Estabilização de Proteína e Proteína—Condensados de RNA em hidrogéis de agarose de baixa fusão para medições biofísicas quantitativas

Resumo

Aqui, apresentamos um método robusto para imobilizar fisicamente condensados separados em fase líquido–líquido dentro de uma matriz porosa de hidrogel de agarosa de baixa fusão, sem perturbar sua dinâmica interna do líquido. A abordagem minimiza a sedimentação de gotículas, a coalescência e artefatos de molhação superficial, permitindo imagens reprodutíveis e análise biofísica quantitativa ao longo de horas.

Resumo

Condensados biomoleculares formados pela separação de fases líquido–líquido são cada vez mais reconhecidos como unidades organizacionais fundamentais da célula, com funções que vão desde o processamento de RNA até a montagem de grânulos de estresse. A reconstituição in vitro desses condensados usando proteínas purificadas e RNA fornece sistemas-modelo, mas gotículas líquidas se engrossam, sedimentam e se espalham nas superfícies ao longo do tempo, introduzindo variabilidade significativa nas medições quantitativas ao longo dos períodos experimentais. Incorporar esses condensados em um hidrogel esparso, opticamente transparente e quimicamente inerte — aqui preparado a partir de agarose de baixa fusão (LMA) a 0,3–1,0% w/v — estabiliza as gotículas em três dimensões, permitindo o uso de metodologias com tempos de medição mais longos ou configurações experimentais com medições repetidas. Este artigo apresenta um protocolo detalhado passo a passo para preparação de estoques LMA, formação de gotículas e incorporação, além de fornecer exemplos de leituras biofísicas específicas a jusante. Também mostramos que propriedades específicas de gotículas, como a difusão molecular, são preservadas após a incorporação da LMA nos sistemas representativos testados. Como o método é compatível com microscopia confocal, de campo amplo ou super-resolução, recuperação de fluorescência após fotobranqueamento ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear, entre outros, pode apoiar a caracterização quantitativa de condensados biomoleculares relevantes para saúde e doença.

Introdução

A separação em fase líquido–líquido (LLPS) impulsiona a formação de organelas sem membrana e condensados biomoleculares nas células, incluindo grânulos de estresse, corpos P e o nucleolo 1,2,3,4,5. Esses condensados concentram proteínas específicas e ácidos nucleicos enquanto mantêm uma troca rápida com o citoplasma ou nucleoplasma ao redor – uma marca registrada do comportamento semelhante ao líquido 1,2,3,4,5. A desregulação da LLPS tem sido associada a várias doenças, como os distúrbios^{neurodegenerativos 3,6,7}, e também está implicada na replicação de vários vírus, como o SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

A reconstituição in vitro de condensados usando proteínas purificadas e RNA sob condições de tampão definidas tornou-se uma abordagem fundamental para estudar os mecanismos^{LLPS 3,4}. No entanto, gotículas em tubos de ensaio ou em uma superfície de vidro são suscetíveis a três artefatos principais: (i) sedimentação gravitacional, que faz com que gotas se acumulem no fundo; (ii) coalescência, onde gotas se fundem ao longo do tempo em estruturas menores e maiores; e (iii) molhação superficial, onde gotículas se espalham e se adsorvem parcialmente sobre o revestimento. Esses fenômenos reduzem a reprodutibilidade das medições quantitativas e dificultam o acompanhamento de gotículas individuais em suas dimensões fisiologicamente^{relevantes 13}. Esses fenômenos limitam ainda mais o uso de métodos que exigem tempos de medição estendidos de minutos a horas (por exemplo, espectroscopia de ressonância magnética nuclear [RMN] ou técnicas de microscopia de superresolução como o STORM) e proíbem medições repetidas em escalas de tempo estendidas.

A imobilização física dentro de uma rede de hidrogel aborda simultaneamente os três artefatos. A agarose forma um gel fisicamente reticulado em temperaturas abaixo de 34–38 °C. Em concentrações de 0,3–1,0% w/v, o tamanho da malha da agarose é grande o suficiente para encapsular gotículas intactas em escala micrométrica, permanecendo suficientemente poroso para não dificultar a dinâmica molecular^{intra-gotícula 13}. Além disso, a porosidade da matriz de agarose permite a difusão de macromoléculas e pequenas moléculas dentro e fora das gotículas embutidas. Para sistemas particularmente sensíveis à temperatura, envolvendo proteínas com domínios dobrados ou seguindo uma separação de fases do tipo UCST/LCST (temperatura de solução crítica superior/inferior), pode-se usar agarose de baixa fusão (LMA) com ponto de gelificação de 26–30 °C. Abordagens alternativas anti-humedecência, como a passivação superficial, podem reduzir a adesão do condensado e, assim, a molhação, mas frequentemente exigem preparação especializada e não impedem a sedimentação ou a coalescência de gotículas. Em contraste, a incorporação de agarosa oferece um método simples e amplamente acessível para imobilizar condensados espacialmente. Importante destacar que a agarose foi validada para não perturbar o estado conformacional da fusão em sarcoma (FUS) e outras proteínas de ligação ao RNA na formação de gotículas até concentrações de agarose de 1,0% w/^{v 13}. Esse protocolo padroniza a abordagem de embedding de agarose para uso geral com muitos sistemas de proteína separadora de fase ou proteína-RNA de interesse, fornecendo orientações passo a passo para a preparação de reagentes e preparação da amostra.

Protocolo

1. Preparação do estoque de agarose

IMPORTANTE: Prepare o estoque de agarose no mesmo buffer usado para formar as amostras separadas por fase (doravante chamadas de "buffer de gotículas") para evitar desajustes no^{buffer 14}. Exemplo: A amostra de nucleocapsídeo é preparada no tampão A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), que também deve ser usado para preparar o estoque de agarose.
NOTA: As condições experimentais finais, incluindo, mas não se limitando à composição do tampão, concentração de proteínas, uso de aditivos e volumes finais da amostra, dependem fortemente do sistema biológico específico em investigação e da aplicação específica a jusante. Da mesma forma, parâmetros de aquisição, configuração do instrumento e análise de dados dependem fortemente da amostra e do experimento específico. Por exemplo, a preparação do nucleocapsídeo SARS-CoV-2 com poly(A) é descrita na Figura 1A (microscopia de fluorescência confocal).

1. Pese a quantidade adequada de LMA ou agarose comum em um tubo de 1,5 mL contendo tampão de gotículas. Exemplo: Para um estoque de 2% em peso por volume, dissolva 20 mg de agarose em 1 mL de buffer A.
   NOTA: A concentração final de agarose deve ser de 1–2% em peso e volta, dependendo da concentração final desejada na amostra. Não é recomendado ultrapassar 2% de peso por volume, pois fica cada vez mais difícil pipetar. Corte a ponta estreita da ponta da pipeta para facilitar a pipetagem, especialmente em porcentagens altas de agarose. Consulte a seção de discussão para determinar se LMA ou agarose regular é necessário para as amostras.
2. Aqueça a agarose a 80–90 °C em um bloco de aquecimento ou banho-maria e dissolva completamente a agarose por vortexing (leva aproximadamente 10 minutos).
   ATENÇÃO: Agarose derretida é quente. Manuseie com cuidado.
3. Equilibre o estoque de agarose a 37 °C (LMA) ou 55 °C (agarose comum) no bloco de aquecimento ou banho-maria. Verifique se a solução permanece limpa e líquida nessa temperatura. Verifique a temperatura do estoque de agarose com um termômetro, se necessário.
   PONTO DE PAUSA: Estoques de agarose derretida podem ser mantidos aquecidos por 30–60 minutos.
   O aquecimento da agarose em banho-maria é fortemente recomendado para garantir um aquecimento mais homogêneo e manter a temperatura alvo com precisão suficiente. Isso é especialmente importante ao trabalhar com LMA, pois pequenas variações de temperatura podem causar gelificação prematura.
4. Após a preparação da amostra (seção 2), armazene os estoques de agarose restantes a +4 °C. Siga os passos 1.2 e 1.3 acima para fundir e reequilibrar o estoque de agarose antes do uso.
   NOTA: Recomendamos manter o estoque de agarose por no máximo 2 semanas a +4 °C e submetê-lo a no máximo 2–3 ciclos de solidificação/fusão. Use boas práticas de fabricação para evitar contaminação. Descarte os estoques mais cedo se não derreterem ou solidificarem novamente, ou se houver contaminação visível.

2. Preparação da amostra

1. Pré-aqueça todos os materiais que entram em contato direto com a agarose (por exemplo, pontas de pipeta, tubos, lâminas de microscopia) a aproximadamente 37 °C, colocando-os sobre o bloco de aquecimento ou em uma incubadora por 2–3 minutos.
2. Prepare o estoque de agarose conforme descrito na Seção 1.
3. Prepare o tampão de gotículas, os componentes separadores de fase (por exemplo, estoques de proteínas ou RNA) e quaisquer outros aditivos (por exemplo, agentes de aglomeração, corantes) para as amostras conforme o protocolo padrão. Equilibre à temperatura ambiente (RT). Exemplo: estoque de proteína A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), estoque de proteína nucleocapsídea (60 μM, no tampão A), estoque de poli(A) (30 μM, no tampão A).
   NOTA: Para recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP), microscopia de fluorescência confocal ou microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), adicione uma pequena fração de proteína ou RNA marcado fluorescentemente aos estoques de proteína ou RNA, respectivamente (recomendado: fração marcada <5%).
4. Calcule os volumes do tampão de gotículas, estoque de agarosa, os componentes separadores de fase (por exemplo, proteína ou RNA de interesse) e quaisquer aditivos suplementares (por exemplo, agentes de aglomeração) necessários para a amostra. Exemplo: 6 μL de buffer A, 5 μL de estoque de agarose a 2% (0,5 final de água), 5 μL de proteína nucleocapsídea (15 μM finais), 4 μL de poly(A) (6 μM finais). Volume final 20 μL.
   NOTA: Embora altamente dependentes do prato, tubo, placa ou outro recipiente usado no experimento, os volumes comumente usados são 150 μL para um tubo de RMN de 3 mm, 20 μL para experimentos de microscopia ou FRAP em lâminas de microscopia de 6 canais, e 20–30 μL para experimentos STORM em lâminas de microscopia de 18 poços (veja a Tabela de Materiais).
   1. Como valores iniciais, use a agarose final de 0,3–0,5% em peso e em peso e em 0,8 a 1,0% em peso e em valor de 0,8 a 1,0% em peso e em peso para estabilização a longo prazo (por exemplo, experimentos de envelhecimento).
      NOTA: Para estabilização e armazenamento a longo prazo das amostras, devem ser tomadas medidas para evitar a desidratação da amostra (por exemplo, selar o recipiente da amostra, armazenar em uma câmara umidificada e adicionar uma barreira de evaporação) e garantir que a composição e o pH do tampão permaneçam estáveis durante incubações prolongadas.
   2. Para amostras de RMN, adicione o D2O final de 5% v/v à amostra para travamento.
      NOTA: A concentração de todos os outros componentes e o volume total da amostra dependem fortemente da aplicação específica e da configuração experimental.
5. Adicione os volumes correspondentes de tampão, componentes separadores de fase, coronha de agarose e aditivos em um tubo pré-aquecido de 1,5 mL.
   NOTA: Recomendamos adicionar primeiro o tampão e a agarose, seguido de quaisquer aditivos suplementares. Recomendamos ainda adicionar os componentes separadores de fase por último para desencadear a formação de condensados. No entanto, a ordem ideal de mistura depende do sistema e deve ser determinada antecipadamente. Isso é especialmente relevante para sistemas nos quais a estequiometria e a ordem de adição podem influenciar fortemente o tamanho das gotículas ou a compartimentalização. Exemplo: A ordem de mistura da amostra de nucleocapsídeos é primeiro Buffer A, segundo estoque de agarose, terceiro núcleo de proteína e último poly(A), usando os volumes indicados no Passo 2.4. Neste exemplo, LLPS é acionado pela adição de poly(A). Para sistemas nos quais LLPS produz turbidez visível, a turbidez pode servir como um indicador qualitativo de controle de qualidade; no entanto, o tempo de início e a visibilidade dependem do sistema, e a falta de turbidez imediata não indica por si só falha do protocolo.
   1. Mantenha o tubo no bloco de aquecimento ou banho-maria enquanto pipete algumas vezes. Evite introduzir bolhas de ar.
      NOTA: Enquanto a agarose ainda está líquida, gotículas podem se fundir. Assim, variar o tempo de pré-incubação no bloco de aquecimento ou em banho-maria antes de iniciar a gelação pode ser uma ferramenta útil para investigar gotículas de diferentes tamanhos. Caracterizar a cinética de crescimento das gotículas na ausência de agarose antes de selecionar o intervalo de tempo pré-incubação permite que os pesquisadores alvos reprodutivelmente uma faixa específica de tamanho de gotícula.
6. Para amostras de microscopia / FRAP:
   1. Use uma pipeta normal para transferir rapidamente a amostra para/sobre a lâmina de microscopia escolhida (por exemplo, lâmina de microscopia em canal com fundo coverslip).
   2. Permita a gelificação em temperatura de temperatura por 5–10 minutos (veja a nota na seção de discussão).
      NOTA: Não mova a lâmina de microscopia durante esse período. Proteja amostras fluorescentes da luz.
   3. Meça a amostra de acordo com o protocolo padrão. Exemplo: microscópio confocal de disco giradisso, objetivo de óleo apo plano 100x 1,45, comprimento de onda de excitação 561 nm para corante Cy3, aquisição de 100 ms a 30% de potência de laser (Cy3) e 50 ms a 6% de intensidade luminosa (campo claro). Para o FRAP: região de alvejante com 1/10^{de parte} do diâmetro da gotícula colocada no centro da gotícula, 25 quadros de pré-branqueamento (aquisição sem atraso), 60 quadros pós-descolorimento (coletados em intervalos de 1 s), pulso laser para branqueamento de 15 ms com 70% de potência do laser. Analisar a recuperação FRAP por normalização em escala total em software de acesso aberto; Informe os parâmetros de ajuste cinético somente se o ajuste for realizado.
7. Para exemplos de STORM:
   1. Use uma pipeta normal para transferir rapidamente a amostra para a lâmina STORM preferida (por exemplo, lâmina de câmara de 18 poços com fundo coverslip). Dispense a amostra em uma gota.
   2. Permita a gelificação em temperatura de temperatura por 5–10 minutos (veja a nota na seção de discussão).
      NOTA: Não mova a lâmina de microscopia durante esse período. Proteja amostras fluorescentes da luz.
   3. Encha todo o poço com o buffer STORM. Fele o poço de acordo com o protocolo padrão.
   4. Equilibre a amostra por pelo menos 1–2 horas antes da medição para permitir que o tampão STORM difunda no hidrogel de agarose.
      NOTA: A difusão bem-sucedida do tampão STORM na amostra pode ser facilmente verificada se os corantes fluorescentes piscarem durante a aquisição do STORM. Dependendo das especificações da amostra, podem ser necessários tempos de equilíbrio mais longos.
   5. Meça a amostra de acordo com o protocolo padrão utilizado. Exemplo: Microscópio invertido Ti2, SR apochromat TIRF 100x 1,49 objetiva de óleo, iluminação fina altamente inclinada. Aquisição de 20.000 quadros por amostra, campo de visão de 64 x 64 pixels, tempo de exposição de 10 ms com um laser de 125 mW de 647 nm para corante Cy5, e uso de um laser de 20 mW de 405 nm para auxiliar na transição do estado escuro de longa duração para o estado fundamental. As imagens foram processadas usando estimativa de máxima verosimilhança com ajuste multiemissor. A correção de deriva foi aplicada, e apenas pontos de dados com precisão de localização de 25 nm ou superior foram incluídos na visualização final. As imagens finais são produzidas usando o método dos histogramas deslocados médios com ampliação de 20x (1 pixel = 8 nm na imagem final).
8. Para amostras de RMN:
   1. Use uma pipeta de vidro longa e fina (pré-aquecida) para transferir rapidamente a amostra para o tubo de RMN. Dispense a amostra no fundo do tubo.
   2. Permita a gelificação em temperatura de temperatura por 5–10 minutos (veja a nota na seção de discussão).
      NOTA: Não agite o tubo de RMN durante esse período.
   3. Meça a amostra de acordo com o protocolo padrão utilizado. Exemplo: intensidade de campo da RMN 750 MHz com sonda PATXI à temperatura ambiente, tubo de 3 mm, aquisição a 25 °C, sequência padrão de pulsos (stebpgp1s19) para experimentos de difusão (DOSY), parâmetros: 4.096 pontos com 32 varreduras, intensidade do gradiente 2–95%, tempo de difusão 0,08 s, pulso do gradiente 12 ms, atraso de relaxamento (d1) 5 s.

Resultados

O protocolo foi aplicado a condensados formados pelo domínio N-TERMINAL FUS (FUS NTD) ou pela proteína nucleocapsídeo (N) do SARS-CoV-2 com RNA poli(A) ou s2m como exemplos representativos tanto de gotículas exclusivas de proteína quanto de RNA proteínico. Para avaliar se a agarose afeta detectivelmente a formação de condensados nas condições testadas, formamos gotículas com proteína N e poly(A) na presença e ausência de 0,5% de LMA em peso e volta. Como a LMA solidifica após aproximadamente 5 minutos em RT, gravamos imagens de microscopia de fluorescência nesse momento e observamos que as gotículas tinham aproximadamente o mesmo tamanho em ambos os casos (Figura 1A,B). Para demonstrar o efeito preventivo da agarose na molhação e fusão das gotículas, registramos outro conjunto de imagens 60 minutos após a preparação da amostra. Embora as gotículas embutidas na agarose não tenham mudado de tamanho, condensados na ausência de LMA mostraram um aumento drástico de tamanho devido à fusão e à molhação superficial (Figura 1A,B). Embora tenhamos embutido as gotículas relativamente cedo após a nucleação, gotículas de diferentes tamanhos podem ser inseridas variando o tempo de incubação pré-embedding. Apesar de as gotículas serem incorporadas no hidrogel de agarose, a dinâmica do condensado medida não foi detectivelmente alterada. A recuperação do FRAP e, portanto, a aparente difusão de gotículas foram altamente semelhantes com e sem LMA na amostra (Figura 1C). Além disso, experimentos anteriores de espectroscopia de RMN ordenada por difusão (DOSY) com condensados FUS NTD mostraram que as taxas de difusão não foram detectivelmente influenciadas pela concentração de agarose, pelo menos na faixa de 0,25–1% w/v (Figura 1D) (adaptado de Emmanouilidis et ^al.13). Esses resultados demonstram que um hidrogel de agarose é adequado para capturar condensados separados em fase no espaço e no tempo, permitindo medições repetidas ao longo de períodos de tempo prolongados.

Embora tanto as medições de microscopia quanto de FRAP sejam relativamente rápidas de registrar (segundos a minutos), alguns experimentos exigem vários minutos (por exemplo, STORM, RMN 1D ^1H) ou até horas (por exemplo, RMN 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) para serem adquiridos. Para tais experimentos, é crucial que as gotículas permaneçam estacionárias durante toda a aquisição e não sedimentem ao longo do tempo. Aqui, mostramos que estabilizamos gotículas de proteína N + RNA s2m em LMA por tempo suficiente para adquirir imagens STORM (Figura 1E). Além disso, espectros de RMN das gotículas de DTN da FUS na presença e ausência de agarose apresentavam larguras de linha comparáveis, sugerindo que não há interação detectável entre hidrogéis de agarose e a proteína nessas condições (Figura 1F) (adaptado de Emmanouilidis et ^al.13). Em contraste, espectros de condensados embutidos em agarose apresentaram maior intensidade de sinal, provavelmente porque gotículas não estabilizadas sedimentaram no tubo de RMN durante a aquisição e, portanto, não estavam mais disponíveis para medição (Figura 1F) (adaptada de Emmanouilidis et ^al.13). Em conclusão, a estabilização de condensados em hidrogéis de agarose não apenas possibilita experimentos de curso temporal, mas também possibilita o uso de metodologias com tempos de aquisição estendidos, preservando as propriedades das gotículas medidas nos sistemas representativos testados.

Figura 1: Estabilização de condensados por embedding de agarosa sem perturbar detectivelmente as propriedades de gotículas medidas. (A) Microscopia de fluorescência da proteína nucleocapsídea de 15 μM com 6 μM de Cy3-poli(A) (5% marcado) no tampão A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2) na presença (+ agarose) ou ausência (sem agarose) de 0,5% em peso e volume de peso (LMA). As imagens foram adquiridas 5 ou 60 minutos após a mistura / embedding de agarose. As imagens são representativas de 7 imagens adquiridas em n = 2 experimentos independentes. Barra de escala = 5 μm. (B) Quantificação dos raios das gotículas dos condensados mostrada em (A). Os dados são exibidos como boxplots (caixa = intervalo interquartil, linha central = mediana, bigodes = intervalo dos dados restantes, ponto = valores atípicos). O raio médio ± o desvio padrão (SD) e o número de gotículas analisadas em cada condição são mostrados diretamente no gráfico. Os dados seguem uma distribuição normal. Gotículas individuais não foram tratadas como réplicas biológicas independentes para inferência estatística. Nenhum teste estatístico foi realizado; as distribuições são apresentadas de forma descritiva. (C) FRAP das gotículas mostradas em (A) no ponto de tempo 5 min. O fotobranqueamento foi realizado com o laser de 561 nm (Cy3). Os dados mostram a intensidade normalizada (média ± sd de n = 3 réplicas independentes por condição), que é obtida normalizando o sinal branqueado para os valores pré-descolorimento, uma área não branqueada da mesma amostra e a fluorescência de fundo. (D) Sinal DOSY não atenuado de 200 μM da proteína fus NTD no tampão B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM ureia, pH 7,3) na presença de 0,25, 0,5 ou 1,0% w/v de agarose regular. N = 1. (E) Microscopia de fluorescência confocal e imagens STORM da proteína Cy5-nucleocapsídea de 15 μM (5% marcada) com 6 μM de RNA viral s2m em buffer A contendo 0,5% de peso e peso de lano (LMA) em peso e volta. Representativo de n = 3 experimentos independentes. Barra de escala = 1 μm em ambas as imagens. (F) espectros 1D ¹H RMN (esquerda) e espectros 2D [¹⁵N ¹H] espectros NMR HSQC (direita) de 200 μM FUS NTD no buffer B na presença ou ausência de 0,5% w/v de agarose regular. N = 1. Os painéis (D) e (F) são reproduzidos de Emmanouilidis et ^al.13 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O sucesso da incorporação de condensados biomoleculares por agarose depende de vários fatores. Primeiro, a agarose deve ser mantida em temperaturas suficientemente altas para evitar gelificação prematura e, ao mesmo tempo, baixas o bastante para não perturbar estruturas ou interações biomoleculares. A agarose de baixa fusão tem ponto de gelificação de 26–30 °C e ponto de fusão de 60–65 °C, enquanto a agarose comum tem ponto de gelificação de 34–38 °C e ponto de fusão de 90–95 °C. Segundo, mistura rápida e transferência para o vaso final de reação (por exemplo, tubo de RMN) são críticas, pois pequenas variações no tempo ou na temperatura podem levar a uma incorporação desigual e, portanto, a reprodutibilidade comprometida.

Apesar desses pontos críticos, o método pode ser facilmente adaptado a diferentes necessidades experimentais. Para sistemas de separação de fases com proteínas intrinsecamente desordenadas ou sistemas que não são propensos à desnaturação térmica, a agarose comum pode ser usada em vez da LMA para economizar custos. Ao preparar amostras contendo proteínas com domínios dobrados, ou qualquer outra (bio-)molécula sensível à temperatura propensa à desnaturação térmica, a LMA deve ser usada para evitar a desnaturação. Uma amostra de controle apenas com calor/sem agarose pode ser preparada para separar os efeitos da embutição de agarose dos efeitos do aquecimento transitório da amostra. Para reduzir o risco desses efeitos de desnaturação dependentes da temperatura, a agarose de baixa fusão é particularmente adequada para amostras sensíveis à temperatura, enquanto a concentração de agarose pode ser ajustada para modular o tamanho da malha e o grau de confinamento mecânico. Para medições de difusão altamente sensíveis, como o método recentemente desenvolvido de RMN chamado LLPS REDIFINE^15,16, a menor concentração de agarose que previne a sedimentação geralmente é preferível, tipicamente 0,3–0,5% w/v. Para experimentos de maturação que exigem semanas a meses de estabilidade, 0,8–1% w/v é preferível. Esses parâmetros devem ser otimizados para garantir uma estabilização eficaz sem alterar detectivelmente a morfologia ou dinâmica do condensado e devem sempre ser adaptados ao sistema específico. Essa validação requer a comparação de amostras com e sem embedding de agarose (e outras condições idênticas) ou comparação de diferentes concentrações de agarose (para excluir efeitos de malha dependentes da concentração), por exemplo, usando microscopia para avaliar a morfologia das gotículas, FRAP para avaliar a difusão, ou qualquer outro método adequado para avaliar propriedades de gotículas importantes para o pesquisador.

O tempo de gelação é outra consideração importante. O tempo que a agarose leva para solidificar depende de vários fatores, como o tipo de tampão, pH, concentração final de agarose, temperatura inicial e se é usada agarose de baixa fusão ou regular. Normalmente, a agarose solidifica em 5–10 minutos. A gelação do caldo de agarose pode ser usada como indicação para a gelação da amostra. Da mesma forma, variar os tempos de pré-incubação antes da incorporação de agarose permite a caracterização reprodutível de diferentes tamanhos de gotas. A escolha do buffer também é crítica¹⁴. É vital que o estoque de agarose seja preparado no mesmo tampão usado para preparar as amostras para evitar desajustes entre os tampões. O buffer deve ser aquele em que o sistema é conhecido por se separar em fase.

A sensibilidade à temperatura deve ser considerada para cada sistema. Muitos sistemas separadores de fase exibem comportamento de fase termo-reversível, conhecido como LLPS do tipo UCST/LCST. Portanto, uma exposição breve a temperaturas ligeiramente elevadas durante a mistura de agarose deve ser validada para garantir que não perturbe o comportamento de fase ou as propriedades das gotículas medidas. Se surgirem problemas, normalmente podem ser resolvidos refinando as condições de temperatura, minimizando o tempo de manuseio ou ajustando a concentração de agarose. Por exemplo, embora o estoque do LMA seja idealmente aquecido a 37 °C, os estoques do LMA ainda permanecerão líquidos entre 33 e 35 °C.

A solução de problemas é importante porque diferentes modos de falha podem surgir dependendo da amostra e da configuração experimental. Se gotas se dissolverem ao misturar com agarose, isso pode ser causado por LMA estar muito quente ou por descompasso no buffer. Nesse caso, o estoque LMA deve ser mantido exatamente na temperatura alvo ou alguns graus abaixo dela, e preparado em um tampão idêntico à proteína/RNA de interesse. Se ocorrer gelificação prematura na ponta da pipeta, pode ser devido ao LMA estar muito frio ou às pontas não estarem pré-aquecidas. Para evitar isso, as pontas e tubos devem ser pré-aquecidos a 37 °C, o operador deve trabalhar rapidamente e o bloco de aquecimento deve ser mantido na temperatura alvo. Se ocorrer umidade, coalescência ou sedimentação ao longo do tempo, pode ser devido ao gel ser muito esparso ou à gelificação desigual. Nesse caso, a concentração de LMA pode ser aumentada, e até mesmo a gelação em temperatura ambiente deve ser garantida. Se a solução de agarose contém partículas visíveis, pode ser devido à dissolução incompleta da agarose. Nesse caso, a agarose deve ser aquecida até ser totalmente transparente e misturada bem antes do uso (por exemplo, em vórtice). Se bolhas de ar forem introduzidas durante a mistura ou pipeteamento, elas podem interferir na imagem e levar à distribuição desigual do condensado. Para minimizar a formação de bolhas, as soluções devem ser misturadas suavemente, pipetando lentamente para cima e para baixo. Se for observada gelificação heterogênea ou distribuição desigual do condensado, isso pode ser devido à mistura insuficiente ou gradientes locais de temperatura durante a gelificação. Nesse caso, as amostras devem ser mantidas no bloco de aquecimento (ou banho-maria) até que todos os componentes sejam adicionados, misturados imediatamente, mas suavemente, e deixados solidificar sob condições de temperatura uniforme. Gradientes de temperatura acentuados devem ser evitados; A solidificação em temperatura ambiente é recomendada (e a solidificação na geladeira deve ser evitada). Em experimentos de longo prazo, a evaporação da amostra pode alterar as concentrações de soluto e as propriedades do condensado. Para minimizar a evaporação, as amostras devem ser seladas adequadamente e mantidas em um ambiente com controle de umidade sempre que possível.

Em contraste com métodos como a fixação de paraformaldeído, a incorporação de agarose não fixa quimicamente as amostras. Portanto, os condensados permanecem dinâmicos, o que é vantajoso para estudos funcionais, mas limita o armazenamento a longo prazo. Para períodos experimentais estendidos, devem ser tomadas precauções para evitar evaporação e mudanças no tampão, como mudanças de pH. Além disso, embora a agarose geralmente tenha pouca interação nesses ensaios, potenciais efeitos indiretos sobre a difusão ou o ambiente local devem ser considerados. Se houver suspeita de interações entre agarose-biomolécula, como ligação inespecífica da proteína à agarose, matrizes alternativas de hidrogel, como o foto-crosscross-crosse polietiloglicol diacrilato (PEG-DA), com tamanho de malha e porosidade correspondentes, podem ser consideradas. A ausência de interações deve ser validada medindo FRAP na presença e ausência da matriz.

Além da fixação química, estratégias de passivação superficial como superfícies revestidas com BSA, PEG ou surfactante e bicamadas lipídicas suportadas são comumente usadas para reduzir a adesão e a umediação do condensado. Embora essas abordagens minimizem efetivamente as interações superficiais, elas não impedem o movimento do condensado, a sedimentação ou a fusão. Portanto, a incorporação de agarose complementa esses métodos ao proporcionar imobilização física enquanto mantém a dinâmica do condensado, tornando-a particularmente útil para experimentos prolongados, imagens tridimensionais e medições quantitativas que exigem posicionamento estável da amostra. A escolha do método deve, portanto, ser guiada pelo objetivo experimental.

No geral, os hidrogéis de agarose fornecem um meio simples, porém eficaz, de estabilizar condensados em três dimensões. Isso previne a humedeção e fusão de gotículas sem perturbar detectivelmente as propriedades intrínsecas medidas nos sistemas representativos testados, permitindo experimentos e técnicas de longo prazo que exigem longos tempos de aquisição, como a espectroscopia^{RMN 15}. Embora esse método possa não ser adequado para todos os sistemas de separação de fase por várias razões, o método apresentado aqui é aplicável ao estudo de vários condensados biomoleculares e pode ser particularmente útil para investigar processos de maturação relevantes para mecanismos de doenças^{neurodegenerativas 17}.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1.5 mL tubes	any brand is OK	N/A
18-well chamber slides	ibidi	81816	for STORM
agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414	molecular biology grade
agarose, ultra pure	Invitrogen	16500500
channel slides	ibidi	80606	for microscopy
confocal microscope	Nikon	N/A
Cy5-dye, NHS chemistry	Jena Biosciences	FP-201-CY5	for labeling protein
D2O (deuterium oxide)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM buffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD protein	N/A	N/A	expressed recombinantly in our lab, as described in ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
heating block or water bath	any brand is OK	N/A	any make or model will do
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
image analysis software	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR spectrometer	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI room-temperature probe, see ref 13 for more details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR tube	Bruker	N/A	3 mm, glass
P10, P20, P200 and P1000 pipettes	any brand is OK	N/A
pCp-Cy3-dye	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	for labelling RNA
poly(A) RNA	N/A	N/A	in-house in vitro transcribed in our lab, length approx 50 nucleotides, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
s2m RNA	N/A	N/A	in-house in vitro transcribed in our lab, length 45 nucleotides, sequence: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
SARS-CoV-2 nucleocapsid protein	N/A	N/A	expressed recombinantly in our lab, as described in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
software for plotting (e.g. R)	R-Project	Version 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM microscope	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM plugin	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
tips for the used pipettes	any brand is OK	N/A
TopSpin	Bruker	Version 3.2 and 4.1
urea	Sigma-Aldrich	U5128