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Artigo de método

Protocolo de Isolamento de RNA de Múltiplas Espécies de Tardígrados

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DOI:

10.3791/72120

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1 de setembro de 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha os procedimentos de isolamento de RNA a partir de várias espécies de tardígrados, utilizando um kit de isolamento de RNA baseado em coluna, projetado para isolar RNA de pequenas quantidades de tecido e produzir quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA e síntese de DNA complementar.

Resumo

Tardígrados são animais microscópicos conhecidos por sua tolerância excepcional ao estresse ambiental. Esses animais podem sobreviver à dessecação, pressões extremas, baixas temperaturas e altos níveis de radiação ionizante. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a essas capacidades de extremotolerância permanecem parcialmente compreendidos. As abordagens moleculares utilizadas para investigar esses mecanismos, que incluem sequenciamento de RNA, interferência de RNA (RNAi) e expressão heteróloga de genes de tardígrados em sistemas como bactérias, exigem o isolamento de RNA mensageiro (mRNA) de alta qualidade a partir de material biológico limitado. Neste estudo, descrevemos um protocolo reprodutível para o isolamento de RNA total de tardígrados que (1) é eficaz em múltiplas espécies, incluindo uma espécie de heterotardígrado, (2) requer apenas 25–200 animais, dependendo do tamanho corporal, e (3) fornece RNA com quantidade e qualidade suficientes para aplicações posteriores. O protocolo atual permite com sucesso a recuperação eficiente de RNA a partir de quantidades razoáveis de tardígrados e sustenta investigações moleculares da tolerância ao estresse em diversas espécies de tardígrados.

Introdução

Os tardígrados são bem conhecidos por sua capacidade de sobreviver a estresses extremos aos quais outros animais não resistiriam, incluindo dessecação, pressões extremas, temperaturas extremas e agentes que danificam o DNA, como drogas quimioterápicas e radiação ionizante1,2,3,4,5,6,7,8. Nos últimos anos, cientistas têm investigado os mecanismos que sustentam a resistência extrema dos tardígrados utilizando abordagens moleculares, como sequenciamento de RNA, interferência de RNA (RNAi) e expressão heteróloga de genes de tardígrados em outros sistemas, incluindo células humanas e bactérias8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Quando aplicadas, essas abordagens têm sido uma ferramenta poderosa para nos proporcionar insights sobre como exatamente os tardígrados são capazes de resistir a tais estresses extremos8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. No entanto, todas essas abordagens moleculares para compreender a tolerância ao estresse em tardígrados dependem da capacidade de isolar RNA desses pequenos animais em quantidade suficiente e com qualidade adequada para uso em processos subsequentes.

Um método anterior para isolamento de RNA de tardígrados mostrou-se bem-sucedido para pesquisadores que trabalham com Hypsibius exemplaris23. No entanto, ao tentar replicar esse protocolo em H. exemplaris, verificamos que ele era pouco confiável quanto à concentração e qualidade do RNA obtido (dados não publicados). Um método alternativo de isolamento de RNA baseado em fenol demonstrou funcionar para H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus e uma espécie de heterotardígrado13,21,22,24,25,26. Esse protocolo mostrou-se capaz de fornecer RNA de qualidade e quantidade adequadas para processos subsequentes, tanto a partir de animais individuais quanto de grupos de animais (~50). No entanto, esse protocolo exige que o usuário manipule reagentes contendo fenol. O fenol é uma substância química perigosa que exige manipulação cuidadosa, e a execução inadequada desse protocolo pode resultar em contaminação residual de fenol, afetando a pureza do RNA e suas aplicações posteriores. Outro protocolo publicado anteriormente para isolamento de RNA de tardígrados enfoca a capacidade de isolar RNA de animais individuais27. Embora esse seja um protocolo valioso para aplicações como PCR quantitativa (qPCR)27, é menos apropriado para aplicações posteriores como sequenciamento de RNA, nas quais o objetivo é obter uma visão mais abrangente de como os animais respondem a um determinado agente estressante ou condição.

Essas limitações nos protocolos disponíveis de isolamento de RNA levaram à investigação de métodos alternativos para o isolamento de RNA de tardígrados. O kit de isolamento de RNA baseado em coluna utilizado neste protocolo é comercializado para isolar RNA de pequenas quantidades de tecido. Este kit também já foi usado anteriormente para isolar RNA de tecidos de insetos para análises de sequenciamento de RNA em etapas subsequentes, sugerindo que poderia ser adequado para isolamentos de outros animais pequenos com cutícula, como os tardígrados28. Este estudo descreve o protocolo passo a passo para o uso deste kit de isolamento de RNA baseado em coluna com tardígrados, incluindo explicações sobre precauções específicas que devem ser tomadas ao realizar este protocolo com tardígrados. Este artigo relata o sucesso deste protocolo em seis espécies de tardígrados (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti e o heterotardígrado Viridiscus celatus). O estudo validou que RNA de qualidade e quantidade substanciais pode ser obtido a partir de apenas 25 animais. Exemplos de dados resultantes de concentração e qualidade do RNA também são fornecidos e são adequados para aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA (com amplificação de biblioteca exponencial e viés mínimo) e síntese de DNA complementar (cDNA). Este protocolo de isolamento de RNA já se mostrou útil para revelar mecanismos de tolerância à radiação em H. exemplaris8. O sucesso deste protocolo em várias espécies de tardígrados sugere que ele poderia ser aplicado de forma mais ampla na investigação de mecanismos de tolerância ao estresse, mecanismos de desenvolvimento e processos evolutivos.

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Protocolo

O seguinte protocolo não exige aprovação ética institucional para uso de animais, pois animais invertebrados são isentos desse requisito. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do equipamento e da área para o isolamento de RNA

  1. Ligue um bloco térmico ou banho-maria a 42 °C em preparação para a extração de RNA.
  2. Obtenha um suporte para tubos microcentrífugos, pipetas (2 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL) e ponteiras filtradas de tamanhos apropriados.
  3. Limpe a superfície da bancada, o suporte para tubos, as pipetas e as caixas de ponteiras com RNase Away, solução diluída de hipoclorito (10%) ou etanol 70% para desnaturar qualquer RNase residual.
    NOTA: A presença excessiva de RNase no equipamento ou na área onde se está isolando o RNA pode resultar em qualidade insuficiente de RNA após o isolamento, devido à degradação. Reduza esse risco permitindo tempo suficiente para que os produtos químicos desnaturantes de RNase atuem, e certifique-se de que a área e o equipamento estejam completamente secos antes de prosseguir.
  4. Use luvas em todas as etapas deste protocolo e trate frequentemente as luvas com uma solução desnaturante de RNase durante todo o procedimento, para evitar a degradação do RNA por RNase.

2. Coleta de animais para isolamento de RNA

  1. Usando uma pipeta com bulbo acoplado a uma câmara de aspiração equipada com uma capilar de vidro (Figura 1A), um laço de Irwin ou uma micropipeta, transfira 25–200 animais (dependendo do tamanho da espécie) de suas placas de cultura para uma placa com água de nascente limpa, a fim de reduzir a quantidade de material não pertencente a tardígrados (como algas ou outras fontes alimentares, tais como nematoides ou rotíferos, dependendo da espécie).
  2. Obtenha um tubo de 1,5 mL livre de RNase e um pistilo.
  3. Usando uma pipeta com bulbo acoplado a uma câmara de aspiração equipada com uma capilar de vidro ou um laço de Irwin, transfira os animais para o fundo do tubo de 1,5 mL livre de RNase, tomando cuidado especial para transferir a menor quantidade possível de água junto com os animais.
  4. Centrifugue a 4.500 g durante 3 minutos para sedimentar os tardígrados no fundo do tubo de microcentrífuga.
  5. Enquanto observa o tubo com os tardígrados sedimentados ao microscópio estereoscópico, use uma pipeta de 20 µL ou uma pipeta com bulbo acoplado a uma câmara de aspiração equipada com uma capilar de vidro com abertura menor do que os tardígrados dos quais está isolando o RNA, para remover cuidadosamente a maior quantidade possível de água, sem perturbar o pellet de tardígrados. Veja a Figura 1B para uma representação da quantidade aceitável de água remanescente.
    NOTA: Tenha cuidado para deixar uma fina camada de água, evitando que os animais se desidratem no breve intervalo entre a remoção da água e a adição do Tampão de Extração (XB). Se os animais se desidratarem, isso pode resultar em baixa qualidade do RNA após o isolamento.
  6. Adicione 100 µL do Tampão de Extração (XB) ao tubo contendo os tardígrados.

3. Disrupção mecânica de tardígrados e extração de RNA

  1. Usando o pistilo livre de RNase, desintegre os tardígrados moendo suave mas firmemente o pistilo no fundo do tubo por cerca de 30 s. Um total de 20 a 30 movimentos de moagem deve ser suficiente para desintegrar os tardígrados.
  2. Remova o pistilo do tubo, tomando cuidado para garantir que o máximo possível de líquido permaneça no fundo do tubo.
  3. Verifique o conteúdo do tubo de microcentrífuga ao microscópio estereoscópico para garantir que não haja animais intactos visíveis restantes.
  4. Incube a mistura a 42 °C por 30 min em um bloco térmico agitador com agitação suave (300 rpm).
    NOTA: O Tampão de Extração (XB) estabiliza o RNA para prevenir sua degradação nesta temperatura.

4. Condicionamento da coluna de isolamento de RNA

  1. Nos últimos 10 min da incubação de extração, monte a coluna para coleta e purificação de RNA. Coloque uma coluna de purificação em um tubo de coleta e identifique a coluna adequadamente.
  2. Adicione 250 µL do Tampão de Condicionamento (CB) diretamente à coluna.
  3. Incube à temperatura ambiente por 5 min.
  4. Centrifugue a 16,000 × g por 1 min e descarte o fluxo passante. A coluna está agora pronta para receber o sobrenadante de RNA da próxima etapa.
  5. Retire o Tampão 10x da Reação de DNase I e Água Isenta de Nucleases do congelador para descongelar completamente a tempo da etapa 6 abaixo.

5. Ligação do RNA à coluna

  1. Após a incubação de extração, centrifugue o tubo contendo tardígrados mecanicamente disruptados e o Tampão de Extração (XB) a 3.000 × g durante 2 min.
  2. Obtenha um novo tubo livre de RNase e rotule-o adequadamente.
  3. Usando uma pipeta de 200 µL com ponteira de filtro, remova cuidadosamente o sobrenadante dos tegumentos de tardígrados sedimentados. Tenha cuidado para não perturbar o pellet de tegumento e para remover apenas o sobrenadante.
    NOTA: A transferência de tegumento para etapas subsequentes resultará em menor eficiência de recuperação de RNA na coluna devido ao entupimento físico da coluna. Para evitar esse erro potencial, você pode observar a ponteira com o sobrenadante ao microscópio para garantir a ausência de tegumento. Se houver algum tegumento presente, devolva o sobrenadante ao tubo e repita a etapa de centrifugação.
  4. Transfira o sobrenadante para o seu tubo recém-rotulado e livre de RNase.
  5. Pipete 100 µL de etanol 70% no tubo contendo seu RNA e misture completamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Nesta etapa, deve-se observar filamentos viscosos claros ao adicionar o etanol. Esse é um bom sinal de que há RNA presente no seu sobrenadante.
  6. Pipete toda a mistura (200 µL) na sua coluna preparada do passo 4.
    NOTA: Ao pipetar quaisquer soluções na coluna nesta e nas etapas subsequentes, tenha o cuidado de dispensar o líquido no centro da coluna e evite tocar fisicamente a coluna com a ponteira da pipeta. A perfuração mecânica da coluna resultará em problemas posteriores na qualidade e quantidade de RNA.
  7. Para ligar o RNA à coluna, centrifugue por 2 min a 100 × g, seguido de centrifugação a 16.000 × g por 30 s para remover o fluxo passante.

6. Preparação da solução de DNase I

  1. Deixe o Tampão de Reação 10x de DNase I e Água Livre de Nucleases descongelarem completamente antes de preparar a solução.
  2. Para cada isolamento de RNA, prepare uma solução de 40 µL em um tubo microfuga de 1,5 mL separado, contendo 32 µL de Água Livre de Nucleases, 4 µL de Tampão de Reação 10x de DNase I e 4 µL de Enzima DNase I. Mantenha a solução no gelo até o momento de aplicá-la na coluna na Etapa 7.3.

7. Lavagem do RNA e tratamento com DNase I

  1. Pipete 100 µL do Tampão de Lavagem 1 (W1) diretamente na coluna de purificação contendo o RNA ligado (do passo 5.7).
  2. Centrifugue por 1 min a 8.000 × g e remova o fluxo passante.
  3. Pipete 40 µL da solução de DNase I do Passo 6 diretamente na coluna de purificação e incube à temperatura ambiente por 15 min para remover contaminação por DNA.
  4. Pipete 40 µL do Tampão de Lavagem 1 (W1) na coluna de purificação e centrifugue a 8.000 × g por 30 s.
  5. Pipete 100 µL do Tampão de Lavagem 2 (W2) na coluna de purificação e centrifugue a 8.000 × g por 1 min.
  6. Pipete mais 100 µL do Tampão de Lavagem 2 (W2) na coluna de purificação e centrifugue a 16.000 × g por 2 min. Descarte o fluxo passante.
  7. Centrifugue a coluna a 16.000 × g por 1 min para secar a coluna.

8. Eluição de RNA

  1. Obtenha um tubo de 0,5 mL (incluído no kit) para cada isolamento de RNA e rotule adequadamente. Este será o tubo que conterá o RNA após o isolamento.
  2. Transfira a coluna com RNA ligado e lavado para o tubo de 0,5 mL rotulado. A coluna deve encaixar firmemente neste tubo.
  3. Observando o tubo de lado, posicione a ponteira da pipeta diretamente acima da membrana da coluna, expulse 11 µL do Tampão de Eluição (EB) sobre a coluna e incube por 1 min a temperatura ambiente.
    NOTA: A falha em dispersar o Tampão de Eluição (EB) diretamente sobre a coluna resultará em menores rendimentos de RNA. Se gotículas de líquido forem observadas ao redor da periferia da coluna, isso indica uma dispersão inadequada do Tampão de Eluição (EB) sobre a coluna. Nesse caso, recomenda-se repetir este passo com o fluxo passante do Passo 8.5, garantindo que o Tampão de Eluição (EB) seja expelido diretamente no centro da coluna.
  4. Coloque o tubo de 0,5 mL contendo a coluna no tubo de coleta fornecido com o kit para garantir o encaixe adequado durante a centrifugação (Figura 2).
  5. Centrifugue a coluna a 1.000 × g por 1 min para distribuir o Tampão de Eluição (EB) e, em seguida, gire a 16.000 × g por 1 min para eluir o RNA.
  6. Coloque imediatamente o tubo de 0,5 mL contendo o RNA sobre gelo.

9. Validação da quantidade e qualidade do RNA com um espectrofotômetro de microvolume

OBSERVAÇÃO: Outros métodos podem ser utilizados para avaliar a quantidade e qualidade do RNA. Aqui, utiliza-se um método com um espectrofotômetro de microvolume. Um fluorímetro ou uma ferramenta de eletroforese em gel por microfluídica também podem ser utilizados29.

  1. Limpe o pedestal do espectrofotômetro de microvolume com um lenço sem fiapos para garantir que esteja livre de outros líquidos.
  2. Selecione a configuração RNA no espectrofotômetro para análise.
  3. Realize a leitura do branco no espectrofotômetro usando 1 µL do Tampão de Eluição (EB) utilizado na Etapa 8.3.
  4. Após a leitura do branco, remova o Tampão de Eluição (EB) do pedestal com um lenço sem fiapos.
  5. Mantendo o tubo de 0,5 mL contendo RNA no gelo, pipete 1 µL de RNA sobre o pedestal do espectrofotômetro. Abaixe o braço do espectrofotômetro para medir a absorbância da amostra e quantificar, bem como avaliar, a qualidade do RNA isolado.
    NOTA: Consulte a seção “Resultados” abaixo para obter detalhes sobre a qualidade e quantidade aceitáveis para aplicações subsequentes.

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Resultados

Uma etapa crítica deste protocolo, conforme mencionado acima, é a remoção de uma quantidade apropriada de água dos tardígrados coletados antes da adição do Tampão de Extração (XB) para extração de RNA. Deixar excesso de água resultará na diluição do Tampão de Extração (XB) e em uma extração de RNA inferior (ou seja, RIN < 7, razão 260/280 <1,8, razão 260/230 <1,8 e/ou concentração <5 ng/µL) a partir dos animais, levando à redução da concentração e qualidade do RNA após a eluição. Remover muita água desidratar...

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Discussão

O objetivo deste protocolo é facilitar o isolamento de RNA de tardígrados com quantidade e qualidade suficientes para serem aplicados em análises posteriores que permitam investigar a tolerância ao estresse nesses organismos. O protocolo apresentado aqui destaca etapas nas quais os usuários podem encontrar dificuldades, incluindo a remoção adequada de água antes da adição do Tampão de Extração (XB) (Passo 2.5), a ruptura dos corpos dos tardígrados (Passos 3.1–3.3), a transferência do sobrenadante para a coluna de purific...

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Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por verbas iniciais da UNC Asheville (para CCH) e por uma concessão da NSF 2225683 para Jason Pienaar (orientador pós-doutoral de PK). Agradecemos à UNC High Throughput Sequencing Facility pela assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos microcêntrifugos de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Tubo microcêntrifugo graduado Seal-Rite de 1,5 mL, natural, polipropileno, 500/unidade em saco
Etanol 70%VWR71001-654Para limpeza de bancadas/equipamentos
Kit Arcturis PicoPure para Isolamento de RNAFisherKIT0204Kit contendo componentes para o protocolo de isolamento descrito neste manuscrito
CentrífugaEppendorf5405000441Centrífuga 5425, com controles rotativos, não refrigerada, com rotor FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (EUA)
Água de Nascente Deer ParkQualquer merceariaN/AEste é o meio para culturas de tardígrados e é usado para enxaguar tardígrados antes do isolamento de RNA
Microscópio de dissecaçãoZeissN/AZeiss Stemi 305, razão de zoom 5:1 e aumento total de 8x-40x, com unidade de transiluminação LED M
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, livre de RNase (1 U/µL)
Pontas de pipeta filtradas de 10 µLVWR76322-528Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Pontas de pipeta filtradas de 1000 µLVWR76322-154Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Pontas de pipeta filtradas de 20 µLVWR76322-134Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Pontas de pipeta filtradas de 200 µLVWR76322-150Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Capilares de vidroFisher50-821-811Capilares de vidro padrão da World Precision Instrument - 1B120-6 (6 polegadas, diâmetro externo 1,2 mm, sem filamento). Estes são puxados para formar dois capilares de vidro com extremidades afinadas sobre uma chama e depois quebrados até o diâmetro apropriado para pipetagem bucal da espécie de tardígrado escolhida.
Bloco térmicoEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, dispositivo básico sem bloco térmico, 100-130 V/50-60 Hz (EUA/Japão/América do Sul/Taiwan)
Escada de RNA de alta sensibilidade para Screen TapeAgilent5067-5581Escada para análise de alta sensibilidade de RNA total em sistemas TapeStation
ScreenTape de RNA de alta sensibilidadeAgilent5067-5579Para análise de alta sensibilidade de RNA total em sistemas TapeStation
Tampão amostral ScreenTape de RNA de alta sensibilidadeAgilent5067-5580Tampão para análise de alta sensibilidade de RNA total em sistemas TapeStation
Eletroforese em gel com microfluídicaAgilentG2991BASistema Agilent 4200 TapeStation
Espectrofotômetro de microvolumeFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, Tipo de detector: sensor de imagem linear CMOS com 2048 elementos, Display: tela colorida de alta definição de 10 polegadas, Idiomas: chinês, inglês, francês, japonês, alemão, Fonte de luz: flash de xenônio, Largura de banda espectral: menor ou igual a 1,8 nm (FWHM em Hg 254 nm), Tensão: 12 VCC
Pipeta bucalMillipore SigmaA5177Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas
Água livre de nucleasesFisherFERR0581Água Thermo Scientific, livre de nucleases
Pipetas (2,5 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, conjunto com 4 unidades
RNase AwayFisher21-402-178Descontaminante de superfície Thermo Scientific RNase AWAY
Tubo e pistilo livres de RNaseFisher12-141-368Tubos e pistilos livres de RNase para isolamento de RNA

Referências

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