Estudo de Associação do Mir-146a Rs2910164 com a Suscetibilidade à Rinite Alérgica

Resumo

O presente estudo tem como objetivo esclarecer a relação entre o polimorfismo miR-146a rs2910164 e a suscetibilidade à rinite alérgica (RA). Níveis plasmáticos mais baixos de miR-146a e o genótipo GG do rs2910164 estão associados a um risco aumentado de RA, respostas inflamatórias acentuadas e manifestações clínicas mais graves em pacientes com RA.

Resumo

A rinite alérgica (RA) não representa uma ameaça à vida dos pacientes, mas compromete seriamente a qualidade de vida deles. O microRNA-146a (miR-146a) é essencial para a regulação imunológica e as respostas inflamatórias; no entanto, a relação entre o polimorfismo miR-146a rs2910164 e a suscetibilidade à RA ainda não é completamente compreendida. Este estudo caso-controle foi planejado para investigar a influência do polimorfismo miR-146a rs2910164 na suscetibilidade à RA. O estudo incluiu um total de 180 voluntários sem RA e 211 pacientes com RA. A expressão do miR-146a no plasma foi medida por RT-qPCR; o genótipo rs2910164 foi detectado pelo método TaqMan-qPCR. A técnica ELISA foi utilizada para detectar os níveis séricos de IgE, IL-4, IL-6 e IL-10. A análise de correlação de Pearson avaliou as correlações lineares entre a expressão do miR-146a e os escores TNSS e RQLQ, bem como a concentração dos fatores séricos. Os fatores de risco para RA foram identificados por meio de regressão logística. O genótipo GG e o alelo G do miR-146a rs2910164 foram significativamente mais frequentes nos pacientes com RA do que nos controles saudáveis. O nível plasmático de miR-146a estava reduzido nos pacientes com RA. O nível plasmático de miR-146a foi menor nos pacientes com RA portadores do genótipo GG, que apresentaram respostas alérgicas e inflamatórias mais ativas. A expressão do miR-146a esteve fortemente relacionada aos sintomas alérgicos e à gravidade das manifestações clínicas. A regressão logística indica que os níveis séricos de IgE e IL-4 foram fatores de risco independentes para RA, enquanto a expressão de IL-10 e miR-146a foram fatores protetores independentes. Níveis plasmáticos baixos de miR-146a são observados em pacientes com RA, e o genótipo GG do miR-146a rs2910164 aumenta a suscetibilidade à RA.

Introdução

A rinite alérgica (RA) é um distúrbio inflamatório não infeccioso da mucosa nasal mediado por alérgenos. Os sintomas clínicos típicos da RA incluem nariz coçando, congestão nasal, corrimento nasal claro e espirros frequentes¹. Em casos mais graves, os pacientes também podem apresentar redução do olfato e, inclusive, comprometimento da qualidade do sono. Dados epidemiológicos indicam que a taxa de prevalência global da RA está aumentando ano após ano, atingindo de 10% a 25%². Embora a RA não coloque em risco a vida dos pacientes, ela interrompe seriamente o sono, o aprendizado e o trabalho, reduz significativamente a qualidade de vida e impõe um pesado ônus econômico para os indivíduos e para a sociedade³. O estudo confirmou que a RA atua como fator de risco para asma, e à medida que a doença progride, os pacientes têm maior probabilidade de desenvolver sinusite ou pólipos nasais, aumentando ainda mais o ônus da doença^4,5. Portanto, a prevenção e o controle da RA tornam-se uma tarefa fundamental na área das doenças respiratórias. No entanto, a patogênese da RA ainda não foi completamente elucidada. A exploração aprofundada do mecanismo fisiopatológico da RA e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas possuem grande importância. São também questões científicas atuais que precisam ser urgentemente abordadas.

O início da RA está relacionado a fatores ambientais e genéticos⁶. A pesquisa atual geralmente sustenta que o efeito sinérgico da suscetibilidade genética individual e do ambiente de exposição a alérgenos é o fator principal que impulsiona o início da RA. A equipe de Brozek confirmou ainda mais que a interação entre a suscetibilidade genética do organismo e as exposições ambientais é a causa fundamental da RA². No campo da pesquisa sobre os mecanismos genéticos da RA, o polimorfismo genético tem se tornado gradualmente o foco de atenção dos pesquisadores. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), por serem a forma prevalente de polimorfismo genético, são a principal causa da variação nas informações genéticas dos organismos⁷. Evidências crescentes indicam que o genótipo TT no sítio IL-33 rs7044343 pode atuar como um alvo potencial para a prevenção e tratamento da RA⁸. Além disso, o genótipo TT no sítio do promotor CD14 C-159T atua como um marcador preditivo para o risco de RA⁹. Isso indica que os SNPs em genes-chave podem funcionar como alvos moleculares importantes para a avaliação do risco de RA, fornecendo alertas precoces e permitindo a prevenção e o tratamento precisos. Isso fornece pistas cruciais para uma compreensão mais profunda do mecanismo de suscetibilidade genética da RA.

Numerosos estudos revelaram que a expressão anormal de microRNAs (miRNAs) é um dos principais fatores impulsionadores da ocorrência e do desenvolvimento de uma ampla gama de doenças¹⁰. Os miRNAs possuem a característica de existência estável em fluidos corporais, tornando-os marcadores moleculares altamente sensíveis para o diagnóstico de doenças. O miR-146a é um tipo de molécula de RNA não codificante com funções biológicas amplas¹¹. O polimorfismo rs2910164 está localizado na região do stem-loop da sequência precursora do miR-146a. A variação neste sítio pode afetar o processamento e a eficiência de maturação do pré-miR-146a, alterando assim o nível de expressão do miR-146a maduro e influenciando as respostas imunes e inflamatórias downstream. Estudos anteriores confirmaram que a superexpressão do miR-146a pode reduzir significativamente a hiperreatividade das vias aéreas em modelos de camundongos com asma e inibir a ativação de linfócitos sensibilizados¹². Ao direcionar e inibir a atividade do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), o miR-146a pode aliviar efetivamente os danos inflamatórios da sinusite¹³. Além disso, a superexpressão do miR-146a também pode aliviar os sintomas patológicos do modelo de camundongo com rinite alérgica (AR) bloqueando a via de sinalização do receptor tipo Toll 4 (TLR4)¹⁴. Essas observações destacam o papel vital do miR-146a na modulação de doenças do sistema respiratório.

Evidências existentes de estudos de polimorfismo genético indicam que a frequência do alelo G no locus miR-146a rs2910164 está estreitamente relacionada à hiperreatividade das vias aéreas¹⁵. Esse SNP também é considerado um biomarcador potencial do risco de asma na população coreana¹⁵. Além disso, a equipe de Jimenez-Morales revelou ainda que o genótipo CC no locus miR-146a rs2910164 confere proteção contra a asma¹⁶. No entanto, não houve estudos relevantes relatando a associação entre o polimorfismo miR-146a rs2910164 e a suscetibilidade à RA. Portanto, este estudo tem como objetivo verificar a influência do polimorfismo do miR-146a rs2910164 na RA, fornecendo uma nova base teórica para a patogênese, diagnóstico clínico e tratamento da RA.

Protocolo

Declaração ética:
Todos os participantes foram devidamente informados sobre o objetivo do nosso experimento e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Esta pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética do Hospital Filiado Longyan de Primeira Classe da Universidade Médica de Fujian (Número de aprovação: LYREC2023-k007-01). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes, regulamentações pertinentes e a Declaração de Helsinque.

Recrutamento de Participantes, Critérios de Elegibilidade e Coleta de Amostras
Um total de 211 indivíduos diagnosticados com RA e 180 participantes saudáveis (não-RA) foram recrutados no departamento de otorrinolaringologia do Hospital Universitário Longyan, Afiliado à Universidade Médica de Fujian, entre janeiro de 2023 e maio de 2025. Os critérios diagnósticos para RA foram adotados das Diretrizes da Sociedade Chinesa de Alergia para o Diagnóstico e Tratamento da Rinite Alérgica¹⁷. Os pacientes deveriam apresentar não menos de dois sintomas clínicos de RA, incluindo coceira nasal, espirros, congestão nasal ou corrimento nasal. Além disso, o exame da mucosa nasal deveria demonstrar palidez e edema, e o resultado do Teste Cutâneo de Prick (TCP) ou do teste sérico de IgE deveria ser positivo. O TCP foi realizado por equipe especializada na sala de testes de alérgenos do ambulatório, a fim de garantir a precisão e a consistência dos resultados. Todos os pacientes com RA realizaram a avaliação do Questionário de Qualidade de Vida na Rinoconjuntivite (RQLQ) e do Escore Total dos Sintomas Nasais (TNSS) com auxílio da equipe médica, e os escores foram registrados para análises posteriores.

Voluntários saudáveis submetidos a exames físicos de rotina no hospital foram recrutados como o grupo sem RA. Os participantes elegíveis não tinham histórico pessoal ou familiar de RA, nem histórico de asma ou outras doenças alérgicas, sinusite crônica ou outras doenças inflamatórias da cavidade nasal, e nem infecção do trato respiratório no mês anterior. Além disso, indivíduos com histórico de doenças graves cardíacas, hepáticas, pulmonares ou renais, ou qualquer tumor maligno, foram excluídos do estudo.

As amostras de sangue venoso periférico dos dois grupos de voluntários foram coletadas. Uma parte do sangue venoso anticoagulado foi utilizada para a extração de DNA e para a extração de RNA plasmático. Outra parte do sangue venoso foi separada para obtenção de soro, o qual foi usado para a detecção de fatores relacionados ao soro (imunoglobulina E (IgE), interleucina-4 (IL-4), IL-6 e IL-10).

Extração de DNA:
200 µL de amostras de sangue venoso periférico foram utilizados para extração de DNA com o kit de extração de DNA genômico de sangue total (consulte a Tabela de Materiais). As amostras de sangue foram coletadas em tubos com anticoagulante heparina de lítio e, em seguida, alíquotas foram congeladas a -20 °C para armazenamento. Os procedimentos operacionais específicos devem seguir rigorosamente as instruções do kit. Por fim, 100 µL de tampão de eluição foram utilizados para eluir o DNA. A pureza das amostras de DNA extraídas foi determinada por meio de analisador de ácidos nucleicos/proteínas (espectrofotômetro) (a razão OD₂₆₀/OD₂₈₀ estava entre 1,8 e 2,0). As amostras de DNA após a análise foram armazenadas a -20 °C para uso futuro nos experimentos subsequentes de genotipagem.

Detecção de Genótipo
O kit de genotipagem SNP TaqMan estava disponível para detectar a distribuição dos genótipos miR-146a rs2910164. As informações do kit foram inseridas na lista de materiais de consumo. O volume total da reação de PCR foi de 10 µL, contendo 5 µL de Master Mix, 0,5 µL da mistura de primers e sonda de tipagem, 10 ng de DNA molde e água livre de RNase. A amplificação do DNA foi realizada no equipamento de PCR quantitativa em tempo real com fluorescência Roche LightCycler 480 II. Condições da reação: pré-desnaturação a 95 °C por 10 min; 40 ciclos (95 °C por 15 segundos, 60 °C por 1 min), com leitura da fluorescência FAM/VIC a 60 °C. Após a conclusão da amplificação, os sinais de dupla fluorescência FAM/VIC coletados foram analisados utilizando o software LightCycler 480, e os dados de genótipo foram processados estatisticamente. Um sinal exclusivo de FAM representa um genótipo homozigoto, um sinal exclusivo de VIC representa outro genótipo homozigoto, e a presença de ambos os sinais indica um genótipo heterozigoto. Amostras com sinais anormais ou resultados inconsistentes após repetição serão retestadas. Cada experimento foi conduzido com controle negativo (sem molde) e controle positivo para controle de qualidade. Todas as amostras foram submetidas a três réplicas técnicas.

RT-qPCR
A extração de miRNA total do plasma foi realizada a partir de 100 µL de plasma utilizando um kit dedicado de extração de miRNA. As informações do kit foram inseridas na lista de materiais de consumo. A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro. A razão OD₂₆₀/OD₂₈₀ das amostras de miRNA extraídas e qualificadas variou entre 1,8 e 2,0. Utilizaram-se 200 ng de RNA para a transcrição reversa com a finalidade de sintetizar cDNA, e o procedimento da reação seguiu as instruções padrão do kit. A transcrição reversa foi realizada em um volume total de 20 µL, incluindo incubação a 42 °C por 60 min e inativação a 85 °C por 5 min. A reação de qPCR foi preparada conforme o protocolo estabelecido, com um volume total de 20 µL. A mistura da reação foi configurada da seguinte forma: 10 µL de pré-mistura para qPCR, 0,4 µL do iniciador direto, 0,4 µL do iniciador reverso, 1 µL do molde de cDNA e 8,2 µL de água livre de RNase. Foram utilizados iniciadores específicos para miR-146a e o gene de referência interna U6. A amplificação foi concluída utilizando o instrumento de PCR quantitativa em tempo real com fluorescência Roche LightCycler 480 II. As condições térmicas do ciclo de qPCR foram: pré-desnaturação a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 5 s e hibridização e extensão a 60 °C por 30 s. Todas as amostras foram submetidas a três réplicas técnicas. Os dados experimentais foram analisados utilizando o software LightCycler 480. Utilizando U6 como referência interna para corrigir a variação entre amostras, primeiramente calculou-se ΔCt (valor de Ct de miR-146a - valor de Ct de U6), em seguida calculou-se ΔΔCt (ΔCt do grupo experimental - ΔCt do grupo controle) e, finalmente, o nível relativo de expressão de miR-146a foi obtido por meio de 2^⁻ΔΔCt.

ELISA
Os níveis séricos de IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 foram detectados por meio de kits de ELISA. Os procedimentos experimentais seguiram o manual de instruções. Os passos específicos foram os seguintes: primeiramente, a solução concentrada de lavagem foi diluída e os padrões foram diluídos em gradiente para preparar as soluções de trabalho para a curva padrão. Em seguida, 50 µL de diluente, solução padrão e amostra a ser testada foram adicionados às poças e incubados a 37 °C por 60 min. Após a incubação, as poças foram lavadas três vezes com tampão de lavagem. Posteriormente, foram adicionados 50 µL de solução de trabalho do anticorpo conjugado com enzima, e as placas foram incubadas a 37 °C por 30 min. Após a conclusão da incubação, o líquido foi descartado, as poças foram lavadas novamente e, em seguida, adicionada a solução cromogênica, seguida de incubação por 15 min a 37 °C no escuro. Após a adição da solução de parada, a absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. As concentrações das amostras foram calculadas com base na curva padrão. Cada amostra foi testada três vezes. Dados com coeficiente de variação inferior a 10% foram considerados válidos. Poças em branco e poças controle foram preparadas durante o experimento para controle de qualidade. A faixa de detecção e a sensibilidade do kit estavam em conformidade com as especificações indicadas no manual do fabricante.

Estatísticas dos dados
Os dados experimentais foram analisados utilizando os softwares SPSS e GraphPad Prism 9. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (média ± DP). O teste de Shapiro-Wilk foi utilizado para avaliar a normalidade das variáveis contínuas, e o teste de Levene foi aplicado para verificar a homogeneidade da variância. A comparação de variáveis contínuas entre os dois grupos foi analisada utilizando o teste t para amostras independentes. A ANOVA de um fator seguida pelo teste post-hoc de Tukey foi realizada para comparações entre múltiplos grupos, e a ANOVA de dois fatores foi aplicada para avaliar os efeitos principais de dois fatores independentes e seu efeito de interação. Valores aberrantes foram identificados e excluídos com base na regra dos 3 desvios padrão. Nenhum dado ausente foi detectado neste estudo. A curva característica de operação do receptor (ROC) foi utilizada para analisar a eficácia diagnóstica do miR-146a para AR. Parâmetros relevantes da curva ROC e intervalos de confiança de 95% foram calculados utilizando algoritmos estatísticos embutidos. A análise de correlação de Pearson foi usada para medir a correlação linear entre a expressão do miR-146a e os níveis de fatores séricos relacionados. Análises de regressão logística univariada e multivariada foram realizadas para identificar fatores de risco para AR. Variáveis com p < 0,05 na análise univariada foram incluídas no modelo de regressão logística multivariada. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Características dos Participantes e Distribuição de Genótipos
Os dados clínicos basais dos dois grupos de indivíduos foram analisados estatisticamente. Os resultados indicaram que os níveis séricos de IgE, IL-4, IL-6 e IL-10 apresentaram diferenças significativas. Em comparação com o grupo de voluntários sem AR, a concentração sérica de IgE, IL-4 e IL-6 no grupo de pacientes com AR foi aumentada, enquanto o nível de IL-10 foi reduzido (Tabela 1). A distribuição de genótipos de miR-14...

Discussão

A RA é uma doença inflamatória alérgica crônica do trato respiratório. O mecanismo central da RA é que, após o organismo ser exposto a alérgenos, lesões inflamatórias na mucosa nasal são mediadas por IgE^17,18. Os sintomas clínicos incluem principalmente coceira nasal, congestão nasal, espirros e corrimento nasal claro, o que prejudica seriamente a qualidade de vida dos pacientes. Estudos epidemiológicos e genéticos confirmaram que a suscetibilidade genética exerc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
tubo cônico de 15 mL	Corning	430791	Para separação de plasma, subembalagem de amostras e operação de extração de ácidos nucleicos
Applied Biosystems TaqMan Genotyping Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4371355	2× mistura-mestra concentrada otimizada para genotipagem de SNP, contendo polimerase Taq com ativação térmica, dNTPs, íons magnésio, tampão de reação e corante referência ROX. Não requer preparação manual do sistema. Compatível com o TaqMan SNP Genotyping Assay mencionado acima, fornece um sistema enzimático estável para amplificação de SNP e genotipagem fluorescente com boa reprodutibilidade e resultados claros de agrupamento.
Applied Biosystems TaqMan SNP Genotyping Assay (rs2910164, miR-146a)	Thermo Fisher Scientific	C__15946974_10	Mistura pré-projetada de primers e sondas para genotipagem de SNP no locus miR-146a humano rs2910164. Contém primers específicos para PCR e duas sondas fluorescentes MGB. O marcador VIC identifica o alelo C e o marcador FAM identifica o alelo G. É capaz de distinguir com precisão os três genótipos (CC, CG, GG) em um único tubo de reação, sendo adequada para discriminação alélica em ponto final em instrumentos de PCR em tempo real.
Tubos de Coleta de Sangue com Anticoagulante Heparina de Lítio BD	BD Vacutainer	367884	Bioquímica clínica, testes de emergência e pesquisa em hematologia
Graphpad	EUA	/	Gráficos científicos profissionais & software estatístico, padrão para biologia/medicina, sem necessidade de programação. Principais vantagens: testes t, ANOVA, análise de sobrevida, regressão não linear (por exemplo, curvas dose-resposta); gera gráficos prontos para publicação (barras, dispersão, curvas de sobrevida) para qPCR, Western Blot, ensaios celulares.
Kit ELISA para Imunoglobulina E (IgE)	Jiancheng	H108-1-2	Aplicação: pesquisa sobre resposta imune e doenças alérgicas
Kit ELISA para Interleucina-10 (IL-10)	Jiancheng	H010-1-2	Aplicação: Inflamação, regulação imune, pesquisa de biomarcadores clínicos
Kit ELISA de Interleucina-4 (IL-4)	Jiancheng	H005-1-2	Área de pesquisa: Inflamação, resposta imune Th2, reação alérgica
Kit ELISA de Interleucina-6 (IL-6)	Jiancheng	H007-1-2	Aplicação: Inflamação, regulação imune, pesquisa de biomarcadores clínicos
LightCycler 480 Software (v1.5 /v1.6)	Roche Diagnostics	/	Software oficial da Roche que permite a aquisição de dados de qPCR com um único clique, análise quantitativa, análise de curva de dissociação e genotipagem de SNP (método TaqMan de ponto final + HRM).
miRcute Enhanced miRNA cDNA First-Strand Synthesis Kit	TIANGEN	KR211-02	Adequado para a transcrição reversa de todos os miRNAs maduros
Kit miRcute de Extração e Isolamento de miRNA de Soro/Plasma	TIANGEN	DP503	Amostra aplicável: soro humano, plasma, sobrenadante celular
Instrumento Roche LightCycler 480 II (Sistema de PCR em Tempo Real)	Roche Diagnostics	05015278001	Quantificação por qPCR + Genotipagem de SNP (incluindo TaqMan) + Análise de Curva de Derretimento de Alta Resolução (HRM)
SPSS 27.0	EUA	/	Software estatístico médico/ciências sociais tudo-em-um, com interface baseada em menus (sem necessidade de programação), ideal para amostras grandes & desenhos complexos. Recursos principais: estatísticas descritivas, ANOVA, regressão, qui-quadrado, análise de sobrevida, confiabilidade, cálculo de tamanho da amostra; suporta limpeza de dados & importação em múltiplos formatos (Excel/CSV) para dados clínicos, de pesquisa e epidemiológicos
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	TIANGEN	FP205-02	Mistura mestra aprimorada de alta especificidade; tampão otimizado com fator H-Bond minimiza dímeros de iniciadores & não específicos; Taq com início quente + ROX para LightCycler 480 II; alta sensibilidade & reprodutibilidade; ideal para genes de baixa abundância, amostras complexas, genotipagem de alto rendimento.
Fotômetro para Microplacas Thermo Scientific Multiskan FC	Thermo	51119180	Leitor de placas multimodo de alta performance; absorbância (incluindo 450 nm) + fluorescência + luminescência; linearidade 0–4 Abs±2%) a 450 nm, desvio padrão da precisão&<0,001 Abs; compatível com placas de 96/384 poços, alcance dinâmico automático; ideal para ELISA, viabilidade celular, imunoensaios, interações moleculares.
Espectrofotômetro UV-Vis Thermo Scientific NanoDrop One	Thermo	/	Espectrofotômetro microvolume UV-Vis padrão-ouro; 1–2 μL amostra, sem necessidade de cubeta; mede diretamente ácidos nucleicos (260 nm), proteínas (280 nm), OD600 com concentração & razões de pureza (A260/A280, A260/A230); varredura de espectro completo 190–850 nm, auto-calibração, tela sensível ao toque; ideal para qPCR, NGS, controle de qualidade na purificação de proteínas.
Kit de extração de DNA genômico de sangue total	TIANGEN	DP304-03	Amostra aplicável: Sangue periférico total, células sanguíneas, amostras de tecido