Interação medicamento-medicamentosa entre eugenol e repaglinida no diabetes mellito tipo 2 e seu potencial mecanismo

Resumo

Este estudo teve como objetivo explorar possíveis interações medicamentosas-medicamentosas entre eugenol (EUG) e repaglinida (RPG) em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (T2DM).

Resumo

Este estudo investigou a potencial interação medicamento-fármaco (DDI) entre eugenol (EUG) e repaglinida (RPG) no diabetes mellitus tipo 2 (T2DM). Um modelo de ratos com DT2DM foi estabelecido usando uma dieta rica em gordura e estreptozotocina (STZ). O grupo de dose única recebeu 0,4 mg/kg de RPG, e os grupos de coadministração foram pré-tratados com EUG (50, 100, 150 mg/kg) por sete dias antes de receber uma dose única de RPG (0,4 mg/kg). Os parâmetros da glicose no sangue e farmacocinética do RPG foram avaliados nas amostras plasmáticas de ratos. O efeito da EUG na estabilidade metabólica do RPG e na atividade do citocromo P3A (CYP3A) foi avaliado em microssomos hepáticos (RLM) de ratos. Em ratos com DT2DM, o tratamento com RPG mostrou efeito hipoglicêmico, que foi ainda mais promovido pela coadministração de EUG de forma dependente da dose (p < 0,001). A coadministração de EUG afetou a farmacocinética da RPG ao aumentar a área sob a curva (AUC, aumento de 88,64%, 164,59% e 244,72% vs RPG único, p < 0,001), concentração máxima plasmática (C_máx, aumento de 18,61%, 53,58% e 77,63% vs RPG único, p < 0,01), concentração máxima (T_máx, 1,0 h para coadministração de EUG vs 0,5 h para RPG único), meia-vida (t_1/2, prolongada 33,86%, 49,61% e 88,19% vs RPG único, p < 0,01), tempo médio de retenção (MRT, prolongado 17,62%, 26,42%, 44,04% vs RPG único, p < 0,001) e diminuição da taxa de resolução (Clz/F, diminuição de 48,92%, 63,31% e 74,10% vs RPG único, p < 0,001) de forma dependente da dose. In vitro Estudo RLM, EUG melhorou a estabilidade metabólica da RPG ao prolongar a meia-vida (44,09 ± 3,25 min) e reduzir a depuração intrínseca (30,55 ± 3,69 μL/min/mg de proteína). A EUG também inibiu a atividade do CYP3A com IC₅₀ de 7,90 ± 1,79 μM. A coadministração de EUG promoveu o efeito hipoglicêmico do RPG ao aumentar a exposição sistêmica ao RPG em ratos com DT2DM, potencialmente ao melhorar a estabilidade metabólica do RPG e inibir a atividade do CYP3A.

Introdução

O diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) é um distúrbio metabólico crônico caracterizado por resistência à insulina ou redução da eficiência da insulina, que afeta milhões de pessoas ao redor^{do mundo 1}. Interações complexas com suscetibilidade genética e fatores de estilo de vida estão envolvidas no DT2DM, resultando em captação de glicose comprometida, gliconogênese hepática excessiva e inflamação crônica de baixo^{grau 2}. A DT2 pode levar a complicações graves se tratada de forma inadequada, incluindo doenças cardiovasculares, doenças renais, retinopatia e neuropatia, afetando significativamente a qualidade de vida dos pacientes e aumentando a^{mortalidade 2}. Os tratamentos medicamentosos atuais para DMT2 incluem metformina, fármacos sulfonilureianos, agonistas do receptor GLP-1 e inibidores de DPP-4, entre^outros. Repaglinida (RPG) é um tipo de meglitinida de ação curta que atua estimulando a secreção de insulina e possui a característica de flexibilidade^{dosificável 4}. Comparados às sulfonilureias, as glinidas oferecem controle superior da hiperglicemia pós-prandial, reduzem o risco de certos efeitos adversos, como a hipoglicemia, e apresentam um perfil de segurança mais favorável, especialmente em pacientes com insuficiência renal ^5,6. O RPG é rapidamente absorvido após administração oral, atingindo concentrações plasmáticas máximas tipicamente em 30–60 minutos, e sua meia-vida curta resulta em uma breve estimulação da liberação de insulina. Clinicamente, o RPG é usado tanto como monoterapia quanto em combinação com outros agentes antihiperglicêmicos orais para otimizar o controle^{glicêmico 7}. No entanto, sua aplicação clínica é limitada pela baixa biodisponibilidade oral (cerca de 56%), metabolismo acelerado do fígado e risco potencial de hipoglicemia 8,9,10,11,12,13,14. Essas desvantagens destacam a necessidade de uma estratégia de tratamento abrangente.

Eugenol (EUG), quimicamente conhecido como 4-alil-2-metoxifenol, é um composto orgânico com a fórmula química C₁₀H_{12O 2}¹⁵. EUG é um líquido incolor a amarelo-claro e é um composto fenólico ativo, encontrado principalmente em cravinhos (Eugenia caryophyllata Thunb.) e outras plantas^{aromáticas 16}. Muita atenção tem sido atraída pela EUG devido às suas diversas propriedades farmacológicas, incluindo atividades antioxidantes, anti-inflamatórias, antibacterianas, analgésicas e^antitumorais 17,18,19. Estudos recentes demonstraram que a EUG demonstrou o valor potencial como terapia auxiliar para a DM2, já que tanto evidências experimentais in vitro quanto in vivo indicam que a EUG melhora a sensibilidade à insulina, promove a captação de glicose nos tecidos periféricos, inibe a gliconogênese hepática e protege a função das células β^{pancreáticas 20,21}. Essas medidas multifacetadas, combinadas com uma toxicidade^{relativamente baixa 22}, posicionam o EUG como um candidato natural altamente promissor, capaz de complementar as limitações dos medicamentos clínicos tradicionais e aliviar complicações relacionadas ao DT2DM por meio de um mecanismo sinérgico.

As enzimas citocromo P450 (P450s) desempenham um papel crucial no processo de metabolismo dos medicamentos e mediam interações medicamento-fármacos (DDIs) induzindo ou inibindo subtipos específicos, o que é de vital importância para um tratamento medicamentoso seguro^{e eficaz 23}. Notavelmente, a RPG é metabolizada principalmente no fígado por CYP2C8 e CYP3A4^24,25. Quando coadministrada com quercetina (QCT), a QCT aumenta a biodisponibilidade in vivo da RPG ao inibir o metabolismo hepático de primeira passagem e o metabolismo sistêmico via CYP450s²⁶. Também foi relatado que a EUG suprime a atividade dos CYP450, incluindo 1A2, 2C9, 2D6 e 3A4, de forma dependente da concentração, indicando possíveis interações quando a EUG é coadministrada com medicamentos metabolizados por essas^{enzimas 27}. Apesar do potencial promissor da EUG como terapia complementar para DMT2 e da suscetibilidade conhecida da RPG a DDIs mediados pelo CYP, ainda não está claro se a EUG altera a exposição sistêmica, a estabilidade metabólica ou o metabolismo mediado pelo CYP3A da RPG. Considerando que tanto EUG quanto RPG provavelmente serão co-administrados em práticas clínicas ou em ambientes de suplementos alimentares, a falta de dados DDI entre eles representa um risco potencial de alterações não intencionais nas concentrações plasmáticas de RPG. Tais alterações podem levar a uma redução da eficácia terapêutica ou a um aumento do risco de hipoglicemia. Assim, essa lacuna de evidências representa um obstáculo significativo para a combinação racional e segura de produtos naturais com medicamentos antidiabéticos convencionais. Portanto, é essencial avaliar sistematicamente o efeito da EUG na farmacocinética e farmacodinâmica da RPG e elucidar o mecanismo metabólico subjacente, com foco especial na atividade do CYP3A. Diante das evidências acima, pode-se especular que a EUG pode influenciar o metabolismo do RPG alterando a atividade do CYP450. Este é o primeiro estudo a investigar a interação EUG–RPG em um contexto T2DM. Espera-se que os resultados preencham uma lacuna crítica de conhecimento e forneçam uma base mecanicista para otimizar a co-administração segura de EUG e RPG na gestão de T2DM. Se for considerada a coadministração, o potencial de aumento da exposição ao RPG deve ser considerado, e os sinais de hipoglicemia devem ser monitorados, especialmente quando EUG é tomado em doses altas ou como suplemento concentrado. Além disso, embora os ratos expressem isoformas do CYP3A funcionalmente análogas ao indivíduo CYP3A4, a extrapolação direta de achados quantitativos para humanos exige cautela devido às diferenças entre espécies na expressão enzimática e na atividade catalítica.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Academia Chinesa de Ciências Médicas de Jilin (Data: 2024.11.21/No.2024112) em conformidade com as^{diretrizes ARRIVE 28}. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Condições de habitação de animais

Ratos machos de Sprague-Dawley (200–250 g) foram alojados em uma sala de animais de laboratório sob as seguintes condições: temperatura: 22 °C ± 2 °C, umidade relativa: 40–60%, e um ciclo claro/escuro de 12 horas, com acesso livre a alimento e água para permitir uma semana de^{aclimatação 29,30}.

2. Modelagem animal, tratamento e processamento de amostras

O tamanho da amostra foi determinado com base em uma análise de potência usando o teste F (G*Power 3.1.9.7). A análise de potência a priori foi realizada com tamanho de efeito de 0,6, nível de α de 0,05 e potência desejada de 0,8, resultando em um tamanho total de amostra de 55. Esse cálculo indicou que pelo menos 9 ratos eram necessários por grupo. Portanto, foram usados dez ratos por grupo, alcançando uma potência real de 0,86.

Antes do modelo T2DM ser estabelecido, todos os ratos eram jejuados por 12 horas. Depois, eles foram divididos aleatoriamente em dois grupos: o grupo controle (n = 10) e o grupo T2DM (n = 50). O estabelecimento do modelo de ratos T2DM foi realizado de acordo com o método anteriormente^{relatado 31}. Resumidamente, ratos do grupo T2DM foram alimentados com uma dieta rica em gordura (com teor de gordura de 60%) por 4 semanas consecutivas e depois receberam uma única injeção intraperitoneal de 30 mg/kg de STZ dissolvido em tampão citrato estéril (pH 4,4). Três dias após a injeção de STZ, a glicose na veia caudal dos ratos foi medida com um medidor de glicose no sangue, e ratos com concentração de glicose superior a 16,7 mmol/L foram considerados como tendo estabelecido com sucesso o DT2. No grupo controle, os ratos receberam uma dieta normal e injeções intraperitoneais de 0,9% de soro fisiológico normal no mesmo período que o grupo com DT2DM.

Ratos T2DM foram ainda divididos em quatro grupos, com 10 ratos em cada grupo: grupo T2DM + RPG (RPG único), grupo T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) (co-RPG+EUG 50 mg/kg), grupo T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) (co-RPG+EUG 100 mg/kg) e grupo T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) (co-RPG+EUG 150 mg/kg). Após jejum de 12 horas, ratos do grupo RPG único receberam administrações orais de 0,4 mg/kg RPG (suspensas em soro fisiológico) via agulha^{de gavage 26}. Ratos dos grupos co-RPG+EUG receberam por via oral 50, 100 e 150 mg/kg de EUG, respectivamente, uma vez ao dia por sete dias consecutivos, e no oitavo dia, após um período adicional de jejum de 12 horas, o grupo co-administrado recebeu adicionalmente 0,4 mg/kg RPG via gavage intragástrico. Posteriormente, os parâmetros da glicose no sangue foram avaliados usando amostras de sangue coletadas da veia caudal.

Para análise farmacocinética, a amostra de sangue (0,2 mL) foi coletada do plexo venoso orbital posterior dos ratos para os tubos de microcentrífuga heparinizada em vários momentos (0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h e 8 h após a dose). Após a coleta, as amostras foram centrifugadas (1500 × g, 10 min, 4 °C) para separar o plasma (amarelo claro, transparente), que foi armazenado a -80 °C até a análise. As amostras de plasma foram posteriormente analisadas quanto à concentração de RPG usando o método HPLC descrito na etapa 4.

3. Estudo do metabolismo nos microssomos hepáticos de rato agrupados

Para investigar o mecanismo subjacente às alterações farmacocinéticas in vivo , o efeito da EUG sobre a estabilidade metabólica do RPG e a atividade do CYP3A foi avaliado no RLM. RPG (3 μM) foi incubado com ou sem EUG em tampão PBS a 37 °C com volume total de 200 μL, incluindo RLM (0,5 mg/mL de proteína microssômica) e um sistema de regeneração de NADPH (1,3 mM de NADP, 3,54 mM de glicose 6-fosfato, 0,4 U/mL de glicose 6-fosfato desidrogenase e 3,3 mM de MgCl₂). Após uma pré-incubação de 5 minutos a 37 °C sem NADPH, a reação foi iniciada pela adição do sistema de regeneração de NADPH. A mistura foi então incubada a 37 °C em um banho-maria agitado. Em diferentes pontos de incubação (0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min), amostras de 30 μL foram coletadas e transferidas para um tubo de microcentrífuga com acetonitrilo gelado para terminar a reação. As amostras foram centrifugadas (12.000 × g por 10 minutos a 4 °C) para obter o sobrenadante (claro). Os supernadantes resultantes foram então analisados para concentração de RPG usando o mesmo método HPLC detalhado na etapa 4.

4. Análise HPLC

A concentração de RPG no plasma (a partir da etapa 2) e nas incubações microssomais (a partir da etapa 3) foi analisada usando o método HPLC relatado por Kim et ^al.26. As etapas específicas da operação são as seguintes: amostras (120 μL) foram misturadas com 300 μL de cetonitrila contendo cetoconazol (padrão interno, 100 ng/mL) para obter precipitação de proteínas. Depois, a mistura foi pulverizada e centrifugada a 15.000 × g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi transferido para um tubo de centrífuga microcoluna e evaporado a 25 °C sob uma atmosfera de nitrogênio. O resíduo após a secagem foi redissolvido com uma fase móvel de 50 μL, depois transformado em vórtice e centrifugado. Subsequentemente, 40 μL do sobrenadante foram injetados na coluna HPLC (250 mm × 4,6 mm, tamanho das partículas 5 μm). A coluna foi eluída a 25 °C em modo de elução isocrática com tampão de fosfato de 10 mM (pH 6,0) e acetonitrila (razão volumétrica 46,4: 53,6), com vazão de 1 mL/min. O eluente foi monitorado usando um detector de fluorescência com comprimento de onda de excitação de 240 nm.

5. Análise estatística

Software de análise farmacocinética foi utilizado para calcular parâmetros farmacocinéticos, incluindo AUC, C_max, T_max, t_1/2, MRT e clearance. Software de análise estatística e gráficos eram usados para geração de figuras e análise de dados. Todos os dados foram apresentados como média ± desvio padrão. As diferenças entre os grupos foram analisadas usando ANOVA unidirecional (para comparações de níveis de glicose) ou ANOVA bidirecional (para comparações de parâmetros farmacocinéticos), conforme apropriado, seguidas pelo teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas. O efeito da EUG na atividade do CYP3A foi avaliado por meio de análise de regressão não linear. Um valor p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

A meia-vida da EUG na estabilidade metabólica do RPG na RLM foi calculada por:
t_1/2 (min) = 0,693/ln(C_t/_{C 0} × 100).

Taxa de depuração intrínseca (μL/min/mg de proteína) = v × 0,693/_{t 1/2};
v (μL/mg) = volume de incubação/concentração de proteína.

Resultados

A EUG promoveu o efeito hipoglicêmico do RPG em ratos com DT2
O nível de glicose no sangue dos ratos do grupo T2DM aumentou (p < 0,001, IC 95%: -13,90~-11,32) em comparação com o do grupo controle, indicando a condução bem-sucedida do modelo T2DM (Figura 1A). A administração de um único RPG suprimiu o nível de glicose no sangue nos ratos com diabetes tipo 2 (p < 0,001, IC 95%: 5,26~7,84). A coadministração de RPG e EUG d...

Discussão

A DT2 é uma doença metabólica crônica que requer tratamento a longo prazo, e os pacientes frequentemente precisam tomar múltiplos medicamentos devido a condições subjacentes, como doenças cardiovasculares e doença renal³². O risco de DDIs aumenta significativamente com a coadministração de medicamentos, pois pode afetar a absorção, metabolismo ou eficácia de medicamentos hipoglicêmicos, o que pode levar a riscos agudos, como coma hipoglicêmico e níveis descontrola...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
acetonitrilo	Merck, Alemanha	34851	≥99,9%
coluna cromatográfica	Phenomenex, EUA	00G-4041-E0	250 mm × 4,6 mm, tamanho de partícula 5 µm
DAS	Beijing Bozhiyin, China	-	3,0
EUG	MUST Bio-tecnologia, China	A0074	pureza ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, EUA	-	9.0.0
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência	Shimadzu Corporation, Japão	228-45147-42	RF-20A
cetoconazol	Merck, Alemanha	K1003	Pureza 99,0-101,0%
Ratos Sprague-Dawley machos	Centro de Animais de Xangai, China	-	200–250 g
NADPH	Merck, Alemanha	10107824001	97% (peso seco)
medidor de glicose no sangue OneTouch Ultra2	Life Scan Inc., EUA	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Alemanha	P4474	pH 7,4
RLM	Merck, Alemanha	M9066	-
RPG	Merck, Alemanha	R9028	pureza ≥98%
STZ	Merck, Alemanha	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, eugenol; RPG, repaglinida; RLM, microssomas do fígado de rato; NADPH, β-nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato; STZ, estreptozotocina; PBS, solução salina tamponada com fosfato.