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Artigo de método
Esse protocolo permite transplantes intracerebrais neonatais eficientes de populações definidas de microglia, apoiando um enfrate robusto de longo prazo e a análise da linhagem da microglia e integração in vivo entre múltiplas fontes de doadores e modelos de receptores.
A substituição da microglia por transplante de células mieloides surgiu como uma abordagem experimental promissora para estudar processos neurológicos e doenças. No entanto, as estratégias de transplante existentes são frequentemente limitadas por enxerramento ineficiente, dependência de condicionamento baseado em irradiação ou flexibilidade restrita entre os sistemas doador e receptor. Aqui, descrevemos um protocolo de transplante intracerebral neonatal para introduzir populações purificadas de microglia (microglias Hoxb8 e não-Hoxb8 ) no cérebro de camundongos em desenvolvimento. Esse método permite o enfratimento eficiente de células doadoras e a integração no parênquima cerebral sob condições fisiologicamente permissivas. Importante destacar que o protocolo é compatível com múltiplas fontes de doadores, incluindo progenitores hematopoiéticos embrionários e microglias derivadas do cérebro pós-natal, e pode ser aplicado em modelos distintos de receptores com microglia endógena reduzida ou ausente, incluindo camundongos condicionais deficientes em Csf1r e camundongos Csf1rΔFIRE . As células doadoras são purificadas por triagem celular ativada por fluorescência e entregues bilateralmente em cérebros de camundongos neonatais usando micropipetas de vidro para uma entrega eficiente e minimamente invasiva. Os camundongos receptores são envelhecidos para permitir que as células doadoras expandam e povoem o nicho da microglia, e os desfechos são avaliados por análise histológica da distribuição de células doadoras e da expressão dos marcadores. Essa abordagem oferece uma plataforma robusta e escalável para estudar a ontogênica da microglia e a integração in vivo em diversos contextos experimentais.
A substituição da microglia por meio do transplante de células mieloides surgiu como uma estratégia poderosa para investigar a biologia da microglia e como um potencial paradigma terapêutico para doenças neurológicas. Nos últimos anos, o campo avançou para estratégias capazes de substituir ampla a microglia no sistema nervosocentral 1. Estudos recentes demonstraram que macrófagos e progenitores derivados de doadores podem enxertar o cérebro, adotar programas transcricionais semelhantes aos de microglia e, em alguns casos, melhorar fenótipos associados àdoença 2,3,4,5,6,7,8.
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Todos os métodos e experimentos deste estudo foram realizados em camundongos. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) da Universidade de Utah, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01).
1. Preparar casais reprodutores para ninhadas doadoras e receptoras
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O transplante intracerebral neonatal de populações purificadas de microglia resulta em sobrevivência a longo prazo e em amplo enfrato de células derivadas de doador dentro do parênquima cerebral receptor. Populações purificadas de microglia doadora foram isoladas por separação celular ativada por fluorescência usando repórteres de linhagem fluorescente (Hoxb8 microglia: tdTomato⁺ GFP⁺; microglia não-Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) antes do transplante (Figu.......
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O transplante intracerebral neonatal de progenitores microgliais purificados ou subpopulações microgliais definidas oferece uma abordagem robusta para reconstruir o compartimento microglial in vivo e examinar propriedades específicas de linhagem dos macrófagos cerebrais. Esse método possibilita a reconstituição seletiva usando células doadoras geneticamente definidas, possibilitando avaliação direta do enfratimento e maturação de células doadoras no ambiente cerebral.
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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Esse trabalho foi apoiado pelos National Institutes of Health (R01 MH093595) (M.R.C.), pela Dauten Family Foundation e pela University of Utah Flow Cytometry Facility. Os camundongosCsf1r ΔFIRE foram gerados pelo Dr. Ben Xu na Universidade de Utah.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bell jar | Various | N/A | Usado para eutanásia |
| Capilares de vidro borossilicato com filamento | Sutter Instrument | BF100-78-15 | Usado para agulhas de injeção |
| Álbumina sérica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A8806 | Usado para preparar buffer PB. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| CD11b Alexa Fluor 700 | BioLegend | 101222 | Células mieloides |
| CD45 APC | BioLegend | 103112 | Células hematopoiéticas |
| Peneiras de células (70 µm) | Falcon | 352350 | Usado para gerar suspensões de células únicas. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| Anticorpo anti-GFP de frango | Aves Labs | GFP-1020 | Coloração por imunofluorescência |
| Anticorpo c-Kit PE-Cy7 | BioLegend | 105814 | Progenitores hematopoiéticos |
| Microscópio confocal | Leica | TCS SP5 | Usado para imagem por fluorescência |
| Tubo cônico (15 mL/ 50 mL) | Eppendorf | https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301 | Processamento de tecido/célula. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| Máquina cryostat | Leica | https://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/ | Gerar seções de tecido congelado . Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| Corante nuclear DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Usado para viabilidade e coloração nuclear |
| Microscópio dissecante | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/ | Usado para aparar e preparar agulhas de injeção . Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| Classificador de citometria de fluxo FACSAria | BD Bioscience | FACSAria | Purificação de células |
| Fc block (CD16/32 purificado) | Biolegend | 101302 | Bloqueia a ligação indesejada de anticorpos a células de camundongo que expressam receptores Fc |
| Soro fetal bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.html | Usado em tampões de preparação celular. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| Tubo flexível para pipeta manual | Various | N/A | Componente do aparelho de injeção manual |
| Software de análise de citometria de fluxo | FlowJo | v10.8.1 | Usado para análise de dados FACS |
| Classificador de células de citometria de fluxo | BD Biosciences | FACSAria | Usado para purificação de células |
| gentleMACS Octo Dissociator com aquecedores | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Usado para dissociação de tecido cerebral |
| Anticorpo secundário Goat anti-chicken Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | Anticorpo secundário |
| Anticorpo secundário Goat anti-cobaia Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | Anticorpo secundário |
| Anticorpo secundário Goat anti-rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21245 | Anticorpo secundário |
| Anticorpo secundário Goat anti-rato Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-48265 | Anticorpo secundário |
| Anticorpo anti-tdTomato de cobaia | Frontier Institute | AB_2631185 | Coloração por imunofluorescência |
| Solução de sal balanceada de Hanks (HBSS) | Gibco | 14175-079 | Usado durante a preparação celular |
| Hemocitómeter | Various | N/A | Contagem de células |
| Filtro em linha para pipeta manual | Various | N/A | Previne a contaminação |
| Microgrinder | Narishige | EG-400 | Usado para chanfrar agulhas de injeção de vidro |
| Extrator de micropipeta | Sutter Instrument | P-1000 | Usado para gerar agulhas de injeção finas |
| Bocal de pipeta manual | Various | N/A | Usado para controle manual de injeção |
| Kit de dissociação de tecido neural (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Usado para dissociação enzimática de tecido cerebral |
| Pratos de Petri | Thermo Fisher Scientific | https://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022 | Usado para armazenar agulhas puxadas ou colheita de tecido. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| Anticorpo anti-Iba1 de coelho | Wako | 019-19741 | Marcador de micróglia |
| Anticorpo anti-TMEM119 de coelho | Abcam | 209064 | Marcador específico de micróglia |
| Anticorpo anti-CD206 de rato | BioLegend | 141712 | Usado para identificar populações de macrófagos |
| Anticorpo anti-P2RY12 de rato | BioLegend | 848002 | Marcador de micróglia |
| Lâminas de barbear/bisturis | Various | N/A | Usado para aparar pontas de agulhas ou colheita de tecido |
| Buffer de lise de RBC | ChemCruz | sc-296258 | Usado para remoção de células vermelhas do sangue |
| Aparelho estereotáxico | Kopf Instruments | https://kopfinstruments.com/ | Usado para implantação cirúrgica. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo. |
| Anticorpo Ter119 PerCP-Cy5.5 | BioLegend | 116228 | Células da linhagem eritroide |
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