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Artigo de método

Perfilagem de Fibras Elásticas em Tecido Pulmonar Usando Análises Quantitativas de Imagem

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DOI:

10.3791/72114

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4 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a preparação do tecido para visualização de fibras elásticas e perfil quantitativo no tecido pulmonar murino. Esse método permite uma avaliação robusta da arquitetura tecidual, organização espacial das fibras e remodelação da matriz extracelular em condições fisiológicas e patológicas.

Resumo

A remodelação da matriz extracelular pulmonar (MEC) é uma característica fundamental da lesão pulmonar e doença. Fibras elásticas são um componente central da ECM pulmonar, proporcionando resiliência e recuo necessários para a função respiratória normal, e sua perturbação contribui para a deterioração da mecânica tecidual. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho robusto e reprodutível para a preparação e análise do tecido pulmonar murino, com foco na visualização e perfilamento quantitativo de fibras elásticas. Ele descreve métodos otimizados de processamento de tecidos e coloração histológica para preservar e detectar estruturas de elastina. Além disso, o protocolo detalha uma linha de análise de imagens que permite a avaliação quantitativa da abundância, organização e distribuição espacial das fibras elásticas dentro do pulmão. O fluxo de trabalho incorpora ainda estimativa de vetores de mancha no QuPath, deconvolução de cor em Fiji/ImageJ e análise de imagens baseada em TWOMBLI para permitir avaliação quantitativa da abundância de fibras elásticas, ramificação e complexidade da rede. Estratégias para aquisição de imagem, seleção de região de interesse, otimização de parâmetros e controle de qualidade são incluídas para garantir reprodutibilidade e minimizar o viés dependente do usuário. Usando esse fluxo de trabalho, identificamos com sucesso alterações na organização das fibras elásticas e na arquitetura da rede nos pulmões de camundongos obesos, demonstrando sua aplicabilidade para detectar remodelação de ECM associada a doenças. Juntas, essas abordagens fornecem uma estrutura abrangente para investigar a remodelação das fibras elásticas e sua contribuição para a arquitetura dos tecidos em condições fisiológicas e patológicas. Esse método facilita o estudo de alterações estruturais causadas por fibroblastos e apoia insights mecanicistas sobre alterações de MCE subjacentes a doenças pulmonares.

Introdução

Fibras elásticas são componentes essenciais da matriz extracelular pulmonar (MEC), composta principalmente por elastina e proteínas microfibrilares associadas que se reúnem em redes altamente organizadase resilientes. No pulmão, as fibras elásticas são dispostas ao longo dos septos alveolares e das estruturas peribrônquicas, onde fornecem a elasticidade e o recuo necessários para a mecânica respiratórianormal 1,2. Como um dos componentes estruturais mais abundantes da ECM em tecidos como pulmão, aorta e útero, sua integridade é fundamental para manter a adeguidadetecidular 1,2. A perturbação da organização das fibras elásticas foi observada em diversas doenças pulmonares, incluindo fibrose, enfisema e condições inflamatórias crônicas, onde a arquitetura alterada das fibras contribui para a função pulmonar comprometida e propriedadesmecânicas 2,3.

O matrisoma pulmonar foi recentemente caracterizado, revelando proteínas centrais da ECM, como colágenos e lamininas, juntamente com componentes associados ao matrissoma, incluindo citocinas, reguladores da ECM e proteínas associadas à ECM (por exemplo, ligandos de integrina, galectinas)4,5. Além de fornecer suporte estrutural, esses componentes regulam ativamente a função dos tecidos e formam nichos especializados que sustentam células residentes emigratórias 6,7. Notavelmente, estudos recentes destacaram que condições metabólicas como a obesidade estão associadas a alterações significativas na organização das fibras elásticas, ligando desregulação metabólica sistêmica a alterações na arquitetura da ECM pulmonar e na funçãodos fibroblastos 3. Esses achados ressaltam a importância de entender a remodelação das fibras elásticas como um processo dinâmico e relevante para a doença.

A avaliação convencional de fibras elásticas frequentemente se baseia em avaliação histológica qualitativa, sistemas de pontuação semi-quantitativa ou medições da abundância de elastina, que fornecem informações limitadas sobre organização das fibras, conectividade e complexidade darede 8,9. Embora essas abordagens sejam úteis para detectar alterações grosseiras no conteúdo de elastina, podem não captar mudanças arquitetônicas sutis associadas à remodelação de tecidos. Análises quantitativas baseadas em imagens têm o potencial de superar essas limitações ao permitir a caracterização objetiva e reprodutível de redes de fibras elásticas e facilitar comparações entre condições experimentais e estudos. Para resolver isso, o protocolo descrito aqui permite a análise integrada da organização pulmonar da ECM com foco específico na arquitetura das fibras elásticas. Além das abordagens estabelecidas para caracterização deECM 4,5, esse fluxo de trabalho incorpora coloração com Elastica e um pipeline de análisede 10 imagens baseado em TWOMBLI, otimizado para a arquitetura do tecido pulmonar. Ao combinar a coloração por Elastica com análise quantitativa de rede, esse fluxo de trabalho vai além da avaliação histológica convencional e permite caracterização detalhada da abundância de fibras, fragmentação, organização espacial e complexidade estrutural. O protocolo é particularmente adequado para estudos que investigam fibrose, enfisema, remodelação pulmonar associada à obesidade, doenças pulmonares inflamatórias, envelhecimento e outras condições caracterizadas pela remodelação da matriz extracelular no pulmão.

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Protocolo

Todos os experimentos com camundongos descritos aqui foram realizados de acordo com a aprovação do Comitê de Ética Animal do estado da Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha (AZ: 81-02.04.2021.A221).

NOTA: Use equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas, proteção ocular) durante todo o procedimento.

1. Amostragem e preparação de tecido pulmonar murino

NOTA: Os camundongos foram eutanasiados por overdose de isoflurano conforme diretrizes institucionais e governamentais antes da coleta de tecidos.

  1. Abra cuidadosamente a cavidade torácica com uma incisão na linha média, depois corte o diafragma ao longo de sua fixação e exponha delicadamente os pulmões.
  2. Remova todo o pulmão extirpando os lobos direito e esquerdo juntos, tomando cuidado para manter todos os lóbulos intactos.
  3. Coloque os lobos pulmonares individualmente em um tubo de 5 mL contendo 2 mL de formalina tamponada neutra a 10% e incube por 15–20 horas a 4 °C.
    NOTA: A fixação preserva a arquitetura do tecido para análises histológicas e de fibras elásticas subsequentes. Como o principal objetivo desse fluxo de trabalho era a visualização e avaliação quantitativa da organização das fibras elásticas, em vez de análises morfométricas alveolares, os pulmões não eram fixados na inflação antes do processamento do tecido.
    ATENÇÃO: Formalina neutra tamponada contém formaldeído, que é tóxico, cancerígeno e pode causar irritação na pele, olhos e respiratória. Manuseie formalina em um exaustor químico certificado enquanto usa equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança.
  4. Imergir o tecido pulmonar fixo em parafina usando o protocolo padrão de imersãohistológica 11.
    NOTA: Garantir desidratação completa e infiltração de parafina para manter a morfologia dos tecidos para a coloração subsequente. Para minimizar a variabilidade entre amostras e garantir compatibilidade entre condições experimentais, sempre use os mesmos lobos pulmonares para cada análise. Recomenda-se usar o lobo esquerdo para histologia.
  5. Corte o tecido pulmonar de FFPE em seções de 5 a 7 μm de espessura usando um micrótomo e monte-as em lâminas de vidro padrão. Asse os slides a 60 °C por 1 hora antes de prosseguir com aplicações a jusante. Os slides podem ser armazenados em RT em um ambiente livre de poeira por várias semanas ou a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
    NOTA: Evite exposição à umidade durante o armazenamento, pois a umidade pode causar oxidação da parafina e comprometer a qualidade das manchas. Armazene os slides em uma caixa plástica lacrada com desidratante caso seja necessário armazenamento a longo prazo.
    Ponto de pausa: Armazene os slides em RT ou 4 °C até a mancha.

2. Mancha de fibra elástica

  1. Realize a coloração com Elastica (ressorcina-fucsina) em seções de tecido pulmonar embutidas em parafina de 5–7 μm para visualizar fibras elásticas nas estruturas alveolares e vasculares.
    NOTA: Apenas tinga o maior número possível de lâminas ao mesmo tempo para garantir intensidade e reprodutibilidade consistentes entre as amostras.
    1. O deparaffinato desliza mergulhando os slides em xileno (isômeros mistos) duas vezes por 5 minutos cada.
      ATENÇÃO: O xileno é tóxico e inflamável. Manuseie em uma caifa química e use equipamentos de proteção adequados.
    2. Reidrate as lâminas em séries descendentes de etanol até 80% de etanol.
      1. Incube a lâmina por 3 minutos em RT em uma câmara de coloração cheia de 100% etanol.
      2. Transfira a lâmina para etanol 100% fresco e incube por 3 minutos em RT.
      3. Transfira a lâmina para etanol 95% e incube por 3 minutos no RT.
      4. Transfira a lâmina para etanol 80% e incube por 3 minutos em RT.
    3. Transfira a lâmina para uma nova câmara de coloração contendo solução de Ressorcina-Fucisina e incube por 20–30 minutos em RT.
      NOTA: A solução de coloração por ressorcina-fucisina pode ser usada várias vezes e é estável na RT.
      ATENÇÃO: A solução de coloração com ressorcina-fucsina contém produtos químicos potencialmente perigosos, incluindo ácidos concentrados e corantes, que podem causar irritação na pele e nos olhos. Manuseie a solução em uma área bem ventilada ou exaustor e use o equipamento de proteção individual adequado conforme as diretrizes de segurança da instituição.
    4. Coloque o lâmina em uma câmara de coloração sob água destilada corrente e lave por 1 minuto.
    5. Diferencie em 95–96% etanol: 15–60 s, monitore ao microscópio.
      NOTA: Pare quando as fibras elásticas permanecem de um roxo-violeta profundo e o fundo estiver adequadamente limpo. Fibras elásticas manchadas parecem de roxo escuro. As fibras de colágeno permanecem sem manchas e normalmente parecem pálidas. Manchas excessivas podem aumentar o fundo; Ajuste o tempo de incubação dependendo da espessura e fixação do tecido.
    6. Interrompa a diferenciação transferindo a lâmina imediatamente para água bidestilada e enxaguando por 30 segundos. Opcional: A contracoloração pode ser realizada se necessário para avaliação pulmonar adicional, mas pode reduzir a eficiência da segmentação de fibras. Recomendamos realizar a coloração H&E para avaliar o pulmão em cortes adjacentes.
    7. Desidrate as lâminas sequencialmente em etanol 95% por 1–2 minutos, seguido por etanol 100% duas vezes por 1–2 minutos para remover água residual.
    8. Limpe as seções em xileno 2 vezes por 3 minutos até que o tecido pareça opticamente transparente.
    9. Monte os coverslips usando uma resina sintética permanente compatível com xileno e permita que os slides sequem planos em RT.
      NOTA: A desidratação completa e a limpeza são essenciais para evitar a turvidão e garantir a preservação a longo prazo das partes manchadas.
      Ponto de Pausa: Armazene lâminas montadas com manchas no RT até a imagem.

3. Imagem de fibra elástica e análise de rede

  1. Aquisição de imagem
    1. Adquira imagens de campo claro de alta resolução de seções de tecido pulmonar usando um scanner de lâminas com objetivo de 40×. Garanta ajustes consistentes de exposição e balanço de branco em todas as amostras.
      NOTA: As imagens foram obtidas usando configurações idênticas do scanner durante todo o estudo, incluindo ampliação, resolução espacial (0,25 μm/pixel), iluminação e exposição.
    2. Desenhe uma região de interesse (ROI) que abrange toda a seção do tecido pulmonar para garantir cobertura completa durante a varredura.
    3. Defina uma área de referência de fundo sem tecido para medir e subtrair a intensidade do fundo durante a análise da imagem.
    4. Use a detecção automática de foco do scanner para atribuir um número ótimo de pontos focais no tecido, garantindo nitidez e qualidade de imagem uniformes.
    5. Adquira a imagem usando iluminação uniforme e configurações de exposição.
      NOTA: Se o foco automático falhar em regiões densas ou irregulares, utilize ajuste manual de foco fino para garantir que todas as estruturas do tecido, incluindo áreas alveolares e vasculares, sejam capturadas com nitidão.
  2. Deconvolução de Imagem: estimativa do vetor de manchação no QuPath12. Vetores de coloração representam os valores específicos de absorção RGB de cada corante histológico, permitindo a separação de colorações sobrepostas durante a deconvolução de cor.
    NOTA: Neste protocolo, vetores de coloração foram definidos no QuPath, pois vetores de coloração pré-definidos para ressorcina-fucisina não estão disponíveis em Fiji.
    1. Abra a imagem no QuPath e selecione o tipo de imagem de campo claro.
      NOTA: Para minimizar o viés, calcule vetores de coloração usando imagens representativas do conjunto de dados e aplique os mesmos valores a todas as imagens.
    2. Desenhe uma região de interesse (ROI) que contenha predominantemente fibras elásticas para definir o primeiro componente de coloração.
    3. Na aba Imagem, navegue até as seções do vetor de Tinção.
    4. Clique em Stain 1, depois defina o vetor stain a partir do ROI para definir o vetor de cor para fibras elásticas (tipicamente roxo-violeta).
    5. Selecione um ROI contendo tecido não elástico (por exemplo, fundo ou colágeno) e clique em coloração 2, então defina o vetor de coloração do ROI para definir o componente de cor secundária.
    6. O QuPath calcula automaticamente o Corte 3, correspondente ao fundo.
    7. Um exemplo de vetores calculados e aplicados em Fiji: Resorcin-Fuchsin R:0,6201225, G:0,6541292, B:0,43308553; Sinal não específico R:0.31585205; G:0.815618; B:0,48477295; Contexto R:-0,105005614, G:-0,4780256, B:0,87204665.
      NOTA: Esses valores foram corados para imagens coradas apenas com ressorcina-fucsina. Se houver uma contracoloração presente, novos vetores de coloração precisam ser calculados.
    8. Salve esses como vetores de coloração personalizados e aplique para uma deconvolução de cor consistente em todas as amostras.
      NOTA: Definir vetores de coloração personalizados a partir de regiões representativas melhora a precisão da deconvolução de cor, especialmente para coloração por ressorcina-fucsina, onde elastina e tons de fundo podem variar entre lotes.
  3. Deconvolução de Cor da Imagem emFiji 13,14.
    1. Abra Fiji (ImageJ) e carregue a imagem do campo claro da seção de tecido tingido.
    2. Opcional: Transforme a imagem para o formato RGB (Tipo → → Colorido RGB) somente se a imagem não estiver já em RGB (por exemplo, imagens de 8 bits). Essa etapa abre uma nova janela de imagem; Salve para preservar os dados brutos originais.
    3. Realize a deconvolução de cores selecionando Imagem > Cor > Deconvolução de Cor > Valores do Usuário.
    4. Apresente o vetor de manchação personalizado obtido anteriormente do QuPath.
    5. Execute o plugin para gerar três imagens em tons de cinza separadas correspondentes a fibras elásticas, tecido excluindo fibras elásticas e fundo.
    6. Use imagens diretamente para TWOMBLI sem pré-processamento adicional. O TWOMBLI requer imagens nítidas com resolução suficiente; suavização (por exemplo, desfoque gaussiano) deve ser evitada para preservar detalhes estruturais.
      NOTA: Certifique-se de que as regiões selecionadas no QuPath para estimativa vetorial sejam representativas da coloração típica, pois esses vetores personalizados serão aplicados uniformemente em todas as imagens para uma comparação consistente.
    7. Salve o canal de fibra elástica como um arquivo TIFF para quantificação e análise a jusante.
  4. Seleção de ROI para Análise de Fibra
    1. Para cada seção pulmonar, selecione cinco ROIs quadrados e imparciais na região alveolar e cinco ROIs na região peribronquiolar (100 μm x 100 μm cada).
    2. Duplique cada ROI na imagem bruta (Imagem > Duplicar) para preservar os dados originais.
    3. Duplique os mesmos ROIs na análise de fibras elásticas desconvolutas.
    4. Salve todos os ROIs duplicados como arquivos TIFF individuais para análise posterior.
      NOTA: Regiões contendo pregas teciduais, artefatos de seção, rasgos, grandes vasos sanguíneos ou arquitetura alveolar mal preservada foram excluídas da análise. Apenas os ROIs de fibra elástica deconvoludos foram usados como entrada para a análise TWOMBLI, enquanto duplicados de imagens brutas correspondentes foram mantidos como arquivos de referência para controle de qualidade e inspeção visual. As regiões de interesse (ROIs) devem ser selecionadas por amostragem aleatória sistemática para garantir uma representação imparcial do tecido. Para minimizar ainda mais o viés do operador, um script automatizado de seleção de ROI compatível com o QuPath é fornecido no Arquivo Suplementar 1 e no Arquivo Suplementar 2, e sua implementação é descrita na Seção 3.5.
  5. Aplicando a seleção automatizada de ROI no QuPath usando um script automatizado de seleção de ROI.
    1. Abra a imagem no QuPath e defina o tipo de imagem para Campo Claro.
    2. No menu Ferramentas , selecione a ferramenta de anotação desejada para criar as anotações iniciais. Anotações quadradas são recomendadas.
    3. Faça anotações quadradas no tecido pulmonar. Cada anotação deve abranger apenas uma região de interesse (ROI) para análise, seja uma região alveolar ou uma área peribrônquica.
    4. Uma vez criadas as anotações, navegue até Anotações e selecione Anotações de Travado para evitar movimentos ou modificações acidentais.
    5. Adicione as classes "alvéolos" e "área peribrônquica" à lista de classes clicando no botão "+" ao lado de lista de classes no painel de anotação.
    6. Atribua cada anotação à classe apropriada. Selecione uma anotação, escolha a classe correspondente e clique em Definir selecionado. A cor da anotação mudará, e a classe atribuída ("alvéolos" ou "área peribrônquica") será exibida no painel de propriedades da anotação.
    7. Abra o script correspondente e execute-o. Ao concluir, uma mensagem indicará que os ROIs foram gerados com sucesso. Os ROIs recém-criados aparecerão na hierarquia de anotações como anotações filhos da anotação original que define a classe.
    8. Para exportar os ROIs, selecione-os e navegue até Arquivo → Exportar Imagens → Pixels Originais. Salve os ROIs exportados como arquivos TIFF.
      NOTA: As prescrições foram projetadas para reconhecer apenas os nomes das classes "alvéolos" e "área peribrônquica". Esses nomes devem ser inseridos exatamente conforme especificado. Por padrão, os scripts geram aleatoriamente cinco ROIs quadrados não sobrepostos, medindo 100 μm × 100 μm dentro de cada anotação. Os ROIs dos candidatos são aceitos apenas se seus cantos e centro estiverem totalmente contidos dentro dos limites de anotação, garantindo total inclusão na região selecionada. Tanto o número quanto as dimensões dos ROIs podem ser modificados dentro do script para acomodar requisitos experimentais específicos. Pelo menos três réplicas biológicas e um mínimo de cinco ROIs por amostra são recomendados para análises.
  6. Análise TWOMBLI
    1. Salve todas as imagens de ROI das fibras elásticas em uma pasta dedicada para análise.
    2. Crie duas subpastas dentro do diretório de trabalho: a. Pasta de máscaras – para máscaras binárias geradas por TWOMBLI. b. Pasta HDM – para imagens de Matriz de Alta Densidade (HDM) geradas por TWOMBLI.
    3. Execute o plugin TWOMBLI: Abra Fiji e inicie TWOMBLI (Plugins -> Macros -> Run).
    4. Selecione o arquivo de parâmetros de análise apropriado. Os seguintes parâmetros TWOMBLI foram usados para análise de fibras elásticas, listados na Tabela 1.
      NOTA: Esses parâmetros podem variar dependendo da intensidade da coloração. Os parâmetros foram otimizados empiricamente usando múltiplas imagens representativas de seções de tecido pulmonar coradas sob condições padronizadas. A otimização foi realizada comparando as máscaras geradas com o padrão de coloração original e selecionando as configurações que proporcionam a melhor sobreposição entre a máscara segmentada e a rede de fibras elásticas subjacentes. Uma vez estabelecido, os mesmos parâmetros foram aplicados a todas as imagens dentro do conjunto de dados.
    5. Escolha a opção "fibras escuras sobre fundo claro".
    6. Gere e salve máscaras binárias na pasta Mask.
    7. Gerar e salvar imagens binárias na pasta HDM.
    8. Extraia parâmetros quantitativos da rede, como comprimento da fibra, pontos de ramificação, curvatura, densidade e alinhamento.
      NOTA: A análise TWOMBLI requer imagens nítidas e de alta resolução (>1 pixel/μm). Deconvolução de cor ruim, regiões desfocadas ou compressão de imagem podem comprometer a precisão da quantificação da rede de fibra.
  7. Quantificação e Análise Estatística
    1. Exporte parâmetros de rede TWOMBLI como um arquivo CSV.
    2. Importe os dados brutos do CSV para o GraphPad Prism para análise estatística e visualização.
      NOTA: Recomenda-se o seguinte parâmetro: Máscara de Comprimento Total, que reflete a quantidade total de fibras elásticas dentro do ROI, permitindo quantificar a abundância e perda de fibras. Extremidades da Fibra indicam o grau de fragmentação da fibra; Um número maior de pontos finais sugere fibras interrompidas ou quebradas. Pontos de Ramificação de Fibra medem o quão interconectadas as fibras estão, refletindo a complexidade estrutural e a integridade da rede ECM. Um número maior de pontos de ramificação indica uma rede mais complexa e interligada. A lacunaridade quantifica a homogeneidade da distribuição das fibras ao longo do ROI. Baixa lacunaridade indica uma rede uniforme com lacunaridades de tamanho semelhante, enquanto alta lacunaridade reflete uma rede heterogênea com tamanhos variáveis de lacunaridade que descrevem uma estrutura mais complexa. A Dimensão Fractal de Contagem de Caixas captura a complexidade da arquitetura de fibras. Valores mais altos de dimensão fractal indicam redes mais intrincadas e detalhadas, enquanto valores mais baixos refletem estruturas mais simples ou perturbadas.
    3. Gerar gráficos colunas mostrando média ± SEM para cada parâmetro quantificado da rede (por exemplo, comprimento da fibra, ramificação, curvatura e densidade).
    4. Normalidade dos dados do teste usando o teste de Shapiro-Wilk. Para dados paramétricos, aplique um teste t de Student sem pareamento bilaterais. Para dados não paramétricos, aplique um teste Mann-Whitney U. Para comparações envolvendo mais de dois grupos experimentais, deve ser aplicada uma análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida de um teste de comparação múltipla post hoc apropriado, ou um teste de Kruskal–Wallis para dados não paramétricos.
      NOTA: Mantenha todos os arquivos CSV brutos inalterados para garantir reprodutibilidade e rastreabilidade dos dados. Informe o número de ROIs e réplicas biológicas analisadas para cada condição nas legendas das figuras.

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Resultados

Este protocolo fornece parâmetros quantitativos da rede de fibras elásticas em diferentes regiões pulmonares e condições experimentais. A análise TWOMBLI, como descrito anteriormente, fornece parâmetros como comprimento da fibra, densidade de ramificação, lacunaridade e dimensão fractal para avaliação da matrizextracelular 10. Com base nesse enquadramento, nossa abordagem permite uma caracterização abrangente da organização das fibras elásticas, possibilitando a a...

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Discussão

Esse protocolo oferece um fluxo de trabalho robusto e reprodutível para investigar a arquitetura da matriz extracelular pulmonar murina (ECM), com foco especial na remodelação de fibras elásticas impulsionadas por fibroblastos. Fibras elásticas são essenciais para manter a compaciência pulmonar e o recuo, e sua perturbação é uma característica marcante de múltiplas doenças pulmonares, incluindo fibrose, lesão pulmonar, envelhecimento e distúrbiosmetabólicos 2. Ape...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer à Instalação Central de Histologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Bonn. Além disso, reconhecemos o trabalho de apoio de Daniela Kraus e de toda a equipe da unidade de iFET para animais. A V.L.K. é financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha – EXC 2151 – 390873048.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Axio CS2 Slide Scanner Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jarSigma-AldrichS6016
DPX MountantSigma-Aldrich6522
Ethanol (100%) for histologyCarl Roth9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/versão 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%SigmaHT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding CassettesSigma-AldrichH0542
microtomeThermo Fischer ScietificHM355S
Micrsocope SlidesVWR631-0108
Mouse: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664Strain #:000664 
paraffin embedding systemEpredia HistoStar embedding module
Prismhttps://www.graphpad.com versão 11
Qupathhttps://qupath.github.ioversão 0.7.0
Resorcin-FuchsinWaldeck2.00E-30
TWOMBLI pluginhttps://github.com/wershofe/TWOMBLI
XyleneApplichem GmBH14020172

Referências

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