Transcrição reversa
    1. Deixe descongelar as amostras de RNA no gelo. Prepare uma reação de transcrição reversa de 20 μL contendo 1 μg de RNA total, 10 μL de Master Mix 2× (contendo inibidor de ribonuclease, hexameros aleatórios, iniciadores oligo(deoxitimidina), íons magnésio [Mg2+] e trifosfatos de desoxirribonucleotídeo), 2 μL de mistura enzimática (contendo transcriptase reversa) e água tratada com pirocarbonato de dietila até um volume final de 20 μL.
    2. Incube a reação em um termociclador por 10 min a 25°C para hibridização dos iniciadores, seguido por 30 min a 50°C para a síntese de cDNA. Inative a transcriptase reversa incubando a reação a 85°C por 5 min.
    3. Adicione 1 μL de RNase H e incube a reação por 20 min a 37°C para degradar a fita de RNA do híbrido RNA–DNA.
    4. Dilua a preparação de cDNA até 1:20 com água estéril, de acordo com os requisitos de otimização do ensaio, e armazene o cDNA diluído a −20°C até a análise por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).

5. Processamento da amostra: Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR)

OBSERVAÇÃO: Meça a expressão dos genes do relógio circadiano utilizando qRT-PCR. Consulte a Tabela Suplementar 2 para obter as sequências de iniciadores validadas, temperaturas de pareamento e concentrações de iniciadores.

  1. Otimização de ensaio
    1. Valide e otimize a concentração dos primers, a temperatura de annealing e a quantidade de cDNA utilizando amostras de cDNA em pool e uma curva padrão antes de analisar as amostras experimentais. Realize a otimização e validação do ensaio conforme descrito anteriormente.15,16.
  2. Preparação da reação
    1. Prepare cada um 10 μL reação de qRT-PCR combinando 5 μL de mistura mestre 2×, 0.4 μL cada um dos primers direto e reverso, 0.2 μL de água tratada com pirocarbonato de dietila e 4 μL de molde de cDNA em uma placa de PCR de 96 poços.
    2. Selle a placa com uma película ou manta de vedação opticamente transparente. Centrifugue a placa a 700 × g por até 5 min em 4°C para remover bolhas e coletar a mistura de reação no fundo de cada poço.
    3. Analise todas as amostras de cDNA para determinar a expressão dos genes-alvo Bmal1 e Per2.
    4. Analisar o gene de referência selecionado (B2m) utilizando a mesma diluição de cDNA para normalizar a expressão gênica entre as amostras.
  3. Ciclagem térmica
    1. Realize uma qRT-PCR utilizando as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial e ativação da DNA polimerase hot-start a 95°C por 2 min, seguido de 39 ciclos de 95°C por 5 s e 60°C por 30 s.
    2. Realize a análise de curva de dissociação aquecendo as reações a 95°C por 5 s, seguido por aumentos incrementais de 0.5°C para 95°C, mantendo por 5 s em cada incremento.
      OBSERVAÇÃO: Ajuste os tempos de permanência e as configurações da curva de dissociação de acordo com as recomendações da mistura mestra, quando necessário.
  4. Validação de genes de referência
    OBSERVAÇÃO: Em experimentos de sincronização com soro, avalie genes de referência candidatos, pois o tratamento com soro pode alterar a expressão de genes de referência17. Avalie a estabilidade da expressão utilizando métodos como o BestKeeper18, geNorm19, NormFinder20, ou o método comparativo de ΔCt21. Selecione o(s) gene(s) mais estável(eis) para normalização. Neste estudo, β-actina (Actb) e β-2-microglobulina (B2m) foram avaliados utilizando o software RefFinder22, que integra múltiplos algoritmos de validação de genes de referência. B2m apresentou a maior estabilidade de expressão ao longo do curso temporal circadiano e foi, portanto, selecionado para normalização.
  5. Verificação do produto
    1. Verifique a especificidade da amplificação analisando os produtos da PCR por meio de eletroforese em gel de agarose a 2%.
      OBSERVAÇÃO: Determine a temperatura de pareamento ideal testando múltiplas temperaturas (por exemplo, 58 °C, 60°C, e 62°C). Selecione a temperatura que produz o menor valor de ciclo de quantificação (Cq) mantendo um único pico na curva de dissociação, sem evidência de formação de dímero de iniciadores.
      OBSERVAÇÃO: Aceite ensaios com eficiências de amplificação entre 90% e 110% e um coeficiente de determinação (R2) de 0,99 ou superior. Confirme que as temperaturas de desnaturação diferem em não mais que 0.5°C entre réplicas técnicas. Aceite apenas réplicas técnicas com diferença de Cq ≤0,5 para análise e utilize esses valores para calcular os níveis médios de expressão. Realize todas as reações em réplicas técnicas (por exemplo, triplicatas) e inclua um controle sem modelo e um controle sem transcriptase reversa.

6. Análise de Dados

  1. Análise da expressão gênica
    1. Calcule a média das réplicas técnicas para cada amostra antes da análise subsequente.
    2. Calcule o valor de ΔCq para cada amostra e ponto temporal usando a seguinte equação:
      ΔCq   = Cqgene alvo  -  Cqgene de referência
    3. Calcule o valor de ΔΔCq para cada amostra e ponto temporal usando a seguinte equação:
      ΔΔCq   = ΔCqamostra  -  ΔCqcontrole  
      NOTA: Para o cálculo de ΔΔCq, ΔCqcontrole foi definido como o valor médio de ΔCq obtido pela média de todas as amostras controle em todos os CTs.
    4. Avalie os parâmetros circadianos, incluindo a estatística estimadora da linha média do ritmo (MESOR), amplitude, pico e fase, utilizando o CircaCompare23. Realize a análise usando a aplicação online ou a implementação do pacote em R.
  2. Análise online com CircaCompare
    NOTA: A implementação online relata estimativas completas de parâmetros circadianos somente quando o conjunto de dados satisfaz os critérios estatísticos de ritmicidade. Quando a ritmicidade é fraca ou não estatisticamente significativa, use a implementação em R para obter estimativas de parâmetros para todos os conjuntos de dados.
    1. Prepare um arquivo de valores separados por vírgulas (.csv).
      1. Digite a variável de tempo (numérica; horas) na Coluna 1.
      2. Digite a variável de agrupamento (apenas dois grupos experimentais) na Coluna 2.
      3. Digite a variável de resultado (numérica; ΔΔCq) na Coluna 3.
    2. Carregue o arquivo .csv na aplicação online CircaCompare.
    3. Atribua as variáveis de tempo, grupo e resultado às colunas correspondentes.
    4. Selecione Executar para realizar a análise.
  3. Análise com CircaCompare em R
    1. Realize a análise usando a versão 4.5.1 do R e a versão 0.2.0 do pacote CircaCompare24.
    2. Instale os pacotes R necessários.
      1. Instale o pacote devtools (versão 2.5.2).
      2. Instale o pacote circacompare (versão 0.2.0).
      3. Instale o pacote ggplot2 (versão 4.0.3).
      4. Instale o pacote svglite (versão 2.2.2).
    3. Carregue o arquivo .csv de entrada.
    4. Execute a análise CircaCompare após definir alpha_threshold = 1.
      NOTA: Definir alpha_threshold = 1 relata estimativas de parâmetros circadianos para todas as oscilações ajustadas, independentemente da significância estatística. No entanto, apenas oscilações com valor de p < 0,05 devem ser interpretadas como rítmicas e estatisticamente significativas.
    5. Personalize o Arquivo Suplementar 1 antes de executar o script.
      1. Substitua “XXX.csv” pelo nome do arquivo de dados de entrada.
      2. Substitua “YYY.csv” pelo nome desejado para o arquivo de resultados.
      3. Substitua “ZZZ.svg” pelo nome desejado para o arquivo de gráfico.
      4. Ajuste os limites do eixo y (ylim) e quaisquer outros parâmetros de plotagem de acordo com o conjunto de dados.
    6. Consulte a Tabela Suplementar 3 para um exemplo de arquivo de entrada.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A sincronização bem-sucedida é indicada pela ritmicidade circadiana estatisticamente significativa dos genes relógio analisados na condição controle (p < 0,05). Neste estudo, foram realizados três experimentos biológicos independentes, utilizando 0,1% de dimetilsulfóxido como controle negativo. Bmal1 e Per2 foram selecionados como marcadores circadianos representativos porque são componentes centrais do relógio circadiano molecular e exibem um padrão de expressão antifásico bem caracterizado...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Os ritmos circadianos são ciclos endógenos de aproximadamente 24 h que regulam uma ampla gama de processos fisiológicos, metabólicos e celulares por meio de mecanismos moleculares conservados do relógio biológico1,2. Modelos de sincronização in vitro fornecem um ambiente experimental controlado para investigar esses mecanismos e tornaram-se ferramentas valiosas para estudar a regulação circadiana em condições normais e patológicas, incluindo exposição a ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi cofinanciado pela União Europeia (UE) através da Facilidade de Recuperação e Resiliência e por fundos nacionais portugueses através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito dos projetos LA/P/0058/2020 (DOI: 10.54499/LA/P/0058/2020), UID/04539/2025, UID/PRR/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR/04539/2025) e UID/PRR2/04539/2025 (DOI: 10.54499/UID/PRR2/04539/2025); pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Operacional Regional Centro 2030 no âmbito do projeto CENTRO2030-FEDER-02360200; e por fundos nacionais portugueses através da FCT no âmbito das bolsas 2023.17896.ICDT (DOI: 10.54499/2023.17896.ICDT), 2023.12355.PEX (DOI: 10.54499/2023.12355.PEX), 2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008 (DOI: 10.54499/2021.02220.CEECIND/CP1656/CT0008), 2020.04850.BD (DOI: 10.54499/2020.04850.BD) e 2021.05334.BD (DOI: 10.54499/2021.05334.BD).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura celular de 6 poçosNest Biotechnology15140122Placa de cultura celular
AgaroseNZYtechMB02702Avaliação da qualidade de RNA
Mistura antibiótica (penicilina/estreptomicina)Gibco, Thermo Fisher ScientificD5648Suplemento para cultura celular
Kit de síntese de cDNA (primeiro filamento)NZYtechMB12502Transcrição reversa
ClorofórmioSigma-AldrichA5256701Reagente de separação de fases
DMEM, glicose alta (4500 mg/L de glicose, L-glutamina)Sigma-Aldrich26050088Meio de cultura celular
Tubos microcentrífugos EppendorfEppendorf30120086Armazenamento de amostras
Etanol (96%)Fisher Bioreagents15552393Purificação de RNA
Soro bovino fetal, inativado pelo calorGibco, Thermo Fisher ScientificJ62692.K7Suplemento para cultura celular
Placa PCR de 96 poços com revestimento rígidoBio-Rad LaboratoriesHSP9601Placa para qRT-PCR
Soro de cavalo, inativado pelo calorGibco, Thermo Fisher Scientific15400054Sincronização por choque sérico
Linhagem celular mHypoE-42 (CVCL_D443)CELLutions Biosystems Inc.MB13402Linhagem celular hipotalâmica de camundongo embrionário
Primeres de oligonucleotídeosNZYtechMB12501Primeres para qRT-PCR
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificMB18502Lavagem celular
qPCR Green Master Mix (2×)NZYtechMB22403Reagente para qRT-PCR
Sistema de detecção de PCR em tempo realBio-Rad LaboratoriesEP0030108116Instrumento para qRT-PCR
Kit de isolamento de RNANZYtech288306Purificação em coluna de sílica por centrifugação
Reagente de lise de RNANZYtechMB18502Reagente de extração de RNA baseado em fenol
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichMB22401Suplemento para meio de cultura celular
Placa de cultura estéril de 35 mmThermo Fisher Scientific121VPlaca de cultura celular
Ciclador térmico T100Bio-Rad Laboratories1861096Síntese de cDNA
Frasco de cultura de tecidos T75Corning430641URecipiente para cultura celular
Solução de azul de tripano (0,4%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061Contagem celular
Tripsina-EDTA (0,5%)Gibco, Thermo Fisher Scientific15400054Dissociação celular

Referências

  1. Fuhr L, Abreu M, Pett P, Relógio A. Circadian systems biology: When time matters. Comput Struct Biotechnol J. 2015;13:417-426.
  2. Albrecht U. Timing to perfection: The biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 2012;74(2):246-260.
  3. Relógio A, et al. Ras-mediated deregulation of the circadian clock in cancer. PLoS Genet. 2014;10(5):e1004338.
  4. Balsalobre A, Damiola F, Schibler U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 1998;93(6):929-937.
  5. Hughes ATL, et al. Constant light enhances synchrony among circadian clock cells and promotes behavioral rhythms in VPAC2-signaling deficient mice. Sci Rep. 2015;5:12092.
  6. Fuhr L, et al. The circadian clock regulates metabolic phenotype rewiring via HKDC1 and modulates tumor progression and drug response in colorectal cancer. EBioMedicine. 2018;33:105-121.
  7. Nagoshi E, et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: Cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 2004;119(5):693-705.
  8. Balsalobre A, et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 2000;289(5488):2344-2347.
  9. Kaneko H, Kaitsuka T, Tomizawa K. Response to stimulations inducing circadian rhythm in human induced pluripotent stem cells. Cells. 2020;9(3):732.
  10. Chalmers JA, et al. Vascular circadian rhythms in a mouse vascular smooth muscle cell line (Movas-1). Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008;295:R1529-R1538.
  11. Brown SA, et al. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Curr Biol. 2002;12(18):1574-1583.
  12. Adamovich Y, et al. Rhythmic oxygen levels reset circadian clocks through HIF1α. Cell Metab. 2017;25(1):93-101.
  13. Rogers EH, et al. Comparing circadian dynamics in primary derived stem cells from different sources of human adult tissue. Stem Cells Int. 2017;2017:2057168.
  14. Gaspar LS, et al. The importance of determining circadian parameters in pharmacological studies. Br J Pharmacol. 2019;176(16):2827-2847.
  15. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 2006;1(3):1559-1582.
  16. Derveaux S, Vandesompele J, Hellemans J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 2010;50(4):227-230.
  17. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-408.
  18. Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett. 2004;26(6):509-515.
  19. Vandesompele J, et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 2002;3(7):research0034.1-research0034.11.
  20. Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization. Cancer Res. 2004;64(15):5245–5250.
  21. Silver N, Best S, Jiang J, Thein SL. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. BMC Mol Biol. 2006;7:33.
  22. Xie F, Wang J, Zhang B. RefFinder: a web-based tool for comprehensively analyzing and identifying reference genes. Funct Integr Genomics. 2023;23:125.
  23. Parsons R, Garner N, Oster H, Rawashdeh O. CircaCompare: A method to estimate and statistically support differences in mesor, amplitude and phase between circadian rhythms. Bioinformatics. 2020;36(4):1208-1212.
  24. Parsons R. circacompare: Analyses of circadian data. R package version 0.2.0. 2021. Available at: https://CRAN.R-project.org/package=circacompare
  25. Di Nisio A, et al. Impairment of human dopaminergic neurons at different developmental stages by perfluoro-octanoic acid (PFOA) and differential human brain areas accumulation of perfluoroalkyl chemicals. Environ Int. 2022;158:106982.
  26. Xiang S, et al. Oscillation of clock and clock-controlled genes induced by serum shock in human breast epithelial and breast cancer cells: Regulation by melatonin. Breast Cancer (Auckl). 2012;6:155-168.
  27. Chang HC, Guarente L. SIRT1 mediates central circadian control in the SCN by a mechanism that decays with aging. Cell. 2013;153(7):1448-1460.
  28. Yoo SH, et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(15):5339-5346.
  29. Ueda HR, et al. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat Genet. 2005;37(2):187-192.
  30. Beaulé C, Granados-Fuentes D, Marpegan L, Herzog ED. In vitro circadian rhythms: Imaging and electrophysiology. Essays Biochem. 2011;49(1):103-117.
  31. Ribeiro RFN, et al. Circadian rhythms are disrupted in patients and preclinical models of Machado-Joseph disease. Brain. 2025;148(11):4127-4142.
  32. Masri S, Sassone-Corsi P. The emerging link between cancer, metabolism, and circadian rhythms. Nat Med. 2018;24(12):1795-1803.
  33. Ribeiro RFN, Cavadas C, Silva MMC. Small-molecule modulators of the circadian clock: Pharmacological potentials in circadian-related diseases. Drug Discov Today. 2021;26(7):1620-1641.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Sincronização por Choque SéricoCélulas Hipotalâmicas de CamundongoAmostragem de Curso TemporalPCR QuantitativaExtração de RNASeleção de Gene de ReferênciaAnálise de Ritmo CircadianoRitmicidade da Expressão Gênica

Este artigo foi publicado

Vídeo em breve

Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.