Artigo de método

Protocolo de Isolamento de RNA de Múltiplas Espécies de Tardígrados

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DOI:

10.3791/72120

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1 de setembro de 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha os procedimentos de isolamento de RNA a partir de várias espécies de tardígrados, utilizando um kit de isolamento de RNA baseado em coluna, projetado para isolar RNA de pequenas quantidades de tecido e produzir quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA e síntese de DNA complementar.

Resumo

Tardígrados são animais microscópicos conhecidos por sua tolerância excepcional ao estresse ambiental. Esses animais podem sobreviver à dessecação, pressões extremas, baixas temperaturas e altos níveis de radiação ionizante. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a essas capacidades de extremotolerância permanecem parcialmente compreendidos. As abordagens moleculares utilizadas para investigar esses mecanismos, que incluem sequenciamento de RNA, interferência de RNA (RNAi) e expressão heteróloga de genes de tardígrados em sistemas como bactérias, exigem o isolamento de RNA mensageiro (mRNA) de alta qualidade a partir de material biológico limitado. Neste estudo, descrevemos um protocolo reprodutível para o isolamento de RNA total de tardígrados que (1) é eficaz em múltiplas espécies, incluindo uma espécie de heterotardígrado, (2) requer apenas 25–200 animais, dependendo do tamanho corporal, e (3) fornece RNA com quantidade e qualidade suficientes para aplicações posteriores. O protocolo atual permite com sucesso a recuperação eficiente de RNA a partir de quantidades razoáveis de tardígrados e sustenta investigações moleculares da tolerância ao estresse em diversas espécies de tardígrados.

Introdução

Os tardígrados são bem conhecidos por sua capacidade de sobreviver a estresses extremos aos quais outros animais não resistiriam, incluindo dessecação, pressões extremas, temperaturas extremas e agentes que danificam o DNA, como drogas quimioterápicas e radiação ionizante1,2,3,4,5,6,7,8. Nos últimos anos, cientistas têm investigado os mecanismos que sustentam a resistência extrema dos tardígrados utilizando abordagens moleculares, como sequenciamento de RNA, interferência de RNA (RNAi) e expressão heteróloga de genes de tardígrados em outros sistemas, incluindo células humanas e bactérias8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Quando aplicadas, essas abordagens têm sido uma ferramenta poderosa para nos proporcionar insights sobre como exatamente os tardígrados são capazes de resistir a tais estresses extremos8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. No entanto, todas essas abordagens moleculares para compreender a tolerância ao estresse em tardígrados dependem da capacidade de isolar RNA desses pequenos animais em quantidade suficiente e com qualidade adequada para uso em processos subsequentes.

Um método anterior para isolamento de RNA de tardígrados mostrou-se bem-sucedido para pesquisadores que trabalham com Hypsibius exemplaris23. No entanto, ao tentar replicar esse protocolo em H. exemplaris, verificamos que ele era pouco confiável quanto à concentração e qualidade do RNA obtido (dados não publicados). Um método alternativo de isolamento de RNA baseado em fenol demonstrou funcionar para H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus e uma espécie de heterotardígrado13,21,22,24,25,26. Esse protocolo mostrou-se capaz de fornecer RNA de qualidade e quantidade adequadas para processos subsequentes, tanto a partir de animais individuais quanto de grupos de animais (~50). No entanto, esse protocolo exige que o usuário manipule reagentes contendo fenol. O fenol é uma substância química perigosa que exige manipulação cuidadosa, e a execução inadequada desse protocolo pode resultar em contaminação residual de fenol, afetando a pureza do RNA e suas aplicações posteriores. Outro protocolo publicado anteriormente para isolamento de RNA de tardígrados enfoca a capacidade de isolar RNA de animais individuais27. Embora esse seja um protocolo valioso para aplicações como PCR quantitativa (qPCR)27, é menos apropriado para aplicações posteriores como sequenciamento de RNA, nas quais o objetivo é obter uma visão mais abrangente de como os animais respondem a um determinado agente estressante ou condição.

Essas limitações nos protocolos disponíveis de isolamento de RNA levaram à investigação de métodos alternativos para o isolamento de RNA de tardígrados. O kit de isolamento de RNA baseado em coluna utilizado neste protocolo é comercializado para isolar RNA de pequenas quantidades de tecido. Este kit também já foi usado anteriormente para isolar RNA de tecidos de insetos para análises de sequenciamento de RNA em etapas subsequentes, sugerindo que poderia ser adequado para isolamentos de outros animais pequenos com cutícula, como os tardígrados28. Este estudo descreve o protocolo passo a passo para o uso deste kit de isolamento de RNA baseado em coluna com tardígrados, incluindo explicações sobre precauções específicas que devem ser tomadas ao realizar este protocolo com tardígrados. Este artigo relata o sucesso deste protocolo em seis espécies de tardígrados (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti e o heterotardígrado Viridiscus celatus). O estudo validou que RNA de qualidade e quantidade substanciais pode ser obtido a partir de apenas 25 animais. Exemplos de dados resultantes de concentração e qualidade do RNA também são fornecidos e são adequados para aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA (com amplificação de biblioteca exponencial e viés mínimo) e síntese de DNA complementar (cDNA). Este protocolo de isolamento de RNA já se mostrou útil para revelar mecanismos de tolerância à radiação em H. exemplaris8. O sucesso deste protocolo em várias espécies de tardígrados sugere que ele poderia ser aplicado de forma mais ampla na investigação de mecanismos de tolerância ao estresse, mecanismos de desenvolvimento e processos evolutivos.

Protocolo

O seguinte protocolo não exige aprovação ética institucional para uso de animais, pois animais invertebrados são isentos desse requisito. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do equipamento e da área para o isolamento de RNA

  1. Ligue um bloco térmico ou banho-maria a 42 °C em preparação para a extração de RNA.
  2. Obtenha um suporte para tubos microcentrífugos, pipetas (2 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL) e ponteiras filtradas de tamanhos apropriados.
  3. Limpe a superfície da bancada, o suporte para tubos, as pipetas e as caixas de ponteiras com RNase Away, solução diluída de hipoclorito (10%) ou etanol 70% para desnaturar qualquer RNase residual.
    NOTA: A presença excessiva de RNase no equipamento ou na área onde se está isolando o RNA pode resultar em qualidade insuficiente de RNA após o isolamento, devido à degradação. Reduza esse risco permitindo tempo suficiente para que os produtos químicos desnaturantes de RNase atuem, e certifique-se de que a área e o equipamento estejam completamente secos antes de prosseguir.
  4. Use luvas em todas as etapas deste protocolo e trate frequentemente as luvas com uma solução desnaturante de RNase durante todo o procedimento, para evitar a degradação do RNA por RNase.

2. Coleta de animais para isolamento de RNA

  1. Usando uma pipeta com bulbo acoplado a uma câmara de aspiração equipada com uma capilar de vidro (Figura 1A), um laço de Irwin ou uma micropipeta, transfira 25–200 animais (dependendo do tamanho da espécie) de suas placas de cultura para uma placa com água de nascente limpa, a fim de reduzir a quantidade de material não pertencente a tardígrados (como algas ou outras fontes alimentares, tais como nematoides ou rotíferos, dependendo da espécie).
  2. Obtenha um tubo de 1,5 mL livre de RNase e um pistilo.
  3. Usando uma pipeta com bulbo acoplado a uma câmara de aspiração equipada com uma capilar de vidro ou um laço de Irwin, transfira os animais para o fundo do tubo de 1,5 mL livre de RNase, tomando cuidado especial para transferir a menor quantidade possível de água junto com os animais.
  4. Centrifugue a 4.500 g durante 3 minutos para sedimentar os tardígrados no fundo do tubo de microcentrífuga.
  5. Enquanto observa o tubo com os tardígrados sedimentados ao microscópio estereoscópico, use uma pipeta de 20 µL ou uma pipeta com bulbo acoplado a uma câmara de aspiração equipada com uma capilar de vidro com abertura menor do que os tardígrados dos quais está isolando o RNA, para remover cuidadosamente a maior quantidade possível de água, sem perturbar o pellet de tardígrados. Veja a Figura 1B para uma representação da quantidade aceitável de água remanescente.
    NOTA: Tenha cuidado para deixar uma fina camada de água, evitando que os animais se desidratem no breve intervalo entre a remoção da água e a adição do Tampão de Extração (XB). Se os animais se desidratarem, isso pode resultar em baixa qualidade do RNA após o isolamento.
  6. Adicione 100 µL do Tampão de Extração (XB) ao tubo contendo os tardígrados.

3. Disrupção mecânica de tardígrados e extração de RNA

  1. Usando o pistilo livre de RNase, desintegre os tardígrados moendo suave mas firmemente o pistilo no fundo do tubo por cerca de 30 s. Um total de 20 a 30 movimentos de moagem deve ser suficiente para desintegrar os tardígrados.
  2. Remova o pistilo do tubo, tomando cuidado para garantir que o máximo possível de líquido permaneça no fundo do tubo.
  3. Verifique o conteúdo do tubo de microcentrífuga ao microscópio estereoscópico para garantir que não haja animais intactos visíveis restantes.
  4. Incube a mistura a 42 °C por 30 min em um bloco térmico agitador com agitação suave (300 rpm).
    NOTA: O Tampão de Extração (XB) estabiliza o RNA para prevenir sua degradação nesta temperatura.

4. Condicionamento da coluna de isolamento de RNA

  1. Nos últimos 10 min da incubação de extração, monte a coluna para coleta e purificação de RNA. Coloque uma coluna de purificação em um tubo de coleta e identifique a coluna adequadamente.
  2. Adicione 250 µL do Tampão de Condicionamento (CB) diretamente à coluna.
  3. Incube à temperatura ambiente por 5 min.
  4. Centrifugue a 16,000 × g por 1 min e descarte o fluxo passante. A coluna está agora pronta para receber o sobrenadante de RNA da próxima etapa.
  5. Retire o Tampão 10x da Reação de DNase I e Água Isenta de Nucleases do congelador para descongelar completamente a tempo da etapa 6 abaixo.

5. Ligação do RNA à coluna

  1. Após a incubação de extração, centrifugue o tubo contendo tardígrados mecanicamente disruptados e o Tampão de Extração (XB) a 3.000 × g durante 2 min.
  2. Obtenha um novo tubo livre de RNase e rotule-o adequadamente.
  3. Usando uma pipeta de 200 µL com ponteira de filtro, remova cuidadosamente o sobrenadante dos tegumentos de tardígrados sedimentados. Tenha cuidado para não perturbar o pellet de tegumento e para remover apenas o sobrenadante.
    NOTA: A transferência de tegumento para etapas subsequentes resultará em menor eficiência de recuperação de RNA na coluna devido ao entupimento físico da coluna. Para evitar esse erro potencial, você pode observar a ponteira com o sobrenadante ao microscópio para garantir a ausência de tegumento. Se houver algum tegumento presente, devolva o sobrenadante ao tubo e repita a etapa de centrifugação.
  4. Transfira o sobrenadante para o seu tubo recém-rotulado e livre de RNase.
  5. Pipete 100 µL de etanol 70% no tubo contendo seu RNA e misture completamente pipetando para cima e para baixo várias vezes. Nesta etapa, deve-se observar filamentos viscosos claros ao adicionar o etanol. Esse é um bom sinal de que há RNA presente no seu sobrenadante.
  6. Pipete toda a mistura (200 µL) na sua coluna preparada do passo 4.
    NOTA: Ao pipetar quaisquer soluções na coluna nesta e nas etapas subsequentes, tenha o cuidado de dispensar o líquido no centro da coluna e evite tocar fisicamente a coluna com a ponteira da pipeta. A perfuração mecânica da coluna resultará em problemas posteriores na qualidade e quantidade de RNA.
  7. Para ligar o RNA à coluna, centrifugue por 2 min a 100 × g, seguido de centrifugação a 16.000 × g por 30 s para remover o fluxo passante.

6. Preparação da solução de DNase I

  1. Deixe o Tampão de Reação 10x de DNase I e Água Livre de Nucleases descongelarem completamente antes de preparar a solução.
  2. Para cada isolamento de RNA, prepare uma solução de 40 µL em um tubo microfuga de 1,5 mL separado, contendo 32 µL de Água Livre de Nucleases, 4 µL de Tampão de Reação 10x de DNase I e 4 µL de Enzima DNase I. Mantenha a solução no gelo até o momento de aplicá-la na coluna na Etapa 7.3.

7. Lavagem do RNA e tratamento com DNase I

  1. Pipete 100 µL do Tampão de Lavagem 1 (W1) diretamente na coluna de purificação contendo o RNA ligado (do passo 5.7).
  2. Centrifugue por 1 min a 8.000 × g e remova o fluxo passante.
  3. Pipete 40 µL da solução de DNase I do Passo 6 diretamente na coluna de purificação e incube à temperatura ambiente por 15 min para remover contaminação por DNA.
  4. Pipete 40 µL do Tampão de Lavagem 1 (W1) na coluna de purificação e centrifugue a 8.000 × g por 30 s.
  5. Pipete 100 µL do Tampão de Lavagem 2 (W2) na coluna de purificação e centrifugue a 8.000 × g por 1 min.
  6. Pipete mais 100 µL do Tampão de Lavagem 2 (W2) na coluna de purificação e centrifugue a 16.000 × g por 2 min. Descarte o fluxo passante.
  7. Centrifugue a coluna a 16.000 × g por 1 min para secar a coluna.

8. Eluição de RNA

  1. Obtenha um tubo de 0,5 mL (incluído no kit) para cada isolamento de RNA e rotule adequadamente. Este será o tubo que conterá o RNA após o isolamento.
  2. Transfira a coluna com RNA ligado e lavado para o tubo de 0,5 mL rotulado. A coluna deve encaixar firmemente neste tubo.
  3. Observando o tubo de lado, posicione a ponteira da pipeta diretamente acima da membrana da coluna, expulse 11 µL do Tampão de Eluição (EB) sobre a coluna e incube por 1 min a temperatura ambiente.
    NOTA: A falha em dispersar o Tampão de Eluição (EB) diretamente sobre a coluna resultará em menores rendimentos de RNA. Se gotículas de líquido forem observadas ao redor da periferia da coluna, isso indica uma dispersão inadequada do Tampão de Eluição (EB) sobre a coluna. Nesse caso, recomenda-se repetir este passo com o fluxo passante do Passo 8.5, garantindo que o Tampão de Eluição (EB) seja expelido diretamente no centro da coluna.
  4. Coloque o tubo de 0,5 mL contendo a coluna no tubo de coleta fornecido com o kit para garantir o encaixe adequado durante a centrifugação (Figura 2).
  5. Centrifugue a coluna a 1.000 × g por 1 min para distribuir o Tampão de Eluição (EB) e, em seguida, gire a 16.000 × g por 1 min para eluir o RNA.
  6. Coloque imediatamente o tubo de 0,5 mL contendo o RNA sobre gelo.

9. Validação da quantidade e qualidade do RNA com um espectrofotômetro de microvolume

OBSERVAÇÃO: Outros métodos podem ser utilizados para avaliar a quantidade e qualidade do RNA. Aqui, utiliza-se um método com um espectrofotômetro de microvolume. Um fluorímetro ou uma ferramenta de eletroforese em gel por microfluídica também podem ser utilizados29.

  1. Limpe o pedestal do espectrofotômetro de microvolume com um lenço sem fiapos para garantir que esteja livre de outros líquidos.
  2. Selecione a configuração RNA no espectrofotômetro para análise.
  3. Realize a leitura do branco no espectrofotômetro usando 1 µL do Tampão de Eluição (EB) utilizado na Etapa 8.3.
  4. Após a leitura do branco, remova o Tampão de Eluição (EB) do pedestal com um lenço sem fiapos.
  5. Mantendo o tubo de 0,5 mL contendo RNA no gelo, pipete 1 µL de RNA sobre o pedestal do espectrofotômetro. Abaixe o braço do espectrofotômetro para medir a absorbância da amostra e quantificar, bem como avaliar, a qualidade do RNA isolado.
    NOTA: Consulte a seção “Resultados” abaixo para obter detalhes sobre a qualidade e quantidade aceitáveis para aplicações subsequentes.

Resultados

Uma etapa crítica deste protocolo, conforme mencionado acima, é a remoção de uma quantidade apropriada de água dos tardígrados coletados antes da adição do Tampão de Extração (XB) para extração de RNA. Deixar excesso de água causará diluição do Tampão de Extração (XB) e resultará em extração de RNA de qualidade inferior (ou seja, RIN < 7, razão 260/280 <1,8, razão 260/230 <1,8 e/ou concentração <5 ng/µL) a partir dos animais, levando à redução da concentração e qualidade do RNA após a eluição. Remover muita água desidratará rapidamente os animais, potencialmente levando à letalidade e à diminuição da qualidade do RNA devido ao aumento da atividade de RNase após a morte. Uma representação visual é fornecida, mostrando a quantidade adequada de água a ser mantida no tubo com os tardígrados antes da adição do Tampão de Extração (XB) (Figura 1B) para auxiliar na execução bem-sucedida deste protocolo.

Até o momento, este protocolo foi realizado em seis espécies diferentes de tardígrados, incluindo um heterotardígrado (V. celatus). Esses isolamentos resultaram em concentrações de RNA variando de 11 ng/µL a 106,6 ng/µL (confirmado em um espectrofotômetro de microvolume, Tabela 1) e de 9 ng/µL a 113 ng/µL (confirmado por eletroforese em gel microfluídica, Tabela 2). O número de animais necessário para o isolamento de RNA varia conforme o tamanho da espécie da qual se está realizando o isolamento. Tardígrados maiores, como espécies de Paramacrobiotus e Milnesium sp., produzem concentrações suficientes de RNA a partir de apenas 25 animais (Tabela 1). Para espécies menores, como H. exemplaris e V. celatus, os isolamentos são mais bem-sucedidos quando realizados com 100 ou mais animais (Tabela 1). A maioria dos isolamentos apresenta uma razão 260/280 em torno de 2, indicando RNA puro30. Isolamentos de algumas espécies (V. celatus e H. exemplaris, e a espécie de Paramacrobiotus) ocasionalmente resultam em uma razão 260/230 baixa, sugerindo contaminação por reagentes30. Isso ocorreu frequentemente ao se utilizar poucos animais (100 para V. celatus e H. exemplaris, e 25 para Paramacrobiotus species), o que sugere que um número insuficiente de animais pode aumentar o risco de contaminação por reagentes no RNA eluído final. Por meio da avaliação da qualidade do RNA via eletroforese em gel microfluídica, pode-se calcular um número de integridade do RNA (RIN). Um RIN entre 9 e 10 indica RNA de alta qualidade com pouca degradação31, sendo geralmente recomendado não prosseguir com processos posteriores, como sequenciamento de RNA, se o RIN for inferior a 7. Alguns exemplos de resultados de eletroforese em gel microfluídica são apresentados (Figura 3) a partir de amostras com valores altos e baixos/indetectáveis de RIN. Algumas dessas amostras foram excluídas da análise subsequente (Tabela 2, Figura 3A,D). No entanto, algumas amostras com RIN baixo/indetectável foram selecionadas para preparação de biblioteca para sequenciamento de RNA e ainda assim resultaram em dados de sequenciamento de RNA de qualidade (Tabela 2, Figura 3B,F, dados não publicados, ver “Discussão” para mais informações).

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Figura 1: Configuração para isolamento de RNA. Imagens mostrando uma pêra de pipeta acoplada a uma câmara de aspiração equipada com uma capilar de vidro para movimentação de animais e remoção de água (A) e uma representação da quantidade aceitável de água remanescente antes da adição do Tampão de Extração (XB) a tardígrados do gênero Paramacrobiotus (B). Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Configuração do tubo de eluição para a eluição final. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Resultados representativos de eletroforese em gel microfluídica para H. exemplaris e P. gadabouti. (A) Gel de RNA de H. exemplaris exposto à radiação ionizante. (B) Gel de RNA de P. gadabouti e H. exemplaris em condições controle. (C–F) Perfis de picos representativos de uma amostra de RNA de H. exemplaris de alta qualidade (C), de uma amostra de H. exemplaris de qualidade duvidosa (D), de uma amostra de P. gadabouti de boa qualidade (E) e de uma amostra de H. exemplaris com degradação aparente (pico em 147 pb) (F). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Concentrações representativas de RNA e informações sobre qualidade de várias espécies de tardígrados coletadas com um espectrofotômetro de microvolume. *Concentrações inferiores a 20 ng/µL, conforme detectado com um espectrofotômetro de microvolume, podem resultar em razões de absorbância imprecisas. **Baixa razão 260/230 causada por velocidade incorreta de centrifugação na Etapa 5.7. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Concentrações representativas de RNA e informações sobre qualidade de duas espécies de tardígrados coletadas com um sistema de eletroforese em gel microfluídico. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

O objetivo deste protocolo é facilitar o isolamento de RNA de tardígrados com quantidade e qualidade suficientes para serem aplicados em análises posteriores que permitam investigar a tolerância ao estresse nesses organismos. O protocolo apresentado aqui destaca etapas nas quais os usuários podem encontrar dificuldades, incluindo a remoção adequada de água antes da adição do Tampão de Extração (XB) (Passo 2.5), a ruptura dos corpos dos tardígrados (Passos 3.1–3.3), a transferência do sobrenadante para a coluna de purificação (Passo 5.3) e a eluição do RNA (Passo 8.3). Erros em qualquer uma dessas etapas podem resultar em redução da concentração ou qualidade do RNA obtido. Caso a concentração final de RNA seja inferior a 5 ng/µL (conforme verificado por um espectrofotômetro de microvolume), o usuário poderá considerar repetir o isolamento de RNA com (1) um maior número de animais iniciais (>100 para espécies pequenas ou >50 para espécies maiores) ou (2) repetir o protocolo, prestando especial atenção às etapas de remoção de água, ruptura dos tardígrados e eluição.

Este artigo fornece exemplos de avaliações da qualidade do RNA (RIN, razão 260/280, razão 260/230) consideradas apropriadas ou inadequadas para sequenciamento de RNA (Tabela 1, Tabela 2, Figura 3). Ocasionalmente, observam-se razões 260/230 baixas (<1,0) em alguns isolamentos de RNA utilizando este protocolo (Tabela 1), sugerindo a presença de compostos orgânicos residuais. Normalmente, isso estava associado a contagens baixas de animais. Se aumentar a quantidade de animais não for uma opção, ou se os usuários enfrentarem consistentemente razões 260/230 baixas, recomenda-se incluir uma etapa adicional de lavagem com o Tampão de Lavagem 2 (W2) (repetir a Etapa 7.6) e/ou prolongar o tempo de centrifugação em vazio na Etapa 7.7 para garantir a remoção desses contaminantes. Além disso, deve-se observar que o único isolamento representativo de H. exemplaris com razão 260/230 baixa (Tabela 1) foi realizado por um usuário universitário iniciante, que, em retrospectiva, percebeu que a Etapa 5.7 (centrifugação para remover etanol após ligação do RNA à coluna) foi realizada em velocidade incorreta de centrifugação (muito lenta). Isso provavelmente resultou na retenção de etanol na coluna e sua propagação ao longo do protocolo, levando à baixa razão 260/230. Isolamentos subsequentes realizados por este usuário resultaram em valores de 260/230 dentro de uma faixa razoável (nunca inferiores a 1,5). Portanto, todos os usuários, especialmente os iniciantes, devem prestar atenção cuidadosa às velocidades de centrifugação ao seguir o protocolo, a fim de evitar esses problemas potenciais. Apesar das razões 260/230 ocasionalmente baixas ou do RIN baixo em H. exemplaris, o RNA com leituras de qualidade semelhantes ainda pode ser utilizado para sequenciamento de RNA posterior, a fim de examinar a expressão gênica diferencial após exposição à radiação ionizante ou outros estressores8 (Tabela 1, Tabela 2 e dados não publicados). Da mesma forma, o RNA isolado de P. gadabouti com este protocolo resultou em alta concentração e qualidade de RNA (conforme verificado pelo RIN, Tabela 2, Figura 3) e gerou dados significativos de sequenciamento de RNA (dados não publicados). De forma anedótica, este estudo utilizou com sucesso RNA de H. exemplaris com baixas concentrações (5–9 ng/µL) para produzir cDNA e realizar clonagem bem-sucedida de genes de H. exemplaris8. Quando o RNA de H. exemplaris resultou em concentração e RIN baixos/indetectáveis (medidos por eletroforese em gel microfluídico), o RNA foi reisolado para este tratamento antes de avançar para a preparação da biblioteca para sequenciamento de RNA (Tabela 2, Figura 3A,D). A decisão de repetir o isolamento de RNA para esta amostra (Figura 3A,D), em vez de avançar com o sequenciamento como foi feito com outras amostras de H. exemplaris com RIN indetectável (Figura 3B,F), foi tomada com base na ausência de bandas definidas no gel microfluídico, o que pode indicar erro de carregamento, RNA degradado ou concentração insuficiente de RNA. Em contraste, quando o RNA isolado de H. exemplaris apresentou concentração relativamente baixa, RIN indetectável e evidência de alguma degradação de RNA, indicada por níveis mais altos de RNA de tamanho pequeno, ainda assim gerou dados utilizáveis de sequenciamento de RNA após a preparação da biblioteca (dados não publicados, Tabela 2, Figura 3B,F). Portanto, embora algumas orientações sejam fornecidas aqui para determinar se as amostras de RNA são adequadas para aplicações posteriores, o usuário deve usar seu critério e considerar sua aplicação específica ao avaliar se a qualidade e a quantidade do RNA são suficientes para avançar.

Cientistas que desejam isolar RNA de tardígrados precisam considerar diversos aspectos ao determinar qual protocolo é mais adequado para seu propósito. Todos os métodos previamente descritos de isolamento de RNA (incluindo o método relatado aqui) produziram RNA em quantidade e qualidade suficientes para aplicações subsequentes, como sequenciamento de RNA, síntese de cDNA e qPCR8,12,13,17,21,22,25,27. O custo é frequentemente um fator a ser considerado, especialmente em laboratórios de pesquisa com orçamentos limitados ou em laboratórios didáticos. O protocolo descrito aqui é mais caro do que os protocolos previamente relatados por reação de isolamento. No entanto, argumentamos que o aumento de custo traz benefícios em comparação com os protocolos anteriores. Em comparação com outros protocolos de isolamento de RNA baseados em coluna23, o protocolo de isolamento de RNA descrito aqui pode produzir quantidade suficiente de RNA de qualidade adequada a partir de uma menor quantidade de material inicial (menor número de animais). Além disso, como mencionado na Introdução, o protocolo anterior baseado em coluna apresentou desempenho inconsistente em nossos testes, frequentemente resultando em rendimentos extremamente baixos de RNA, insuficientes para processos subsequentes (dados não publicados). O protocolo descrito aqui também é consideravelmente mais seguro do que abordagens de isolamento de RNA baseadas em fenol, pois não exige que os usuários manipulem substâncias químicas perigosas que necessitem de capela. Além disso, um problema comum em protocolos de extração de RNA baseados em fenol é o arraste de fenol, o que afeta a pureza do RNA e pode interferir nas aplicações posteriores. Esses problemas tornam a extração de RNA baseada em fenol menos acessível a estudantes de graduação (seja em laboratórios de pesquisa ou em salas de aula). No entanto, o método baseado em fenol é o mais econômico. O protocolo descrito aqui não é adequado para isolar RNA de um único animal com o objetivo de avaliar respostas transcritômicas individuais (como publicado por Kirk et al), mas é útil para examinar alterações compartilhadas entre indivíduos em resposta a um agente estressor, fornecendo uma visão mais abrangente das respostas ao estresse. Portanto, os usuários devem avaliar a importância do custo, da disponibilidade de animais e da acessibilidade do protocolo para determinar qual método melhor atende às suas necessidades.

Este relato validou que este protocolo produz RNA de quantidade e qualidade suficientes a partir de seis espécies diferentes de tardígrados, incluindo uma espécie representativa de Heterotardigrada. Além disso, este método de isolamento de RNA fornece quantidade suficiente de RNA a partir de um número razoável de animais (25–200, dependendo do tamanho da espécie). A validação deste protocolo de isolamento de RNA em múltiplas espécies abre caminho para compreender aspectos fascinantes da biologia dos tardígrados. Isso não se limita à investigação da tolerância ao estresse, mas também se estende à compreensão da evolução desses animais, incluindo a evolução dos mecanismos de resistência e seu desenvolvimento. Este protocolo é particularmente útil para espécies de tardígrados não modelo e coletadas em campo, onde a biomassa é limitada e faltam métodos padronizados de isolamento de RNA. Por fim, este protocolo é acessível aos pesquisadores e pode ser realizado de forma reprodutível por estudantes de graduação, tornando-se um recurso valioso em laboratórios de ensino ou pesquisa em instituições voltadas principalmente para a graduação.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por verbas iniciais da UNC Asheville (para CCH) e por uma concessão da NSF 2225683 para Jason Pienaar (orientador pós-doutoral de PK). Agradecemos à UNC High Throughput Sequencing Facility pela assistência técnica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos microcêntrifugos de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500Tubo microcêntrifugo graduado Seal-Rite de 1,5 mL, natural, polipropileno, 500/unidade em saco
Etanol 70%VWR71001-654Para limpeza de bancadas/equipamentos
Kit Arcturis PicoPure para Isolamento de RNAFisherKIT0204Kit contendo componentes para o protocolo de isolamento descrito neste manuscrito
CentrífugaEppendorf5405000441Centrífuga 5425, com controles rotativos, não refrigerada, com rotor FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (EUA)
Água de Nascente Deer ParkQualquer merceariaN/AEste é o meio para culturas de tardígrados e é usado para enxaguar tardígrados antes do isolamento de RNA
Microscópio de dissecaçãoZeissN/AZeiss Stemi 305, razão de zoom 5:1 e aumento total de 8x-40x, com unidade de transiluminação LED M
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, livre de RNase (1 U/µL)
Pontas de pipeta filtradas de 10 µLVWR76322-528Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Pontas de pipeta filtradas de 1000 µLVWR76322-154Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Pontas de pipeta filtradas de 20 µLVWR76322-134Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Pontas de pipeta filtradas de 200 µLVWR76322-150Qualquer ponta de pipeta filtrada é adequada
Capilares de vidroFisher50-821-811Capilares de vidro padrão da World Precision Instrument - 1B120-6 (6 polegadas, diâmetro externo 1,2 mm, sem filamento). Estes são puxados para formar dois capilares de vidro com extremidades afinadas sobre uma chama e depois quebrados até o diâmetro apropriado para pipetagem bucal da espécie de tardígrado escolhida.
Bloco térmicoEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, dispositivo básico sem bloco térmico, 100-130 V/50-60 Hz (EUA/Japão/América do Sul/Taiwan)
Escada de RNA de alta sensibilidade para Screen TapeAgilent5067-5581Escada para análise de alta sensibilidade de RNA total em sistemas TapeStation
ScreenTape de RNA de alta sensibilidadeAgilent5067-5579Para análise de alta sensibilidade de RNA total em sistemas TapeStation
Tampão amostral ScreenTape de RNA de alta sensibilidadeAgilent5067-5580Tampão para análise de alta sensibilidade de RNA total em sistemas TapeStation
Eletroforese em gel com microfluídicaAgilentG2991BASistema Agilent 4200 TapeStation
Espectrofotômetro de microvolumeFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, Tipo de detector: sensor de imagem linear CMOS com 2048 elementos, Display: tela colorida de alta definição de 10 polegadas, Idiomas: chinês, inglês, francês, japonês, alemão, Fonte de luz: flash de xenônio, Largura de banda espectral: menor ou igual a 1,8 nm (FWHM em Hg 254 nm), Tensão: 12 VCC
Pipeta bucalMillipore SigmaA5177Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas
Água livre de nucleasesFisherFERR0581Água Thermo Scientific, livre de nucleases
Pipetas (2,5 µL, 20 µL, 200 µL e 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, conjunto com 4 unidades
RNase AwayFisher21-402-178Descontaminante de superfície Thermo Scientific RNase AWAY
Tubo e pistilo livres de RNaseFisher12-141-368Tubos e pistilos livres de RNase para isolamento de RNA

Referências

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