Perfilagem de Fibras Elásticas em Tecido Pulmonar Usando Análises Quantitativas de Imagem

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a preparação do tecido para visualização de fibras elásticas e perfil quantitativo no tecido pulmonar murino. Esse método permite uma avaliação robusta da arquitetura tecidual, organização espacial das fibras e remodelação da matriz extracelular em condições fisiológicas e patológicas.

Resumo

A remodelação da matriz extracelular pulmonar (MEC) é uma característica fundamental da lesão pulmonar e doença. Fibras elásticas são um componente central da ECM pulmonar, proporcionando resiliência e recuo necessários para a função respiratória normal, e sua perturbação contribui para a deterioração da mecânica tecidual. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho robusto e reprodutível para a preparação e análise do tecido pulmonar murino, com foco na visualização e perfilamento quantitativo de fibras elásticas. Ele descreve métodos otimizados de processamento de tecidos e coloração histológica para preservar e detectar estruturas de elastina. Além disso, o protocolo detalha uma linha de análise de imagens que permite a avaliação quantitativa da abundância, organização e distribuição espacial das fibras elásticas dentro do pulmão. O fluxo de trabalho incorpora ainda estimativa de vetores de mancha no QuPath, deconvolução de cor em Fiji/ImageJ e análise de imagens baseada em TWOMBLI para permitir avaliação quantitativa da abundância de fibras elásticas, ramificação e complexidade da rede. Estratégias para aquisição de imagem, seleção de região de interesse, otimização de parâmetros e controle de qualidade são incluídas para garantir reprodutibilidade e minimizar o viés dependente do usuário. Usando esse fluxo de trabalho, identificamos com sucesso alterações na organização das fibras elásticas e na arquitetura da rede nos pulmões de camundongos obesos, demonstrando sua aplicabilidade para detectar remodelação de ECM associada a doenças. Juntas, essas abordagens fornecem uma estrutura abrangente para investigar a remodelação das fibras elásticas e sua contribuição para a arquitetura dos tecidos em condições fisiológicas e patológicas. Esse método facilita o estudo de alterações estruturais causadas por fibroblastos e apoia insights mecanicistas sobre alterações de MCE subjacentes a doenças pulmonares.

Introdução

Fibras elásticas são componentes essenciais da matriz extracelular pulmonar (MEC), composta principalmente por elastina e proteínas microfibrilares associadas que se reúnem em redes altamente organizadas^{e resilientes.} No pulmão, as fibras elásticas são dispostas ao longo dos septos alveolares e das estruturas peribrônquicas, onde fornecem a elasticidade e o recuo necessários para a mecânica respiratória^{normal 1,2}. Como um dos componentes estruturais mais abundantes da ECM em tecidos como pulmão, aorta e útero, sua integridade é fundamental para manter a adeguidade^{tecidular 1,2}. A perturbação da organização das fibras elásticas foi observada em diversas doenças pulmonares, incluindo fibrose, enfisema e condições inflamatórias crônicas, onde a arquitetura alterada das fibras contribui para a função pulmonar comprometida e propriedades^{mecânicas 2,3}.

O matrisoma pulmonar foi recentemente caracterizado, revelando proteínas centrais da ECM, como colágenos e lamininas, juntamente com componentes associados ao matrissoma, incluindo citocinas, reguladores da ECM e proteínas associadas à ECM (por exemplo, ligandos de integrina, galectinas^)4,5. Além de fornecer suporte estrutural, esses componentes regulam ativamente a função dos tecidos e formam nichos especializados que sustentam células residentes e^{migratórias 6,7}. Notavelmente, estudos recentes destacaram que condições metabólicas como a obesidade estão associadas a alterações significativas na organização das fibras elásticas, ligando desregulação metabólica sistêmica a alterações na arquitetura da ECM pulmonar e na função^{dos fibroblastos 3}. Esses achados ressaltam a importância de entender a remodelação das fibras elásticas como um processo dinâmico e relevante para a doença.

A avaliação convencional de fibras elásticas frequentemente se baseia em avaliação histológica qualitativa, sistemas de pontuação semi-quantitativa ou medições da abundância de elastina, que fornecem informações limitadas sobre organização das fibras, conectividade e complexidade da^{rede 8,9}. Embora essas abordagens sejam úteis para detectar alterações grosseiras no conteúdo de elastina, podem não captar mudanças arquitetônicas sutis associadas à remodelação de tecidos. Análises quantitativas baseadas em imagens têm o potencial de superar essas limitações ao permitir a caracterização objetiva e reprodutível de redes de fibras elásticas e facilitar comparações entre condições experimentais e estudos. Para resolver isso, o protocolo descrito aqui permite a análise integrada da organização pulmonar da ECM com foco específico na arquitetura das fibras elásticas. Além das abordagens estabelecidas para caracterização de^{ECM 4,5}, esse fluxo de trabalho incorpora coloração com Elastica e um pipeline de análise^{de 10} imagens baseado em TWOMBLI, otimizado para a arquitetura do tecido pulmonar. Ao combinar a coloração por Elastica com análise quantitativa de rede, esse fluxo de trabalho vai além da avaliação histológica convencional e permite caracterização detalhada da abundância de fibras, fragmentação, organização espacial e complexidade estrutural. O protocolo é particularmente adequado para estudos que investigam fibrose, enfisema, remodelação pulmonar associada à obesidade, doenças pulmonares inflamatórias, envelhecimento e outras condições caracterizadas pela remodelação da matriz extracelular no pulmão.

Protocolo

Todos os experimentos com camundongos descritos aqui foram realizados de acordo com a aprovação do Comitê de Ética Animal do estado da Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha (AZ: 81-02.04.2021.A221).

NOTA: Use equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas, proteção ocular) durante todo o procedimento.

1. Amostragem e preparação de tecido pulmonar murino

NOTA: Os camundongos foram eutanasiados por overdose de isoflurano conforme diretrizes institucionais e governamentais antes da coleta de tecidos.

1. Abra cuidadosamente a cavidade torácica com uma incisão na linha média, depois corte o diafragma ao longo de sua fixação e exponha delicadamente os pulmões.
2. Remova todo o pulmão extirpando os lobos direito e esquerdo juntos, tomando cuidado para manter todos os lóbulos intactos.
3. Coloque os lobos pulmonares individualmente em um tubo de 5 mL contendo 2 mL de formalina tamponada neutra a 10% e incube por 15–20 horas a 4 °C.
   NOTA: A fixação preserva a arquitetura do tecido para análises histológicas e de fibras elásticas subsequentes. Como o principal objetivo desse fluxo de trabalho era a visualização e avaliação quantitativa da organização das fibras elásticas, em vez de análises morfométricas alveolares, os pulmões não eram fixados na inflação antes do processamento do tecido.
   ATENÇÃO: Formalina neutra tamponada contém formaldeído, que é tóxico, cancerígeno e pode causar irritação na pele, olhos e respiratória. Manuseie formalina em um exaustor químico certificado enquanto usa equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança.
4. Imergir o tecido pulmonar fixo em parafina usando o protocolo padrão de imersão^{histológica 11}.
   NOTA: Garantir desidratação completa e infiltração de parafina para manter a morfologia dos tecidos para a coloração subsequente. Para minimizar a variabilidade entre amostras e garantir compatibilidade entre condições experimentais, sempre use os mesmos lobos pulmonares para cada análise. Recomenda-se usar o lobo esquerdo para histologia.
5. Corte o tecido pulmonar de FFPE em seções de 5 a 7 μm de espessura usando um micrótomo e monte-as em lâminas de vidro padrão. Asse os slides a 60 °C por 1 hora antes de prosseguir com aplicações a jusante. Os slides podem ser armazenados em RT em um ambiente livre de poeira por várias semanas ou a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: Evite exposição à umidade durante o armazenamento, pois a umidade pode causar oxidação da parafina e comprometer a qualidade das manchas. Armazene os slides em uma caixa plástica lacrada com desidratante caso seja necessário armazenamento a longo prazo.
   Ponto de pausa: Armazene os slides em RT ou 4 °C até a mancha.

2. Mancha de fibra elástica

1. Realize a coloração com Elastica (ressorcina-fucsina) em seções de tecido pulmonar embutidas em parafina de 5–7 μm para visualizar fibras elásticas nas estruturas alveolares e vasculares.
   NOTA: Apenas tinga o maior número possível de lâminas ao mesmo tempo para garantir intensidade e reprodutibilidade consistentes entre as amostras.
   1. O deparaffinato desliza mergulhando os slides em xileno (isômeros mistos) duas vezes por 5 minutos cada.
      ATENÇÃO: O xileno é tóxico e inflamável. Manuseie em uma caifa química e use equipamentos de proteção adequados.
   2. Reidrate as lâminas em séries descendentes de etanol até 80% de etanol.
      1. Incube a lâmina por 3 minutos em RT em uma câmara de coloração cheia de 100% etanol.
      2. Transfira a lâmina para etanol 100% fresco e incube por 3 minutos em RT.
      3. Transfira a lâmina para etanol 95% e incube por 3 minutos no RT.
      4. Transfira a lâmina para etanol 80% e incube por 3 minutos em RT.
   3. Transfira a lâmina para uma nova câmara de coloração contendo solução de Ressorcina-Fucisina e incube por 20–30 minutos em RT.
      NOTA: A solução de coloração por ressorcina-fucisina pode ser usada várias vezes e é estável na RT.
      ATENÇÃO: A solução de coloração com ressorcina-fucsina contém produtos químicos potencialmente perigosos, incluindo ácidos concentrados e corantes, que podem causar irritação na pele e nos olhos. Manuseie a solução em uma área bem ventilada ou exaustor e use o equipamento de proteção individual adequado conforme as diretrizes de segurança da instituição.
   4. Coloque o lâmina em uma câmara de coloração sob água destilada corrente e lave por 1 minuto.
   5. Diferencie em 95–96% etanol: 15–60 s, monitore ao microscópio.
      NOTA: Pare quando as fibras elásticas permanecem de um roxo-violeta profundo e o fundo estiver adequadamente limpo. Fibras elásticas manchadas parecem de roxo escuro. As fibras de colágeno permanecem sem manchas e normalmente parecem pálidas. Manchas excessivas podem aumentar o fundo; Ajuste o tempo de incubação dependendo da espessura e fixação do tecido.
   6. Interrompa a diferenciação transferindo a lâmina imediatamente para água bidestilada e enxaguando por 30 segundos. Opcional: A contracoloração pode ser realizada se necessário para avaliação pulmonar adicional, mas pode reduzir a eficiência da segmentação de fibras. Recomendamos realizar a coloração H&E para avaliar o pulmão em cortes adjacentes.
   7. Desidrate as lâminas sequencialmente em etanol 95% por 1–2 minutos, seguido por etanol 100% duas vezes por 1–2 minutos para remover água residual.
   8. Limpe as seções em xileno 2 vezes por 3 minutos até que o tecido pareça opticamente transparente.
   9. Monte os coverslips usando uma resina sintética permanente compatível com xileno e permita que os slides sequem planos em RT.
      NOTA: A desidratação completa e a limpeza são essenciais para evitar a turvidão e garantir a preservação a longo prazo das partes manchadas.
      Ponto de Pausa: Armazene lâminas montadas com manchas no RT até a imagem.

3. Imagem de fibra elástica e análise de rede

1. Aquisição de imagem
   1. Adquira imagens de campo claro de alta resolução de seções de tecido pulmonar usando um scanner de lâminas com objetivo de 40×. Garanta ajustes consistentes de exposição e balanço de branco em todas as amostras.
      NOTA: As imagens foram obtidas usando configurações idênticas do scanner durante todo o estudo, incluindo ampliação, resolução espacial (0,25 μm/pixel), iluminação e exposição.
   2. Desenhe uma região de interesse (ROI) que abrange toda a seção do tecido pulmonar para garantir cobertura completa durante a varredura.
   3. Defina uma área de referência de fundo sem tecido para medir e subtrair a intensidade do fundo durante a análise da imagem.
   4. Use a detecção automática de foco do scanner para atribuir um número ótimo de pontos focais no tecido, garantindo nitidez e qualidade de imagem uniformes.
   5. Adquira a imagem usando iluminação uniforme e configurações de exposição.
      NOTA: Se o foco automático falhar em regiões densas ou irregulares, utilize ajuste manual de foco fino para garantir que todas as estruturas do tecido, incluindo áreas alveolares e vasculares, sejam capturadas com nitidão.
2. Deconvolução de Imagem: estimativa do vetor de manchação no QuPath¹². Vetores de coloração representam os valores específicos de absorção RGB de cada corante histológico, permitindo a separação de colorações sobrepostas durante a deconvolução de cor.
   NOTA: Neste protocolo, vetores de coloração foram definidos no QuPath, pois vetores de coloração pré-definidos para ressorcina-fucisina não estão disponíveis em Fiji.
   1. Abra a imagem no QuPath e selecione o tipo de imagem de campo claro.
      NOTA: Para minimizar o viés, calcule vetores de coloração usando imagens representativas do conjunto de dados e aplique os mesmos valores a todas as imagens.
   2. Desenhe uma região de interesse (ROI) que contenha predominantemente fibras elásticas para definir o primeiro componente de coloração.
   3. Na aba Imagem, navegue até as seções do vetor de Tinção.
   4. Clique em Stain 1, depois defina o vetor stain a partir do ROI para definir o vetor de cor para fibras elásticas (tipicamente roxo-violeta).
   5. Selecione um ROI contendo tecido não elástico (por exemplo, fundo ou colágeno) e clique em coloração 2, então defina o vetor de coloração do ROI para definir o componente de cor secundária.
   6. O QuPath calcula automaticamente o Corte 3, correspondente ao fundo.
   7. Um exemplo de vetores calculados e aplicados em Fiji: Resorcin-Fuchsin R:0,6201225, G:0,6541292, B:0,43308553; Sinal não específico R:0.31585205; G:0.815618; B:0,48477295; Contexto R:-0,105005614, G:-0,4780256, B:0,87204665.
      NOTA: Esses valores foram corados para imagens coradas apenas com ressorcina-fucsina. Se houver uma contracoloração presente, novos vetores de coloração precisam ser calculados.
   8. Salve esses como vetores de coloração personalizados e aplique para uma deconvolução de cor consistente em todas as amostras.
      NOTA: Definir vetores de coloração personalizados a partir de regiões representativas melhora a precisão da deconvolução de cor, especialmente para coloração por ressorcina-fucsina, onde elastina e tons de fundo podem variar entre lotes.
3. Deconvolução de Cor da Imagem em^{Fiji 13,14}.
   1. Abra Fiji (ImageJ) e carregue a imagem do campo claro da seção de tecido tingido.
   2. Opcional: Transforme a imagem para o formato RGB (Tipo → → Colorido RGB) somente se a imagem não estiver já em RGB (por exemplo, imagens de 8 bits). Essa etapa abre uma nova janela de imagem; Salve para preservar os dados brutos originais.
   3. Realize a deconvolução de cores selecionando Imagem > Cor > Deconvolução de Cor > Valores do Usuário.
   4. Apresente o vetor de manchação personalizado obtido anteriormente do QuPath.
   5. Execute o plugin para gerar três imagens em tons de cinza separadas correspondentes a fibras elásticas, tecido excluindo fibras elásticas e fundo.
   6. Use imagens diretamente para TWOMBLI sem pré-processamento adicional. O TWOMBLI requer imagens nítidas com resolução suficiente; suavização (por exemplo, desfoque gaussiano) deve ser evitada para preservar detalhes estruturais.
      NOTA: Certifique-se de que as regiões selecionadas no QuPath para estimativa vetorial sejam representativas da coloração típica, pois esses vetores personalizados serão aplicados uniformemente em todas as imagens para uma comparação consistente.
   7. Salve o canal de fibra elástica como um arquivo TIFF para quantificação e análise a jusante.
4. Seleção de ROI para Análise de Fibra
   1. Para cada seção pulmonar, selecione cinco ROIs quadrados e imparciais na região alveolar e cinco ROIs na região peribronquiolar (100 μm x 100 μm cada).
   2. Duplique cada ROI na imagem bruta (Imagem > Duplicar) para preservar os dados originais.
   3. Duplique os mesmos ROIs na análise de fibras elásticas desconvolutas.
   4. Salve todos os ROIs duplicados como arquivos TIFF individuais para análise posterior.
      NOTA: Regiões contendo pregas teciduais, artefatos de seção, rasgos, grandes vasos sanguíneos ou arquitetura alveolar mal preservada foram excluídas da análise. Apenas os ROIs de fibra elástica deconvoludos foram usados como entrada para a análise TWOMBLI, enquanto duplicados de imagens brutas correspondentes foram mantidos como arquivos de referência para controle de qualidade e inspeção visual. As regiões de interesse (ROIs) devem ser selecionadas por amostragem aleatória sistemática para garantir uma representação imparcial do tecido. Para minimizar ainda mais o viés do operador, um script automatizado de seleção de ROI compatível com o QuPath é fornecido no Arquivo Suplementar 1 e no Arquivo Suplementar 2, e sua implementação é descrita na Seção 3.5.
5. Aplicando a seleção automatizada de ROI no QuPath usando um script automatizado de seleção de ROI.
   1. Abra a imagem no QuPath e defina o tipo de imagem para Campo Claro.
   2. No menu Ferramentas , selecione a ferramenta de anotação desejada para criar as anotações iniciais. Anotações quadradas são recomendadas.
   3. Faça anotações quadradas no tecido pulmonar. Cada anotação deve abranger apenas uma região de interesse (ROI) para análise, seja uma região alveolar ou uma área peribrônquica.
   4. Uma vez criadas as anotações, navegue até Anotações e selecione Anotações de Travado para evitar movimentos ou modificações acidentais.
   5. Adicione as classes "alvéolos" e "área peribrônquica" à lista de classes clicando no botão "+" ao lado de lista de classes no painel de anotação.
   6. Atribua cada anotação à classe apropriada. Selecione uma anotação, escolha a classe correspondente e clique em Definir selecionado. A cor da anotação mudará, e a classe atribuída ("alvéolos" ou "área peribrônquica") será exibida no painel de propriedades da anotação.
   7. Abra o script correspondente e execute-o. Ao concluir, uma mensagem indicará que os ROIs foram gerados com sucesso. Os ROIs recém-criados aparecerão na hierarquia de anotações como anotações filhos da anotação original que define a classe.
   8. Para exportar os ROIs, selecione-os e navegue até Arquivo → Exportar Imagens → Pixels Originais. Salve os ROIs exportados como arquivos TIFF.
      NOTA: As prescrições foram projetadas para reconhecer apenas os nomes das classes "alvéolos" e "área peribrônquica". Esses nomes devem ser inseridos exatamente conforme especificado. Por padrão, os scripts geram aleatoriamente cinco ROIs quadrados não sobrepostos, medindo 100 μm × 100 μm dentro de cada anotação. Os ROIs dos candidatos são aceitos apenas se seus cantos e centro estiverem totalmente contidos dentro dos limites de anotação, garantindo total inclusão na região selecionada. Tanto o número quanto as dimensões dos ROIs podem ser modificados dentro do script para acomodar requisitos experimentais específicos. Pelo menos três réplicas biológicas e um mínimo de cinco ROIs por amostra são recomendados para análises.
6. Análise TWOMBLI
   1. Salve todas as imagens de ROI das fibras elásticas em uma pasta dedicada para análise.
   2. Crie duas subpastas dentro do diretório de trabalho: a. Pasta de máscaras – para máscaras binárias geradas por TWOMBLI. b. Pasta HDM – para imagens de Matriz de Alta Densidade (HDM) geradas por TWOMBLI.
   3. Execute o plugin TWOMBLI: Abra Fiji e inicie TWOMBLI (Plugins -> Macros -> Run).
   4. Selecione o arquivo de parâmetros de análise apropriado. Os seguintes parâmetros TWOMBLI foram usados para análise de fibras elásticas, listados na Tabela 1.
      NOTA: Esses parâmetros podem variar dependendo da intensidade da coloração. Os parâmetros foram otimizados empiricamente usando múltiplas imagens representativas de seções de tecido pulmonar coradas sob condições padronizadas. A otimização foi realizada comparando as máscaras geradas com o padrão de coloração original e selecionando as configurações que proporcionam a melhor sobreposição entre a máscara segmentada e a rede de fibras elásticas subjacentes. Uma vez estabelecido, os mesmos parâmetros foram aplicados a todas as imagens dentro do conjunto de dados.
   5. Escolha a opção "fibras escuras sobre fundo claro".
   6. Gere e salve máscaras binárias na pasta Mask.
   7. Gerar e salvar imagens binárias na pasta HDM.
   8. Extraia parâmetros quantitativos da rede, como comprimento da fibra, pontos de ramificação, curvatura, densidade e alinhamento.
      NOTA: A análise TWOMBLI requer imagens nítidas e de alta resolução (>1 pixel/μm). Deconvolução de cor ruim, regiões desfocadas ou compressão de imagem podem comprometer a precisão da quantificação da rede de fibra.
7. Quantificação e Análise Estatística
   1. Exporte parâmetros de rede TWOMBLI como um arquivo CSV.
   2. Importe os dados brutos do CSV para o GraphPad Prism para análise estatística e visualização.
      NOTA: Recomenda-se o seguinte parâmetro: Máscara de Comprimento Total, que reflete a quantidade total de fibras elásticas dentro do ROI, permitindo quantificar a abundância e perda de fibras. Extremidades da Fibra indicam o grau de fragmentação da fibra; Um número maior de pontos finais sugere fibras interrompidas ou quebradas. Pontos de Ramificação de Fibra medem o quão interconectadas as fibras estão, refletindo a complexidade estrutural e a integridade da rede ECM. Um número maior de pontos de ramificação indica uma rede mais complexa e interligada. A lacunaridade quantifica a homogeneidade da distribuição das fibras ao longo do ROI. Baixa lacunaridade indica uma rede uniforme com lacunaridades de tamanho semelhante, enquanto alta lacunaridade reflete uma rede heterogênea com tamanhos variáveis de lacunaridade que descrevem uma estrutura mais complexa. A Dimensão Fractal de Contagem de Caixas captura a complexidade da arquitetura de fibras. Valores mais altos de dimensão fractal indicam redes mais intrincadas e detalhadas, enquanto valores mais baixos refletem estruturas mais simples ou perturbadas.
   3. Gerar gráficos colunas mostrando média ± SEM para cada parâmetro quantificado da rede (por exemplo, comprimento da fibra, ramificação, curvatura e densidade).
   4. Normalidade dos dados do teste usando o teste de Shapiro-Wilk. Para dados paramétricos, aplique um teste t de Student sem pareamento bilaterais. Para dados não paramétricos, aplique um teste Mann-Whitney U. Para comparações envolvendo mais de dois grupos experimentais, deve ser aplicada uma análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida de um teste de comparação múltipla post hoc apropriado, ou um teste de Kruskal–Wallis para dados não paramétricos.
      NOTA: Mantenha todos os arquivos CSV brutos inalterados para garantir reprodutibilidade e rastreabilidade dos dados. Informe o número de ROIs e réplicas biológicas analisadas para cada condição nas legendas das figuras.

Resultados

Este protocolo fornece parâmetros quantitativos da rede de fibras elásticas em diferentes regiões pulmonares e condições experimentais. A análise TWOMBLI, como descrito anteriormente, fornece parâmetros como comprimento da fibra, densidade de ramificação, lacunaridade e dimensão fractal para avaliação da matriz^{extracelular 10}. Com base nesse enquadramento, nossa abordagem permite uma caracterização abrangente da organização das fibras elásticas, possibilitando a avaliação de mudanças na abundância das fibras, conectividade, uniformidade e complexidade estrutural tanto em tecidos pulmonares fisiológicos quanto patológicos.

No tecido pulmonar saudável, as fibras elásticas formam redes longas, contínuas e bem alinhadas ao longo dos septos alveolares e das estruturas peribrônquicas. Em contraste, pulmões patológicos ou metabolicamente alterados, como os de camundongos obesos, frequentemente apresentam aumento do ramificamento e maior complexidade da rede, refletindo alterações na organização das fibras^{elásticas 3}. Resultados representativos, incluindo máscaras binárias e parâmetros quantitativos, são representados nas Figuras 1A e B. Esses resultados podem ser integrados com análises histológicas e moleculares para avaliar a integridade da ECM e a extensão da^{remodelação 3}. Lacunaridade e preenchimento de lacunas são exemplificadas em tecido pulmonar saudável para visualizar diferenças na organização da ECM (Figura 1C). Em combinação com outras métricas quantitativas, esses parâmetros capturam a complexidade da rede e revelam mudanças na arquitetura dos tecidos impulsionadas pela reorganização da ECM, fornecendo insights sobre padrões distintos de remodelação estrutural dentro da rede de fibras elásticas.

A interpretação precisa desses resultados quantitativos depende criticamente da aquisição e processamento de imagens de alta qualidade. Condições de imagem ou processamento subótimas, incluindo foco ruim, iluminação inconsistente ou estimativa imprecisa do vetor de coloração, podem resultar em máscaras fragmentadas ou ruidosas e, consequentemente, resultados quantitativos pouco confiáveis (Figura 1D). Portanto, uma inspeção visual cuidadosa das imagens brutas e dos resultados de segmentação é essencial para garantir a qualidade dos dados antes da interpretação. Máscaras subótimas podem ser tipicamente reconhecidas por fragmentação excessiva de fibras contínuas, segmentação descontínua ou incompleta, incorporação de ruído de fundo como estruturas de fibra, ou má sobreposição entre o padrão original de coloração e a máscara gerada, indicando que os parâmetros de aquisição de imagem, estimativa do vetor de coloração ou segmentação devem ser reavaliados. Para ilustrar essas características, seções com contracoloração foram intencionalmente analisadas, o que interfere na identificação das fibras elásticas e resulta em segmentação subótima. Um exemplo de máscara de baixa qualidade desse tipo é mostrado na Figura 1E. Para avaliar ainda mais a robustez e reprodutibilidade do fluxo de trabalho, conjuntos de dados de imagens foram analisados independentemente por dois pesquisadores usando os mesmos parâmetros otimizados de análise (Figura 2A). Além disso, amostras derivadas de animais independentes foram incluídas para avaliar a variabilidade biológica (Figura 2B). Resultados quantitativos comparáveis foram obtidos entre operadores e réplicas biológicas, apoiando a reprodutibilidade e independência do usuário do pipeline de análise de imagens proposto. Juntas, essas análises demonstram que o fluxo de trabalho permite uma avaliação robusta da organização das fibras elásticas e facilita comparações entre condições fisiológicas e patológicas.

Figura 1. Fluxo de Trabalho de Análise de Coloração Elástica. (A) Imagem bruta representativa, sinal de fibra elástica isolada obtido por deconvolução de imagem, máscara binária gerada usando TWOMBLI e sobreposição das fibras elásticas originais com a máscara correspondente, demonstrando segmentação precisa. (B) Parâmetros quantitativos representativos gerados pela análise TWOMBLI. (C) Exemplos de análises de lacunaridade e preenchimento de lacunas em tecido pulmonar murino saudável para ilustrar diferenças na organização da matriz extracelular. (D) Ilustração de máscaras fragmentadas e ruidosas resultantes de aquisição ou processamento de imagem subótimo. (E) Seção de tecido contra-colorida com hematoxilina e eosina, demonstrando identificação prejudicada das fibras elásticas e geração de máscara subótima. Áreas que apresentam correspondência fraca entre o padrão original de coloração e a máscara gerada são indicadas. Barra da escala A, D = 100 μm, E = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Reprodutibilidade e robustez do fluxo de trabalho de análise de fibras elásticas. (A) Conjuntos de dados de imagens foram analisados independentemente por dois pesquisadores usando parâmetros de análise TWOMBLI para avaliar a reprodutibilidade entre operadores. Métricas quantitativas derivadas de TWOMBLI são apresentadas. A e B indicam os dois operadores independentes. (B) Amostras derivadas de animais independentes foram analisadas para avaliar a variabilidade biológica. Métricas quantitativas derivadas do TWOMBLI são apresentadas, demonstrando resultados comparáveis entre réplicas biológicas e apoiando a robustez da linha de análise. M1, M2 e M3 indicam animais individuais saudáveis. n = 3, A análise estatística foi realizada usando ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de múltiplas comparações de Dunnett. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Parâmetros	Valores
Saturação de contraste	0.75
Largura mínima de linha	5
Largura máxima da linha	10
Janela de curvatura mínima	20
Janela de curvatura máxima	80
Comprimento mínimo dos ramos	10
Exibição Maximun HDM	175
Diâmetro mínimo da lacuna	0

Tabela 1: Resumo dos parâmetros quantitativos derivados do TWOMBLI. Visão geral dos parâmetros gerados pelo TWOMBLI e sua interpretação para a avaliação da arquitetura das fibras elásticas no tecido pulmonar. As métricas incluem medidas de abundância de fibra, ramificação, alinhamento, conectividade e organização da rede.

Arquivo Suplementar 1: Alvéolos de ROI Imparcial Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: ROI imparcial área peribrônquica. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Esse protocolo oferece um fluxo de trabalho robusto e reprodutível para investigar a arquitetura da matriz extracelular pulmonar murina (ECM), com foco especial na remodelação de fibras elásticas impulsionadas por fibroblastos. Fibras elásticas são essenciais para manter a compaciência pulmonar e o recuo, e sua perturbação é uma característica marcante de múltiplas doenças pulmonares, incluindo fibrose, lesão pulmonar, envelhecimento e distúrbios^{metabólicos 2}. Apesar de seu papel funcional central, a avaliação quantitativa da organização e montagem das fibras elásticas permaneceu limitada. O fluxo de trabalho preenche essa lacuna ao permitir a caracterização sistemática e quantitativa da arquitetura de redes de fibra elástica.

Uma grande força desse método está na integração de um fluxo de trabalho de imagem quantitativa com análise histológica estrutural. Embora abordagens convencionais frequentemente avaliem separadamente a composição ou características histológicas da ECM, esse protocolo permite a quantificação objetiva da organização das fibras elásticas, incluindo comprimento da fibra, ramificação e complexidade da rede. Isso permite a comparação direta entre condições fisiológicas e patológicas e fornece insights sobre a remodelação de ECM mediada por^{fibroblastos 3}.

No entanto, vários aspectos técnicos são críticos para garantir a consistência experimental e a qualidade dos dados. A coloração por ressorcina–fucsina é sensível a variáveis como tempo de fixação, espessura da seção e consistência do reagente, tornando a padronização essencial para a reprodutibilidade. Os resultados quantitativos do TWOMBLI dependem da qualidade da imagem, resolução e seleção consistente da região de interesse, e portanto devem ser interpretados junto com a avaliação histológica e validados em múltiplas amostras. Além disso, a densidade e morfologia das fibras diferem entre as regiões alveolar e peribrônquica, exigindo otimização específica para cada região. Essa abordagem captura a organização global da rede de fibras elásticas em duas dimensões e não resolve características ultraestruturais, que exigem técnicas de maior resolução, como microscopia eletrônica. Modalidades de imagem tridimensional, incluindo microscopia confocal ou multifotônica, podem aprimorar ainda mais a análise da geometria e conectividade das fibras.

Várias etapas dentro do fluxo de trabalho são particularmente críticas para garantir resultados confiáveis e reproduzíveis. Fixação do tecido, qualidade da seção e coloração consistente por ressorcina-fucsina influenciam substancialmente a visualização das fibras elásticas e, portanto, devem ser cuidadosamente padronizadas.  Baixa intensidade de tingimento, coloração desigual ou alto fundo de fundo podem resultar de qualidade variável dos reagentes, condições de coloração inconsistentes ou preservação inadequada dos tecidos. Além disso, recomenda-se a inclusão de tecidos pulmonares saudáveis e doentes, controles técnicos de coloração e amostras de referência processadas em lotes experimentais para monitorar a consistência da coloração e a robustez analítica. Tecidos ricos em fibras elásticas podem ainda servir como controles positivos para validar procedimentos de aquisição e segmentação de imagens. A estimativa precisa do vetor de coloração durante a deconvolução da imagem é outro passo essencial, pois a seleção inadequada do vetor pode levar à extração incompleta de fibras e à fragmentação de máscaras. Dependendo da questão experimental, o fluxo de trabalho pode ser modificado ajustando o tamanho e o número do ROI, adaptando parâmetros de processamento de imagem ou integrando abordagens de imagem tridimensional para investigar mais a fundo a organização das fibras elásticas.

No geral, esse método representa uma plataforma versátil para estudar a remodelação da ECM em contextos fisiológicos e patológicos. Como a integridade das fibras elásticas está diretamente ligada à adesão pulmonar e à função mecânica, essa abordagem é particularmente importante para entender como as mudanças estruturais na ECM se traduzem em alterações na função pulmonar. Ele é bem adequado para investigar mudanças estruturais impulsionadas por fibroblastos e oferece novas oportunidades para compreender melhor a remodelação da ECM e sua contribuição para a progressão da doença e função tecidual. A abordagem também pode ser estendida a outros tecidos, incluindo tecidos cardiovasculares, pele, útero, distúrbios do tecido conjuntivo, órgãos fibróticos e amostras humanas, ou combinada com técnicas avançadas de imagem espacial e de alta resolução para ampliar ainda mais sua aplicabilidade.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172