Imagem do Transporte de Líquido Cerebrospinal por Ressonância Magnética com Contraste via Infusão Intraventricular em Roedores

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo de cânulação intraventricular e infusão de traçador adaptado para estudos de ressonância magnética com contraste dinâmico (DCE-MRI) em roedores. O protocolo permite a administração contínua do traçador durante a aquisição de imagens, possibilitando o mapeamento de todo o cérebro do transporte do traçador e sua eliminação a partir do cérebro em uma única sessão de imagem contínua e ininterrupta.

Resumo

A cânulação intraventricular (ICV) permite a administração de traçadores exógenos ou agentes terapêuticos diretamente no ventrículo lateral, origem da via de circulação do líquido cefalorraquidiano (LCR). As moléculas infundidas são transportadas pelo fluxo em massa do LCR através dos compartimentos ventriculares até o espaço subaracnóideo e, posteriormente, entram no parênquima cerebral via o espaço perivascular. No entanto, os métodos convencionais de cânulação ICV geralmente utilizam cânulas ferromagnéticas, incompatíveis com estudos de RM e que, portanto, exigem a infusão fora do escâner e a remoção da cânula antes da aquisição de imagens. O tempo necessário para o transporte do animal e o preparo para a imagem muitas vezes resulta na perda da fase inicial — e potencialmente mais crítica — do transporte do traçador. Aqui, descrevemos um protocolo de cânulação e infusão ICV compatível com RM para roedores, que permite a administração contínua do traçador durante a aquisição dinâmica de imagens por RM. A linha de infusão é construída inteiramente com materiais não magnéticos, possibilitando a aquisição ininterrupta de imagens dentro de uma única sessão. Esta abordagem é particularmente adequada para estudos de RM com contraste dinâmico da dinâmica do LCR, transporte gliolinfático, eliminação de solutos e administração de fármacos por via intratecal.

Introdução

O cérebro é um dos órgãos mais metabolicamente ativos e dinâmicos do corpo, gerando continuamente produtos residuais que devem ser eficientemente eliminados para manter a função neural normal¹. O acúmulo de resíduos metabólicos é uma característica marcante da neurodegeneração e do envelhecimento cerebral². O sistema gliatático desempenha um papel central nesse processo de eliminação, facilitando a remoção de subprodutos metabólicos e resíduos tóxicos por meio do fluxo em massa do líquido cefalorraquidiano (LCR) e da troca entre o LCR e o líquido intersticial (ISF)^3,4,5, um processo facilitado pelos canais de água aquaporina-4 (AQP4) localizados nos pedicelos astrocíticos⁶. Um entendimento substancial sobre a dinâmica do LCR foi obtido por meio do estudo do transporte de diversos traçadores de LCR. A ressonância magnética dinâmica com contraste (DCE-MRI) utilizando agentes de contraste à base de gadolínio (GBCAs) é particularmente adequada para a avaliação abrangente do transporte de traçadores no cérebro^7,8. A relevância clínica dessa abordagem foi demonstrada por trabalhos translacionais em humanos. A administração intratecal de GBCAs seguida por ressonâncias magnéticas seriadas foi utilizada para avaliar a dinâmica do LCR no cérebro humano⁹. Trabalhos posteriores demonstraram o transporte abrangente de traçadores no cérebro seguido pela eliminação durante a noite¹⁰. Essa abordagem foi recentemente aplicada para revelar o comprometimento do transporte de traçadores periarterial em indivíduos com capacidade reduzida de reserva volume-pressão intracraniana, bem como em pacientes com hidrocefalia idiopática de pressão normal¹¹. Esses estudos estabelecem a DCE-MRI do transporte de traçadores de LCR como uma abordagem clinicamente translacional e incentivam o desenvolvimento de métodos pré-clínicos rigorosos e reprodutíveis para investigação mecanicista da regulação da dinâmica do LCR e da eliminação de resíduos.

A cânulação na cisterna magna (ICM) é comumente usada em estudos glicinfáticos para a administração de traçadores¹². No entanto, apenas aproximadamente 20% dos contraste paramagnéticos (GBCAs) administrados via esta rota são transportados para a substância parenquimatosa do cérebro, com a maioria drenando diretamente para a medula espinhal ou para os linfáticos⁸. Este método também apresenta risco de lesão do cerebelo ou tronco encefálico, e a fixação da cânula para estudos longitudinais permanece tecnicamente desafiadora. A cânulação intraventricular (ICV) surgiu como uma alternativa mais robusta^13,14,15. Um estudo recente demonstrou sua reprodutibilidade e vantagens fundamentais na administração de traçadores fluorescentes, incluindo a fixação estável da cânula, que permite o movimento livre do animal e suporta injeções repetidas de traçadores em estudos longitudinais¹³.

Apesar dessas vantagens, os protocolos existentes de cânula para infusão intracerebroventricular (ICV) não são diretamente compatíveis com estudos de RM¹⁶. Como a cânula ICV exige a penetração do parênquima cerebral, normalmente utiliza cânulas ferromagnéticas que geram artefatos de suscetibilidade graves nas imagens de RM. Como resultado, a infusão do traçador deve ser realizada fora do escâner, com a remoção da cânula antes da transferência do animal para a aquisição de imagens. Um fluxo de trabalho típico envolve a aquisição de um exame basal, a remoção do animal para cânula e infusão do traçador, e posterior reposicionamento do animal para exames dinâmicos subsequentes. Esse fluxo de trabalho interrompido impede a aquisição contínua referenciada à linha basal e introduz desalinhamentos no reposicionamento que podem comprometer a análise cinética voxel a voxel. Mais importante ainda, como a fase inicial de captação é tipicamente a porção mais dinâmica e transitória da cinética do traçador, realizar a transferência do animal e a configuração do escâner durante esse período resulta na perda dos dados mais informativos.

Aqui, apresentamos um protocolo que supera essas limitações ao integrar uma linha de infusão intracerebroventricular compatível com ressonância magnética com a capacidade de administração de agente de contraste durante a aquisição de imagens, permitindo a aquisição contínua e dinâmica de imagens por RM em roedores. Esta abordagem permite o mapeamento quantitativo e de todo o cérebro do transporte de traçadores no LCR dentro de uma única sessão de imagem contínua e ininterrupta. Este protocolo é particularmente adequado para o estudo da dinâmica do LCR em todo o cérebro, do transporte glicinfático e da cinética de eliminação de solutos. Embora descrito aqui para ratos adultos, o protocolo pode ser adaptado para camundongos com ajustes apropriados nas coordenadas de cânula e nos parâmetros de infusão¹⁵.

Protocolo

O protocolo descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Case Western Reserve University (A-3145-01-2023-0015), de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Política do Serviço de Saúde Pública sobre o Cuidado e Uso Humanitário de Animais de Laboratório. Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da linha de infusão

1. Corte um segmento de 30 mm de cânula de cobre e um comprimento de 2 m de tubo de polietileno (PE) usando tesoura serrilhada.
2. Sob microscópio, alargue suavemente uma extremidade do tubo de PE com uma agulha de 30 G, em seguida insira a cânula de cobre na extremidade alargada e fixe a junção com adesivo de cianocrilato. Conecte a extremidade oposta do tubo de PE a uma agulha de 30 G.
   NOTA: O cobre é altamente dúctil; tenha cuidado para não colapsar a luz durante o corte. Evite deformar a cânula ou perfurar o tubo durante a montagem. O comprimento do tubo de PE deve permitir a colocação da bomba de seringa fora do campo magnético periférico do scanner.
3. Encha a montagem da cânula e do tubo com solução de traçador desgaseificada e conecte-a a uma seringa Hamilton de 50 µL. Envolva a ponta da seringa com fita veda-rosca de politetrafluoretileno (PTFE) para evitar vazamentos. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar durante este processo.
4. Monte a seringa Hamilton na bomba de seringa e aspire um volume adicional de 30 µL de solução de traçador para dentro da seringa.

2. Procedimento de cânula

1. Pese o rato e anestesie-o com uma injeção intraperitoneal de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confirme a profundidade adequada da anestesia pelo reflexo de pinçamento do dedo do pé. Suplemente com um terço da dose inicial, se necessário, e verifique novamente antes de prosseguir.
2. Apare a cabeça e o pescoço, remova os pelos soltos e esterilize a pele exposta com discos de etanol 70%.
3. Fixe o rato em um aparelho estereotáxico e coloque uma almofada térmica coberta com papel absorvente sob o animal. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para prevenir o ressecamento da córnea.
4. Ajuste o prendedor nasal para nivelar o crânio. Faça uma incisão mediana e retrai a pele com quatro clipes hemostáticos para expor o bregma e o lambda. Aplique peróxido de hidrogênio a 3% sobre o crânio para remover o periósteo residual e realçar a visibilidade dos pontos de referência.
   NOTA: O nivelamento preciso do crânio é essencial para o posicionamento reprodutível da cânula. Como medida prática de controle de qualidade, compare as coordenadas mediolaterais (ML) e dorsoventrais (DV) no bregma e no lambda: se o crânio estiver corretamente nivelado, a diferença entre os dois pontos de referência não deve exceder 0,2 mm em qualquer um dos eixos ML ou DV.
5. Acople a broca elétrica com uma ponteira fina ao braço estereotáxico e certifique-se de que o braço esteja firmemente travado.
6. Posicione a ponteira no bregma, depois mova 0,7 mm para posterior e 1,4 mm para lateral direita. Abaixe a ponteira até que entre em contato com a superfície do crânio e registre a coordenada DV.
7. Sob observação microscópica, avance a broca em incrementos de 0,1 mm. Interrompa imediatamente ao perfurar o crânio (a espessura típica do crânio em ratos adultos é de 0,3–0,4 mm).
8. Substitua a broca pela cânula previamente carregada no braço estereotáxico. Avance brevemente a bomba de infusão até que o fluido apareça na ponta da cânula, confirmando uma passagem livre para o fluido.
9. Verifique se a cânula está montada perpendicularmente à superfície do crânio, depois alinhe-a sobre o orifício. Avance a cânula a 0,1 mm/s até uma profundidade final-alvo de 3,5 mm abaixo da superfície dural.
10. Aplicar uma gota de adesivo tecidual na interface entre a cânula e o crânio. Após a cura, feche a incisão no couro cabeludo com pontos e dobre suavemente a cânula de cobre paralelamente à superfície do crânio para evitar contato com a bobina de ressonância magnética.

3. Configuração da RM e aquisição dinâmica

1. Posicione a bobina transmissora de volume no isocentro do scanner.
2. Transfira o animal para uma maca compatível com ressonância magnética na posição prona. Conecte o sistema de monitoramento fisiológico, incluindo o sensor respiratório e a sonda de temperatura retal. Ligue o banho de água morna circulante para manter a temperatura corporal em aproximadamente 37 °C.
3. Mantenha uma anestesia adequada durante toda a sessão de imagem usando isoflurano suplementar administrado via cone nasal. Ajuste a concentração de isoflurano entre 0,25% e 1,0% para manter uma frequência respiratória de 50–70 respirações/min.
   NOTA: A anestesia com cetamina-xilazina administrada antes da cirurgia de cânula fornecerá sedação residual durante a transferência inicial para a maca de ressonância magnética. Introduza o isoflurano gradualmente e monitore continuamente a frequência respiratória durante o exame.
   ATENÇÃO: O isoflurano é um agente volátil que representa risco por inalação; utilize sistema ativo de exaustão e minimize a exposição do pessoal.
4. Posicione a bomba de infusão fora do campo magnético periférico, ajuste a taxa de infusão para 1 µL/min e a duração da infusão para 20 min, correspondendo a um volume total de infusão de 20 µL. Organize e fixe cuidadosamente a linha de infusão ao longo da maca para evitar tração e deslocamento.
   ATENÇÃO: Objetos ferromagnéticos podem tornar-se projéteis perigosos quando colocados próximos a um scanner de ressonância magnética. Mantenha todos os equipamentos incompatíveis com ressonância magnética fora do campo periférico.
5. Monte a bobina de superfície diretamente sobre o crânio dorsal, centralizada no cérebro. Coloque um pequeno pedaço de papel absorvente entre a bobina e o local da incisão para absorver qualquer exsudação da ferida.
6. Avance a maca para dentro do ímã até que o cérebro esteja no isocentro. Verifique se a linha de infusão e os cabos de monitoramento fisiológico permanecem sem obstruções.
7. Realize a configuração inicial do scanner e adquira imagens anatômicas para confirmar o posicionamento correto da cânula.
8. Após adquirir as imagens basais, inicie simultaneamente a bomba de infusão e o exame dinâmico, continuando a aquisição por um total de 3 h (consulte Table 1 para detalhes da aquisição).

Resultados

A estação cirúrgica é configurada para permitir o posicionamento preciso da broca com o objetivo de atingir o ventrículo lateral (0,7 mm posterior e 1,4 mm lateral ao bregma; Figura 1A,D). A linha de infusão é composta por uma cânula de cobre de 30 mm, um segmento de 2 m de tubo de PE e uma agulha de 30 G conectada a uma seringa Hamilton (Figura 1B). O comprimento prolongado do tubo permite que a bomba de seringa seja posicionada fora do campo m...

Discussão

O protocolo descrito aqui integra a cânula intraventricular (ICV) com infusão durante a aquisição por ressonância magnética dinâmica, permitindo a avaliação quantitativa do transporte de traçadores no líquido cefalorraquidiano em todo o cérebro dentro de uma única sessão de imagem. Os valores, bem como as limitações, da infusão ICV são melhor avaliados em comparação com a infusão ICM. A infusão ICM evita a cânula transparênquimatosa e, portanto, é menos invasiva. No entanto, como a cisterna magna está localizada a meio c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha hipodérmica 30 G x 1 pol. com hub de plástico	Exel	26439
50 µL, seringa gastight, ponta luer (LT)	Hamilton	80901
Pinça anatômica fina	Fine Science Tools	11003-12
LCR artificial	TOCRIS	3525
Attane Isoflurano 1000 mg/g	ScanVet	55226
Tubo capilar de cobre 0,32 mm OD × 0,16 mm ID	Nippon Tokushukan Mfg. Co., Ltd.	C1220-11-109
Clipes de cobre	IEUYO	FEBA 1801
Cotonete	Puritan	868-WCS
Dotarem (gadoterato de meglumina) Injeção, 0,5 mmol/mL	Guerbet	NDC 67684-2001-1
Broca	Foredom	Modelo SR
Broca para fresa	Fine Science Tools	19007-05
Suporte para broca	Stoelting	51630
Pinça cirúrgica Dumont	Fine Science Tools	11252-00, 11253-20
Pomada oftálmica	Rugby	NDC 0536
Sistema de Anestesia E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic	E-Z Systems	EZ-7000
Pinça de Graefe	Fine Science Tools	11052-10,11152-10
Manta térmica	Braintree Scientific	5381
Kit de cauterização de alta temperatura	Fine Science Tools	18010-00
Ketaminol Vet 100 mg/mL (quetamina)	Intervet International BV	511519
Adesivo de silicone KWIK-SIL, baixa toxicidade, kit	World Precision Instruments	KWIK-SIL
Agulha descartável 5/8 pol., estéril, 26 G	BD	305115
Tubo de polietileno 0,61 mm OD × 0,28 mm ID	Scandidact	SKU252
Rompin Vet 20 mg/mL (xilazina)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
Lâminas de bisturi	Fine Science Tools	10023-00
Tesouras	Fine Science Tools	91460-11, 14007-14
Spátula	Fine Science Tools	10090-13
Estereotáxico	Stoelting	51600U
Porta-agulhas cirúrgico	AgnTho’s	12502-12
Bomba de seringa	New era pump system	NE-4000
Xylocain 20 mg/mL (lidocaína)	AstraZeneca	158543