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Acupotomia para Espondilose Cervical em Ratos: Um Protocolo Visualizado para Estabelecimento de Modelo e Intervenção

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DOI:

10.3791/72132

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3 de setembro de 2026

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Dermatology, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua Medicine, Tsinghua University, 3Acupuncture and Moxibustion Clinic, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo descreve detalhadamente um método de modelagem para espondilose cervical em ratos e uma estratégia de intervenção com acupotomia, fornecendo um protocolo operacional visualizado para pesquisas relacionadas.

Resumo

A espondilose cervical (EC) é uma doença degenerativa crônica. Alterações degenerativas nos discos intervertebrais da coluna cervical, juntamente com alterações patológicas subsequentes, afetam os tecidos e estruturas circundantes, levando a manifestações clínicas como dor no pescoço, rigidez, mobilidade limitada e, ocasionalmente, dormência e sintomas irradiados nos membros superiores. Dentre essas, a compressão da raiz nervosa é a mais comum. Portanto, este estudo estabeleceu um modelo de rato de EC induzida por compressão da raiz nervosa cervical. A terapia com acupotomia tem demonstrado potencial no tratamento clínico da EC ao liberar aderências no tecido mole local e aliviar a compressão nervosa. No entanto, atualmente há uma falta de protocolos procedimentais visualizados em experimentos com animais. Este estudo fornece uma descrição detalhada de um método confiável para o estabelecimento de um modelo de rato de EC e do protocolo correspondente de intervenção com acupotomia. Neste procedimento, detalhamos o processo de indução do modelo, os passos da manipulação com acupotomia, a localização terapêutica, técnicas de contenção do rato e precauções críticas. Além disso, este estudo utilizou eletromiografia (EMG) para confirmar o estabelecimento bem-sucedido do modelo de EC e avaliou a intervenção por meio de limiares mecânicos de retirada, análise da marcha e histopatologia da raiz nervosa. Esta pesquisa não apenas fornece uma referência para o estabelecimento do modelo de rato de EC e intervenção com acupotomia, mas também oferece um framework experimental sistemático e viável para estudos futuros que investiguem os mecanismos de ação.

Introdução

A espondilose cervical (EC) é uma doença espinhal degenerativa comum. Seu processo patológico central origina-se da degeneração dos discos intervertebrais, o que desencadeia uma série de alterações patológicas secundárias, incluindo estreitamento do espaço intervertebral, formação de osteófitos e hipertrofia do ligamento1,2. Essas alterações patológicas resultam em diversos sintomas clínicos, como dor e incômodo no pescoço e ombros, e dormência irradiada nos membros superiores. Em casos graves, podem ocorrer comprometimentos neurológicos, incluindo disfunção motora e até tetraplegia2,3. Notavelmente, a incidência de espondilose cervical tem aumentado gradualmente nos últimos anos, com idade de início cada vez mais jovem, impondo uma carga socioeconômica substancial4. A degeneração dos discos intervertebrais cervicais e a proliferação osteofítica podem envolver estruturas ósseas adjacentes e tecidos moles, resultando em estenose do canal espinhal cervical ou dos forames intervertebrais e, consequentemente, compressão de estruturas próximas, incluindo raízes nervosas cervicais, medula espinhal e artérias vertebrais1,2,3,4. Dentre essas, a compressão das raízes nervosas cervicais é a mais frequente, correspondendo a aproximadamente 60%–70% de todos os casos de EC5,6,7. Embora múltiplas abordagens terapêuticas estejam disponíveis na prática clínica, incluindo fisioterapia, intervenção farmacológica e cirurgia, os tratamentos não cirúrgicos tornaram-se a opção preferida para a maioria dos pacientes devido ao alto custo, trauma significativo e resultados pós-operatórios incertos dos procedimentos cirúrgicos4. Na prática médica contemporânea, medicamentos anti-inflamatórios não esteroides e agentes neurotróficos são comumente utilizados. Embora esses medicamentos possam aliviar a dor e retardar a progressão da doença até certo ponto, estão associados a reações adversas, como lesão do sistema digestivo e dano renal8,9.

A acupotomia é uma modalidade terapêutica característica desenvolvida com base nas teorias tradicionais chinesas de acupuntura combinadas com técnicas cirúrgicas minimamente invasivas modernas. Ela exerce seus efeitos por meio da dissecação e liberação de aderências do tecido mole, regulação de fatores inflamatórios locais e melhoria da microcirculação regional10,11,12. Nos últimos anos, a eficácia clínica da acupotomia para espondilose cervical tem sido amplamente reconhecida, demonstrando potencial promissor no alívio da compressão nervosa, redução da dor e melhoria da função motora cervical13,14. No entanto, quando aplicada em experimentos com animais, as intervenções com acupotomia enfrentam desafios, como localização imprecisa e dificuldade em controlar a profundidade da manipulação. Enquanto isso, para transformar essas observações clínicas em conclusões sólidas baseadas em evidências, o estabelecimento de modelos animais estáveis e reprodutíveis é um pré-requisito essencial. O método de sutura de náilon intravertebral induz compressão mecânica direta pela inserção de suturas de náilon no forame intervertebral, simulando com precisão o processo fisiopatológico da compressão clínica da raiz nervosa15. Essa abordagem de modelagem também apresenta vantagens, como um ciclo de modelagem curto e segmentos de compressão controláveis15. No entanto, seu procedimento cirúrgico depende amplamente da experiência individual, e atualmente faltam descrições operacionais detalhadas e visualizadas.

Este estudo apresenta um protocolo experimental completo, detalhado e visualizado, abrangendo o estabelecimento de um modelo de ratos de espondilose cervical e todo o procedimento de intervenção com acupotomia. Como agentes anestésicos podem afetar a medição do limiar de retirada mecânica e, consequentemente, interferir nos resultados experimentais16,17,18,19, neste estudo foi adotado um dispositivo específico para contenção de ratos. Este artigo fornece uma descrição detalhada do processo de indução do modelo em ratos, da manipulação passo a passo da acupotomia, da localização precisa dos sítios de tratamento, dos métodos de contenção e fixação dos ratos e de outros cuidados experimentais essenciais. Foram adotadas múltiplas dimensões de avaliação, incluindo a medição do limiar de retirada mecânica, gravações eletrofisiológicas, análise da marcha e observação histopatológica da raiz nervosa. Este estudo tem como objetivo fornecer um protocolo visualizado para a indução do modelo e intervenção com acupotomia em um modelo de ratos de espondilose cervical, oferecendo assim suporte metodológico para investigações mecanicistas e para a avaliação da eficácia da terapia com acupotomia no tratamento da EC.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram revisados, aprovados e rigorosamente monitorados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Beijing MDKN Biotech Company (número de aprovação: MDKN-2025-096). Todos os protocolos foram conduzidos em estrita conformidade com o Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório emitido pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Animais experimentais e grupos

  1. Selecione ratos machos adultos Sprague–Dawley (SD) pesando 230,0 g ± 20 g para inclusão no experimento.
  2. Mantenha os animais em uma instalação dedicada para animais de laboratório.
  3. Mantenha a temperatura ambiente a 24 °C ± 2 °C e a umidade relativa entre 50%–60%, sob um ciclo claro/escuro de 12 h. Forneça acesso ad libitum a ração padrão e água durante todo o estudo.
  4. Após um período de aclimatação de 7 dias, distribua aleatoriamente 24 ratos em quatro grupos (n = 6 por grupo): grupo controle normal (Controle), grupo falso-operado (Sham), grupo modelo de CS (Modelo) e grupo acupotomia. A linha do tempo do delineamento experimental é ilustrada na Figura 1.

2. Estabelecimento do modelo de CS

OBSERVAÇÃO: Retire a comida e a água de todos os ratos por 12 h antes do modelamento. Pese e registre o peso corporal. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos por autoclavação a vapor sob alta pressão (Figura 2A).

  1. Prepare o fio de náilon 1 dia antes da cirurgia, cortando-o em segmentos com diâmetro de 0,5 mm e comprimento aproximado de 1 cm. Mergulhe os filamentos em etanol 75% por 4 h, seque-os em condições estéreis e, em seguida, imerja-os em solução de poli-L-lisina 0,1% por 8 h para aumentar a adesividade tecidual.
  2. Coloque a rata em uma câmara de indução. Induza anestesia com 4% de isoflurano, depois mantenha a anestesia com 1,5%–2,0% de isoflurano. via uma máscara facial. Prenda o animal em posição prona (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
  3. Apare a região cervical dorsal para expor completamente o campo cirúrgico. Desinfete a área cirúrgica três vezes com iodopovidona do interior para o exterior e repita o procedimento de desinfecção com etanol 75%.
  4. Palpe e marque o processo espinhoso mais alto (T2) no dorso da rata. Faça uma incisão mediana na pele dorsal de aproximadamente 3 cm, estendendo-se cranialmente a partir do ápice do processo espinhoso de T2. Disseque rombamente o tecido subcutâneo e a musculatura cervical posterior (Figura 2B).
  5. Exponha completamente o arco vertebral esquerdo de C5 a T1 e remova cuidadosamente os tecidos musculares e conjuntivos sobrejacentes (Figura 2C).
  6. Disseque cuidadosamente o ligamento amarelo e os tecidos conjuntivos nos espaços intervertebrais C6–C7 e C7–T1 utilizando pinças microcirúrgicas. Abra o arco vertebral esquerdo de C7 com pinças hemostáticas para expor a medula espinhal.
  7. Retraia suavemente a medula espinhal em direção ao lado direito utilizando um dissector nervoso oftálmico. Posicione o fio de náilon esterilizado sob as raízes nervosas C6–C7 e C7–T1 ao longo do eixo longitudinal da medula espinhal com pinça microcirúrgica; evite compressão excessiva para prevenir lesão venosa vertebral.
    OBSERVAÇÃO: Expor a medula espinhal no mesmo sítio anatômico no grupo controle, sem inserir o fio de náilon.
  8. Feche e sutura a incisão camada por camada ao final do procedimento.
  9. Transfira as ratas para uma plataforma aquecida com controle termostático mantida a 37 °Ce monitorar os sinais vitais até a recuperação completa da consciência.
  10. Administre uma injeção intramuscular de 50.000 unidades de solução de penicilina sódica na pata traseira para profilaxia anti-infecciosa pós-operatória. Devolva os animais às suas gaiolas de origem para recuperação pós-operatória.

3. Procedimento de contenção

  1. Posicione a rata em uma manga preta de contenção em malha.
  2. Prenda dois cabos de nylon em um suporte de plástico. Fixe o cabo superior na região axilar e o cabo inferior ao redor da região pélvica (Figura 3B).
    NOTA: Utilize uma placa de plástico medindo 200 mm × 300 mm × 5 mm, perfurada com fendas de 20 mm × 4 mm espaçadas a cada 10 mm ao longo das bordas longas e a cada 3 mm ao longo das bordas curtas, e equipada com cinco pés de apoio localizados no centro e nos quatro cantos (Figura 3A).
  3. Após a indução do modelo, repita o procedimento de contenção acima para cada rata em todos os grupos durante três dias consecutivos para garantir uma habituação adequada. Mantenha cada sessão de contenção por um mínimo de 5 min por dia.

4. Tratamento com acupotomia

  1. Inicie a intervenção com acupotomia no 4º dia após o estabelecimento do modelo.
  2. Prepare agulhas descartáveis estéreis para acupotomia (diâmetro: 0,40 mm; comprimento: 40 mm).
  3. Remova os pelos da região cervical para expor completamente o campo operatório.
  4. Palpe os tecidos moles em ambos os lados dos processos espinhosos cervicais para identificar nódulos endurecidos ou estruturas em forma de cordão. Determine um ponto no processo espinhoso de C6 ou C7 e localize então dois pontos adicionais aproximadamente 0,5 cm laterais a cada lado desse processo espinhoso.
  5. Denomine esses três locais como os pontos de inserção da acupotomia e marque-os (Figura 3C).
  6. Desinfete os pontos de inserção marcados com iodo-povidona médica, seguido por etanol medicinal a 75%.
  7. Oriente a borda cortante da acupotomia paralelamente à linha média posterior e mantenha o eixo da agulha perpendicular ao plano coronal cervical posterior durante a inserção.
  8. Aplicar compressão suave sobre o local de inserção com o polegar esquerdo, ao mesmo tempo em que segura a acupotomia firmemente entre o polegar e o indicador direitos. Penetre rapidamente através do tecido subcutâneo em direção perpendicular, depois avance lentamente a agulha até alcançar a superfície óssea.
  9. Realize três cortes longitudinais localizados e duas liberações transversais do tecido mole na área lesada, restringindo o alcance da operação a 1 mm. Retire a agulha após a conclusão da manipulação (Figura 3D).
  10. Aplicar pressão firme sobre o local de inserção durante 3 min para obter hemostasia. Aplicar a intervenção com acupotomia uma vez a cada 5 dias, num total de três sessões.
    NOTA: Exceto o grupo submetido à acupotomia, os outros três grupos não recebem qualquer intervenção terapêutica. Contudo, os animais desses grupos são imobilizados da mesma maneira e pela mesma duração que os do grupo submetido à acupotomia.

5. Teste do limiar de retirada mecânica (MWT)

OBSERVAÇÃO: Realize a medição no dia anterior à cirurgia de estabelecimento do modelo, no 3º dia e no 14º dia após a cirurgia, utilizando um estimulador mecânico de dor plantar para ratos e camundongos.

  1. Coloque cada rato em uma câmara de teste transparente posicionada sobre um piso de malha metálica, em um ambiente silencioso mantido a 24 °C ± 2 °C.
  2. Permita que o rato se aclimate dentro da câmara por pelo menos 5 min, ou até que os comportamentos exploratórios e de alisamento tenham diminuído significativamente.
  3. Posicione a ponta do filamento de von Frey perpendicularmente à superfície plantar da pata dianteira esquerda, entre o terceiro e o quarto metacarpianos. Aplique o estímulo por baixo, através da malha metálica, até que seja provocada uma resposta rápida de retirada da pata, lambida ou sacudida.
  4. Registre o valor exibido no momento da retirada como o limiar de dor mecânica.
  5. Após testar cada rato, limpe completamente o piso de malha metálica e as paredes internas da câmara com álcool médico a 75%, depois seque com gaze limpa para eliminar odores residuais que possam influenciar testes comportamentais subsequentes. Introduza o próximo rato somente após o equipamento estar completamente seco.
    ​NOTA: Teste todos os ratos sequencialmente em ordem rotativa por três rodadas. Mantenha um intervalo de pelo menos 10 min entre duas medições sucessivas de LDM no mesmo rato. Utilize a média das três medições como valor final de LDM para cada rato.

6. Registro de eletromiografia (EMG)

OBSERVAÇÃO: Realize o EMG de estado de repouso no Dia 3 após o estabelecimento do modelo, utilizando um sistema de aquisição e análise de sinal biológico.

  1. Anestesie o rato por inalação de isoflurano (concentração de indução 3%–4%, concentração de manutenção 1,5%–2,0%). Fixe o animal em posição prona sobre a plataforma experimental e exponha completamente o membro anterior esquerdo.
  2. Conecte os fios condutores dos eletrodos de registro aos canais de aquisição designados. Inicie o software de aquisição, selecione o modo de sinal EMG e defina a frequência de amostragem para 20 kHz com uma faixa de filtro passa-faixa de 15 Hz–5 kHz.
  3. Desinfete os músculos do membro anterior esquerdo (flexor carpi radialis, flexor carpi ulnaris, biceps brachii e triceps brachii) usando bolas de algodão desengordurado embebidas em etanol médico 75%.
  4. Insira o eletrodo de agulha para registro perpendicularmente no ventre muscular, orientado ortogonalmente à direção das fibras musculares. Insira um segundo eletrodo de agulha a 3–5 mm de distância como eletrodo de referência e insira o eletrodo de terra na base da cauda.
  5. Observe a atividade de inserção imediatamente após a inserção da agulha. Após os potenciais de inserção desaparecerem e o músculo estar completamente relaxado, registre o sinal EMG em repouso por 1 minuto para cada rato.
    NOTA: Mantenha um ambiente silencioso durante todo o registro e minimize a interferência eletromagnética externa. As interferências comuns incluem interferência de frequência de rede proveniente de corrente alternada e ruído de alta frequência proveniente de outros equipamentos de laboratório, que se manifestam como ondas senoidais regulares sobrepostas aos eletromiogramas. Essas interferências podem ser reduzidas por meio do aterramento, configurações de filtro e gestão ambiental.
  6. Retire cuidadosamente todos os eletrodos de agulha e devolva o rato à sua gaiola, permitindo que ele se recupere espontaneamente da anestesia.
  7. Após concluir o registro de EMG para cada rato, limpe os eletrodos de agulha com etanol médico 75% usando bolas de algodão desengordurado e seque-os completamente com gaze estéril para prevenir contaminação cruzada.

7. Análise da marcha em ratos

OBSERVAÇÃO: Realize a análise da marcha no primeiro dia após a conclusão da intervenção com acupotomia (dia 15 pós-operatório após a cirurgia do modelo). O sistema de análise da marcha é composto por uma esteira equipada com uma correia transparente, uma câmera digital de alta velocidade posicionada sob a correia e uma estação de trabalho computadorizada.

  1. Coloque a rata na esteira e permita que ela se aclimate livremente por 3 min.
  2. Ative a esteira e aumente gradualmente a velocidade de 5,0 cm/s até que a rata exiba uma marcha estável, sem comportamento exploratório.​
  3. Adquira um vídeo de 10 s da caminhada da rata com visão ventral (vista inferior) utilizando a câmera de alta velocidade.
  4. Após a conclusão do teste para cada rata, limpe completamente a esteira e a câmara de teste com etanol 75% para eliminar odores residuais que possam afetar avaliações comportamentais subsequentes. Aguarde a secagem total da esteira antes de introduzir a próxima rata.
  5. Importe os vídeos gravados para o software de análise. Utilize o software para identificar a colocação das patas de cada membro e extrair uma série de parâmetros da marcha.
  6. Após a conclusão da análise automatizada, exporte os dados dos parâmetros da marcha para análises estatísticas posteriores.
  7. Inclua os seguintes parâmetros da marcha no presente estudo: área impressa média da pata dianteira esquerda (a média do tamanho da pegada durante toda a fase de apoio), área máxima de apoio da pata dianteira esquerda (o tamanho máximo da pegada durante toda a fase de apoio) e pressão de apoio da pata dianteira esquerda (refletindo a intensidade relativa da pressão da pata durante a fase de apoio, conforme registrada pelo sistema de análise da marcha).
    ​NOTA: Adquira três sequências válidas de marcha para cada rata e utilize a média das três medições para análise.

8. Coloração HE dos tecidos da raiz nervosa

OBSERVAÇÃO: Após os testes comportamentais no 15º dia pós-operatório após a cirurgia do modelo, colete amostras de tecido da raiz nervosa para coloração com HE.

  1. Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio a 2% (0,3 mL/100 g) e realizar perfusão transcardial com paraformaldeído.
  2. Dissecar as raízes nervosas espinhais C6–T1 e imergir o tecido em paraformaldeído a 4% a 4 °C para pós-fixação por 48 h.
    CAUTION: Manipular o paraformaldeído como um irritante em ambiente bem ventilado ou capela de exaustão química.
  3. Lavar o tecido das raízes nervosas fixado sob água corrente por 1 h para remover o fixador residual.
  4. Sujeitar o tecido à desidratação com etanol em concentrações crescentes, clarear sequencialmente em xilol (I) e xilol (II), embutir em parafina e cortar com espessura de 3–5 µm. Incubar os cortes a 65 °C.
  5. Desparafinar os cortes sequencialmente em xilol (I) e xilol (II), 8 min cada. Reidratar os cortes por meio de uma série de etanol em concentrações decrescentes (100% por 15 min, 95% por 5 min, 80% por 5 min, 70% por 3 min), depois imergir em água destilada por 2 min.
  6. Colorir os cortes com solução de hematoxilina por 5 s, depois lavar em água corrente por 2 min para remover o corante em excesso.
  7. Diferenciar os cortes em água destilada por 30 s. Immergir os cortes em etanol a 70% por 10 s, seguido por etanol a 80% por 10 s.
  8. Colorir os cortes com solução de eosina por 4 min, depois lavar sob água corrente para remover o corante superficial. Desidratar os cortes por meio de etanol em concentrações crescentes (70% por 10 s, 80% por 10 s, 95% por 10 s, 100% por 160 s), clarear em xilol por 4 min.
  9. Montar as lâminas com resina neutra.
  10. Examinar as alterações patológicas e morfológicas do tecido da raiz nervosa espinhal ao microscópio óptico com aumento de 400× e adquirir imagens microscópicas de campos-alvo representativos.

9. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas utilizando o software SPSS. Expresse as variáveis contínuas que seguem uma distribuição normal como média ± desvio padrão.
  2. Sob as premissas de normalidade e homogeneidade de variância, analise os limiares de retirada mecânica por meio de análise de variância de medidas repetidas e analise os parâmetros da marcha utilizando ANOVA unifatorial. Realize comparações pareadas pós-hoc entre grupos utilizando o teste da Diferença Mínima Significativa (LSD).
  3. Utilize testes não paramétricos caso as premissas de distribuição normal ou homogeneidade de variância não sejam satisfeitas.
  4. Considere diferenças estatisticamente significativas quando p < 0,05.

Resultados

As avaliações do limiar de retirada mecânica (MWT) demonstraram valores basais comparáveis em todos os grupos antes da indução do modelo. No 3º dia após a modelagem e a operação simulada, nenhuma diferença significativa foi observada entre o grupo simulado e o grupo controle (p > 0,05). Em contraste, tanto o grupo modelo quanto o grupo de acupotomia exibiram uma redução acentuada no MWT em relação ao grupo simulado (p < 0,01, Figura 4). Após a conclusão do tratamento, o grupo de acupotomia mostrou uma elevação significativa no MWT em comparação com o grupo modelo (p < 0,05, Figura 4).

Os registros de eletromiografia (EMG) revelaram que, no 3º dia após a modelagem e a operação simulada, atividades espontâneas anormais, como potenciais de fibrilação e ondas positivas agudas, eram detectáveis em repouso na EMG com agulha dos grupos modelo e de acupotomia. Em contraste, nenhum descarga espontânea anormal foi observada nos traçados de EMG com agulha em repouso dos grupos controle ou simulado (Figura 5). Se não houver potenciais espontâneos anormais no lado afetado, isso sugere que o modelo pode não ter danificado com sucesso a raiz nervosa-alvo, e o procedimento cirúrgico precisa ser reavaliado.

A análise da marcha revelou que, após a conclusão do tratamento, a área média de impressão, a área máxima de apoio e a pressão de apoio no grupo simulado não diferiram significativamente dos valores no grupo controle (p > 0,05). Em contraste, todos os parâmetros da marcha foram acentuadamente reduzidos no grupo modelo em comparação com o grupo simulado (p < 0,001). Em relação ao grupo modelo, o grupo submetido à acupotomia exibiu aumentos significativos em cada um desses índices de marcha (p < 0,05, Figura 6). A área média de impressão é a média do tamanho da pegada durante toda a fase de apoio. A área máxima de apoio é o tamanho máximo da pegada durante toda a fase de apoio. A pressão de apoio reflete a intensidade relativa da pressão da pata durante a fase de apoio, conforme registrada pelo sistema de análise da marcha.

A coloração HE do tecido da raiz nervosa cervical demonstrou que, nos grupos controle e falso-operado, a morfologia do tecido nervoso apresentava-se essencialmente normal. As fibras nervosas e os corpos celulares neuronais estavam dispostos de maneira relativamente ordenada e compacta, com limites estruturais bem definidos e ausência de edema intersticial evidente. Em contraste com o grupo falso-operado, o grupo modelo exibiu alterações patológicas acentuadas indicativas de lesão da raiz nervosa, caracterizadas por arranjos desorganizados e frouxos de fibras nervosas e corpos celulares, ruptura e deformação de um subconjunto de células neuronais, fragmentação parcial das fibras e edema intersticial acentuado. Em comparação com o grupo modelo, o tratamento com acupuntomia atenuou significativamente essas lesões patológicas, evidenciado por um alinhamento mais regular das fibras nervosas e dos corpos celulares, redução do edema intersticial e restauração parcial da integridade estrutural do tecido neural (Figura 7).

Diagrama de linha do tempo do processo de tratamento com acupotomia com testes MWT, registro de EMG e análise da marcha.
Figura 1: Diagrama do eixo temporal do desenho experimental. Após um período de adaptação alimentar de 7 dias, modelos de CS foram estabelecidos nos grupos de modelo e de acupotomia em ratos. O grupo simulado foi submetido à mesma região da medula espinhal do grupo modelo, mas sem a colocação do fio de peixe. A intervenção com acupotomia iniciou-se no 4º dia após a modelagem bem-sucedida no grupo de acupotomia. Os limiares de dor mecânica dos ratos foram medidos no dia anterior à modelagem, no 3º dia pós-operatório e ao final da intervenção, no 14º dia pós-operatório. A avaliação de eletromiografia foi realizada no 3º dia pós-operatório para avaliar a compressão da raiz nervosa. A análise da marcha foi realizada no 15º dia pós-operatório, após a intervenção, para avaliar a função de coordenação motora dos ratos. As amostras para detecção foram coletadas após os testes comportamentais no 15º dia pós-operatório. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Configuração de instrumentos cirúrgicos, processo de dissecação de roedor, diagrama marcado com exposição das vértebras para estudo anatômico.
Figura 2: Estabelecimento do modelo de ratos com EL. (A) Instrumentos cirúrgicos utilizados para indução do modelo. (B) Incisão cervical dorsal e dissecação do tecido. (C) Lâminas vertebrais cervicais esquerdas de C5 a T1. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Preparação da pesquisa com animais, incluindo diagrama de imobilização de rato, para configuração do procedimento médico.
Figura 3: Procedimento da intervenção com acupotomia. (A) Placa de plástico utilizada para contenção do rato. (B) Ilustração esquemática da contenção do rato. (C) Marcadores anatômicos superficiais correspondentes aos processos espinhosos C6 e C7 em ratos. (D) Representação esquemática do tratamento com acupotomia em ratos. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras mostrando o limiar de retirada mecânica entre os grupos: controle, simulado, modelo, acupotomia.
Figura 4: Comparação do limiar de retirada mecânica entre os quatro grupos experimentais de ratos (n = 6 por grupo). **p < 0,01 em comparação com o grupo submetido à operação simulada; #p < 0,05 em comparação com o grupo modelo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Comparação da amplitude da forma de onda; A, B mostram alto ruído; C, D mostram baixo ruído; gráfico de análise de sinal de áudio.
Figura 5: Eletromiogramas do membro anterior em repouso nos quatro grupos experimentais após a indução do modelo. (A) Eletromiograma do membro anterior no grupo modelo. (B) Eletromiograma do membro anterior no grupo acupotomia. (C) Eletromiograma do membro anterior no grupo controle. (D) Eletromiograma do membro anterior no grupo simulado. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de barras comparando a área média da pegada, a área máxima da fase de apoio e a pressão de apoio entre quatro grupos.
Figura 6: Comparação dos parâmetros da marcha entre os quatro grupos experimentais de ratos (n = 6 por grupo). (A) Comparação da área média da pegada. (B) Comparação da área máxima da fase de apoio. (C) Comparação da pressão de apoio. ***p < 0,001 em comparação com o grupo submetido à operação simulada; #p < 0,05 em comparação com o grupo modelo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Comparação de tecido histológico, quatro lâminas, imagem de microscopia, escala de 100μm para análise celular.
Figura 7: Coloração HE de tecido da raiz nervosa dos quatro grupos de ratos experimentais com aumento de 400×. (A) Coloração HE do grupo controle. (B) Coloração HE do grupo simulado. (C) Coloração HE do grupo modelo. (D) Coloração HE do grupo acupotomia. Barra de escala = 100 µm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Discussão

A seleção de um modelo animal apropriado é um pré-requisito para elucidar a patogênese da espondilose cervical (EC) e para avaliar rigorosamente intervenções terapêuticas. Atualmente, o método de sutura de náilon intravertebral é amplamente adotado devido às suas vantagens de relativa simplicidade, ciclo de modelagem curto e alta reprodutibilidade e confiabilidade15,20. Nesta abordagem, um material compressivo é implantado no canal espinhal de ratos para exercer compressão contínua sobre as raízes nervosas cervicais, recapitulando assim a condição patológica de comprometimento da raiz nervosa causada pela hérnia do disco intervertebral ou hiperplasia osteofítica em contextos clínicos. Entre as lesões secundárias associadas à espondilose cervical, a compressão da raiz nervosa é a mais comum e constitui uma causa principal das manifestações clínicas acentuadas, geralmente apresentando-se como dor cervical, rigidez e sintomas irradiados nos membros superiores5,7,21. Assim, este estudo adotou o método de sutura de náilon intravertebral para estabelecer um modelo de rato de EC e forneceu um protocolo operacional visualizado para o estabelecimento do modelo e intervenção com acupotomia em ratos com EC.

Após a compressão da raiz nervosa, isquemia local, respostas inflamatórias e irritação mecânica podem induzir tanto a sensibilização periférica quanto central, levando, em última instância, à hiperalgesia22,23,24,25,26. Os achados atuais demonstraram uma redução acentuada no limiar de dor mecânica da pata dianteira ipsilateral em ratos após a indução do modelo, indicando que o procedimento conseguiu provocar com sucesso hiperalgesia mecânica. Em ratos submetidos à intervenção com acupotomia, o limiar mecânico de retirada foi significativamente restaurado, sugerindo que a liberação por acupotomia atenua efetivamente o estado de sensibilização à dor. A dor não afeta apenas os limiares sensoriais, mas também altera os padrões espontâneos de movimento dos animais. Sistemas de análise da marcha, ao capturar parâmetros espaço-temporais das pegadas durante a locomoção, permitem uma quantificação objetiva das alterações compensatórias na marcha induzidas pela dor, superando assim a acentuada subjetividade inerente aos métodos tradicionais de pontuação comportamental27. Neste estudo, ratos do grupo modelo exibiram redução na área média de impressão, na área máxima de apoio e na pressão de apoio da pata dianteira ipsilateral, refletindo comportamento de evitação de carga e alterações protetoras na marcha secundárias à dor. Em contraste, ratos submetidos à intervenção com acupotomia mostraram uma tendência à normalização desses parâmetros da marcha, indicando que o tratamento com acupotomia, além de aliviar a dor, também melhora a coordenação locomotora. Observações histomorfológicas revelaram ainda diferenças intergrupos no arranjo e na morfologia das fibras nervosas e dos corpos celulares neuronais dentro da raiz nervosa, bem como no grau de edema intersticial. Esses achados sugerem que a terapia com acupotomia pode atenuar as alterações patológicas da raiz nervosa.

A compressão da raiz nervosa não apenas induz distúrbios na condução sensorial, mas também pode resultar em desnervação ou hiperexcitabilidade anômala da musculatura inervada. A eletromiografia (EMG) em repouso, ao registrar atividade elétrica espontânea (como potenciais de fibrilação e ondas positivas agudas) em um músculo completamente relaxado, fornece um indicador sensível de excitabilidade sarcolemal anormal secundária a lesão neurogênica e constitui uma modalidade eletrofisiológica fundamental para a avaliação de radiculopatias em ambientes clínicos e experimentais28,29,30. Em condições fisiológicas, um músculo completamente relaxado exibe silêncio elétrico, com ausência de descargas espontâneas. Neste estudo, foram detectadas descargas espontâneas acentuadas nos músculos em repouso do membro anterior ipsilateral em ratos após a indução do modelo. Essa atividade EMG anormal em repouso é uma manifestação característica de dano neurogênico e sugere que as raízes nervosas cervicais desses ratos podem estar sujeitas a compressão prolongada31. Os achados anormais de EMG nos grupos modelo e de acupotomia após a modelagem confirmaram ainda mais, do ponto de vista eletrofisiológico, o estabelecimento bem-sucedido do modelo de ratos com EC.

Para evitar confundir avaliações comportamentais com os efeitos cumulativos de anestesias repetidas, a intervenção com acupotomia neste estudo foi realizada utilizando um aparato de contenção em animais acordados32. Relatos anteriores demonstraram que treinamento adequado de habituação e exposições repetidas podem atenuar significativamente as respostas ao estresse induzido pela contenção33,34,35,36. Isso sugere que o treinamento de habituação antes da intervenção neste protocolo pode minimizar efetivamente a interferência do estresse agudo de contenção nos indicadores experimentais.

Este estudo não está isento de limitações. Primeiro, o método de sutura de náilon intravertebral reproduz principalmente compressão mecânica aguda ou subaguda, enquanto a ES humana geralmente segue um curso degenerativo crônico. Segundo, embora o protocolo de contenção atual tenha sido planejado para minimizar o estresse, investigações futuras devem avaliar biomarcadores relacionados ao estresse, como o cortisol sérico, para avaliar de forma mais abrangente o impacto do aparato de contenção.

Em conclusão, este estudo fornece um procedimento operacional detalhado para estabelecer um modelo de rato de CS e subsequentemente tratá-lo com acupotomia. Os resultados indicam que a liberação por acupotomia eleva significativamente os limiares de dor mecânica, melhora os padrões de marcha evitadores de dor e atenua as alterações patológicas da raiz nervosa. Este trabalho fornece, portanto, uma estrutura experimental sistemática e prática para elucidar os mecanismos subjacentes à terapia por acupotomia no tratamento de CS.

Divulgações

Todos os autores declararam não haver conflitos de interesse potenciais.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Fundamental da China (número do convênio: 2023YFC3502703) e pelo Projeto Chave do Fundo Conjunto de Inovação e Desenvolvimento da Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei (número do convênio: 2024AFD271).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
seringa de 0,5 mLHebei Yunsheng Biotechnology Co., LtdSN-04442
seringa de 1 mLShanghai Zhiyu Medical Equipment Co., LTDZSQ-1
Sutura 4-0 com Agulha, Monofilar (4×12)GLASSJZZSX193
álcool 75%Shandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTD75-500ml
Agulha de AcupotomiaBeijing Huaxia Blue Chip Biotechnology Co., Ltd.HY0440
Lâmina aderenteCITOTEST188105
Sistema de Aquisição e Análise de Sinais BiológicosTechmanBL-420N
Sistema de Aquisição e Análise de Sinais Biológicos (Software)TechmanBL-420N Versão 3.0.0.237
Lâmina de coberturaCitotest Labware Manufacturing Co.,Ltd10212432C
DesidratadorDIAPATHDonatello
Balança eletrônicaMettler-ToledoME203E/02
Estufa elétrica de secagem por jato de ar quenteLaboteryGEL-70
Máquina de inclusãoWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Líquido Transparente e Descerificador EcológicoServicebioG1128-1L
Pinceta de Aço Inoxidável Preta com Proteção ESD (Ponta Curva)solomenESD-15
EtanolSCRC100092683
Bola de algodão sem gorduraCaoxian Hualu Sanitary Material Co. LTDTZMQ-500
Kit de Coloração Constante Hematoxilina-Eosina (HE) ServicebioG1076
Pinça HemostáticasolomenB0557
IBM SPSS StatisticsIBM CorporationVersão 22.0
Sistema de imagemNikonNIKON DS-U3
IodóforoShandong Anjie Gaoke Disinfection Technology Co. LTDDF-500
IsófluranoRWD life scienceR510-22-10
Luvas de látexBeijing Ruijing Latex Products Co. LTDRJJC-S
Dispositivo Mecânico para Teste de Puncionamento da PataKew basisKW-CT-1
Pinça cirúrgicaAIZANCHENGAZN00008
Pinça hemostática tipo mosquitoServicebioQX1310D
Borracha neutraSCRC10004160
Solução salina normalSHIMENSLYS-500ml
Tesoura oftálmicasolomenB0754
Líquido de parafinaMacklin8012-95-1
Fixador de Paraformaldeído (Neutro)ServicebioG1101
Fatiador de patologiaShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
Penicilina G Sódica para InjeçãoJilin Huamu Animal Health Product Co., Ltd.Nº de Aprovação de Medicamento Veterinário 070011248
Solução de poli-L-lisinaShanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.R23126-50ml
Depilador para roedoressolomenB1564
Sistema de Imagem e Análise da Marcha de RoedoresCleverTreadScan; BCamCapture
Sistema de Imagem e Análise da Marcha de Roedores (Software)CleverTreadScan Versão 4.00; BCamCapture Versão 3.00
Ratos SDBeijing Sibefei Biotechnology Co., LtdA102
Máquina de Anestesia para Pequenos Animais YuYAN ABM
Sterilizador a vapor (autoclave)YamatoSQ810C
Lâmina cirúrgicasolomenB1177
Máscara cirúrgicawinnerWJKZ-1
Alicate cirúrgicosolomenB0772
Tesoura cirúrgicaGLASSJZZSX-ZC544R
Espalhador de tecidosZhejiang Kehua Instrument Co., Ltd KD-P
Sistema de Polimento de Água UltrapuraAiken water ElAK-RO-C2
Fixador universal de tecidos (neutro)ServicebioG1101-15ML
Microscópio óptico eretoNikonNIKON ECLIPSE E100
XilolSCRC10023418

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