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Direcionamento de Cas9 para Realizar Experimentos de Resgate em Células HEK293 Knockout Transduzidas Estavelmente

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DOI:

10.3791/72172

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28 de agosto de 2026

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1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

Neste artigo

Resumo

Este protocolo elimina a proteína Cas9 após a edição do genoma para facilitar experimentos de resgate robustos em linhagens celulares com knockouts estavelmente transduzidas.

Resumo

A tecnologia de edição gênica CRISPR-Cas9 revolucionou a biologia molecular. Frequentemente, essa tecnologia é empregada para deletar um gene que codifica uma proteína de interesse. O fenótipo resultante fornece informações valiosas sobre a função da proteína. A importância funcional da proteína-alvo pode ser confirmada pela reintrodução da proteína para restaurar a função perdida (resgate). Isso é tipicamente realizado pela introdução do cDNA codificador da proteína em trans, utilizando um vetor de expressão. No entanto, em linhagens celulares knockout que expressam estavelmente o sistema CRISPR-Cas9, o plasmídeo de expressão recém-introduzido também pode ser clivado pela Cas9. O protocolo apresentado aqui fornece uma estratégia para contornar essa barreira potencial em experimentos de resgate. Essa abordagem é demonstrada usando células HEK293 nas quais o gene que codifica a proteína-âncora do ligase de ubiquitina E3, CUL4B, foi interrompido por CRISPR-Cas9. A transdução dessas células com um RNA guia (gRNA) direcionado ao transgene Cas9 integrado resultou na perda da proteína Cas9 detectável. A ablação da Cas9 permitiu a restauração da expressão e função de CUL4B após a introdução de um plasmídeo de expressão de CUL4B. Esses resultados fornecem a prova de conceito para uma abordagem amplamente aplicável ao estudo da função proteica por meio de experimentos de resgate.

Introdução

O CRISPR-Cas9 é uma poderosa ferramenta de edição genômica derivada de um sistema imunológico adaptativo naturalmente ocorrente que os procariontes utilizam para se defenderem da infecção por bacteriófagos. Devido ao seu baixo custo, alta taxa de sucesso e facilidade de uso, a tecnologia CRISPR-Cas9 superou outras ferramentas de edição genômica, como as nucleases com dedos de zinco (ZFNs) e as nucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs), para modificação genética precisa, particularmente em cultivo celular. O sistema de dois componentes é composto por uma nucleasse Cas9 e um RNA guia (gRNA). Por meio do emparelhamento de bases de Watson-Crick, o gRNA direciona a Cas9 a um alvo genômico adjacente a um motivo adjacente ao protospaçador (PAM). A sequência PAM atua como um sítio de reconhecimento crítico que autoriza a atividade da nucleasse. Nesse local, a Cas9 gera uma quebra de dupla fita (DSB). Na ausência de um modelo de reparo homólogo, a célula repara a DSB por meio da junção de extremidades não homólogas (NHEJ). Esse mecanismo de reparo pode introduzir inserções ou deleções (indels), levando a mutações por quadro de leitura deslocado e ao knockout funcional do gene-alvo. Assim, a interrupção do gene-alvo é alcançada pela introdução da Cas9 juntamente com um gRNA projetado. A sequência de 20 nucleotídeos do gRNA é complementar a um sítio genômico imediatamente adjacente ao PAM. A perda funcional resultante do gene-alvo revela os papéis específicos desse gene nos processos celulares1.

Um experimento de resgate, ou ensaio de complementação, envolve a restauração da proteína ausente para demonstrar a reversão do fenótipo observado. Essa abordagem atua como um controle rigoroso para descartar efeitos experimentais não intencionais, como aqueles resultantes de deleções 'fora do alvo' do CRISPR-Cas9. O método mais comum para reintroduzir uma proteína de interesse é por meio da transfeção ou transdução de um vetor de expressão exógeno. No entanto, esse DNA introduzido é suscetível ao mesmo direcionamento do CRISPR-Cas9 que o locus endógeno. Esse risco é particularmente alto em linhagens celulares transduzidas de forma estável, nas quais a expressão constitutiva da Cas9 é combinada com seleção por antibiótico para garantir uma população homogênea e consistente de knockout; uma estratégia frequentemente necessária em linhagens celulares difíceis de transfectar ou transduzir, como aquelas derivadas de linhagens imunes, hematopoéticas ou neuronais.

Um método para contornar o direcionamento do vetor é introduzir mRNA exógeno que codifica a proteína de interesse, contornando assim a clivagem mediada por Cas9 e a necessidade de transcrição nuclear. No entanto, em comparação com o DNA plasmidial, o mRNA sintético é mais caro de produzir, inerentemente menos estável e resulta em expressão altamente transitória. Além disso, requer modificações químicas específicas para evitar o disparo de respostas imunes inatas citosólicas2.

Para evitar o direcionamento do complexo Cas9/gRNA a plasmídeos de expressão, pode-se empregar a engenharia da base vacilante da sequência codificadora. Aproveitando a degenerescência do código genético, mutações sinônimas podem ser introduzidas para eliminar a sequência PAM necessária e/ou interromper a complementaridade com o gRNA, sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína codificada. No entanto, o uso de mutações sinônimas não está isento de riscos. Essas alterações podem introduzir um uso subótimo de códons, o que pode perturbar a cinética da tradução e levar ao mau dobramento proteico, redução da estabilidade do mRNA ou alterações prejudiciais na estrutura secundária do RNA3,4. Embora com menor frequência, outras consequências potenciais incluem a introdução de sinais de poliadenilação cripticos, a interrupção de motivos regulatórios pós-transcricionais e o aumento da densidade de CpG5,6. Além disso, sequências modificadas podem inadvertidamente ativar respostas celulares ao estresse se a estrutura do mRNA resultante interferir na progressão ribossomal7,8.

Além dos desafios associados ao uso de RNAs mensageiros sintéticos ou à engenharia de bases volúveis, a expressão constitutiva de Cas9 após a edição introduz diversas variáveis confundidoras em ensaios subsequentes. Como a especificidade da Cas9 pode ser imperfeita, a expressão persistente aumenta a probabilidade de clivagem fora do alvo, levando à aquisição cumulativa de mutações não intencionais ao longo do tempo9,10,11. Além disso, a vigilância genômica crônica e as quebras repetidas de dupla fita (DSBs) podem desencadear uma resposta contínua ao dano no DNA, levando, em última instância, as células ao arresto do ciclo celular, senescência ou apoptose12,13. Essa produção constitutiva também impõe uma carga metabólica, potencializando assim a deriva clonal, na qual células com baixa expressão superam células com alta expressão, resultando em níveis inconsistentes do transgene ao longo de sucessivas passagens. Por fim, por ser uma proteína procarionte de grande porte, a Cas9 pode induzir estresse por meio da sinalização imune inata ou sobrecarregar a maquinaria de proteostase do hospedeiro, desencadeando a resposta à proteína desdobrada14,15,16.

Para mitigar essas complicações, diversas estratégias de inibição transitória da Cas9 foram desenvolvidas, incluindo proteínas Anti-CRISPR derivadas de fagos (Acrs)17,18, inibidores de pequenas moléculas ou sistemas fundidos a degrons como os PROTACs19,20 e mecanismos de controle optogenético19,21. No entanto, essas abordagens introduzem dificuldades práticas que limitam sua utilidade em ensaios de resgate. As Acrs inibem por meio de mimetismo molecular e, portanto, exigem otimização estequiométrica para alcançar precisão. As Acrs também podem agravar os mesmos estresses proteostáticos e imunogênicos associados à superexpressão da Cas9. A modulação química introduz complexidades farmacocinéticas, potencial citotoxicidade e os chamados "efeitos gancho" associados aos PROTACs, nos quais concentrações excessivas de ligante impedem paradoxalmente a formação produtiva do complexo ternário22. As plataformas optogenéticas são limitadas pela fototoxicidade celular e pela necessidade de equipamentos especializados para manter uma entrega consistente de luz19,21. Importante ressaltar que, como esses métodos proporcionam apenas inibição temporária ou reversível, frequentemente são insuficientes para aplicações nas quais a Cas9 é expressa constitutivamente.

Em contraste, os sistemas CRISPR autoinativáveis oferecem uma solução permanente ao interromperem autonomamente e de forma definitiva o transgene Cas9 imediatamente após a edição bem-sucedida do gene alvo. Ao eliminar a atividade nucleásica residual, essa abordagem protege permanentemente os vetores de resgate subsequentes de clivagem, ao mesmo tempo que reduz o estresse proteostático de longo prazo e a deriva genômica fora do alvo. Embora as gRNAs autorrecrutáveis possam ser entregues por meio de transfeções transientes de ribonucleoproteínas ou baseadas em lipídios23,24, esses métodos estão sujeitos à diluição e à variação estocástica, resultando em uma população "mosaico" na qual algumas células escapam da inativação25,26,27.

Para superar essas limitações, o protocolo descrito aqui utiliza um sistema de entrega lentiviral para a autoinativação da Cas9, oferecendo vantagens práticas distintas na modificação de linhagens celulares estáveis. A entrega lentiviral garante a herança conjunta do transgene Cas9 e de seu regulador direcionado a si mesmo, prevenindo efetivamente o "escape por diluição" típico de populações que se dividem rapidamente. Além disso, a capacidade ampliada de carga dos vetores lentivirais permite a coexpressão de marcadores de seleção para assegurar uma população homogênea com deleção da Cas9, enquanto seu amplo tropismo, conferido pela pseudotipagem com VSV-G, facilita a entrega com alta eficiência em tipos celulares difíceis de transfectar25,28,29.

Como uma demonstração de prova de conceito deste método, este protocolo detalha a autoinativação da Cas9 para facilitar a recuperação fenotípica da proteína-estrutura do ligase de ubiquitina E3 CUL4B em células HEK293 com CUL4B knockout30.

Protocolo

Este estudo utilizou linhagens celulares humanas imortalizadas e bem estabelecidas (HEK293 e HEK293FT) e não envolveu participantes humanos, tecidos humanos primários nem experimentos com animais. Portanto, não foi necessária aprovação ética institucional.

1. Geração de Cas9-construto lentiviral de gRNA específico

  1. Insira a sequência específica de gRNA para Cas9 (Tabela 1) no vetor lentiviral pLentiGuide-Puro.
  2. Substitua o gene de resistência ao antibiótico por um que seja diferente do marcador de resistência usado para selecionar a linhagem celular CRISPR-Cas9 transduzida de forma estável.
  3. Verifique a inserção bem-sucedida e a fidelidade da sequência tanto do gRNA específico para Cas9 quanto do gene de resistência ao antibiótico substituído por meio de sequenciamento Sanger utilizando primers específicos para o vetor.
    NOTA: Neste protocolo, o gene de resistência à puromicina (PuroR) foi substituído pelo gene de resistência à higromicina B (HygroR) para gerar o vetor Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro. Outros genes de resistência a antibióticos alternativos incluem blasticidina S (BlastR), G418/Geneticina (NeoR) e zeocina (ZeoR).

2. Produção de lentivírus codificando gRNA específico para Cas9

  1. Semeie 2,5 × 106  células HEK293FT em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm.
    NOTA: Mantenha as células em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; glicose alta) suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) (doravante denominado cDMEM) e incube-as a 37 °C em incubadora umidificada contendo 5% de CO2. As células HEK293FT são utilizadas porque geram títulos de lentivírus mais altos do que outras linhagens celulares derivadas de HEK29331.
  2. Incube as células por 12 h até que alcancem pelo menos 60% de confluência antes da transfeção.
    CAUTELA: Realize todos os procedimentos envolvendo vetores lentivirais de terceira geração sob condições de Nível de Biossegurança 2 (NB-2), utilizando equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados e procedimentos de descontaminação aprovados (por exemplo, cabine de segurança biológica Classe II, contenção secundária e etanol 70%), conforme descrito por Pauwels et al32.
  3. Prepare uma mistura padrão de transfeção por fosfato de cálcio (CaPhos). Dilua 20 µg de DNA plasmidial total em água estéril para biologia molecular até um volume final de 450 µL. Adicione 50 µL de CaCl2 2,5 M, seguido por 500 µL de solução salina tamponada com HEPES 2× (HBS; pH 7,05), obtendo um volume final de 1 mL em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
    NOTA: Utilize DNA plasmidial predominantemente superenrolado e com sequência verificada, que atenda aos seguintes critérios de qualidade: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 e endotoxina <0,1 UE/µg. Prepare a mistura de transfeção utilizando uma proporção equimolar aproximada consistindo de 5 µg de Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5,6 µg de pLP1 (Gag/Pol), 3,8 µg de pLP2 (Rev) e 5,6 µg de pLP/VSVG (glicoproteína do vírus da estomatite vesicular).
  4. Misture bem a solução de transfeção por CaPhos por pipetagem suave.
  5. Adicione gota a gota 1 mL da mistura de transfeção por CaPhos ao cultivo de células HEK293FT.
  6. Balançe suavemente a placa de cultura para distribuir os complexos de transfeção uniformemente.
  7. Incube as células por 12 h.
    NOTA: A transfeção por fosfato de cálcio geralmente não é afetada por antibióticos de manutenção padrão33. No entanto, recomenda-se o uso de meio sem antibióticos para métodos de transfeção mais sensíveis, como a lipofecção, pois antibióticos policatiônicos podem interferir na formação do complexo DNA-lipídio34.
  8. Aspire e descarte o meio de cultura.
  9. Lave as células uma vez com 10 mL de PBS (solução salina tamponada com fosfato 1×) estéril à temperatura ambiente.
  10. Aspire e descarte o PBS.
  11. Adicione 10 mL de cDMEM fresco à temperatura ambiente.
  12. Retorne as células à incubadora e permita que as partículas lentivirais se acumulem no meio de cultura por 36 h.
    NOTA: Nessas condições, estima-se que o sobrenadante lentiviral não concentrado produza aproximadamente 1,0 × 106 unidades transdutoras (UT)/mL após 48 h, embora o título real deva ser determinado experimentalmente conforme descrito por Kutner et al.35 ou Barde et al.36. Armazene o sobrenadante lentiviral a −80 °C por até 2 anos. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, pois podem reduzir o título viral em aproximadamente 55%37,38,39,40.

3. Coleta do lentivírus codificando gRNA específico para Cas9 e transdução de células-alvo

  1. Plaque 1,0 × 106 células-alvo aderentes em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm tratada.
  2. Incube as células-alvo por 12 h antes da transdução com lentivírus.
    NOTA: As células-alvo são células HEK293 que expressam estavelmente a Cas9 de Streptococcus pyogenes, um gRNA direcionado ao gene CUL4B (Tabela 1) e um gene de resistência à puromicina (PuroR). Mantenha as células em DMEM completo (cDMEM) contendo 10 µg/mL de puromicina e verifique a interrupção de CUL4B por meio de análise de western blot antes da autoinativação da Cas9. Realize todos os experimentos subsequentes utilizando células HEK293ΔCUL4B de baixo número de passagens.
  3. Recolha o meio contendo lentivírus transferindo cuidadosamente o sobrenadante das células produtoras HEK293FT para um tubo cônico estéril de 15 mL, tomando cuidado para não perturbar a monocamada celular.
    NOTA: Descarte as células produtoras HEK293FT de acordo com as diretrizes estabelecidas de biossegurança32.
  4. Centrifugue o sobrenadante coletado a 1.000 × g durante 10 min à temperatura ambiente (TA) para sedimentar quaisquer células produtoras HEK293FT residuais.
  5. Aspire e descarte o meio de cultura das células HEK293ΔCUL4B previamente semeadas.
  6. Transfira 7 mL do sobrenadante lentiviral clarificado para a placa de 10 cm contendo as células HEK293ΔCUL4B. Evite perturbar o pellet no fundo do tubo de centrífuga e deixe pelo menos 1 mL de sobrenadante residual para minimizar o arraste de células produtoras.
    NOTA: Se desejado, filtre o sobrenadante através de um filtro de 0,45 µm para eliminar ainda mais as células produtoras residuais. Descarte o sobrenadante restante de acordo com as diretrizes de biossegurança32. Com um título estimado de 1,0 × 106 UT/mL, espera-se que uma inoculação de 7 mL produza uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 3,5 e 5,541.
  7. Incube as células HEK293ΔCUL4B transduzidas por 24 h para permitir a transdução e integração completas do lentivírus.
  8. Aspire e descarte o sobrenadante viral.
  9. Lave as células uma vez com 10 mL de PBS 1× estéril à temperatura ambiente.
  10. Aspire e descarte o PBS.
  11. Adicione 10 mL de cDMEM fresco à temperatura ambiente.
  12. Retorne as células ao incubador e cultive-as por quatro dias para permitir a expressão do transgene e a interrupção da Cas9.
    NOTA: Se o vetor lentiviral de gRNA da Cas9 não codificar um repórter fluorescente, transduza uma cultura sentinela paralela com um vetor lentiviral semelhante que expresse um repórter fluorescente. Utilize a cultura sentinela para estimar a eficiência de transdução e o momento da redução do gene-alvo por microscopia de fluorescência qualitativa ou citometria de fluxo quantitativa. Neste estudo, a expressão de GFP foi facilmente detectada por microscopia de fluorescência quatro dias após a transdução.

4. Seleção com antibiótico de transduzidos com gRNA específico para Cas9

OBSERVAÇÃO: Quatro dias após a transdução, as células-alvo devem estar em confluência ou próximo dela e precisarão ser transferidas para um vaso de cultura maior. Realize a transferência celular simultaneamente com o início da seleção com antibiótico.

  1. Aspire e descarte o meio de cultura das células HEK293ΔCUL4B .
  2. Lave as células uma vez com 10 mL de solução estéril de PBS 1× tamponado com fosfato, à temperatura ambiente.
  3. Aspire e descarte o PBS.
  4. Adicione 2 mL de solução estéril de tripsina-EDTA à temperatura ambiente ao recipiente de cultura.
  5. Incube as células por 5 min para promover a dessanexação.
  6. Adicione 8 mL de cDMEM à temperatura ambiente para neutralizar a tripsina.
  7. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico estéril de 15 mL.
  8. Triture a suspensão celular de 15 a 20 vezes para dissociar completamente os agregados celulares.
  9. Centrifugue as células a 200 × g durante 10 min à temperatura ambiente.
  10. Enquanto as células estão sendo centrifugadas, prepare um frasco de cultura de tecidos T150 contendo 20 mL de cDMEM suplementado com 250 µg/mL de higromicina B.
    NOTA: A concentração de higromicina B necessária para seleção pode variar entre os tipos celulares. Realize uma curva de morte utilizando 50–500 µg/mL de higromicina B para determinar a concentração mínima necessária para eliminar todas as células não transduzidas em 7–10 dias. Se um marcador de resistência a antibiótico alternativo for utilizado no vetor Cas9 gRNA, realize uma curva de morte utilizando 2–10 µg/mL de blasticidina S, 400–800 µg/mL de G418/Geneticina ou 50–400 µg/mL de zeocina.
  11. Aspire e descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
  12. Resuspenda o pellet celular em 10 mL de cDMEM suplementado com 250 µg/mL de higromicina B.
  13. Transfira a suspensão celular de 10 mL para o frasco T150 preparado contendo 20 mL de meio de seleção.
  14. Balançe suavemente o frasco para distribuir as células uniformemente.
  15. Incube as células sob seleção por três dias.
  16. No dia 3 da seleção, aspire o meio de seleção e substitua por 30 mL de cDMEM fresco suplementado com 250 µg/mL de higromicina B.
    NOTA: A substituição do meio de seleção remove células mortas não aderidas, repõe nutrientes e mantém a atividade do antibiótico.
  17. Continue a incubação até que a monocamada de células sobreviventes atinja aproximadamente 90% de confluência, geralmente após mais quatro dias.

5. Validação da eliminação da Cas9 e resgate in trans do CUL4B

OBSERVAÇÃO: Assim que as células atingirem cerca de 90% de confluência, confirme a ablação de Cas9 nos experimentos iniciais e imediatamente criopreserve a população celular remanescente42. Essa abordagem minimiza o desenvolvimento de mecanismos compensatórios secundários.

  1. Semente de HEK293 em passagem inicialΔCUL4B células que expressam de forma estável um gRNA direcionado ao Cas9 (doravante referidas como HEK293ΔCUL4BΔcas9) em quatro poços de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços, com densidade de 2,5 × 105 células por poço
  2. Semente de HEK293ΔCUL4B células em quatro poços de uma placa separada de 6 poços. Semeie células parentais HEK293 em pelo menos um poço adicional para servir como controle.
    OBSERVAÇÃO: Utilize as HEK293ΔCUL4B e culturas parentais de HEK293 como controles para a expressão de Cas9 e CUL4B, respectivamente.
  3. Incubar todas as culturas por 12 h para permitir a completa adesão celular e proliferação ativa.
  4. Preparar misturas de transfeção de fosfato de cálcio (CaPhos) contendo 0, 0,5, 1,0 ou 2.0 µg de pCMV-FLAG-CUL4B. Ajuste cada mistura para um total constante de 10 µg DNA plasmidial adicionando um vetor pCMV vazio.
  5. Dilua cada mistura de DNA em água estéril de grau biologia molecular para um volume final de 180 µL, adicione 20 µL de 2,5 M de CaCl2, e então adicione 200 µL de 2× salina tamponada com HEPES (HBS; pH 7,05) para obter um volume final de 400 µL em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
    OBSERVAÇÃO: Ao utilizar plasmídeos de expressão controlados por promotores fortes (por exemplo, CMV), realize uma titulação de DNA para obter níveis de expressão proteica comparáveis aos de expressão endógena. Utilize DNA plasmidial predominantemente superenrolado e com sequência verificada, com valores de A260/A280 entre 1,8 e 2,0, valores de A260/A230 entre 2,0 e 2,2, e nível de endotoxina de <0,1 UE/µg.
  6. Misture cada solução de transfeção CaPhos cuidadosamente por pipetagem suave.
  7. Adicione 200 µL de cada mistura de transfeção gota a gota no poço designado contendo HEK293ΔCUL4BΔcas9 células. Troque as ponteiras da pipeta entre as amostras para evitar contaminação cruzada.
  8. Adicione o restante 200 µL de cada mistura de transfeção correspondente, gota a gota, para o poço designado contendo HEK293ΔCUL4B células
  9. Incubar as culturas transfectadas durante 12 h.
  10. Aspire o meio de cultura de cada poço.
  11. Lave as células uma vez com 1 mL de solução estéril à temperatura ambiente× PBS.
  12. Aspire e descarte o PBS.
  13. Adicione 2 mL de cDMEM fresco à temperatura ambiente a cada poço.
  14. Incube as culturas por mais 24 h para permitir a expressão de CUL4B e respostas funcionais downstream.
  15. Colete as células utilizando procedimentos padrão de tripsinização.
  16. Transfira cada suspensão celular para um tubo individual de microcentrífuga de 1,5 mL.
  17. Lave cada suspensão celular uma vez com 1× PBS.
  18. Pulse brevemente as amostras a 14.000 × g à temperatura ambiente para centrifugar as células.
  19. Aspire e descarte o sobrenadante de PBS.
    ATENÇÃO: βO β-mercaptoetanol é um irritante volátil da pele e do sistema respiratório, com odor forte. Manipule as soluções estoque em capela química certificada, utilizando equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas resistentes a produtos químicos, jaleco de laboratório e óculos de segurança. Descarte ponteiras, tubos e resíduos contaminados de acordo com as diretrizes institucionais para resíduos perigosos.
  20. Lise cada pellet celular diretamente em 200 µL Tampão de amostra Laemmli suplementado com 5% (v/v) β-mercaptoetanol
  21. Desnaturar as proteínas aquecendo as amostras em 95 °C por 15 min.
  22. Resolva 20–40 µg de proteína total por poço por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) padrão.
  23. Transfira as proteínas resolvidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF).
  24. Bloqueie a membrana por 30 min à temperatura ambiente utilizando o tampão de bloqueio.
    OBSERVAÇÃO: Prepare o tampão de bloqueio utilizando 5% (p/v) de leite desnatado em pó ou 5% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA) dissolvidos no tampão de lavagem padrão (0,1% de Tween 20 em qualquer um dos 1× Salina tamponada com Tris ou 1× PBS).
  25. Lave a membrana três vezes por 10 min cada utilizando tampão de lavagem padrão.
  26. Incubar a membrana com anticorpos primários contra CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 ou α-TUBULINA por 12 h em 4 °C com agitação suave.
    OBSERVAÇÃO: Dilua os anticorpos primários na proporção de 1:1.000 no tampão de lavagem padrão.
  27. Remova a solução de anticorpo primário e lave a membrana três vezes, por 10 min cada, utilizando tampão de lavagem padrão.
  28. Incubar a membrana com o anticorpo secundário anti-murino ou anti-coelho IgG conjugado à peroxidase do rabanete (HRP) apropriado durante 12 h a 4 °C com agitação suave.
    OBSERVAÇÃO: Dilua os anticorpos secundários 1:3.000 em tampão de bloqueio.
  29. Remova a solução do anticorpo secundário e lave a membrana três vezes, por 10 min cada, utilizando o tampão de lavagem padrão.
  30. Aplique o substrato quimioluminescente aumentado (ECL) uniformemente sobre a membrana e incube por 1 min.
  31. Capture os sinais quimioluminescentes utilizando um sistema de imagem digital.
    OBSERVAÇÃO: Caso desejado, confirme a interrupção gênica bem-sucedida por meio de sequenciamento Sanger da região genômica direcionada após amplificação por PCR do DNA genômico isolado43.

Resultados

Para gerar linhagens de "knockout" com Cas9 inativada para reconstituição experimental, produziu-se lentivírus codificando um RNA guia direcionado à Cas9 (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro) em células HEK293FT utilizando plasmídeos de empacotamento padrão (pLP1, pLP2 e pLP/VSVG). O sobrenadante viral resultante foi coletado e usado para transduzir as células-alvo. A sobrevivência durante a seleção com higromicina B confirmou a transdução lentiviral bem-sucedida, e análises subsequentes de western blot confirmaram a ablação da Cas9 (Figura 1).

A proteína CUL4B foi facilmente detectada em células HEK293 parentais, mas ausente em células HEK293 transfectadas com vetor vazioΔCUL4B e HEK293ΔCUL4BΔcas9 células. Conforme esperado com a perda de CUL4B, WDR5 e CDC6 exibiram aumentos e diminuições, respectivamente, na expressão em estado estacionário, confirmando a interrupção da função de CUL4B. A proteína Cas9 foi detectada em HEK293ΔCUL4B células, mas era indetectável nas células HEK293 parentais e HEK293ΔCUL4BΔcas9 células, confirmando a ablação bem-sucedida da Cas9. Como esperado, a transfeção do plasmídeo de expressão de CUL4B em HEK293ΔCUL4B células resultou apenas em restauração mínima da expressão da proteína CUL4B. Em contraste, observou-se expressão robusta de CUL4B após transfeção de HEK293ΔCUL4BΔcas9 células, acompanhada pela restauração da expressão proteica downstream, evidenciada pela redução nos níveis de WDR5 e aumento nos níveis de CDC6. Em conjunto, esses achados demonstram que a ablação de Cas9 permite a restauração eficiente da expressão e função de CUL4B, impedindo a clivagem mediada por Cas9 do plasmídeo de resgate (Figura 2).

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Figura 1: Fluxo experimental para a ablação estratégica da Cas9 e validação do resgate de CUL4B. Este fluxo descreve a geração de células submetidas a interrupção gênica CRISPR com ablação da Cas9 por meio da co-transfecção de células produtoras HEK293FT com pLP1, pLP2, pLP/VSVG e um construto Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro por transfeção com fosfato de cálcio. O sobrenadante lentiviral resultante é coletado, centrifugado para remoção das células produtoras residuais e utilizado para transduzir as células-alvo. Após a seleção, a ablação bem-sucedida da Cas9 é confirmada por meio de análise de western blot, estabelecendo uma linhagem celular com interrupção gênica completa, pronta para a reconstituição experimental de CUL4B. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Recuperação da expressão e função de CUL4B em células HEK293 editadas por CRISPR-Cas9. (A) Esquema experimental do protocolo de transfeção. Células HEK293ΔCUL4B   e HEK293ΔCUL4BΔcas9 foram transfectadas com um vetor vazio ou com quantidades crescentes de pCMV-FLAG-CUL4B. As células foram coletadas 36 h após a transfeção, e as proteínas dos lisados foram separadas por SDS-PAGE. (B) Análise por Western blot da eficiência de recuperação e controles funcionais downstream. As proteínas indicadas foram visualizadas por Western blot. WDR5 e CDC6 foram utilizados como controles da função de CUL4B. α-TUBULINA foi utilizada como controle de carregamento. Células HEK293 parentais foram utilizadas como controle para expressão basal. Os blotagens são representativos de experimentos replicados (n = 2). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gene AlvoSequência gRNA (5′→3′)PAM (5′→3′)Localização do AlvoDescrição do Alvo
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Exon 3Região N-terminal do ORF humano CUL4B para interrupção por deslocamento do quadro de leitura
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)Região interna conservada do transgene cas9 para induzir inserções e deleções autoinativadoras

Tabela 1: Sequências de RNA guia CRISPR-Cas9 e especificações dos alvos genômicos.

Discussão

Este protocolo permitiu a restauração robusta da expressão e função da proteína-alvo em linhagens celulares nocaute editadas por CRISPR-Cas9 nas quais a Cas9 foi ablatada após a edição. Uma observação notável deste trabalho é o grau substancial em que a expressão constitutiva da Cas9 suprime a expressão de transgene mediada por plasmídeo. A força deste protocolo reside na sua capacidade de recuperar tanto a proteína perdida quanto o fenótipo associado. Este método também estabelece uma estrutura para a exploração fenotípica de uma ampla variedade de alterações proteicas. Por exemplo, a introdução de uma variante fosfomimética (por exemplo, serina para ácido aspártico) pode fornecer informações valiosas sobre o papel dessa modificação pós-traducional sem o fundo confundidor da proteína nativa.

Consequentemente, este protocolo é amplamente aplicável a linhagens celulares aderentes padrão (por exemplo, HeLa, A549) e em suspensão (por exemplo, Jurkat, THP-1). No entanto, esse enfoque de seleção sequencial pode ser impraticável para células primárias ou não divididas (por exemplo, neurônios primários ou macrófagos). Nesses sistemas sensíveis, a rápida eliminação de células espectadoras não transduzidas libera detritos citotóxicos e sinais de estresse pró-apoptóticos no microambiente compartilhado, induzindo toxicidade indireta46,47. Pode igualmente falhar em linhagens de câncer altamente adaptáveis e aneuploides (por exemplo, glioblastoma U87 ou melanoma A375) que tendem a escapar de fenótipos mediados por CRISPR por meio de rearranjos cromossômicos rápidos ou da seleção rápida de clones resistentes preexistentes48,49. Em última análise, a adequação depende da capacidade da linhagem celular tolerar a carga metabólica da expressão por dois vetores, resistir a essas pressões seletivas indiretas e manter cinética de crescimento estável ao longo do protocolo de várias semanas.

Embora esta abordagem sirva como uma prova de conceito versátil para a maioria das linhagens celulares, sua implementação exige um equilíbrio cuidadoso entre eficiência de entrega e integridade genômica. Conforme descrito, o uso da entrega por lentivírus para gRNA direcionado a 'si mesmo' garante uma população homogênea com Cas9 abolida, especialmente em células de difícil transfeção. No entanto, o risco de mutagênese por inserção decorrente da integração semi-aleatória permanece uma preocupação. Esses riscos podem ser controlados mediante a otimização da MOI. Em linhagens permissivas como HEK293, uma MOI de 1–5 alcança alta saturação enquanto minimiza a mutagênese e a citotoxicidade induzidas pela integração41. Em contraste, células imunes ou neuronais refratárias geralmente exigem MOIs de 10–50, frequentemente necessitando potencializadores como polibreno e/ou spinoculação para atingir eficiências semelhantes50,51,52,53,54,55.

Essa compensação técnica se estende à escolha entre populações policlonais e monoclonais. As células HEK293ΔCUL4BΔcas9 geradas aqui são policlonais, uma escolha que acelera os cronogramas experimentais ao contornar a expansão demorada de semanas necessária para subclonagem a partir de uma única célula. Além disso, um pool policlonal capta o fenótipo médio da cultura, atuando efetivamente como amortecedor contra artefatos clonais ou problemas específicos de integração no sítio. Embora linhagens monoclonais sejam mais propensas a gerar resultados consistentes devido à homogeneidade genética, os resultados apresentados aqui sugerem que a seleção policlonal é uma alternativa viável e muitas vezes melhor quando priorizam-se velocidade e representatividade da população.

A estabilidade temporal do fenótipo resultante também pode ser uma variável crítica. No sistema apresentado aqui, o impacto regulatório do CUL4B sobre o WDR5 e o CDC6 diminuiu ao longo de passagens sucessivas das linhagens celulares com deleção, correlacionando-se com uma upregulação compensatória do parólogo CUL4A (dados não mostrados). Isso reflete as descobertas de Nakagawa et al., que demonstraram que o CUL4A pode parcialmente restaurar a função do CUL4B em células com esgotamento de CUL4B44. Essa compensação homeostática é comum na biologia celular, particularmente ao direcionar uma proteína com alta homologia estrutural e redundância funcional em relação a outras proteínas celulares.

Para contornar esses mecanismos compensatórios secundários, duas abordagens estratégicas distintas podem ser empregadas, dependendo dos objetivos experimentais e da linhagem celular utilizada. Para pesquisadores que priorizam eficiência ou trabalham com linhagens celulares altamente adaptativas, é essencial um cronograma experimental condensado. Essa estratégia envolve a validação imediata da perda da proteína alvo, idealmente assim que o cultivo atingir 90% de confluência após a seleção, seguida rapidamente por Cas9 autoinativável direcionado e ensaios funcionais. Ao adotar esse fluxo de trabalho acelerado, é mais provável capturar as consequências biológicas primárias do knockout antes que a maquinaria homeostática celular tenha tempo suficiente para aumentar a expressão de parálogos redundantes ou de outra forma mascarar o fenótipo resultante.

Alternativamente, para estudos que exigem estabilidade de longo prazo ou experimentos de resgate de alta precisão, particularmente em modelos refratários à transfeção, como células imunes e neuronais, um sistema controlado por tetraciclina (Tet-Ligado/Desligado) oferece uma solução viável56,57. Embora a implementação dessa estrutura induzível exija rodadas adicionais de transdução lentiviral e o uso de marcadores distintos de resistência a antibióticos, ela fornece um mecanismo para a restauração sustentada da proteína-alvo, estabilizando o ambiente celular antes de desencadear eventos transitórios de "perda e resgate" mediados por doxiciclina57.

Divulgações

Os autores utilizaram o Google Gemini para auxiliar no aprimoramento da terminologia técnica e na edição do manuscrito. A inteligência artificial foi usada como uma ferramenta para melhoria linguística e não contribuiu para a síntese original dos dados, a concepção do estudo ou a redação inicial do texto. Os autores analisaram e editaram a saída e assumem total responsabilidade pelo conteúdo do manuscrito final. Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por recursos iniciais fornecidos pelo Le Moyne College, pelo Comitê de Pesquisa e Desenvolvimento do Le Moyne College, pelo Comitê de Pesquisa de Estudantes do Le Moyne College, pelo Fundo do Centro Jesuíta Walter L. '66 e MaryAnne Poland para Inovação em Pesquisa e Ensino, e pelo Departamento de Ciências Biológicas e Ambientais do Le Moyne College. Os autores agradecem pelo uso do BioRender.com na elaboração das ilustrações gráficas. A Figura 1 foi criada no BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), e o painel superior da Figura 2 foi criado no BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
anticorpo anti-Cas9Cell Signaling65832Este anticorpo monoclonal de camundongo fornece detecção específica de Cas9 de S. pyogenes em lisados humanos, tornando-o ideal para verificar a eliminação de Cas9 mediada por gRNA autodirigida.
anticorpo anti-CDC6Cell Signaling3387Este anticorpo monoclonal de coelho fornece detecção específica de CDC6 humano, tornando-o ideal para monitorar os impactos funcionais downstream de CUL4B.
anticorpo anti-CUL4BSigma-AldrichC9995Este anticorpo policlonal de coelho purificado por afinidade fornece detecção específica de CUL4B humano sem reagir cruzadamente com seu parólogo estreitamente relacionado CUL4A.
anticorpo secundário conjugado a IgG anti-camundongo ligado à HRPCell Signaling7076Este anticorpo de IgG anti-camundongo de cavalo é conjugado à peroxidase de rábano (HRP) e otimizado para detecção quimioluminescente de anticorpos primários monoclonais de camundongo.
anticorpo secundário conjugado a IgG anti-coelho ligado à HRPCell Signaling7074Este anticorpo de IgG anti-coelho de cabra é conjugado à peroxidase de rábano (HRP) e otimizado para detecção quimioluminescente de anticorpos primários policlonais e monoclonais de coelho.
anticorpo anti-WDR5Cell Signaling13105Este anticorpo monoclonal de coelho fornece detecção específica de WDR5 humano, tornando-o ideal para monitorar os impactos funcionais downstream de CUL4B.
anticorpo anti-α-TUBULINACell Signaling3873Este anticorpo monoclonal de camundongo direcionado à alfa-tubulina humana é ideal como controle uniforme de carga para normalização em análises de western blot.
Kit de Transfecção por Fosfato de CálcioThermoFisher ScientificK278001Este kit fornece reagentes de transfeção transitória eficientes, otimizados para a produção escalonável e economicamente viável de vetores lentivirais em células produtoras aderentes HEK293FT.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation custom synthesissequência de gRNA Cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, sequência PAM: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation custom synthesissequência de gRNA Cas9: CGTGATCACCGACGAGTACA, sequência PAM: AGG
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco GibcoD5796Este meio de alta concentração de glicose, suplementado com L-glutamina e piruvato de sódio, é otimizado para sustentar o crescimento, viabilidade e estabilidade metabólica em linhagens celulares mamíferas de rápida proliferação (por exemplo, HEK293FT).
Soro Bovino Fetal, Premium (Inativado pelo Calor)Corning35-016-CVEste soro de qualidade premium, inativado pelo calor, fornece fatores de crescimento e hormônios essenciais, minimizando ao mesmo tempo a citotoxicidade mediada pelo complemento em linhagens celulares mamíferas.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573Esta linhagem celular bem caracterizada de rim embrionário humano é altamente transfectável e serve como modelo robusto e padrão para investigar fenótipos de eliminação gênica e estruturas de resgate proteico.
Células HEK293FT ThermoFisher ScientificR70007Esta variante de crescimento rápido e altamente transfectável da linhagem de rim embrionário humano expressa estavelmente o antígeno T grande do SV40, tornando-a otimizada para maximizar os títulos virais durante a produção de vetores lentivirais.
Higromicina BsigmaaldrichH7772Este antibiótico aminonucleosídeo é utilizado como agente seletivo em cultura celular de mamíferos para isolar transductantes estáveis que expressam o marcador de resistência à higromicina.
plasmídeo pCLIP-All-hCMV-Puro (gRNA CUL4B)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bsequência de gRNA CUL4B: ATCAAACCCTACAAACTCCA, sequência PAM: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/AEste plasmídeo de expressão em mamíferos utiliza um promotor de citomegalovírus (CMV) para induzir a expressão constitutiva de uma proteína Cullin 4B (CUL4B) marcada com FLAG e é um presente de Jianping Jin.
Vetor de Expressão Mamífero pCMV-M1Addgene23007Controle de vetor de expressão vazio (um presente de Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Este vetor de transferência lentiviral induz a expressão de um gRNA personalizável pelo promotor U6 humano, juntamente com um marcador de resistência à puromicina conduzido pelo promotor EF-alfa, para direcionamento CRISPR em células que expressam Cas9, e é um presente de Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 Vetor lentiviral que codifica GFP para avaliar a eficiência de transdução (um presente de Kevin Janes)
PuromicinaSigma-AldrichP8833Este antibiótico aminonucleosídeo é utilizado como agente seletivo em cultura celular de mamíferos para isolar transductantes estáveis que expressam o marcador de resistência à puromicina.
Solução Salina Tamponada com Fosfato Estéril (PBS)Corning21-040-CVEsta solução padrão de sais balanceados é utilizada para lavar monocamadas celulares a fim de remover efetivamente traços de meio de cultura, proteínas séricas ou enzimas sem perturbar a pressão osmótica ou a viabilidade celular.
Tripsina EDTA 1XCorning25-051-CIEsta solução enzimática de dissociação padrão é utilizada para destacar células mamíferas aderentes dos recipientes de cultura clivando ligações peptídicas, enquanto o EDTA quelata cátions bivalentes para romper a adesão intercelular.
Mistura de Embalagem Lentiviral ViraPowerThermoFisher ScientificK497500Esta mistura otimizada de plasmídeos de embalagem (pLP1, pLP2 e pLP/VSVG) é utilizada para co-transfecção em células produtoras, facilitando a montagem de alto título e a produção de vetores de expressão lentivirais incapazes de replicação.

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