Este estudo investiga a lesão da mucosa gástrica associada ao tratamento com clopidogrel em ratos e células epiteliais gástricas, destacando sua associação com alterações moleculares relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático, apoptose e inflamação sistêmica.
Artigo de investigação
Lesão da Mucosa Gástrica Induzida por Clopidogrel Associada ao Estresse do Retículo Endoplasmático em Ratos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O clopidogrel é amplamente utilizado como agente antiplaquetário para a prevenção e tratamento de doenças trombóticas arteriais, mas sua aplicação clínica pode ser limitada por efeitos adversos gastrointestinais, incluindo lesão da mucosa gástrica. Como a sobrevivência das células epiteliais é essencial para manter a integridade da mucosa gástrica, formulamos a hipótese de que a lesão epitelial gástrica induzida pelo clopidogrel seria acompanhada por alterações nos marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático (ER) e à apoptose. Para testar essa hipótese, células epiteliais gástricas humanas GES-1 foram tratadas com diferentes concentrações de clopidogrel, e a viabilidade celular, apoptose, distribuição do ciclo celular e alterações moleculares foram avaliadas utilizando o ensaio com o kit de contagem celular-8 (CCK-8), citometria de fluxo, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e Western blotting. Paralelamente, ratos Sprague-Dawley receberam clopidogrel por gavagem para estabelecer um modelo in vivo de lesão gástrica. As alterações patológicas da mucosa gástrica foram avaliadas por coloração com hematoxilina e eosina, e os níveis séricos de citocinas inflamatórias foram medidos por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). O clopidogrel reduziu a viabilidade das células GES-1, promoveu apoptose e alterou a progressão do ciclo celular. Em ratos, o clopidogrel induziu erosão da mucosa gástrica, edema e infiltração de células inflamatórias, acompanhado por aumento nos níveis séricos de interleucina (IL)-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α). O clopidogrel também aumentou a expressão dos marcadores de estresse do retículo endoplasmático proteína homóloga a C/EBP (CHOP) e fator de transcrição ativador 5 (ATF5), aumentou a expressão da proteína Bcl-2 associada a X (Bax), diminuiu a expressão da linfoma de células B 2 (Bcl-2) e elevou a razão Bax/Bcl-2 em tecidos gástricos e nas células GES-1. Esses achados sugerem que a lesão da mucosa gástrica induzida pelo clopidogrel está associada ao aumento da expressão de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à desregulação do equilíbrio Bax/Bcl-2, embora uma relação causal direta entre a via de estresse do retículo endoplasmático e a apoptose mitocondrial não tenha sido estabelecida neste estudo.
Introdução
Os sistemas imunológico inato e adaptativo da mucosa gástrica, compostos por células epiteliais, células imunes e moléculas sinalizadoras, atuam em conjunto para manter a integridade da mucosa e funcionam como uma barreira fisiológica crítica contra fatores nocivos1,2. Essa função protetora é essencial para a homeostase gastrointestinal, e sua interrupção pode contribuir para o desenvolvimento de doenças gástricas, incluindo gastrite3. Clinicamente, a lesão da mucosa gástrica induzida por medicamentos é uma complicação comum, sendo as drogas anti-inflamatórias não esteroides e os agentes antiplaquetários entre as causas mais frequentes4. A integridade da mucosa gástrica depende de um equilíbrio dinâmico entre proliferação celular e apoptose5. A exposição crônica a fatores ambientais, incluindo medicamentos, pode desestabilizar esse equilíbrio, promover a apoptose e resultar em lesão da mucosa6,7. O retículo endoplasmático desempenha um papel central na manutenção da homeostase intracelular. Em condições de estresse celular, o acúmulo de proteínas mal dobradas ou desdobradas ativa a resposta à proteína desdobrada, incluindo a sinalização PERK/eIF2α/ATF4/CHOP, que pode promover a apoptose e alterar a expressão das proteínas da família da linfoma de células B (Bcl-2)8. A ATF5 também está envolvida nas respostas ao estresse mitocondrial e na interação entre disfunção mitocondrial e estresse do retículo endoplasmático9. Evidências clínicas recentes indicam que a terapia contínua com antiplaquetários, incluindo clopidogrel, está associada à lesão progressiva da mucosa gástrica e do intestino delgado10.
O clopidogrel é um agente antiplaquetário amplamente prescrito que requer ativação metabólica antes de se ligar irreversivelmente aos receptores plaquetários P2Y12, inibindo assim a agregação plaquetária mediada por difosfato de adenosina e produzindo efeitos antitrombóticos11. Essa bioativação ocorre principalmente por meio das enzimas hepáticas do citocromo P450. Portanto, a exposição direta de células epiteliais gástricas cultivadas ao composto original do clopidogrel não reproduz o contexto metabólico e farmacocinético completo do tratamento com clopidogrel in vivo. No entanto, evidências crescentes sugerem que o tratamento com clopidogrel pode estar associado a úlceras gástricas recorrentes e sangramento gastrointestinal, destacando a importância de equilibrar a eficácia antitrombótica com a segurança gastrointestinal12,13,14. Embora esses efeitos adversos tenham sido relatados, os mecanismos subjacentes à lesão da mucosa gástrica associada ao clopidogrel permanecem parcialmente compreendidos, limitando o desenvolvimento de estratégias preventivas e terapêuticas direcionadas. No presente estudo, investigamos os efeitos do clopidogrel na mucosa gástrica utilizando ratos Sprague–Dawley e células GES-1. Os ratos receberam clopidogrel por gavagem, e experimentos complementares in vitro foram realizados com células GES-1. Análises histopatológicas, moleculares e celulares foram conduzidas para investigar se a lesão da mucosa gástrica induzida por clopidogrel está associada ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose. Assim, o presente estudo focou-se em caracterizar as alterações moleculares associadas à lesão gástrica induzida por clopidogrel, em vez de estabelecer uma via de sinalização causal. Nossos achados fornecem novas perspectivas sobre as alterações moleculares associadas à lesão da mucosa gástrica induzida por clopidogrel e podem contribuir para estudos futuros voltados à prevenção e ao manejo desses efeitos adversos.
Protocolo
Todos os procedimentos experimentais com animais foram revisados e aprovados pelo Laboratório de Inspeção Ética Experimental Animal da Dr. Can Biotechnology (Zhejiang) Co., Ltd. O estudo foi conduzido de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. O número de aprovação de ética animal foi DRK-20251015210.
Animais e Linhagens Celulares
A aprovação ética abrangeu o uso de 20 ratos Sprague–Dawley de grau SPF. Um total de 12 ratos Sprague–Dawley de grau SPF, machos, com idade entre 6 e 8 semanas e peso entre 280 e 300 g no início do experimento, foram incluídos no presente estudo. Os ratos foram obtidos da Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Hangzhou, China; Licença de Produção nº SCXK [Zhejiang] 2024-0004) e distribuídos aleatoriamente nos grupos controle e tratado com clopidogrel, com seis ratos por grupo. Os animais foram mantidos em um ambiente controlado a aproximadamente 22 °C, sob ciclo de luz/escuridão de 12 h, com acesso livre a ração padrão e água potável esterilizada. Todos os ratos tiveram um período de aclimatação de uma semana antes do início do experimento. O clopidogrel hidrogenssulfato foi suspenso em carboximetilcelulose sódica (CMC-Na) a 0,5% na concentração de 0,781 mg/mL. Os ratos do grupo tratado com clopidogrel receberam clopidogrel hidrogenssulfato por gavagem oral na dose de 10 mL/kg de peso corporal (equivalente a 1 mL/100 g de peso corporal e a uma dose de 7,81 mg/kg) uma vez ao dia durante 3 dias consecutivos. Os ratos do grupo controle receberam volume igual de CMC-Na a 0,5%. A dose e a duração do tratamento de 3 dias foram escolhidas com base em um modelo em rato previamente descrito para administração oral de clopidogrel em curto prazo. Após a última gavagem no dia 3, a alimentação foi suspensa por 12 h, enquanto a água foi fornecida ad libitum. Os ratos foram anestesiados em câmara de indução com 3% de isoflurano em oxigênio, e a anestesia foi mantida com 1,5%–2,0% de isoflurano administrado por meio de cone nasal. A profundidade anestésica adequada foi confirmada pela ausência de reflexos corneano e de retirada plantar. A coleta de sangue foi realizada por punção cardíaca terminal sob anestesia profunda. Permanecendo ainda profundamente anestesiados, os ratos foram eutanasiados por exsanguinação seguida de toracotomia bilateral. A morte foi confirmada pela ausência de respiração espontânea e atividade cardíaca por pelo menos 5 minutos, juntamente com a ausência de reflexos corneano e de retirada plantar. O estômago foi então rapidamente removido, aberto ao longo da curvatura maior e levemente lavado com solução salina gelada.
A linhagem de células epiteliais da mucosa gástrica humana GES-1 foi obtida da iCell Bioscience Inc. (Xangai, China; n.º do catálogo iCell-h062) e foi autenticada pelo fornecedor por meio de perfis de repetições em tandem curtas. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) e 1% de penicilina-estreptomicina em incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂. Células de passagens iniciais, entre as passagens 3 e 10, foram utilizadas nos experimentos. Quando a confluência celular atingiu aproximadamente 80%–90%, as células foram repassadas numa razão de divisão de 1:3. Células na fase logarítmica de crescimento foram utilizadas nos experimentos subsequentes. Para o ensaio CCK-8, as células foram semeadas em placas de 96 poços a 6 × 103 células/poço. Para as análises de apoptose e ciclo celular, as células foram semeadas em placas de 6 poços a aproximadamente 5 × 105 células/poço e deixadas aderirem antes do tratamento com clopidogrel.
Produtos Químicos e Soluções
Clopidogrel hidrogenossulfato (n.º do catálogo C874834; pureza ≥ 99%) foi utilizado nos experimentos com animais e células. Uma solução estoque de clopidogrel foi preparada dissolvendo-se 100 mg do pó de clopidogrel em dimetil sulfoxido (DMSO) para obter uma solução estoque de 1 M. A solução estoque foi posteriormente diluída para as concentrações de trabalho necessárias antes do uso. A solução estoque de 1 M foi diluída seriamente com DMSO para preparar soluções de dosagem 1000× nas concentrações de 10, 100, 200, 400, 600, 800 e 1000 mM. Imediatamente antes do tratamento, cada solução de dosagem 1000× foi adicionada ao meio de cultura completo na proporção de 1:1000 (v/v) para obter concentrações finais de clopidogrel de 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mM, respectivamente. O grupo controle veicular recebeu um volume igual de DMSO sem clopidogrel. Assim, a concentração final de DMSO foi mantida em 0,1% (v/v) em todos os grupos. As células GES-1 cultivadas não reproduzem a bioativação mediada pelo citocromo P450 hepático do clopidogrel. Portanto, o tratamento direto com clopidogrel foi utilizado como um modelo exploratório de exposição ao composto original. A faixa de concentração foi escolhida para caracterizar as respostas celulares dependentes da concentração nas condições experimentais e não deve ser interpretada como equivalente às concentrações plasmáticas ou teciduais gástricas clinicamente alcançáveis.
Subcultura de Células
O meio completo foi preparado suplementando o meio de cultura basal com soro bovino fetal (FBS) e penicilina-estreptomicina. Quando a confluência celular atingiu aproximadamente 80%, o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). As células foram então digeridas com solução de tripsina–ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) por aproximadamente 1–2 min. Após a dessanexação parcial das células, adicionou-se meio completo para encerrar a digestão. A suspensão celular foi centrifugada a 1.200 × g durante 3 min. Após a remoção do sobrenadante, o pellet celular foi ressuspenso em 1–2 mL de meio completo e semado em novas placas de cultura de acordo com os requisitos experimentais.
Ensaio de Viabilidade Celular CCK-8
Células GES-1 na fase de crescimento logarítmico foram semeadas em placas de 96 poços a 6 × 103 células/poço e cultivadas durante a noite para permitir a adesão celular. Após a aderência, as células foram tratadas com diferentes concentrações de clopidogrel (0, 0,01, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mM) por 24 h. O grupo controle recebeu a mesma concentração final de veículo. Após o tratamento, solução CCK-8 foi adicionada a cada poço e incubada a 37 °C de acordo com as instruções do kit. A absorbância em 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi calculada como uma porcentagem do grupo controle. Com base nos resultados da curva concentração-resposta, o tratamento com clopidogrel 0,1 mM por 24 h foi selecionado para as análises subsequentes de apoptose, ciclo celular, qPCR e Western blot.
Análise por Citometria de Fluxo
Células GES-1 foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com clopidogrel 0,1 mM por 24 h após a adesão celular. Após o tratamento, tanto as células em suspensão quanto as aderidas foram coletadas. As células aderidas foram digeridas com tripsina sem EDTA, lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspendidas em tampão de ligação. As células foram coradas utilizando um Kit de Apoptose Annexina V-FITC/PI de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação à temperatura ambiente no escuro, as células apoptóticas foram detectadas utilizando um citômetro de fluxo RaiseCyte 2L6C. Os dados foram adquiridos com o software de aquisição RaiseFlower e analisados com o software FlowJo (versão 10.8.1). As populações de células em apoptose precoce, apoptose tardia e apoptose total foram quantificadas utilizando o software FlowJo.
Análise Citométrica de Fluxo da Distribuição do Ciclo Celular
Células GES-1 foram semeadas em placas de 6 poços e tratadas com clopidogrel 0,1 mM por 24 h. Após o tratamento, as células foram coletadas, lavadas com PBS e fixadas em etanol 70% pré-resfriado a 4°C. As células fixadas foram então lavadas para remover o etanol residual e incubadas com solução de coloração de RNase A e iodeto de propídio, no escuro, de acordo com as instruções do fabricante. A distribuição do ciclo celular foi analisada usando um citômetro de fluxo. Os dados foram adquiridos com o software de aquisição e analisados com o software FlowJo. As distribuições do ciclo celular foram ajustadas usando o modelo de Watson, e as porcentagens de células nas fases G0/G1, S e G2/M foram calculadas.
PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR)
O RNA total foi extraído de células GES-1 e amostras de tecido gástrico de rato utilizando um kit de extração de RNA, conforme as instruções do fabricante. Para as amostras de tecido, os tecidos da mucosa gástrica foram coletados rapidamente, homogeneizados em condições de baixa temperatura e submetidos à extração de RNA. A concentração e pureza do RNA foram determinadas pela medição da absorbância em 260 e 280 nm. Quantidades iguais de RNA foram transcritas reversamente em DNA complementar (cDNA) utilizando um kit de transcrição reversa com remoção de DNA genômico. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada utilizando uma mistura mestra de PCR baseada em SYBR Green. Cada reação foi realizada em um volume total de 20 µL contendo 10 µL da mistura mestra 2×, 1 µL de cDNA, 0,4 µL do iniciador direto, 0,4 µL do iniciador reverso e 8,2 µL de água ddH₂O livre de RNase. As condições de ciclagem térmica foram as seguintes: desnaturação inicial a 95°C por 10 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95°C por 10 s, pareamento a 60°C por 30 s e extensão a 72°C por 30 s. Os níveis de expressão de CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax foram determinados. O gene GAPDH foi utilizado como gene de referência interno. A expressão gênica relativa foi calculada utilizando o método 2−ΔΔCt. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela Suplementar 1.
Western Blot
Proteínas totais foram extraídas de células GES-1 e amostras de tecido gástrico de rato. Para amostras celulares, as células GES-1 tratadas foram lavadas com PBS frio e lisadas usando tampão de lise RIPA (ensaio de radioimunoprecipitação) contendo um inibidor de protease. Para amostras de tecido, os tecidos da mucosa gástrica foram homogeneizados em tampão RIPA sob condições de baixa temperatura e, em seguida, centrifugados para coletar o sobrenadante. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um ensaio de proteína BCA. Um total de 20 µg de proteína por poço foi separado por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferido para membranas de polivinilideno fluoreto (PVDF). Após o bloqueio com albumina sérica bovina (BSA), as membranas foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários contra CHOP (1:1000), ATF5 (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000) e β-actina (1:5000). Após lavagem, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários conjugados à peroxidase do rabo-de-cavalo correspondentes (1:10000). As bandas proteicas foram visualizadas usando um reagente de quimioluminescência aprimorada e capturadas com um sistema de imagem de quimioluminescência. As intensidades das bandas foram quantificadas utilizando software de análise de imagem e normalizadas em relação à β-actina.
Avaliação Histopatológica
Amostras de tecido gástrico foram coletadas de ratos Sprague–Dawley após tratamento com clopidogrel e fixadas em formalina tamponada neutra a 10%. As amostras foram desidratadas, clareadas, emblocadas em parafina e seccionadas com espessura de 4 µm. Cortes em parafina foram corados com hematoxilina e eosina. Alterações histopatológicas foram avaliadas qualitativamente ao microscópio óptico com base na morfologia da mucosa, integridade epitelial, edema e infiltração de células inflamatórias. Imagens representativas foram capturadas. Nenhum sistema de pontuação histológica foi aplicado.
Imunohistoquímica
Seções de tecido gástrico embutido em parafina foram desparafinizadas em xilol e reidratadas através de uma série graduada de etanol. A recuperação de antígeno induzida por calor foi realizada em tampão citrato. A atividade peroxidásica endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogênio a 3% durante 10 min, e a ligação inespecífica foi bloqueada com soro normal de cabra durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, as seções foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários contra CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax. Após lavagem com PBS, as seções foram incubadas com o anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano-picante correspondente. Os sinais imunorreativos foram visualizados utilizando solução cromogênica DAB, seguida de contra-coloração com hematoxilina. As seções foram desidratadas, clareadas, montadas e examinadas ao microscópio óptico. Imagens representativas foram capturadas, e a área de coloração positiva foi quantificada utilizando software de análise de imagem.
Coloração por Imunofluorescência
Seções de tecido gástrico embebido em parafina foram desparafinizadas, reidratadas e submetidas à recuperação de antígeno induzida por calor em tampão citrato. Após bloqueio com soro de cabra normal por 30 min, as seções foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários contra CHOP (1:50), ATF5 (1:100), Bcl-2 (1:50) e Bax (1:200). Após lavagem com PBS, as seções foram incubadas com os respectivos anticorpos secundários fluorescentes (1:500) por 1 h à temperatura ambiente no escuro e, em seguida, contra-coloridas com DAPI. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência com aumento de ×200. Três campos aleatórios, não sobrepostos, de cada animal foram analisados usando o software Image-Pro Plus 6.0, e a intensidade de fluorescência foi expressa como IOD/Área. Três animais por grupo foram incluídos na análise.
Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
As amostras de sangue foram coletadas de ratos Sprague–Dawley após o tratamento e deixadas coagular à temperatura ambiente. O soro foi separado por centrifugação e armazenado a −80°C até a análise. Os níveis séricos de IL-1β, IL-6 e TNF-α foram medidos utilizando kits de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância foi medida usando um leitor de microplacas, e as concentrações de citocinas foram calculadas com base nas curvas padrão.
Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando software de análise estatística. Os dados são apresentados como média ± DP. A normalidade e a homogeneidade da variância foram avaliadas utilizando o teste de Shapiro–Wilk e o teste de Levene, respectivamente. As comparações entre dois grupos foram realizadas utilizando o teste t de Student. As comparações entre múltiplos grupos foram realizadas utilizando análise de variância unidirecional seguida pelo teste pós-hoc de Dunnett. Um valor de P < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Todos os experimentos com células foram realizados com pelo menos três réplicas biológicas independentes.
Resultados
O clopidogrel reduz a viabilidade celular de GES-1 e aumenta a apoptose In Vitro
Primeiro investigamos se o clopidogrel afeta a viabilidade celular e a apoptose em células GES-1. Ensaios CCK-8 mostraram que o tratamento com clopidogrel reduziu significativamente a viabilidade das células GES-1 (Figura 1A,B), indicando diminuição da viabilidade celular. Com base na redução geral da viabilidade celular ao longo da faixa de concentrações testadas, optou-se por utilizar 0,1 mM de clopidogrel por 24 h em todos os experimentos celulares subsequentes. Posteriormente, realizou-se citometria de fluxo para analisar a apoptose e a distribuição do ciclo celular (Figura 1C–F). A análise por citometria de fluxo revelou um aumento na proporção de células na fase S, acompanhado por uma redução na população G0/G1 e nenhuma elevação evidente na população G2/M, indicando acúmulo na fase S ao invés de parada na fase G2/M. Os resultados demonstraram que o clopidogrel aumentou significativamente a apoptose e alterou a distribuição do ciclo celular em células GES-1 em comparação com o grupo controle. Em conjunto, essas descobertas indicam que o clopidogrel reduz a viabilidade das células GES-1 e está associado ao aumento da apoptose e alterações na progressão do ciclo celular. Esses achados demonstram respostas citotóxicas após exposição direta ao composto original de clopidogrel nas condições experimentais selecionadas. No entanto, eles não estabelecem que efeitos comparáveis ocorram em níveis de exposição clinicamente relevantes ou que as respostas observadas sejam mediadas pelo metabólito ativo do clopidogrel.
Figura 1. O clopidogrel reduz a viabilidade celular da linhagem GES-1 e aumenta a apoptose. (A) A viabilidade celular da linhagem de células epiteliais gástricas humanas GES-1 foi avaliada utilizando o ensaio CCK-8 após tratamento com concentrações crescentes de clopidogrel (0–1,0 mM) por 24 h. (B) Comparação quantitativa da viabilidade celular entre o grupo controle e o grupo tratado com clopidogrel 0,1 mM por 24 h. (C) Perfis representativos do ciclo celular analisados por citometria de fluxo utilizando o modelo Watson. (D) Quantificação das porcentagens de células nas fases G0/G1, S e G2/M. O tratamento com clopidogrel aumentou a população na fase S sem aumento evidente na população G2/M. (E) Gráficos de dispersão representativos de citometria de fluxo para apoptose após coloração com anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) e iodeto de propídio (PI). (F) Quantificação da população total de células apoptóticas. Todos os experimentos celulares foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A significância estatística foi determinada pela comparação com o grupo controle. ***P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
A lesão gástrica induzida por clopidogrel está associada à inflamação sistêmica
Ratos Sprague–Dawley foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 6 por grupo): um grupo controle e um grupo tratado com clopidogrel que recebeu gavagem diária. A dose de clopidogrel e o regime de tratamento de 3 dias foram selecionados com base em um modelo de rato previamente descrito de lesão gástrica induzida por clopidogrel16. Após 3 dias, tecidos gástricos foram coletados para coloração com hematoxilina e eosina (H&E). O exame histopatológico revelou erosões da mucosa gástrica, edema e infiltração de células inflamatórias no grupo tratado com clopidogrel em comparação com o grupo controle (Figura 2A). Os níveis séricos de citocinas inflamatórias foram medidos por ELISA. O grupo tratado com clopidogrel apresentou níveis séricos significativamente mais altos de interleucina (IL)-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) do que o grupo controle (Figura 2B–D). Esses achados indicam que o tratamento com clopidogrel está associado a lesão da mucosa gástrica e aumento das respostas inflamatórias sistêmicas15,16.
Figura 2. O clopidogrel induz lesão da mucosa gástrica e aumenta os níveis circulantes de citocinas inflamatórias em ratos. (A) Cortes representativos da mucosa gástrica corados com hematoxilina e eosina (H&E) de ratos Sprague–Dawley controle e tratados com clopidogrel. O exame histológico mostra arquitetura preservada da mucosa gástrica no grupo controle e alterações morfológicas no grupo tratado com clopidogrel. As setas amarelas indicam células epiteliais da mucosa gástrica, as setas vermelhas indicam congestão focal na camada mucosa e as setas pretas indicam leve infiltração de células inflamatórias. Aumento original, ×200; barra de escala = 100 µm. n = 6 animais por grupo. (B–D) As concentrações séricas de interleucina (IL)-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) foram medidas por ensaio imunoenzimático (ELISA). Os dados são apresentados como média ± DP; n = 6 animais por grupo. ***P < 0,001 em comparação com o grupo controle. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
O clopidogrel altera marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose na mucosa gástrica de ratos
Para investigar alterações moleculares associadas à lesão gástrica induzida por clopidogrel, foi realizada coloração imuno-histoquímica em cortes de tecido gástrico. Imagens representativas mostraram coloração mais intensa para CHOP, ATF5 e Bax no grupo tratado com clopidogrel em comparação com o grupo controle, enquanto a coloração para Bcl-2 apareceu mais fraca (Figura 3A). A análise quantitativa da IOD/área demonstrou aumento significativo na coloração de CHOP, ATF5 e Bax após o tratamento com clopidogrel (Figura 3B,C,E). A coloração de Bcl-2 mostrou uma tendência decrescente, embora a diferença não tenha atingido significância estatística (Figura 3D). Esses resultados indicam que o tratamento com clopidogrel está associado à alteração na expressão de proteínas relacionadas ao estresse e à apoptose na mucosa gástrica de ratos. A análise por imunofluorescência mostrou sinais mais intensos de CHOP e ATF5 no tecido da mucosa gástrica do grupo tratado com clopidogrel. A análise quantitativa confirmou aumentos significativos em CHOP (Figuras 4A e 5A) e ATF5 (Figuras 4B e 5B), enquanto Bcl-2 (Figuras 4C e 5C) e Bax (Figuras 4D e 5D) mostraram tendências decrescente e crescente, respectivamente, sem atingir significância estatística. Em conjunto, esses achados indicam que o tratamento com clopidogrel está associado à alteração na expressão de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose na mucosa gástrica de ratos.
Figura 3. Detecção imunohistoquímica de proteínas relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose em tecido gástrico. (A) Imagens representativas de coloração imunohistoquímica da proteína homóloga a C/EBP (CHOP), fator de transcrição ativador 5 (ATF5), linfoma de células B 2 (Bcl-2) e proteína associada a Bcl-2 (Bax) em tecido da mucosa gástrica de ratos Sprague–Dawley controles e tratados com clopidogrel. A coloração marrom indica imunorreatividade positiva, e os núcleos foram contra-coloridos com hematoxilina. As imagens mostradas são representativas de todas as amostras analisadas, com três animais em cada grupo. Magnificação original, ×200; barra de escala = 100 µm. (B–E) Análise quantitativa da densidade óptica integrada por área unitária (IOD/Área) para CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax, respectivamente. Os dados são apresentados como média ± DP. *P < 0,05 e **P < 0,01 em comparação com o grupo controle. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4. Detecção por imunofluorescência de proteínas relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose em tecido gástrico. Imagens representativas de imunofluorescência mostrando a localização da proteína homóloga ao C/EBP (CHOP), do fator de transcrição ativador 5 (ATF5), da linfoma de células B 2 (Bcl-2) e da proteína associada à Bcl-2 X (Bax) em tecido da mucosa gástrica de ratos Sprague–Dawley controle e tratados com clopidogrel. Os núcleos foram contra-coloridos com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (azul), e a coloração positiva por imunofluorescência é mostrada em vermelho. As imagens fusionadas estão apresentadas na coluna da direita. (A) CHOP. (B) ATF5. (C) Bcl-2. (D) Bax. Aumento original, ×200; barra de escala = 100 µm. As imagens mostradas são representativas de todas as amostras analisadas, com n = 3 animais por grupo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5. Análise quantitativa da imunofluorescência de proteínas relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático e apoptose em tecido gástrico. (A–D) Quantificação da densidade óptica integrada por unidade de área (IOD/Área) da proteína homóloga a C/EBP (CHOP), fator de transcrição ativador 5 (ATF5), linfoma de células B 2 (Bcl-2) e proteína associada a Bcl-2 (Bax) no tecido da mucosa gástrica de ratos Sprague–Dawley tratados com clopidogrel e controles. Para cada animal, foram analisados três campos microscópicos não sobrepostos, selecionados aleatoriamente por corte tecidual, utilizando software de análise de imagem, e o valor médio foi utilizado para análise estatística. Os dados são apresentados como média ± DP; n = 3 animais por grupo. *P < 0,05 e **P < 0,01 em comparação com o grupo controle. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
O clopidogrel altera a expressão gênica e proteica relacionada ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose em células GES-1 e tecido gástrico de rato
Estudos anteriores indicaram que o estresse do retículo endoplasmático (ER) desempenha um papel fundamental nas respostas celulares ao estresse e na apoptose17,18. Para avaliar alterações nos marcadores relacionados ao estresse do ER após o tratamento com clopidogrel, a expressão de CHOP e ATF5 foi analisada em células GES-1. A qRT-PCR demonstrou aumento na expressão de mRNA de CHOP e ATF5 após o tratamento com clopidogrel. A análise por Western blot confirmou ainda o aumento na expressão proteica de CHOP e ATF5 (Figura 6A–E). Posteriormente, a expressão de proteínas relacionadas à apoptose foi avaliada em células GES-1 e no tecido gástrico de ratos. Em comparação com o grupo controle, o tratamento com clopidogrel aumentou a expressão de Bax e reduziu a expressão de Bcl-2, resultando em uma razão Bax/Bcl-2 aumentada (Figura 6A–J). Esses padrões de expressão foram consistentemente observados tanto nos níveis de mRNA quanto de proteína em células GES-1 e no tecido gástrico de ratos. Em conjunto, esses achados demonstram que o tratamento com clopidogrel está associado a alterações na expressão de marcadores relacionados ao estresse do ER e à apoptose em ambos os modelos experimentais.
Figura 6. Expressão de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose em células GES-1 e tecido gástrico de rato após tratamento com clopidogrel. (A–D) Expressão relativa de RNA mensageiro (mRNA) da proteína homóloga a C/EBP (CHOP), fator de transcrição ativador 5 (ATF5), linfoma de células B 2 (Bcl-2) e proteína associada a Bcl-2 X (Bax) na linhagem celular epitelial gástrica humana GES-1, determinada por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). (E) Imagens representativas de Western blot com quantificação densitométrica correspondente da expressão proteica de CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax em células GES-1. Os níveis de expressão proteica foram normalizados em relação à β-actina. Os experimentos em células foram realizados com três réplicas biológicas independentes (n = 3). (F–I) Expressão relativa de mRNA de CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax em tecido gástrico de rato, determinada por qRT-PCR. (J) Imagens representativas de Western blot com quantificação densitométrica correspondente da expressão proteica de CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax em tecido gástrico de rato. Os níveis de expressão proteica foram normalizados em relação à β-actina. Os experimentos com tecidos incluíram n = 3 animais por grupo. Os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada pela comparação com o grupo controle. *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Coletivamente, os resultados demonstram que o tratamento com clopidogrel reduziu a viabilidade das células GES-1, aumentou a apoptose, alterou a expressão de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose, e esteve associado a lesão da mucosa gástrica acompanhada por níveis aumentados de citocinas inflamatórias circulantes em ratos. Esses achados sustentam a hipótese do estudo de que o tratamento com clopidogrel está associado a lesão da mucosa gástrica e alterações concomitantes em marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose.
Disponibilidade de Dados:
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e em seus materiais suplementares. As sequências de iniciadores utilizadas para RT-PCR estão fornecidas na Tabela Suplementar 1. Os dados brutos que sustentam todas as figuras e painéis individuais de figuras, incluindo conjuntos de dados experimentais originais e arquivos fonte, estão fornecidos no arquivo suplementar Dados Brutos (arquivo compactado em formato zip).
Tabela Suplementar 1. Sequências de iniciadores utilizadas na análise de RT-PCR. As sequências dos iniciadores diretos (D) e reversos (R) utilizadas na análise de RT-PCR de GAPDH, CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax neste estudo estão listadas na orientação 5′–3′.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O clopidogrel é amplamente utilizado para a prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares; no entanto, seu uso clínico está associado a riscos de sangramento e complicações gastrointestinais, incluindo úlceras pépticas, sangramento e perfuração19. Portanto, compreender as alterações moleculares associadas à lesão gástrica induzida por clopidogrel é importante para melhorar a prevenção e o manejo desses efeitos adversos. No presente estudo, investigamos os efeitos do clopidogrel sobre células epiteliais gástricas e tecido gástrico de ratos, observando alterações na viabilidade celular, apoptose, respostas inflamatórias e na expressão de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose. Esses achados sugerem que a lesão da mucosa gástrica induzida por clopidogrel está associada a alterações na expressão de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose. No entanto, como nenhum experimento farmacológico de resgate ou de perda de função genética foi realizado, esses achados não estabelecem uma relação causal entre estresse do retículo endoplasmático e apoptose.
Estudos anteriores indicaram que o clopidogrel pode prejudicar a reparação da mucosa gástrica e atrasar a cicatrização de úlceras gástricas20. No presente estudo, ensaios CCK-8 mostraram que o clopidogrel reduziu a viabilidade de células GES-1, e a citometria de fluxo demonstrou aumento da apoptose e alteração na progressão do ciclo celular (Figura 1). Esses achados são consistentes com relatos anteriores de apoptose induzida pelo clopidogrel em células epiteliais gástricas21. Essas observações sugerem que o tratamento com clopidogrel está associado à redução da viabilidade das células epiteliais gástricas e ao aumento da apoptose, o que pode contribuir para lesão da mucosa gástrica11. No modelo com ratos, a coloração com H&E demonstrou lesão da mucosa gástrica após o tratamento com clopidogrel (Figura 2A). Os níveis séricos de IL-1β, IL-6 e TNF-α também foram significativamente aumentados (Figura 2B–D), indicando uma resposta inflamatória associada à lesão da mucosa gástrica22. Além disso, análises imuno-histoquímicas e de imunofluorescência demonstraram expressão alterada de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose no tecido gástrico de ratos tratados com clopidogrel em comparação com o grupo controle (Figura 3, Figura 4, Figura 5).
CHOP, ATF5, Bcl-2 e Bax são reguladores importantes das respostas ao estresse celular e da apoptose23,24,25,26. Neste estudo, o tratamento com clopidogrel foi associado ao aumento da expressão de CHOP e ATF5 e à alteração da expressão de Bax e Bcl-2 em células GES-1 e no tecido gástrico de ratos (Figura 6). Esses achados indicam alterações concomitantes em marcadores relacionados ao estresse e à apoptose. No entanto, o presente estudo avaliou apenas mudanças na expressão e não determinou se essas moléculas mediam diretamente a lesão da mucosa gástrica induzida por clopidogrel. Da mesma forma, embora tenha sido observada uma razão aumentada de Bax/Bcl-2, o estudo não demonstrou diretamente a ativação da via mitocondrial de apoptose. Portanto, esses achados devem ser interpretados como associações, e não como evidência de um mecanismo de sinalização causal.
O presente estudo combina um modelo in vivo com ratos e experimentos exploratórios de exposição direta em células GES-1 para avaliar as alterações morfológicas e moleculares associadas ao tratamento com clopidogrel. O modelo in vivo fornece a evidência primária de lesão da mucosa gástrica, enquanto os experimentos com GES-1 fornecem evidências complementares sobre as respostas celulares após exposição direta ao composto original. A combinação de análise histopatológica, medição de citocinas inflamatórias, imunohistoquímica, imunofluorescência, qRT-PCR e Western blotting permite a avaliação abrangente das alterações morfológicas e moleculares associadas à lesão gástrica. Essa abordagem experimental pode ser útil para investigar os efeitos gastrointestinais de agentes antiplaquetários e para avaliar intervenções protetoras potenciais em estudos futuros.
Várias limitações devem ser reconhecidas. O clopidogrel é um pró-fármaco que requer ativação metabólica hepática, enquanto a exposição direta das células GES-1 ao composto original não reproduz esse processo nem reflete plenamente a farmacocinética clínica. Além disso, as concentrações relativamente altas utilizadas in vitro podem ter causado citotoxicidade inespecífica. Portanto, os experimentos com GES-1 devem ser considerados como evidência exploratória de respostas celulares sob condições de exposição direta. O ensaio CCK-8 não incluiu um controle positivo para viabilidade celular reduzida, limitando a verificação independente do desempenho do ensaio. Os mecanismos upstream responsáveis pelas alterações relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático observadas não foram investigados, e experimentos com inibição farmacológica, silenciamento gênico ou deleção gênica não foram realizados para determinar se o estresse do retículo endoplasmático regula diretamente o equilíbrio Bax/Bcl-2 e a apoptose. Estudos futuros devem comparar o composto original com seu metabólito ativo, incorporar um sistema apropriado de ativação metabólica e realizar experimentos funcionais de intervenção para esclarecer essas relações. Além disso, um controle positivo bem estabelecido para indução de apoptose não foi incluído no ensaio Annexin V-FITC/PI. Portanto, embora o tratamento com clopidogrel tenha sido associado a um aumento na população de células positivas para Annexin V em comparação com o controle veicular, o desempenho técnico do ensaio de apoptose não foi verificado independentemente utilizando uma condição de controle positivo. Estudos futuros devem incluir um indutor de apoptose, como a estaurasporina, no mesmo lote experimental.
Em conclusão, o tratamento oral com clopidogrel causou lesão da mucosa gástrica em ratos e foi acompanhado por alterações nos marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose. A exposição direta de células GES-1 ao composto clopidogrel também reduziu a viabilidade celular e alterou marcadores moleculares relacionados nas condições experimentais. No entanto, como o modelo celular não reproduz a bioativação hepática e foram utilizadas concentrações relativamente altas, os achados in vitro não podem ser diretamente extrapolados para a exposição clínica, e a citotoxicidade inespecífica não pode ser excluída. De modo geral, os achados indicam que a lesão da mucosa gástrica induzida pelo clopidogrel está associada a alterações na expressão de marcadores relacionados ao estresse do retículo endoplasmático e à apoptose, embora estudos mecanicistas adicionais sejam necessários para estabelecer relações causais.
Divulgações
Conflito de Interesse:
Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que poderiam ter parecido influenciar o trabalho relatado neste estudo.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo projeto “Pesquisa Fundamental sobre a Via de Sinalização CHOP/ATF5/Bcl-2 na Apoptose de Células Epiteliais da Mucosa Gástrica Induzida por Clopidogrel” (Número do Projeto 2023BWKY009).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Detecção de Apoptose por Anexina V-FITC/PI | Elabscience | E-CK-A211 | Kit para detecção de apoptose |
| Anticorpo contra ATF5 | Proteintech | 67066-1-AP | Anticorpo primário |
| Kit de Ensaios de Proteína BCA | Solarbio | PC0020 | Ensaio de concentração proteica |
| Anticorpo contra Bax | Proteintech | 50599-1-AP | Anticorpo primário |
| Anticorpo contra Bcl-2 | Proteintech | 26593-1-AP | Anticorpo primário |
| β-actina Anticorpo | Proteintech | 66009-1-Ig | Anticorpo primário |
| Tampão Bloqueador | Beyotime | P0252 | Solução bloqueadora para Western blot |
| Kit de Contagem Celular CCK-8 | KeyGen Biotech | KGA317 | Ensaio de viabilidade celular |
| Kit de Síntese de cDNA | TransGen Biotech | AU341 | Kit para síntese de cDNA de primeira fita com remoção de DNA genômico |
| Kit de Detecção do Ciclo Celular | Lianke Biotechnology | CCS012 | Kit para análise do ciclo celular |
| Anticorpo contra CHOP | Proteintech | 15204-1-AP | Anticorpo primário |
| Clopidogrel Hidrogenossulfato (Pureza ≥99%) | Macklin | C874834 | Fármaco experimental |
| Kit Cromogênico DAB | Beyotime | P0201M | Substrato para imunohistoquímica |
| Dissulfóxido de Dimetila (DMSO) | MedChemExpress | HY-Y0320C | Solvente |
| Reagente de Quimioluminescência Aprimorado (ECL) | Meilunbio | MA0186 | Substrato quimioluminescente |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Gibco | 10099-141 | Suplemento para cultura celular |
| Linha Celular Epitelial Gástrica Humana GES-1 | iCell Bioscience | iCell-h062 | Linha celular epitelial gástrica humana |
| Kit de Coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) | Beyotime | C0105S | Coloração histológica |
| Anticorpo Secundário Conjugado com Peroxidase do Rabo-de-Cavalo (HRP) | Proteintech | RGAM001/RGAR001 | Anticorpo secundário |
| Solução de Peróxido de Hidrogênio | Absin | ABS9333-100mL | Reagente bloqueador de peroxidase endógena |
| Kit ELISA para IL-1β | MEIMIAN | MM-0047R2 | Ensaio de citocina sérica |
| Kit ELISA para IL-6 | MEIMIAN | MM-0190R2 | Ensaio de citocina sérica |
| Leitor de Microplacas | Beijing Liuyi Biotechnology | WD-2102B | Medição de absorbância |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina | Solarbio | P1400 | Solução antibiótica |
| Tampão Salino Fosfato (PBS) | Servicebio | G4202-500ML | PBS 1× |
| Membrana de Difluoreto de Polivinilideno (PVDF) | Millipore | IPVH00010 | Membrana para Western blot |
| Diluente para Anticorpos Primários | Beyotime | P0023A | Diluente para anticorpos |
| Marca-dor de Peso Molecular Proteico | Yeasen | WJ103 | Escala proteica pré-colorida |
| Mistura Mestra para PCR em Tempo Real Quantitativa (SYBR Green) | CWBio | CW3008 | Reagente para qPCR |
| Tampão de Lise para Ensaio de Imunoprecipitação por Radioimunoensaio (RIPA) | Solarbio | R0010 | Tampão para extração proteica |
| RNase A | Lianke Biotechnology | CCS012 | Reagente para análise do ciclo celular |
| Meio RPMI-1640 | Servicebio | G4535-500ML | Meio basal para cultura celular |
| Ratos Sprague-Dawley | Hangzhou Ziyuan Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | N/A | Classe SPF |
| Kit ELISA para TNF-α | MEIMIAN | MM-0180R2 | Ensaio de citocina sérica |
| Kit de Extração de RNA Total | TransGen Biotech | ER501-01 | Kit de extração de RNA |
| Solução de Tripsina-EDTA | Solarbio | T1300 | Reagente de dissociação celular |
Referências
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