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Artigo de método

Transplante Intracerebral Neonatal para Substituição da Microglia e Análise de Linhagem In Vivo

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DOI:

10.3791/72119

⸱

28 de julho de 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo permite transplantes intracerebrais neonatais eficientes de populações definidas de microglia, apoiando um enfrate robusto de longo prazo e a análise da linhagem da microglia e integração in vivo entre múltiplas fontes de doadores e modelos de receptores.

Resumo

A substituição da microglia por transplante de células mieloides surgiu como uma abordagem experimental promissora para estudar processos neurológicos e doenças. No entanto, as estratégias de transplante existentes são frequentemente limitadas por enxerramento ineficiente, dependência de condicionamento baseado em irradiação ou flexibilidade restrita entre os sistemas doador e receptor. Aqui, descrevemos um protocolo de transplante intracerebral neonatal para introduzir populações purificadas de microglia (microglias Hoxb8 e não-Hoxb8 ) no cérebro de camundongos em desenvolvimento. Esse método permite o enfratimento eficiente de células doadoras e a integração no parênquima cerebral sob condições fisiologicamente permissivas. Importante destacar que o protocolo é compatível com múltiplas fontes de doadores, incluindo progenitores hematopoiéticos embrionários e microglias derivadas do cérebro pós-natal, e pode ser aplicado em modelos distintos de receptores com microglia endógena reduzida ou ausente, incluindo camundongos condicionais deficientes em Csf1r e camundongos Csf1rΔFIRE . As células doadoras são purificadas por triagem celular ativada por fluorescência e entregues bilateralmente em cérebros de camundongos neonatais usando micropipetas de vidro para uma entrega eficiente e minimamente invasiva. Os camundongos receptores são envelhecidos para permitir que as células doadoras expandam e povoem o nicho da microglia, e os desfechos são avaliados por análise histológica da distribuição de células doadoras e da expressão dos marcadores. Essa abordagem oferece uma plataforma robusta e escalável para estudar a ontogênica da microglia e a integração in vivo em diversos contextos experimentais.

Introdução

A substituição da microglia por meio do transplante de células mieloides surgiu como uma estratégia poderosa para investigar a biologia da microglia e como um potencial paradigma terapêutico para doenças neurológicas. Nos últimos anos, o campo avançou para estratégias capazes de substituir ampla a microglia no sistema nervosocentral 1. Estudos recentes demonstraram que macrófagos e progenitores derivados de doadores podem enxertar o cérebro, adotar programas transcricionais semelhantes aos de microglia e, em alguns casos, melhorar fenótipos associados àdoença 2,3,4,5,6,7,8. Esses achados apoiam o conceito de que a substituição de macrófagos cerebrais pode ser utilizada para estudar e potencialmente modificar processos de doenças neurológicas.

Um desafio central no transplante de microglia é alcançar um entravimento robusto enquanto minimizam os confundimentos experimentais. Muitas estratégias de reposição estabelecidas dependem de irradiação, quimioterapia ou paradigmas de depleção da microglia para gerar um nicho enxertável 6,9,10,11,12,13. Apesar de sua eficácia, essas abordagens podem induzir senescência da microglia, perturbar a barreira hematoencefálica e alterar a sinalização inflamatória, tudo isso pode complicar a interpretação do comportamento das célulasdoadoras 9,14. Trabalhos mais recentes começaram a explorar abordagens independentes ou de toxicidade reduzida para a substituição damicroglia 5,8,15.

O momento do desenvolvimento é um fator importante para o sucesso do transplante. O cérebro neonatal oferece um ambiente permissivo que apoia a expansão das células doadoras e a integração a longo prazo, provavelmente devido à redução das barreiras estruturais e ao estabelecimento contínuo do nicho endógeno da microglia. Estudos recentes de transplante usando parto pós-natal precoce (P0–P5) demonstram enfrate parênquima robusto e aquisição de identidade semelhante à microglia, reforçando a importância do contexto de desenvolvimento para uma substituição eficiente 7,8,16,17.

A microglia Hoxb8 fornece um sistema particularmente informativo para estudar contribuições específicas de linhagem para a biologia da microglia. Essas células surgem de progenitores hematopoiéticos embrionários e representam um subconjunto definido da microglia parênquimata com consequências comportamentais quandodisfuncionais 17,18,19,20,21. Trabalhos recentes usando progenitores primários do Hoxb8 e sistemas progenitores dos receptores de microglia e estrogênio (ER)-Hoxb8 demonstram que essas células podem ser expandidas, geneticamente manipuladas e enxertadas com sucesso no cérebro, onde adotam perfis transcricionais semelhantes aos de microglia e características funcionais 7,8,17. Esses avanços destacam ainda mais a utilidade das abordagens de transplante para dissecar a linhagem e a heterogeneidade da microglia.

Aqui, descrevemos uma plataforma de transplante intracerebral neonatal otimizada para versatilidade entre sistemas de doador e receptor. Em contraste com abordagens que dependem de irradiação ou condicionamento sistêmico, esse método utiliza entrega intracerebral bilateral direta em camundongos neonatais, permitindo a colocação de células doadoras em um ambiente cerebral permissivo para o desenvolvimento, minimizando perturbações sistêmicas. A técnica é compatível com múltiplas fontes de doadores, incluindo progenitores hematopoéticos embrionários e microglias derivadas do cérebro pós-natal, e pode ser aplicada em modelos distintos de receptores com microglia endógena reduzida ou ausente. Uma grande vantagem prática é que o crânio neonatal fino permite a injeção manual rápida com micropipetas de vidro, eliminando a necessidade de perfuração ou fixação estereotáxica, ao mesmo tempo em que alcança um entravimento parênquimatoso amplo.

Juntos, essa abordagem oferece um sistema robusto, flexível e escalável para estudar ontogenia da microglia, heterogeneidade e integração in vivo em diversos contextos experimentais. Isso posiciona o transplante intracerebral neonatal como uma alternativa complementar e experimentalmente controlada às estratégias de substituição sistêmica da microglia.

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Protocolo

Todos os métodos e experimentos deste estudo foram realizados em camundongos. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) da Universidade de Utah, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01).

1. Preparar casais reprodutores para ninhadas doadoras e receptoras

  1. Coloque os casais de reprodutores na mesma gaiola à noite para iniciar acasalamentos programados.
  2. Inspecione as fêmeas todas as manhãs para a presença de um tampão vaginal para confirmar o acasalamento bem-sucedido.
  3. Retirar as fêmeas tapadas dos machos e mantê-las separadas até o parto, que leva aproximadamente 18 a 20 dias.
  4. Manuseie as mães grávidas com cuidado por 5 minutos diários, de 7 a 10 dias antes do nascimento, para reduzir o estresse associado ao manuseio neonatal.
  5. Expõe as mães a um cotonete contendo odor de betadine durante as sessões diárias de manuseio para reduzir o estresse materno quando os filhotes retornam após a cirurgia.
  6. Prepare gaiolas limpas com material de nidificação para fêmeas grávidas antes do parto previsto.

2. Colheita e processamento de cérebros neonatais

  1. Eutanasie camundongos doadores neonatais (P0–P4) por overdose de isoflurano usando um sino de jarra ou câmara fechada semelhante equipada com piso falso para evitar contato direto com o anestésico.
  2. Assim que a respiração cessa e a ausência de reflexos é confirmada, decapite imediatamente.
  3. Colhe o cérebro inteiro, incluindo o cerebelo e os bulbos olfativos. Coloque cérebros em 3 mL de Solução Salina Equilibrada 1× Hanks (HBSS) fria em uma placa de Petri plástica sobre gelo.
  4. Usando bisturis e pinças estéreis, triture o cérebro em pedaços de aproximadamente 1–2mm 3 .
  5. Transfira o tecido cerebral moído (1 cérebro por tubo de dissociação tecidual) para tubos de dissociação tecidual contendo reagentes digestivos enzimáticos fornecidos pelo sistema de dissociação do tecido neural, conforme o protocolo recomendado pelo fabricante.
  6. Coloque os tubos em um dispositivo mecânico de dissociação com capacidade de aquecimento e incube a 37 °C por 30 minutos usando o programa de dissociação de tecido neural recomendado pelo fabricante.
  7. Pré-imersão em peneiras de células de 70 μm com 400 μL de 1× HBSS.
  8. Passe o tecido dissociado pelos filtros pré-imersos que são colocados sobre um tubo cônico de 50 mL sobre gelo.
  9. Lave os tubos com 10 mL de 1× HBSS e passe pelos filtros para garantir a máxima recuperação celular.
  10. Descarte os filtros e centrifuge as células a 300 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. Aspire o sobrenadante.
  11. Ressuspenda as células em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos em água ultrapura estéril por amostra e incube por 10 minutos a 4 °C.
  12. Extingua a reação de lise com 10 mL de 1× HBSS/1% BSA/5% FBS.
  13. Descarte os filtros e centrifuge as células a 300 × g por 10 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
  14. Determine o número de células usando um hemocitômetro. A faixa típica de rendimento das células é de 3,2–4,0 ×10,6 antes da seleção.
  15. Resuspender células em 5% de FBS em 1× HBSS na concentração desejada para coloração de anticorpos a jusante.

3. Coloração por anticorpos celulares para triagem FACS de populações de microglia

  1. Resuspenda as células em 1 mL de tampão de coloração (5% FBS em 1× HBSS) contendo anticorpo bloqueador do receptor Fc (CD16/32 purificado, 1:2000) e incube as células por 10 minutos a 4 °C.
  2. Centrifuge as células a 240 × g por 3 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
  3. Incubar células com anticorpos conjugados fluorescentes (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) em 1 mL de tampão de tingimento por 30 minutos sobre gelo no escuro.
  4. Centrifuge as células a 240 × g por 3 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
  5. Adicione um corante de viabilidade (por exemplo, 3 μM DAPI em 1× HBSS) para excluir células mortas.
  6. Realize a classificação FACS usando um separador de células de alta velocidade equipado com lasers apropriados para detecção DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC e CD11b-Alexa Fluor 700.
  7. Use um bico de 100 μm com baixa pressão de bainha sempre que possível para maximizar a viabilidade da célula. Mantenha os tubos de coleta de amostras e as células separadas no gelo durante todo o processo.
  8. Use células não coradas, controles de compensação de cor única e controles de fluorescência menos um quando necessário para ajustar tensões, compensação e gates.
  9. Primeiro, as células de gate por área de dispersão frontal versus área de dispersão lateral para excluir detritos.
  10. Singletes de porta usando altura de espalhamento lateral versus largura de dispersão lateral.
  11. Exclua células mortas por meio de gating em células DAPI⁻.
  12. De singlets ao vivo, gate no CD45CD11b⁺ microglia baixo .
  13. Dentro da portamicroglial baixa CD11b⁺ CD45, use GFP e fluorescência tdTomato para separar populações microglianas doadoras (microglia Hoxb8 : DAPI⁻ CD45CD11b⁺ tdTomato ⁺ GFP⁺, microglia não-Hoxb8 : DAPI⁻ CD45CD11b ⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Separe cada população em tubos de coleta estéreis contendo HBSS frio 1x.
  15. Após a separação, reanalise uma pequena alíquota de células separadas para confirmar pureza e viabilidade antes do transplante.
  16. Colete as células separadas em HBSS 1× estéreis e mantenha-as no gelo no escuro até o transplante.
    NOTA: Os rendimentos típicos para microglia Hoxb8 variam de 3,70–4,60 x10 4 células e para microglia não-Hoxb8 1,10–1,14 x10 5 células por cérebro neonatal (P0–P4), embora os rendimentos possam variar dependendo da idade, genótipo e eficiência do processamento tecidual. Transplante células vivas purificadas o mais rápido possível, idealmente dentro de 60 minutos após a separação celular.

4. Colheita e processamento de progenitores hematopoiéticos do fígado fetal

  1. Eutanasiem mães grávidas usando isoflurano a 5% administrado em oxigênio por meio de um vaporizador de precisão até que a respiração cesse e a ausência de reflexos seja confirmada.
  2. Após overdose de isoflurano, realizar um método físico secundário por luxação cervical para garantir a morte, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidado e uso animal.
  3. Remova os chifres uterinos dos camundongos grávidos e coloque-os em 3 mL frios de 1× HBSS em placas plásticas de Petri (60 mm × 15 mm).
  4. Dissecar embriões de E12.5 do útero e colocar em 3 mL frescos e frios 3 mL de 1× HBSS em placas plásticas de Petri.
  5. Disseque fígados fetais usando pinças finas e coloque-os em 3 mL frescos de HBSS 1× frio contendo 5% de FBS em placas de Petri.
  6. Dissocie mecanicamente o tecido hepático fetal agrupado usando uma agulha de 26 G e uma seringa de 3 mL.
  7. Centrifuge as células a 240 × g por 5 minutos a 4 °C. Aspire o sobrenadante.
  8. Lave as células com 1× HBSS.
  9. Passe a suspensão da célula por um filtro de célula de 80 μm.
  10. Incube as células em 20 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (0,15 M cloreto de amônio, 1 mM KHCO3) por 5 minutos, seguido pela adição de 13 mL de 1× HBSS para têmpera.
  11. Continue a incubação por 5 minutos para lisar os glóbulos vermelhos.
  12. Centrifuge as células a 200 × g por 5 minutos a 4 °C.

5. Coloração por anticorpos celulares para classificação FACS de células progenitoras hematopoéticas

  1. Incubar células do fígado fetal com anticorpos conjugados fluorescentes (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; Kit PE-Cy7, 1:100) em 5% FBS/1% BSA em 1× HBSS por 30 minutos no gelo no escuro.
  2. Lave as células com 1× HBSS e centrifuge a 240 × g por 5 minutos a 4 °C.
  3. Adicione um corante de viabilidade (por exemplo, 3 μM DAPI em 1× HBSS) para excluir células mortas.
  4. Realize a separação FACS usando um classificador de células de alta velocidade equipado com lasers e filtros apropriados para detecção DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato e GFP.
  5. Use um bico de 100 μm com baixa pressão de bainha sempre que possível para maximizar a viabilidade da célula. Mantenha os tubos de coleta de amostras e as células separadas no gelo durante todo o processo.
  6. Use células não coradas, controles de compensação de cor única e controles de fluorescência menos um quando necessário para ajustar tensões, compensação e gates.
  7. Primeiro as células de porta usando área de dispersão frontal versus área de dispersão lateral para excluir detritos.
  8. Singletes de porta usando altura de dispersão frontal versus largura de dispersão frontal, seguida pela altura de dispersão lateral versus largura de dispersão lateral.
  9. Exclua células mortas por meio de gating em células DAPI⁻.
  10. Dos singletos vivos, excluir as células da linhagem eritróide por meio de um gate para células Ter119⁻.
  11. Dentro da população Ter119⁻, a porta nas células progenitorashematopoética de alto nível Kit é de alta frequência.
  12. Dentro daalta população DAPI⁻ Ter119⁻ Kit, isole progenitores positivos para linhagem Hoxb8 por meio de gating em células tdTomato⁺.
  13. Se a linha doadora também contiver o repórter Cx3cr1-GFP, use fluorescência de GFP para confirmar que a população progenitora hepática fetal classificada está GFP⁻ ouGFP baixa neste estágio, distinguindo as células progenitoras das células mieloides diferenciadas que expressam Cx3cr1.
  14. Separe a população final DAPI⁻ Ter119⁻Kit high tdTomato⁺ GFP em tubos de coleta estéreis contendo 1× HBSS frio.
  15. Após a separação, reanalise uma pequena alíquota de células separadas para confirmar pureza e viabilidade antes do transplante.
  16. Colete as células separadas em HBSS 1× estéreis e mantenha-as no gelo no escuro até o transplante.
    NOTA: Os rendimentos típicos variam de aproximadamente 5,0–7,0 × 104 progenitores hematopoiéticos Hoxb8 por preparação hepática fetal E12,5, dependendo do tamanho do embrião e da eficiência de triagem. Transplante células vivas purificadas o mais rápido possível, idealmente dentro de 60 minutos após a separação.

6. Preparação de agulhas de injeção

  1. Coloque capilares de vidro borosilicato (1,0 mm de diâmetro externo, 0,58 mm de diâmetro interno, com filamento) em um puxador de micropipeta.
  2. Puxe capilares usando um programa de puxação de duas linhas otimizado para gerar agulhas longas e afiladas, adequadas para transplante intracerebral neonatal.
    1. Configurações típicas incluem: Calor = 645, Puxão = 30, Velocidade = 120, Atraso = DESLIGADO e Pressão = 200. Otimize as configurações finais para o tipo específico de vidro, condições ambientais e calibração do puxador. Em seguida, apare as agulhas resultantes e bisel-as para produzir um diâmetro final da ponta externa de aproximadamente 30 μm.
  3. Coloque as agulhas puxadas sobre duas tiras de massa dentro de uma grande placa plástica de Petri para proteger as pontas de danos antes de aparar e chanfrar.
  4. Coloque a agulha puxada sob um microscópio estereoscópico dissecante com aproximadamente 10× a 20× ampliação e apoie-a com uma órtese suave.
    NOTA: Ampliações maiores (20×–40×) podem ser usadas durante a inspeção da ponta para verificar a formação correta do afilamento e identificar quaisquer defeitos antes do corte e do biselado.
  5. Use uma lâmina de barbear estéril para aparar a ponta da agulha e obter um diâmetro externo de aproximadamente 30 μm.
  6. Prenda a agulha aparada em um suporte para micromoedor.
  7. Ajuste o ângulo do chanframento para 30°–35°.
  8. Ligue o moedor e a iluminação.
  9. Deixe a água destilada pingar sobre a pedra de moer a uma taxa constante de aproximadamente uma gota a cada 4–5 segundos.
  10. Leve a ponta da agulha suavemente em contato com a pedra de moer giratória até que uma borda chanfrada seja formada.
  11. Meça o diâmetro externo da ponta chanfrada usando um dispositivo de medição de ponta quando disponível.
  12. Selecione agulhas com diâmetro externo próximo a 30 μm para transplante.
  13. Encha a agulha com buffer estéril e exija o líquido suavemente para confirmar que a ponta está aberta e sem obstrução.

7. Preparação do aparelho de injeção

  1. Monte uma pipeta manual controlada pela boca, composta por tubos flexíveis, um bocal, um filtro em linha e um suporte capilar.
    NOTA: Um filtro em linha é incorporado ao aparelho de pipetagem controlado pela boca para evitar contaminação.
  2. Marque a agulha a cada 2 mm (até 2 marcas por agulha). Cada 2 mm corresponde a ~2 μL.
  3. Insira a agulha de injeção de vidro preparada ~1,5 cm no suporte capilar e confirme que o conjunto está seguro e hermético.
  4. Aplique uma sucção suave pelo bocal para verificar o fluxo de ar desobstruído e a resistência adequada.
  5. Confirme que o sistema permite controle suave da aspiração e injeção antes de carregar as células doadoras.
  6. Preencha a agulha de injeção de vidro com a suspensão de células doadoras preparadas (4,5 μL no total) usando uma ponta fina de pipeta.
    NOTA: Certifique-se de que nenhuma bolha de ar permaneça na agulha antes de iniciar o transplante. Use uma agulha por mouse.

8. Anestesiação de receptores neonatais e preparação do campo cirúrgico

  1. Posicione o camundongo neonatal na orientação supina sobre a mesa cirúrgica e induza anestesia usando isoflurano 2,0%–5,0% entregue em oxigênio por meio de um vaporizador de precisão.
  2. Coloque o nariz do camundongo dentro de um cone nasal para manter a entrega contínua de isoflurano e oxigênio durante todo o procedimento.
  3. Deixe aproximadamente 1 minuto para a indução da anestesia enquanto monitora a respiração.
  4. Toque suavemente os membros e confirme a ausência de reflexo de abstinência para verificar anestesia adequada.
  5. Uma vez alcançado um plano anestésico adequado, reduza a concentração de isoflurano para 0,5%–2,0% para manutenção e continue a anestesia por até 10 minutos durante o procedimento de transplante.
  6. Mantenha o camundongo neonatal em aproximadamente 38 °C usando uma almofada térmica colocada sob a mesa cirúrgica.
  7. Limpe a área do local da injeção na cabeça usando aplicações alternadas de betadine e etanol 70% com cotonetes estéreis.
  8. Aplique uma camada final de betadine e deixe a pele secar antes da injeção.
    ATENÇÃO: O isoflurano é um agente anestésico perigoso. Use sistemas adequados de limpeza anestésica e garanta ventilação adequada do ambiente, de acordo com as diretrizes de segurança institucionais.

9. Realização de transplante intracerebral neonatal

  1. Estabilize suavemente a cabeça usando dedos enluvados ou um suporte macio para minimizar o movimento durante a injeção.
    NOTA: Os camundongos receptores são transplantados entre P1 e P4.
  2. Identificar locais bilaterais de injeção no telencefalão dorsal anterior (futura região do córtex frontal), aproximadamente 1–2 mm laterais à linha média sagital e imediatamente caudais aos bulbos olfativos. Posicione os locais de injeção simetricamente em cada hemisfério, evitando vasos sanguíneos visíveis na superfície.
    NOTA: Devido ao crânio fino e ao pequeno tamanho dos camundongos neonatais, as injeções são realizadas usando marcos anatômicos visuais em vez de coordenadas estereotáxicas.
  3. Inspecione visualmente o crânio e evite inserir a agulha perto de vasos sanguíneos visíveis.
  4. Avance suavemente a micropipeta de vidro chanfrado pela pele e pelo crânio em desenvolvimento.
  5. Guie a agulha aproximadamente 1–2 mm abaixo da superfície do crânio até o hemisfério frontal.
  6. Administre células doadoras usando pressão manual controlada através do aparelho de pipeta controlada pela boca.
    NOTA: Ao transplantar progenitores hematopoiéticos purificados ou microglia neonatal, injete 2–3 μL por hemisfério, correspondendo a aproximadamente 2,5 × 104 células por injeção. Isso fornece aproximadamente 5 × 104 células por cérebro de camundongo.
  7. Retire lentamente a micropipeta do cérebro para minimizar o refluxo das células injetadas e reduzir danos tecidos.
  8. Realize a injeção contralateral.
    NOTA: Use uma agulha por camundongo para evitar contaminação cruzada entre camundongos.

10. Recuperação de recém-nascidos transplantados

  1. Coloque cada filhote em um almofadeiro térmico imediatamente após o procedimento.
  2. Monitore os filhotes até que a cor normal do corpo, o movimento espontâneo e a atividade geral retornem.
    NOTA: O tempo de recuperação varia de 5 a 10 minutos.
  3. Devolvam os filhotes para a represa.
  4. Esfregue cada filhote cuidadosamente com a cama da gaiola e o material de ninho.
  5. Coloque os filhotes de volta na gaiola com a mãe.
  6. Confirme que a mãe recupera e aceita os filhotes devolvidos.

11. Monitoramento da saúde pós-operatória

  1. Observe os filhotes diariamente por 10 minutos nos primeiros 3 dias após o transplante.
  2. Avalie os filhotes quanto à atividade normal, comportamento de mamação e interação com a mãe.
    NOTA: Não perturbe as gaiolas de ratos durante esse período. Isso pode aumentar o estresse na barragem.
  3. Continue monitorando os filhotes dia sim, dia não, até o desmame após o período inicial de 3 dias.
  4. Avalie os filhotes quanto ao desenvolvimento normal, comportamento alimentar, nível de atividade e cuidados maternos.
  5. Meça e registre o peso corporal diariamente durante o período pós-operatório inicial.
  6. Avalie os filhotes em busca de sinais de desconforto, postura anormal, letargia ou alimentação prejudicada.
  7. Realize a eutanásia humanitária quando necessário, conforme as diretrizes institucionais de cuidado animal.
    1. Para camundongos neonatais, eutanasie por overdose de isoflurano usando um sino de jarro ou câmara fechada semelhante equipada com um piso falso para evitar contato direto com o anestésico. Assim que a respiração cessa e a ausência de reflexos é confirmada, decapite imediatamente.
    2. Para camundongos adultos, eutanasia usando isoflurano a 5% administrado em oxigênio por meio de um vaporizador de precisão até que a respiração cesse e a ausência de reflexos seja confirmada, seguida pela luxação cervical como método físico secundário para garantir a morte.
      NOTA: Animais que apresentaram mortalidade pós-operatória ou ausência de enxerto de células doadoras detectáveis no desfecho experimental foram excluídos da análise. Analgesia pós-operatória não foi administrada porque o transplante intracerebral neonatal foi considerado minimamente invasivo.

12. Coleta de tecidos cerebrais para criossecção e coloração por imunofluorescência

  1. Remova o cérebro cuidadosamente e prepare-o para análise em seções congeladas.
  2. Processar tecido cerebral pós-natal para criossecação e cortar as seções coronais usando um crióstato conforme os procedimentos descritos anteriormente.
    NOTA: Para cada camundongo, são analisadas 9–12 seções coronais que atravessam o córtex somatossensorial.
  3. Monte seções sobre lâminas de microscópio e armazene-as a -20 °C até a mancha.
  4. Incubar seções brevemente em tampão de permeabilização contendo 0,2% de Triton X-100 e 1% de desoxicolato de sódio.
  5. Prepare anticorpos primários (anti-GFP de frango, 1:500; Anticorpo anti-td do tomate para porquinho-da-índia, 1:250; coelho anti-Iba1; 1:500) diluído no tampão de diluição de anticorpos apropriado.
  6. Incube as seções do tecido com anticorpos primários durante a noite a 4 °C.
  7. Lave as seções com soro salino tamponado com fosfato para remover anticorpos primários não ligados.
  8. Incubar seções com anticorpos secundários conjugados com fluoróforos (anti-coelho de cabra Alexa Fluor 647, 1:500; anti-porquinho-da-índia de cabra Alexa Fluor 555, 1:500; anti-frango de cabra Alexa Fluor 488, 1:500) por 2 horas em temperatura ambiente no escuro.
  9. Contra-colorir seções com DAPI para visualizar núcleos celulares.
  10. Monte as seções usando um meio antifade e aplique um revestimento de vidro.

13. Aquisição de imagens em microscopia confocal

  1. Adquira imagens de fluorescência usando um microscópio confocal equipado com 10× ou 20× alvos.
  2. Adquira imagens em resolução de 512 × 512 ou 1024 × 1024 pixels usando velocidades de varredura de 200–400 Hz.
  3. Colete seções ópticas com intervalos de z-step de 2 a 5 μm pelo tecido.

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Resultados

O transplante intracerebral neonatal de populações purificadas de microglia resulta em sobrevivência a longo prazo e em amplo enfrato de células derivadas de doador dentro do parênquima cerebral receptor. Populações purificadas de microglia doadora foram isoladas por separação celular ativada por fluorescência usando repórteres de linhagem fluorescente (Hoxb8 microglia: tdTomato⁺ GFP⁺; microglia não-Hoxb8 : tdTomato⁻ GFP⁺) antes do transplante (Figu...

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Discussão

O transplante intracerebral neonatal de progenitores microgliais purificados ou subpopulações microgliais definidas oferece uma abordagem robusta para reconstruir o compartimento microglial in vivo e examinar propriedades específicas de linhagem dos macrófagos cerebrais. Esse método possibilita a reconstituição seletiva usando células doadoras geneticamente definidas, possibilitando avaliação direta do enfratimento e maturação de células doadoras no ambiente cerebral.

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelos National Institutes of Health (R01 MH093595) (M.R.C.), pela Dauten Family Foundation e pela University of Utah Flow Cytometry Facility. Os camundongosCsf1r ΔFIRE foram gerados pelo Dr. Ben Xu na Universidade de Utah.

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Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bell jarVariousN/AUsado para eutanásia
Capilares de vidro borossilicato com
filamento		Sutter InstrumentBF100-78-15Usado para agulhas de injeção
Álbumina sérica bovina (BSA)Sigma AldrichA8806Usado para preparar buffer PB. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Células mieloides
CD45 APCBioLegend103112Células hematopoiéticas
Peneiras de células (70 µm)Falcon352350Usado para gerar suspensões de
células únicas. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
Anticorpo anti-GFP de frangoAves LabsGFP-1020Coloração por imunofluorescência
Anticorpo c-Kit PE-Cy7BioLegend105814Progenitores hematopoiéticos
Microscópio confocalLeicaTCS SP5Usado para imagem por fluorescência
Tubo cônico (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Processamento de tecido/célula. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
Máquina cryostatLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Gerar seções de tecido congelado
. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
Corante nuclear DAPIThermo Fisher ScientificD1306Usado para viabilidade e
coloração nuclear
Microscópio dissecanteLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Usado para aparar e preparar agulhas de injeção
. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
Classificador de citometria de fluxo FACSAriaBD BioscienceFACSAria Purificação de células
Fc block (CD16/32 purificado)Biolegend101302Bloqueia a ligação indesejada de anticorpos a células de camundongo que expressam receptores Fc
Soro fetal bovino (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlUsado em tampões de preparação
celular. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
Tubo flexível para pipeta manualVariousN/AComponente do aparelho de injeção
manual
Software de análise de citometria de fluxoFlowJov10.8.1Usado para análise de dados FACS
Classificador de células de citometria de fluxoBD BiosciencesFACSAriaUsado para purificação de células
gentleMACS Octo Dissociator com
aquecedores		Miltenyi Biotec130-096-427Usado para dissociação de tecido cerebral
Anticorpo secundário Goat anti-chicken Alexa Fluor 488
Thermo Fisher ScientificA-11039Anticorpo secundário
Anticorpo secundário Goat anti-cobaia Alexa Fluor
555		Thermo Fisher ScientificA-21428Anticorpo secundário
Anticorpo secundário Goat anti-rabbit Alexa Fluor 647
Thermo Fisher ScientificA-21245Anticorpo secundário
Anticorpo secundário Goat anti-rato Alexa Fluor 647
Thermo Fisher ScientificA-48265Anticorpo secundário
Anticorpo anti-tdTomato de cobaiaFrontier InstituteAB_2631185Coloração por imunofluorescência
Solução de sal balanceada de Hanks
(HBSS)		Gibco14175-079Usado durante a preparação
celular
HemocitómeterVariousN/AContagem de células
Filtro em linha para pipeta manualVariousN/APrevine a contaminação
MicrogrinderNarishigeEG-400Usado para chanfrar agulhas de injeção de
vidro
Extrator de micropipetaSutter InstrumentP-1000Usado para gerar agulhas de injeção finas
Bocal de pipeta manualVariousN/AUsado para controle manual de
injeção
Kit de dissociação de tecido neural (P)Miltenyi Biotec130-092-628Usado para dissociação enzimática de tecido cerebral
Pratos de PetriThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Usado para armazenar agulhas puxadas ou colheita de tecido. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
Anticorpo anti-Iba1 de coelhoWako019-19741Marcador de micróglia
Anticorpo anti-TMEM119 de coelhoAbcam209064Marcador específico de micróglia
Anticorpo anti-CD206 de ratoBioLegend141712Usado para identificar populações de macrófagos
Anticorpo anti-P2RY12 de ratoBioLegend848002Marcador de micróglia
Lâminas de barbear/bisturisVariousN/AUsado para aparar pontas de agulhas ou
colheita de tecido
Buffer de lise de RBCChemCruzsc-296258Usado para remoção de células
vermelhas do sangue
Aparelho estereotáxicoKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Usado para implantação cirúrgica. Várias marcas estão disponíveis. A listada aqui é apenas um exemplo.
Anticorpo Ter119 PerCP-Cy5.5BioLegend116228Células da linhagem eritroide
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Referências

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