Demonstrando o direcionamento do inibidor de peptidila fluorescente do ClpXP mitocondrial por microscopia de fluorescência em células mamíferas

Resumo

Esse protocolo estabelece um fluxo de trabalho de imagem quantitativa que inclui a aplicação da microscopia confocal para monitorar a localização seletiva do inibidor fluorescente de peptidil ClpP FAM-FAPAL-CMK (Carboxifluoresceína-FAPAL-clorometil cetona) nas mitocôndrias para direcionar a ClpP, e as subsequentes alterações morfológicas nas mitocôndrias em células intactas causadas pela inibição da ClpP.

Resumo

Proteases mitocondriais dependentes de ATP são essenciais para manter a homeostase proteica por meio da degradação de proteínas danificadas ou mal dobradas. Entre eles, o complexo de protease ClpXP localiza-se na matriz mitocondrial e contribui para o controle de qualidade mitocondrial sob condições fisiológicas e de estresse. Este trabalho demonstra um fluxo de trabalho de microscopia de fluorescência quantitativa para avaliar o direcionamento mitocondrial do inibidor fluorescente de peptidil FAM-FAPAL-CMK e avaliar alterações morfológicas mitocondriais associadas à inibição de ClpXP em células de mamíferos. As células HeLa foram tratadas com FAM-FAPAL-CMK e analisadas usando microscopia confocal combinada com coloração por imunofluorescência de marcadores mitocondriais e análise quantitativa de imagem. A análise de colocalização usando limiar de Costes e coeficientes de sobreposição de Manders demonstrou enriquecimento mitocondrial do sinal inibidor. Como consequência, a inibição de ClpP alterou a morfologia mitocondrial. A análise de imunoblot não mostrou mudança significativa na abundância de proteína ClpP após o tratamento com inibidor. Em conjunto, este trabalho descreve um fluxo de trabalho reprodutível baseado em imagens que permitirá a interrogação das funções ClpXP mitocondriais em células intactas em resposta a perturbações da homeostase, como o estresse oxidativo.

Introdução

Proteases mitocondriais dependentes de ATP são centrais para a homeostase das proteínas, degradando proteínas mal dobradas ou^danificadas 1,2,3,4,5,6. Entre eles, ClpXP é um complexo proteasé AAA+ hetero-oligomérico localizado na matriz mitocondrial. A ATPase ClpX reconhece e desdobra proteínas, depois as transloca para a câmara proteolítica^{ClpP 7,8,9}. Junto com outras proteases mitocondriais, o ClpXP mantém controle de qualidade proteica tanto em condições normais quanto sob estresse, incluindo estresse oxidativo e perturbações^{metabólicas 1,2,4}. A perturbação da homeostase das proteínas mitocondriais tem sido associada a doenças como neurodegeneração e câncer, ressaltando a importância de compreender essas atividades proteaseis em sistemas celulares^{intactos 3,6,10}.

Um grande desafio na área é a falta de métodos para monitorar diretamente a atividade das proteases mitocondriais com resolução espacial em células intactas. Abordagens existentes dependem principalmente de ensaios bioquímicos usando proteínas purificadas ou lisados celulares, que fornecem informações cinéticas detalhadas, mas não preservam o contexto subcelular 11,12,13,14. Estratégias de biologia química abordaram essa limitação em parte desenvolvendo substratos peptídicos fluorogênicos e inibidores direcionados ao local ativo. Substratos fluorescentes de peptidílicos permitem a medição quantitativa da atividade da peptidase dependente de ATP, enquanto inibidores de peptidila formam interações covalentes reversíveis com o sítio proteolítico para alcançar inibição^seletiva 13,15,16,17,18,19. Anteriormente, o inibidor de ClpXP sintetizado em laboratório FAPAL-CMK já demonstrou formar uma ligação covalente com^{ClpP 20}. Neste estudo, o FAM-FAPAL-CMK, um derivado marcado com fluoresceína do FAPAL-CMK, foi desenvolvido como um inibidor baseado em mecanismos do ClpP, permitindo visualizar sua localização intracelular.

Comparado aos ensaios bioquímicos, a microscopia de fluorescência confocal permite a avaliação espacialmente resolvida da distribuição da sonda e da morfologia mitocondrial em células intactas, fornecendo informações que não podem ser obtidas apenas a partir de lisados. No entanto, ao contrário dos ensaios enzimáticos, a localização de fluorescência não mede diretamente a atividade catalítica ou eventos de ligação molecular e pode ser influenciada pela eficiência da captação da sonda, dinâmica mitocondrial e condições de imagem. Além disso, a implementação bem-sucedida depende do acúmulo adequado da sonda e das redes mitocondriais suficientemente resolvidas, tornando esse fluxo de trabalho mais adequado para células cultivadas aderentes com morfologia mitocondrial claramente distinguível.

O objetivo deste estudo é estabelecer um fluxo de trabalho quantitativo que integre sondas fluorescentes baseadas em mecanismos com microscopia confocal para monitorar a localização e a função da protease mitocondrial em células intactas. Ao combinar sondas químicas seletivas com imagens confocais de alta resolução, esse fluxo de trabalho permite a avaliação da localização mitocondrial, distribuição das sondas e respostas morfológicas a perturbações da homeostase mitocondrial em células intactas. Ele pode complementar os ensaios bioquímicos existentes que medem diretamente a atividade das proteases, mas carecem de resolução espacial.

Protocolo

Experimentos foram realizados usando células HeLa comercialmente disponíveis. Nenhum participante humano, animal vertebrado ou materiais biológicos primários derivados de humanos ou vertebrados foram utilizados. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura e tratamento celular

1. Cultive células HeLa no Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de_CO2.
2. Placar as células sobre coberturas de vidro estéreis e incubar por 24 horas para permitir a fixação celular.
3. Dissolva o inibidor FAM-FAPAL-CMK em DMSO para preparar um estoque de 50 μM e congele a -20 °C para armazenamento.
4. Adicione 50 nM FAM-FAPAL-CMK ao meio de crescimento celular nas amostras celulares tratadas.
5. Adicione um volume igual de DMSO às amostras de controle para igualar a concentração final de solvente das amostras tratadas com inibidores, garantindo que quaisquer efeitos não sejam causados pelo DMSO.
6. Incube as células por mais 18 horas sob as mesmas condições de cultura antes do processamento posterior.
   Nota: O inibidor FAM-FAPAL-CMK é projetado em laboratório e sintetizado, e o método de síntese já foi^{relatado anteriormente 20}.

2. Fixação e permeabilização

1. Lave as células com D-PBS pré-aquecido por 5 minutos e repita uma vez.
2. Fixe as células por 15 minutos em temperatura ambiente usando um tampão PHEM (68 mM PIPES, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM_{MgCl 2}, pH 6,9) contendo 2,4% (v/v) formaldeído, 0,05% (v/v) glutaraldeído e 0,5% (v/v) saponina.
3. Prepare uma solução fresca de borohidreto de sódio (5 mg/mL em D-PBS).
4. Incube as células na solução de borohidreto de sódio por 15 minutos em temperatura ambiente para neutralizar o glutaraldeído residual.
5. Enxágue as células três vezes com D-PBS por 5 minutos cada antes da coloração.
   NOTA: Formaldeído e glutaraldeído são fixadores tóxicos. Realize as etapas de fixação no capuz e use o equipamento de proteção individual apropriado (luvas, jaleco e proteção ocular). O borohidreto de sódio é um agente redutor reativo e deve ser manuseado com cuidado. O tampão de fixação baseado em PHEM, contendo formaldeído, glutaraldeído e saponina, foi selecionado para preservar a morfologia mitocondrial enquanto mantinha o acesso ao antígeno durante a imunocoloração. Formaldeído e glutaraldeído fornecem reticulação proteica para preservação estrutural, enquanto a composição de buffer e o pH do PHEM ajudam a estabilizar a ultraestrutura^{mitocondrial 21}. A saponina facilita a permeabilização de membrana para melhorar a taxa de penetração do fixador. Essa estratégia de fixação minimiza a distorção das redes mitocondriais e é particularmente adequada para análise quantitativa da morfologia mitocondrial.

3. Coloração por imunofluorescência

1. Bloquear células por 1 hora em temperatura ambiente em tampão bloqueante contendo 3% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) em PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2HPO 4}, 1,8 mM_{KH 2}PO₄, pH 7,4) com 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Incubar células com anticorpos primários diluídos em tampão bloqueador por 1 hora em temperatura ambiente. Use anti-TOMM20 do mouse (1:500) e anti-ClpP do coelho (1:500).
3. Lave as células três vezes com PBS por 5 minutos cada para remover os anticorpos primários não ligados.
4. Incubar células com anticorpos secundários diluídos em tampão bloqueador por 1 hora em temperatura ambiente. Use anticorpo secundário de camundongo conjugado com CF405S (1:500) e anticorpo secundário de coelho conjugado com Alexa Fluor 647 (1:500).
5. Proteja as amostras da luz durante e após a incubação secundária de anticorpos.
6. Repita o passo 3.3.
7. Monte os coverslips em slides de vidro usando meio de montagem.
   NOTA: ClpP e TOMM20 foram visualizados sob 405 nm e 647 nm para evitar qualquer sobreposição espectral com sinais FAM.

4. Aquisição de imagem

1. Adquira imagens usando um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma objetiva de imersão em óleo de alta abertura numérica.
2. Excite fluoróforos usando linhas de laser de 405 nm e 633 nm. Use divisores de feixe dicróicos apropriados para refletir a luz de excitação e transmitir a fluorescência emitida aos detectores.
3. Defina o tamanho do pixel para 35,3 nm (X, Y) e o passo Z para 0,1 μm para garantir amostragem axial suficiente das estruturas mitocondriais.
4. Adquira imagens com tamanho de quadro de 1900 x 1900 pixels (X, Y) e colete 5 seções ópticas por empilhamento Z, começando no sinal mitocondrial superior e terminando abaixo do sinal mitocondrial para garantir que o sinal mitocondrial predominante seja coletado.
   NOTA: Configurações representativas de aquisição do microscópio são fornecidas na Figura Suplementar 1. Para células HeLa, as mitocôndrias são tipicamente estruturas tubulares finas, com cerca de 0,5-1 μm de^{diâmetro 22}. Portanto, um Z-volume de 0,5 μm é suficiente para capturar uma fração substancial da matriz mitocondrial individual, mas não necessariamente a célula inteira. Uma pilha Z de 5 seções foi selecionada para equilibrar amostragem suficiente de estruturas mitocondriais com rápida aquisição de imagens, minimizando artefatos relacionados ao movimento durante a imagem celular.

5. Tratamento e imagem com células vivas

1. Cultive células HeLa em pratos de fundo de vidro de 35 mm em DMEM com 10% de FBS a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
2. Adicione o inibidor (concentração final: 50 nM) ou um volume equivalente de DMSO às células 24 horas após a semeadura. Incube as células por mais 18 horas sob condições padrão de cultura.
3. Remova o meio de cultura contendo o inibidor ou DMSO e enxágue as células uma vez com D-PBS pré-aquecido por 5 minutos.
4. Adicione uma solução de imagem de células vivas contendo MitoTracker DeepRed de 20 nM.
5. Realize imagens de células vivas em temperatura ambiente usando as mesmas configurações de microscópio descritas acima. Adquira imagens no modo de varredura por quadro com aproximadamente 4,72 s por seção óptica (cerca de 24 s no total por pilha Z de 5 seções).
   NOTA: Cinco seções ópticas por Z-stack são configuradas para equilibrar amostragem suficiente de estruturas mitocondriais com tempos de aquisição gerenciáveis. Além disso, uma solução de imagem de células vivas em temperatura ambiente é usada para reduzir a motilidade mitocondrial em comparação com a imagem a 37 °C. Embora o movimento mitocondrial durante a imagem de células vivas ainda possa contribuir para a variabilidade nas medições de colocalização, configurações consistentes de aquisição em todas as amostras ajudam a reduzir o viés sistemático. Configurações representativas de software são mostradas na Figura Suplementar 2.

6. Análise da morfologia mitocondrial

1. Abra arquivos de imagem no Fiji²³ e gere projeções de máxima intensidade a partir de Z-stacks selecionando Image → Stacks → projeto Z e escolhendo Max Intensity.
2. Aplique o método de thresholding Otsu navegando até Image → Ajustar → Threshold e selecionando Otsu entre as opções de threshold. Aplique o limiar às mitocôndrias segmentadas.
3. Execute o plugin Mitochondria Analyzer²⁴ e selecione o modo de análise 2D por mito.
4. Meça o tamanho (área) e o perímetro mitocondrial usando a saída do Analisador de Mitocôndrias.
5. Obtenha os valores do fator de forma mitocondrial diretamente da saída do Analisador de Mitocôndrias, onde o fator de forma é calculado como P²/(4πA), com P representando o perímetro e A a área.
6. Meça o comprimento total de ramo por mitocôndrio usando a função de análise de rede dentro do plugin para avaliar a conectividade mitocondrial.
7. Apresente os dados como distribuições de medições mitocondriais individuais juntamente com valores médios derivados de 30 células por condição em três réplicas biológicas independentes.
8. Avalie a significância estatística usando o teste t de Welch em um software de análise estatística.

7. Análise de colocalização

1. Abra arquivos de imagem em Fiji e gere projeções 2D de máxima intensidade a partir de pilhas de imagens 3D. Para consistência, analise todas as amostras usando a mesma estratégia de projeção e aquisição.
2. Divida os canais de fluorescência selecionando Imagem → Cor → Canais Divididos.
3. Inicie o plugin Coloc 2 selecionando Plugins → Colocalização → Coloc 2.
4. Atribua os canais apropriados para análise e ative a regressão de limiar de Costes nas configurações do plugin. Realize a análise por célula.
5. Registre os coeficientes de sobreposição de Manders (M1 e M2) para avaliar a fração de sinal em cada canal que coincide espacialmente com o outro.
6. Ative a randomização de Costes nas configurações do Coloc 2 e defina o número de randomizações para 50 para avaliar a significância estatística.

8. Geração de lisado celular

1. Semeie células HeLa em DMEM com 10% de FBS e incube a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂.
2. Adicione um inibidor de 50 nM ou volume equivalente de DMSO às células 24 horas após a semeadura e incube por mais 18 horas sob condições padrão de cultura.
3. Remova o meio de cultura e enxágue as células com D-PBS pré-aquecido por 5 minutos, depois tripsinize para descolar.
4. Apague a tripsinização com meio de crescimento celular fresco e centrifuge a 300 x g por 3 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernadante.
5. Ressuspenda o pellet de célula em D-PBS e centrifuge a 300 x g por 3 minutos para lavar as células. Descarte o supernadante.
6. Ressuspenda a célula em tampão de lise pré-resfriado (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM cloreto de sódio, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sódio, 2% CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x cocktail inibidor de protease).
7. Incube lisados no gelo por 20 minutos e sonice lisados em banho-maria com gelo por 2 minutos para garantir a lise completa.
8. A centrífuga lisa a 13.000 x g, 4 °C por 20 minutos.
9. Transfira o sobrenadante limpo para um tubo pré-resfriado novo para análise a jusante.
   NOTA: O PMSF é tóxico e deve ser manuseado em uma exaustão com equipamentos de proteção individual adequados. O SDS é um irritante, e a sonicação gera calor e aerossóis. Realize passos de lise e sonicação no gelo e siga as diretrizes de segurança da instituição.

9. Ensaio de Bradford

1. Prepare um conjunto de soluções padrão usando BSA em 0,15 M cloreto de sódio. As concentrações são: 0, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL.
2. Diluir o lisado celular desconhecido 50 vezes e 100 vezes em 0,15 M cloreto de sódio.
3. A pipeta replica cada solução padrão de curva e amostras desconhecidas em uma placa de 96 poços.
4. Adicione reagente Bradford a cada poço. Para cada poço, use uma solução proteica de 160 μL com 40 μL do reagente Bradford 5x (disponível comercialmente). Misture suavemente pipetando.
5. Incube a placa em temperatura ambiente por 10 minutos e meça a absorção a 595 nm usando um leitor de placa.
6. Gerar uma curva padrão plotando as concentrações de BSA no eixo x e a absorvância média a 595 nm a partir de medições replicadas no eixo y.
7. Determine as concentrações de proteínas das amostras usando a curva padrão. Multiplique os valores calculados pelo fator de diluição para obter a concentração original.

10. Imunoblotting

1. Carregue quantidades iguais de lisado celular em um gel de poliacrilamida a 12% e separe proteínas por SDS-PAGE.
2. Ative a membrana PVDF mergulhando-a brevemente em etanol. Equilibre tanto a membrana quanto os papéis de absorção no buffer de transferência.
3. Transfira proteínas do gel para uma membrana PVDF usando um sistema de transferência semi-seco.
4. Bloqueie a membrana em leite desnatado 5% (p/v) em TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) em temperatura ambiente por 1 hora com agitação suave.
5. Incube a membrana com o anticorpo primário diluído em um tampão bloqueador em temperatura ambiente por 1 hora com agitação suave. Use anti-ClpP de coelho (1:2000) e anti-beta-actina de camundongos (ACTB, 1:10.000).
6. Lave a membrana três vezes com TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20, pH 7,6) por 5 minutos por lavagem para remover o anticorpo não ligado.
7. Incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado com HRP, diluído em tampão bloqueador (1:3000) em temperatura ambiente por 1 hora com agitação suave.
8. Repita a etapa da lavagem.
9. Detectar faixas proteicas usando reagentes quimioluminescentes para detecção.

11. Análise densitométrica

1. Abra a imagem da mancha ocidental em Fiji.
2. Mude o tipo de imagem para 8 bits pelo tipo de Imagem → → 8 bits.
3. Subtraia o fundo da imagem pelo Process → subtraia o fundo. Verifique o fundo claro e defina o raio da bola rolante para 50,0 pixels.
4. Circule a faixa na primeira faixa usando a ferramenta retangular, depois selecione analisar → gel → selecione a primeira pista.
5. Mova a ferramenta retângulo para a segunda faixa e selecione analisar → gel → selecione próxima faixa. Repita essa etapa até que todas as faixas estejam selecionadas.
6. Plote a densidade de bandas analisando → gel → plotando as rotas.
7. Use a ferramenta de linha reta para desenhar uma linha na parte inferior do pico de densidade de bandas, e use a ferramenta varinha para ler a densidade da banda.
8. Repita o mesmo procedimento dos passos 11.1–11.8 na imagem de blot de controle de carregamento.
9. Relate a densidade de banda relativa dividindo a densidade (ClpP) pela densidade (ACTB).

Resultados

A inibição da ClpP altera a morfologia mitocondrial e a organização da rede
A morfologia mitocondrial foi avaliada para determinar se a inibição de ClpP altera a organização mitocondrial nas células HeLa. Imagens representativas de fluorescência mostraram diferenças claras na organização mitocondrial entre células controle e tratadas com FAM-FAPAL-CMK (Figura 1A). A análise quantitativa mostrou que a área mitocondrial diminuiu de 1,15 ± 4...

Discussão

A cetona peptidil clorometil FAPAL-CMK¹⁵ já foi anteriormente demonstrada como um inibidor potencial irreversível da subunidade protease (ClpP) da protease dependente de ATP mitocondrial ClpXP. Embora os experimentos cinéticos tenham demonstrado a potência do inibidor e o mecanismo de ação, a abordagem in vitro não conseguiu avaliar a eficácia do FAPAL-CMK como inibidor seletivo mitocondrial de ClpP em células intactas. A microscopia confocal de fluorescê...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 647-conjugated rabbit secondary antibody	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin mouse antibody	Proteintech	66009
bovine serum albumin	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP rabbit PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-conjugated mouse secondary antibody	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
fetal bovine serum	R&D Systems	S11550
glutaraldehyde, 70% solution	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-conjugated nouse antibody	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-conjugated rabbit antibody	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging solution	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin for Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
mouse anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Potassium Chloride	Alfa Aesar	11595
potassium phosphate monobasic	VWR	BDH9268
ProLong mounting medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponin	Thermo Scientific	A18820.14
sodium borohydride	Thermo Scientific	200050250
Sodium Chorlde	VWR	BDH9286
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium Dodecyl Sulfate	VWR	0227
sodium phosphate dibasic	AMERSCO	0348
Software name	Version information
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3