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Artigo de método

Abertura da Barreira Hematoencefálica (BHE) Controlada por Ultrassom em um Chip Microfluídico de BHE-Glioblastoma para Estudos de Entrega de Fármacos

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DOI:

10.3791/72041

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18 de agosto de 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a construção de um modelo de chip microfluídico de barreira hematoencefálica-glioblastoma (BBB-GBM). O modelo é validado quanto à integridade da barreira hematoencefálica e permite investigar a abertura transitória e amplamente reversível da barreira hematoencefálica induzida por ultrassom de baixa intensidade, possibilitando a avaliação quantitativa do transporte de nanomicelas mediado por ultrassom através da barreira hematoencefálica e da eficiência de direcionamento ao tumor.

Resumo

A barreira hematoencefálica (BHE) é um obstáculo importante para o tratamento do glioblastoma (GBM), pois restringe a entrada da maioria das moléculas terapêuticas no cérebro. Diferenças interespecíficas na estrutura e função da BHE complicam a tradução clínica de modelos animais, destacando a necessidade de plataformas in vitro da BHE relevantes para humanos para avaliar a permeabilidade de fármacos na terapia do GBM. Aqui, descreve-se um protocolo para a construção de um modelo de chip microfluídico BHE-GBM. Este modelo estabelece um sistema de tripla cultura composto por células endoteliais microvasculares cerebrais humanas (HCMECs), astrócitos primários (ACs) e células U87-MG em uma plataforma microfluídica com Matrigel. A integridade da BHE é verificada por meio de imunomarcação contínua da zônula oclusiva-1 (ZO-1) e ensaio de permeabilidade ao dextrano-FITC. Em seguida, utiliza-se ultrassom de baixa intensidade (US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) para induzir a abertura transitória e amplamente reversível da BHE, permitindo que nanomicelas direcionadas ao tumor (SFN@RB@SPMs) atravessem eficientemente a barreira e se acumulem nas células de GBM. Um aspecto fundamental deste protocolo é a integração de medidas em tempo real da permeabilidade da BHE e da entrega de fármacos em um único chip responsivo ao ultrassom, fornecendo uma plataforma poderosa para investigar os mecanismos de entrega de fármacos potencializada por ultrassom no GBM.

Introdução

O tratamento do glioblastoma (GBM) é fortemente limitado pela BHE, que restringe severamente a entrada de quase todos os agentes terapêuticos no cérebro1,2. A BHE é formada por células endoteliais não fenestradas unidas por proteínas de junções apertadas (por exemplo, ocludina, ZO-1), com suporte adicional de pericitos e pés astrocíticos3. Embora modelos animais tenham fornecido informações valiosas sobre a função da BHE, variações específicas da espécie na fisiologia e no metabolismo limitam sua capacidade de prever com precisão as respostas a medicamentos em humanos4,5. Consequentemente, modelos humanos da BHE fisiologicamente relevantes são indispensáveis para avaliar a permeabilidade de fármacos no tratamento do GBM.

Modelos tradicionais in vitro da BHE, como o sistema de cultura Transwell, não conseguem recapitular a complexidade da BHE, incluindo a interação célula-célula, as mudanças fluidicas dinâmicas e o estresse cisalhante induzido pelo fluxo6. Em contraste, os modelos microfluídicos da BHE surgiram como plataformas superiores que imitam de perto essas características semelhantes às in vivo7. Tais sistemas de BHE-em-um-chip têm sido amplamente utilizados para estudar a metástase de tumores cerebrais8, investigar a disfunção da BHE em doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer9, e avaliar o transporte de fármacos através da BHE10,11. No entanto, a maioria dos modelos atuais de chip-BHE é usada principalmente para testes de permeabilidade de fármacos e carece da capacidade de incorporar estímulos físicos externos que modulam a permeabilidade da BHE. Atualmente, a ultrassonografia focalizada (FUS) emergiu como uma estratégia promissora para abrir temporariamente a BHE com recuperação substancial, permitindo uma entrega aumentada de agentes terapêuticos ao cérebro12,13. Estudos mecanicistas anteriores demonstraram que a estimulação mecânica induzida por ultrassom pode modular temporariamente a função da barreira por meio da remodelação das junções célula-célula e do aumento da permeabilidade endotelial. Por exemplo, Silvani et al. mostraram que as forças mecânicas induzidas por ultrassom geraram a formação reversível de lacunas interendoteliais em um vaso-em-um-chip in vitro14. Em consonância com esses achados, Beekers et al. demonstraram que os bioefeitos mecânicos mediados por ultrassom induziram uma abertura transitória dos contatos célula-célula endoteliais, aumentando assim a permeabilidade endotelial15. Mais recentemente, Qiao et al. relataram que a permeabilidade da barreira endotelial é criticamente regulada pelos parâmetros de exposição ao ultrassom, particularmente pela duração do pulso, enfatizando a importância da otimização dos parâmetros acústicos para alcançar uma modulação segura e controlável da BHE16. Apesar desses avanços, plataformas in vitro que permitam simultaneamente a análise quantitativa da abertura da BHE mediada por ultrassom e seu impacto na entrega de nanomedicamentos ainda são limitadas.

Para preencher essa lacuna, apresenta-se um protocolo para a construção de um chip microfluídico BBB-GBM. O dispositivo microfluídico suporta uma tricultura de HCMECs, ACs primários e células GBM U87-MG incorporadas em Matrigel. A BHE reconstruída exibiu características estruturais e funcionais de uma barreira intacta, demonstradas pela localização contínua de ZO-1 ao longo das junções intercelulares e pela difusão limitada de dextrano-FITC de 40 kDa através da interface vascular. Importante, este chip pode ser acoplado a estímulos controlados de ultrassom para induzir a abertura transitória da BHE, aumentando assim o transporte subsequente e a eficiência de direcionamento tumoral de nanomicelas. Utilizando este sistema, o transporte e a eficiência de direcionamento tumoral das nanomicelas SFN@RB@SPM podem ser quantitativamente avaliados. No geral, esta plataforma fornece uma ferramenta útil para estudar a relação entre parâmetros de ultrassom, modulação da BHE com características reversíveis e entrega aprimorada de nanomicelas na terapia do GBM.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais seguiram as Diretrizes (GB/T35892-2018) para a Avaliação Ética do Bem-Estar de Animais de Experimentação e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Instituto de Vida e Saúde de Ningbo, UCAS (Número de Aprovação GK-2023-XM-0073). Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação e preparação do dispositivo em chip órgão-sobre-uma-placa BBB-GBM

  1. Projeto do chip e layout da fotomáscara
    1. Projete o chip utilizando software Auto CAD.
      ​OBSERVAÇÃO: O chip é composto por três canais microfluídicos paralelos, incluindo um canal sanguíneo, um canal cerebral e um canal tumoral. As larguras do canal sanguíneo e do canal tumoral são ambas de 1000 µm, enquanto a largura do canal cerebral é de 1300 µm. A altura dos três canais é de 150 µm, e canais adjacentes são separados por matrizes de micropilares trapezoidais com largura de 200 µm, que permitem difusão molecular intercompartimental e comunicação celular. O layout detalhado do projeto da fotomáscara está apresentado na Figura Suplementar 1 e na Figura Suplementar 2. A resistência fotossensível SU-8 utilizada no presente estudo é a 3050.
  2. Construa um molde mestre de silício utilizando fotolitografia padrão com resistência fotossensível SU-8.
    1. Coloque uma pastilha de silício virgem no porta-substrato do centrífugo e ative o vácuo para fixar firmemente a pastilha.
    2. Dispense lentamente 10 mL de resistência fotossensível SU-8 no centro da pastilha.
    3. Realize um processo de revestimento por centrifugação em duas etapas para obter uma camada uniforme de resistência fotossensível: primeiramente a 500 rpm por 10 s, seguido por 2500 rpm por 90 s.
    4. Transfira a pastilha revestida para uma placa aquecedora e realize uma pré-cura a 95 °C por 30 min para evaporar o solvente.
    5. Permita que a pastilha esfrie até a temperatura ambiente e meça a espessura da camada de SU-8 utilizando um medidor de espessura.
      OBSERVAÇÃO: Para uma formação ideal da BHE, recomenda-se uma altura de canal entre 110–150 µm. Uma única aplicação por centrifugação (passo 1.2.3) geralmente resulta em uma espessura de filme de 40–50 µm; portanto, são necessários dois a três processos de revestimento por centrifugação para atingir a espessura total desejada.
  3. Padronização por fotolitografia
    1. Defina a intensidade da luz ultravioleta (UV) do alinhador de máscara em 14–15 mW/cm2.
    2. Alinhe a fotomáscara de cromo com a pastilha de silício revestida com SU-8 e realize a exposição à luz UV por 10 s.
    3. Transfira imediatamente a pastilha de silício para uma placa aquecedora e realize uma pós-exposição térmica nas seguintes condições: 65 °C por 10 s, seguido por 95 °C por 300 s.
    4. Após a pastilha de silício atingir a temperatura ambiente, imerja-a em solução reveladora (acetato de monometil éter de propilenoglicol, PGMEA) e permita que o processo de revelação ocorra por 4–6 min.
    5. Lave a pastilha com isopropanol para interromper a revelação, seguido por enxágue com água desionizada.
    6. Seque a pastilha utilizando gás nitrogênio e inspecione as estruturas dos microcanais padronizados sob um microscópio óptico.
      ​OBSERVAÇÃO: Caso restem resíduos de resistência fotossensível não revelada, repita a etapa de revelação até que as microestruturas estejam claramente definidas.
    7. Submeta o molde mestre de silício finalizado a um forno a 200 °C por 1 h para melhorar a adesão entre a resistência fotossensível SU-8 e a superfície da pastilha de silício.
  4. Fabricação do chip de PDMS
    1. Prepare o polidimetilsiloxano (PDMS) misturando completamente o pré-polímero base e o agente de cura na proporção de 10:1 em peso (p/p) por 30 min para obter um pré-polímero de PDMS homogêneo.
    2. Despeje a mistura de PDMS sobre o molde mestre de silício fabricado, garantindo que as microestruturas estejam completamente cobertas.
    3. Coloque o molde mestre em um dessecador a vácuo para desgaseificação e remoção de bolhas de ar.
    4. Transfira o molde mestre para um forno e cure-o a 65 °C por 1,5–2 h.
    5. Após a cura, corte cuidadosamente a camada de PDMS ao longo das bordas do chip utilizando uma lâmina de corte e remova-a suavemente do molde mestre de silício.
    6. Imersa o chip de PDMS em etanol a 70%–75% por 30 min para esterilização preliminar, enxágue com água desionizada e deixe secar ao ar.
    7. Faça orifícios de entrada e saída utilizando um furador de biópsia de 2 mm.
  5. Junção por plasma e montagem do dispositivo
    1. Coloque o chip de PDMS e uma lâmina de vidro limpa na câmara de um limpador de plasma, garantindo que o lado dos microcanais do PDMS esteja voltado para cima.
    2. Evacue a câmara até que a pressão caia abaixo de 30 Pa, então introduza gás oxigênio.
    3. Mantenha o fluxo de oxigênio por 90 s, mantendo a pressão da câmara abaixo de 40 Pa.
    4. Defina a potência de Radiofrequência (RF) em 55% e realize o tratamento por plasma por 90 s para ativar as superfícies do PDMS e do vidro.
    5. Imediatamente coloque o chip de PDMS ativado em contato com a lâmina de vidro e pressione suavemente para obter uma ligação irreversível.
    6. Coloque o dispositivo montado em um forno a 65 °C por 24 h para estabilizar a ligação e restaurar sua hidrofobicidade.
    7. Antes da semeadura celular, esterilize o dispositivo ligado por irradiação ultravioleta por 30 min.
      OBSERVAÇÃO: Mantenha condições estéreis armazenando os chips esterilizados em placas de Petri seladas dentro de uma cabine de segurança biológica até o uso.

2. Semeadura celular e estabelecimento do modelo BBB-GBM

  1. Prepare os seguintes reagentes:
    1. Meio de cultura de ACs (para o canal cerebral): meio basal DMEM/F12 contendo 20% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina (P/S).
    2. Meio de cultura de HCMECs (para o canal vascular): meio para células endoteliais (ECM) suplementado com 1% de P/S.
    3. Meio de cultura de células GBM (para o canal de glioma): meio basal MEM contendo 10% de FBS e 1% de P/S.
    4. Reagente de dissociação celular: utilize solução de tripsina-EDTA 0,25% para destacar células aderentes.
      NOTA: A exposição prolongada à tripsina pode reduzir a viabilidade celular. Monitore o desprendimento celular ao microscópio e neutralize a tripsina imediatamente com meio completo.
    5. Mantenha todas as células (ACs, HCMECs e U87-MG) em placas de cultura de 100 mm antes da semeadura no dispositivo microfluídico.
  2. Isolamento de ACs primárias
    1. Isole ACs primárias dos córtices cerebrais de ratos neonatos (dias pós-natais 1–3). Após remoção cuidadosa das meninges e vasos sanguíneos em gelo, pique o tecido cortical com tesoura cirúrgica estéril e submeta-o à digestão enzimática.
    2. Lave a suspensão celular dissociada com PBS gelado, trate com tripsina para obter dissociação em células individuais e recolha os pellets por centrifugação (400 x g, 5 min, temperatura ambiente).
    3. Resuspenda as células e semeie-as em frascos de cultura T25 contendo meio de cultura de ACs.
    4. Identifique as ACs por meio da coloração de imunofluorescência para GFAP. A imagem está apresentada na Figura Suplementar 3.
  3. Semeadura celular
    ​NOTA: Dia 1 – Semeadura de ACs no canal cerebral.
    1. Introduza 1 mL de tripsina-EDTA 0,25% no prato de cultura contendo ACs. Agite suavemente para garantir cobertura uniforme.
    2. Incube a 37 °C por 1–2 min até que as células se desprendam do prato de cultura.
    3. Adicione 3 mL de meio de cultura de ACs (do passo 2.1.1) para neutralizar a tripsina. Pipete suavemente para obter uma suspensão de células individuais.
    4. Recolha a suspensão celular em um tubo cônico e centrifugue a 300 × g por 3 min a 4 °C.
    5. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 µL de meio para ACs.
    6. Determine a concentração celular utilizando um contador automático de células e ajuste a densidade para 2,5 × 106 células/mL.
    7. Misture a suspensão de células ACs com Matrigel numa proporção de 3:5 (v/v) (células ACs: Matrigel).
    8. Utilizando uma micropipeta, dispense 10 µL da mistura de Matrigel-ACs no canal cerebral.
      NOTA: Realize o procedimento de carregamento com o chip mantido em gelo para evitar a polimerização prematura do Matrigel.
    9. Incube o chip a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 por 30 min para permitir a polimerização do Matrigel e a estabilização celular.
      NOTA: Dia 1 – Semeadura de HCMECs no canal vascular.
    10. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA 0,25% e incube a 37 °C por aproximadamente 30 s até que as células se desprendam.
    11. Adicione 3 mL de meio para HCMECs (passo 2.1.2) para interromper a digestão enzimática.
    12. Pipete suavemente para gerar uma suspensão uniforme de células individuais.
    13. Recolha a suspensão e centrifugue a 300 × g por 3 min a 4 °C.
    14. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 µL de meio para HCMECs.
    15. Conte as células e ajuste a concentração para 2 × 106 células/mL.
    16. Introduza cuidadosamente 10 µL da suspensão de HCMECs no canal vascular do chip.
    17. Posicione o chip de lado por 30 min na incubadora para promover a adesão das células endoteliais à parede do canal.
    18. Semeie mais 10 µL da suspensão de HCMECs no canal vascular para aumentar a densidade endotelial no canal.
    19. Incube o chip por mais 30–60 min para permitir a adesão de HCMECs.
    20. Adicione 100 µL de meio de cultura misto à entrada do chip.
      NOTA: O meio misto consiste em meio para ACs e meio para HCMECs numa proporção de 1:1 (v/v).
      Dia 3 – Semeadura de células U87-MG no canal de glioma.
    21. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA 0,25% ao prato de cultura e incube a 37 °C por 1–2 min.
    22. Adicione 3 mL de meio para U87-MG (do passo 2.1.3) para encerrar a digestão.
    23. Pipete suavemente para obter uma suspensão homogênea de células individuais.
    24. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico e centrifugue a 300 × g por 3 min.
    25. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 µL de meio para U87-MG.
    26. Conte a concentração celular e ajuste a densidade para 2 × 106 células/mL.
    27. Introduza 10 µL da suspensão de células U87-MG no canal de glioma do chip.
    28. Incube o chip a 37 °C com 5% de CO2 por 30–60 min para permitir a adesão celular.
    29. Adicione 100 µL de meio de cultura U87-MG à entrada do chip.
    30. Mantenha o dispositivo microfluídico em ambiente a 37 °C com 5% de CO2 por mais 48 h para permitir a formação de junções apertadas endoteliais.

3. Avaliação da integridade da BHE

  1. Ensaio de permeabilidade
    1. Prepare dextrana marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrana) com pesos moleculares de 40 kDa em meio de cultura misto (meio ACs: meio HCMEC = 1:1, v/v) numa concentração final de 10 µg/mL.
    2. Introduza 10 µL da solução de FITC-dextrana no canal vascular.
    3. Coloque o chip microfluídico na platina de um microscópio de fluorescência invertido para adquirir imagens de fluorescência tanto do canal vascular quanto do canal cerebral adjacente em intervalos de 20 min, a fim de monitorar a difusão da dextrana através da barreira endotelial.
    4. Quantifique o coeficiente de permeabilidade (Papp, cm/s) utilizando a seguinte fórmula:
      Papp (cm/s)= Equação para eficiência do processo, apresentando Fs, Fc, Δt; fórmula matemática para pesquisa científica.
      Onde Papp é o coeficiente de permeabilidade aparente (cm/s), FS é a intensidade de fluorescência no tempo inicial no canal sanguíneo, FC é a intensidade de fluorescência no canal cerebral no final do intervalo de difusão, Δt é o tempo de difusão (s), VT é o volume de difusão da FITC-dextrana no canal cerebral (cm3), e A é a área da superfície endotelial (cm2).
      NOTA: Um coeficiente de permeabilidade mais baixo indica maior integridade da BHE e formação mais estreita da barreira endotelial.
    5. Realize a análise de dados e definições de parâmetros.
      NOTA: Os valores de intensidade de fluorescência dos canais sanguíneo e cerebral foram corrigidos quanto ao fundo, utilizando medições obtidas de regiões do chip sem células. As ROI foram definidas em ambos os lados da interface entre sangue e cérebro com base no comprimento de difusão da fluorescência. A área da superfície endotelial (A) foi calculada a partir da área de interface entre os canais vascular e cerebral (utilizando o espaço entre dois micropilares como referência): 200 µm × 150 µm = 30.000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. O volume de difusão da FITC-dextrana (VT) foi derivado da distância de penetração da difusão no canal cerebral multiplicada por A. As imagens de fluorescência foram adquiridas a cada 20 min (1200 s) durante um período de 60 min; o coeficiente de permeabilidade foi calculado utilizando os dados do intervalo de 20 min. Os valores de permeabilidade foram calculados a partir de três chips independentes para cada grupo experimental. Todas as conversões de unidades foram realizadas antes de expressar a permeabilidade em cm/s.
  2. Análise de imunofluorescência de ZO-1
    1. Lave os canais microfluídicos três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio de cultura remanescente.
    2. Fixe as células introduzindo 4% de paraformaldeído (PFA) nos canais e incubando por 10 min à temperatura ambiente.
    3. Permeabilize as células com Triton X-100 0,1% em PBS por 15 min à temperatura ambiente.
    4. Bloqueie a ligação inespecífica de anticorpos incubando os canais com albumina sérica bovina (BSA) 2% em PBS por 45 min à temperatura ambiente.
    5. Introduza o anticorpo primário anti-ZO-1 (diluição 1:200) nos canais e incube a 4 °C durante a noite.
    6. Lave o canal cuidadosamente com PBS para remover o anticorpo primário não ligado.
    7. Incube os chips com um anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 555 anti-coelho (diluição 1:1000) por 45 min à temperatura ambiente no escuro.
    8. Contracolora os núcleos com 1 µg/mL de 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 1 min à temperatura ambiente no escuro.
      NOTA: O DAPI é sensível à luz e deve ser protegido da luz durante a coloração.
    9. Lave os canais três vezes com PBS.
    10. Image o dispositivo microfluídico utilizando um microscópio de fluorescência invertido e um microscópio confocal de varredura a laser para visualizar a localização de ZO-1 ao longo da junção das células endoteliais.

4. Entrega de nanomicelas potencializada por ultrassom através da BHE até células de GBM

  1. Estimulação por ultrassom
    1. Retire cuidadosamente o chip da placa de cultura e coloque-o dentro de uma cabine de segurança biológica.
    2. Aplicar estimulação por ultrassom utilizando um sistema terapêutico de ultrassom equipado com um transdutor de 1 MHz (área efetiva de irradiação: 5 cm²)2).
    3. Aplique uma camada acústica de grau médico com 3 mm de espessura entre a sonda de ultrassom e a superfície do chip microfluídico para garantir uma transmissão acústica eficiente.
    4. Posicione a sonda de ultrassom diretamente acima da região do canal vascular do dispositivo microfluídico.
      OBSERVAÇÃO: Bolhas de ar entre o transdutor e o chip reduzem significativamente a transmissão de energia acústica e devem ser evitadas.
    5. Defina os parâmetros de ultrassom conforme a seguir: ciclo de trabalho: 60%; frequência: 1 MHz; intensidade: 1 W/cm2; duração da exposição: 30 s; frequência de repetição de pulsos (PRF): 100 Hz. Os parâmetros detalhados de ultrassom são fornecidos em Tabela Suplementar 1.
    6. Para o grupo controle não tratado, posicione o transdutor de ultrassom na mesma posição, mas certifique-se de mantê-lo inativo para servir como controle simulado, garantindo procedimentos de manipulação idênticos sem exposição acústica.
    7. Após a exposição ao ultrassom, remova o acoplador e retorne imediatamente o chip para uma placa de cultura estéril.
    8. Adicione meio de cultura fresco aos orifícios de entrada do chip.
    9. Incubar o dispositivo a 37 °C com 5% CO2 até nova análise.
  2. Avaliação da modulação da BHE induzida por ultrassom
    1. Realize a coloração por imunofluorescência de ZO-1 imediatamente após o tratamento com ultrassom (0 h) e 24 h após o tratamento para avaliar alterações na integridade das junções apertadas.
    2. Siga o procedimento de coloração por imunofluorescência descrito no passo 3.2.
    3. Compare a distribuição da marcação de ZO-1 ao longo do eixo z para avaliar o efeito da estimulação por ultrassom na integridade das junções apertadas da BHE.
  3. Preparação e caracterização de nanomicelas SFN@RB@SPM
    1. Prepare as nanomicelas SFN@RB@SPM de acordo com o protocolo previamente estabelecido17. Resumidamente, soluções-estoque do peptídeo anfifílico (denominado SPM, 6 mg/mL), RB (0,6 mg/mL) e SFN (6 mM) foram misturadas numa proporção volumétrica de 1:1:1.
    2. Coloque a mistura em um sonicador e sonique a 28 kHz, 25 °C por 30 min.
    3. Dialise a mistura (corte de peso molecular: 1000 Da) durante 48 h para remover RB e SFN livres.
    4. Meça o tamanho e o potencial zeta das nanomicelas por espalhamento dinâmico de luz (DLS). Os dados de caracterização são fornecidos em Figura Suplementar 4.
  4. Avaliação da liberação estimulada por ultrassom de nanomicelas e acúmulo em células de glioma
    1. Imediatamente após a exposição ao ultrassom, introduza o meio de cultura contendo nanomicelas no canal vascular do dispositivo microfluídico.
    2. Para avaliar o transporte de nanomicelas através da BHE, coloque o chip microfluídico sobre a platina de um microscópio de fluorescência invertido e adquira imagens de fluorescência tanto do canal vascular quanto do canal cerebral adjacente em intervalos de 20 minutos durante 60 minutos.
    3. Quantifique as imagens de fluorescência no canal cerebral para avaliar a permeabilidade de nanomicelas potencializada por ultrassom.
    4. Para avaliar o acúmulo de nanomicelas em células de glioma, incubar o dispositivo em condições padrão de cultura (37 °C, 5% CO₂2por 3 h após a exposição ao ultrassom, em seguida, visualize o canal do glioma usando um microscópio de fluorescência para avaliar a captação intracelular de nanomicelas.
  5. Análise estatística
    1. Expresse todos os dados quantitativos como média ± erro padrão da média (EPM).
    2. Realize cada experimento com três réplicas biológicas independentes (n = 3 chips por condição experimental). Para cada réplica biológica, foram realizadas pelo menos três réplicas técnicas (área de interesse por canal) para garantir a confiabilidade dos dados.
    3. Calcule o coeficiente de permeabilidade (Paplicativo, cm/s) de cada chip independente serviu como unidade primária de análise para todas as comparações estatísticas.
      OBSERVAÇÃO: As comparações entre dois grupos foram realizadas utilizando um teste t de Student não pareado bicaudal teste t. As comparações entre três ou mais grupos foram analisadas por meio de análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. Para experimentos envolvendo duas variáveis independentes, foi realizada ANOVA bidirecional seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. As análises estatísticas foram conduzidas utilizando software estatístico e de criação de gráficos. Um p-valor de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Para recapitular o in vivo estrutura da BHE, um chip microfluídico de tríplice cultura foi desenvolvido incorporando HCMECs, ACs primárias e células U87-MG (denominado "modelo em chip"). Conforme mostrado em Figura 1A,B, três canais paralelos são dispostos dentro do dispositivo: o canal vascular (esquerdo, azul), o canal cerebral preenchido com Matrigel (central, rosa) e o canal tumoral (direito, verde), que são semeados com células HCMEC, ACs e células U87-MG, resp...

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Discussão

Este protocolo descreve o estabelecimento de um chip microfluídico BBB-GBM para avaliar a modulação da BHE mediada por ultrassom e a entrega de nanomicelas. Em comparação com modelos convencionais in vitro da BHE (por exemplo, Transwell), esta plataforma microfluídica permite o cultivo co-cultura espacialmente definido de células endoteliais, ACs e células de glioma, permitindo assim a investigação do transporte de fármacos através de uma BHE fisiologicamente relevante. Várias etapas críticas do protocolo exigem...

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Divulgações

Durante a preparação deste manuscrito, os autores utilizaram o ChatGPT (OpenAI) apenas para edição e aprimoramento da linguagem. Os autores revisaram e editaram todo o conteúdo assistido por IA e assumem total responsabilidade pela precisão e integridade do manuscrito. Nenhuma ferramenta de IA foi utilizada para geração de dados, análise ou preparação de figuras.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente o financiamento da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang (LQ24H160003), da Fundação de Pesquisa Científica Médica da Província de Zhejiang (2024KY351), da Fundação de Ciências Naturais de Ningbo (2023J365), do Programa de Introdução de Talentos Yongjiang (Projeto de Jovens Talentos Inovadores, 2021A-012-G) e do Programa de Talentos Bei’An do Distrito de Jiangbei, Ningbo (2023RC004).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 555 anticoelhoCell Signaling Technology, Inc.4413
anticorpo anti-ZO-1Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
punção biópsiaZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
albumina sérica bovinaAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
contador de célulasThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
placa de cultura celular (100 mm)Corning Inc.430167
centrífugaBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
máscara de cromoSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
microscópio confocal de varredura a laserCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
reveladorSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
etanolNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
soro bovino fetalScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)projeto de código abertoN/A
fitocromo Dextran (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
lâminas de vidroCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
Graphpad prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
células endoteliais microvasculares cerebrais humanas (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
incubadoraEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
microscópio invertido de fluorescênciaNikon Instruments Inc.TS2-FL
isopropanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
nitrogênioNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
oxigênioNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
paraformaldeído (PFA, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
penicilina/estreptomicinaPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
fotolitografiaInstitute of Optics and Electronics,Chinese Academy of SciencesURE-2000\AL
placa quente para fotolitografiaSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
cinza de plasmaTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
astrócitos primáriosN/AN/Aisolados do cérebro de rato neonatal (dia 1-3)
wafer de silícioZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
centrifugador de revestimentoSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
tripsinaScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
células U87-MGPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
dispositivo de ultrassom Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(edição azul)Carl Zeiss AGN/A

Referências

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